專利名稱：一種間接競爭法檢測微量氧化低密度脂蛋白膠體金試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氧化低密度脂蛋白的檢測，具體涉及一種檢測氧化低密度脂蛋白的膠體金試紙。
二.
背景技術(shù)：
據(jù)美國心臟學(xué)會2001年的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)，心血管疾病已成為人類的頭號殺手。而動脈粥 樣硬化是大多數(shù)心腦血管疾病發(fā)生的前期病理基礎(chǔ)，故研究動脈硬化的發(fā)病機理、診斷和防 治方法已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點。
脂蛋白是血漿膽固醇和甘油三酯的主要載體。低密度脂蛋白(LDL)是由磷脂，載脂蛋 白(Apo) B多肽鏈，膽固醇，甘油三酯，碳水化合物等組成。氧化低密度脂蛋白(oxLDL) 是經(jīng)LDL氧化修飾形成的。近年來人們發(fā)現(xiàn)oxLDL與動脈粥樣硬化有密切的關(guān)系。oxLDL促使 泡沫細胞的形成，而泡沫細胞的死亡將導(dǎo)致脂類在動脈壁的沉積，這是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的 主要病因之一。最近研究表明，在動脈粥樣硬化病灶中發(fā)現(xiàn)了oxLDL沉積，而正常動脈壁中 沒有，此屬于動脈粥樣硬化病灶的特有成分。因此，患者體內(nèi)的oxLDL量遠高于正常人，其 濃度與病變范圍呈比例。臨床認為健康人體內(nèi)oxLDL的含量為200-500yg/L，而當(dāng)臨床檢測 oxLDL含量大于600 y g/L時為異常。因此oxLDL的檢測對動脈粥樣硬化心血管病的預(yù)警及早期 輔助診斷具有重要意義。
目前檢測oxLDL的方法很多，最常用的方法是采用oxLDL單抗或多抗的酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA)檢測血清oxLDL的含量。該法的缺陷為操作過程相對復(fù)雜，需要特殊的儀器如酶標 儀來進行操作，需要專業(yè)的檢驗人員進行操作；操作時間較長，整個過程需要超過一個小時 ;檢測費用較高，且不能實現(xiàn)單人分檢測等。
膠體金免疫層析技術(shù)作為一種快速臨床診斷技術(shù)，其特點是單分檢測，方便快捷，除商 品試劑外無需任何儀器設(shè)備，幾分鐘即可肉眼觀察結(jié)果，且保質(zhì)期長。
中國專利200510200394. 6公開了一種氧化低密度脂蛋白膠體金試紙條，其根據(jù)氧化低密 度脂蛋白抗體捕獲抗原的量建立顏色對濃度的關(guān)系。然而，肉眼對顏色深淺的辨別存在一定 局限，因此對此種檢測法半定量功能的靈敏度形成一種限制，且可能根據(jù)個人對顏色深淺的 辨別不同，產(chǎn)生個體差異。
本發(fā)明的目的在于提供一種不需特殊儀器設(shè)備，有效、快速、準確的測定低密度氧化脂 蛋白的方法，通過此方法可以簡單直接的判定人體內(nèi)氧化低密度脂蛋白是否高于正常水平。 同時有效的降低了檢測成本，簡化了操作過程，縮短了檢測時間。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過競爭法建立一種測定人體中氧化低密度脂蛋白含量的方法。通過對檢測區(qū)顏 色的有、無，判定人體內(nèi)氧化低密度脂蛋白是否高于正常水平。從而實現(xiàn)了動脈粥樣硬化心 血管疾病的預(yù)警及早期輔助診斷。
本發(fā)明包括基本支持片，以及在所述基本支持片上依次排列的樣品吸收墊，金標抗體墊 ，層析顯色膜及吸水墊。
基本支持片為一面涂有不干膠的不吸水韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成 部分的作用。
樣品吸收墊為無紡布或者玻璃纖維素膜。
金標抗體墊設(shè)置有玻璃纖維素膜，該玻璃纖維素膜包被有金標抗體。上述金標抗體為一 定量的鼠源抗氧化低密度脂蛋白的單克隆抗體或者多克隆抗體。
層析顯色膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。顯色區(qū)上依次設(shè)立檢測帶和質(zhì)控帶。檢測 帶包被有作抗原用氧化低密度脂蛋白。質(zhì)控帶包被有第二種動物抗鼠的IgG。
吸水墊為濾紙或玻璃纖維素膜。
本發(fā)明的原理是玻璃纖維素膜上包被一定量的金標抗體，檢測帶上包被的氧化低密度脂 蛋白與樣品中的氧化低密度脂蛋白成競爭關(guān)系。待測樣品中氧化低密度脂蛋白與金標抗體結(jié) 合，形成金標抗原抗體結(jié)合物。金標抗原抗體與未結(jié)合抗原的金標抗體由于毛細作用沿層析 膜層析到檢測帶。如果檢測帶不顯色，則證明樣品中的氧化低密度脂蛋白超過了限定值，即 金標抗體全部跟樣品中的氧化低密度脂蛋白結(jié)合而無法與檢測帶上的氧化低密度脂蛋白結(jié)合 。如果檢測帶顯色，則證明樣品中的氧化低密度脂蛋白濃度未達到限定值，未結(jié)合樣品中氧 化低密度脂蛋白的金標抗體與檢測帶上的氧化低密度脂蛋白結(jié)合顯色。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點
1. 檢測準確率高，特異性強。
2. 檢測快速僅需要5分鐘即可觀察結(jié)果。
3. 攜帶方便，操作簡單檢測不需要任何特殊的儀器或設(shè)備，操作步驟簡單，便于醫(yī) 護人員攜帶，也可供常年病患者自我檢測與監(jiān)控，從而達到預(yù)警作用。 4. 氧化低密度脂蛋白檢測試紙制作工藝簡單，成本低。
5. 膠體金試紙可常溫下保存，無需特殊儀器及設(shè)備。保存期達一年，重復(fù)性好。
四.


圖一為本發(fā)明結(jié)構(gòu)的正面示意圖和側(cè)面示意圖。圖一中l(wèi)為吸水墊，2為質(zhì)控帶，3為檢 測帶，4為層析顯色膜，5為金標抗體墊，6為樣品吸收墊，7為基本支持片，如PVC板等。
圖二為本發(fā)明的使用結(jié)果說明圖。圖二中a質(zhì)控帶顯色而檢測帶不顯色，為陽性結(jié)果， 表明樣品中氧化低密度脂蛋白含量高于或等于600yg/L，患??；b質(zhì)控帶和檢測帶均顯色， 為陰性結(jié)果，表明樣品中氧化低密度脂蛋白含量低于正常值yg/L，正常；c質(zhì)控帶和檢測帶 均不顯色，表明試紙條失效。
五. 具體實施方案
實施例一
氧化低密度脂蛋白單克隆抗體的制備
用oxLDL (購自北京協(xié)和三友科技開發(fā)公司)免疫小鼠。取已免疫小鼠的脾細胞與小鼠 骨髓瘤細胞雜交融合，制備雜交瘤細胞。挑選陽性高的雜交瘤細胞進行克隆，制備單克隆雜 交瘤細胞。持續(xù)培養(yǎng)20代，篩選并最終建立可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
采用接種雜交瘤細胞至小鼠腹腔的方法制備腹水，再從腹水中提取抗體的方法制備單克 隆抗體。
實施例二
膠體金制備及標記單克隆抗體的方法
采用檸檬酸三鈉還原法制取膠體金顆粒。取0.01XHAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸。根 據(jù)需要迅速加入l^枸櫞酸三鈉水溶2ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)酒紅色。靜置冷卻，這樣制 成直徑約20nm的膠體金顆粒。
采用凝聚比色法測定膠體金最適結(jié)合蛋白量。以O(shè). 1Mol/L K2C03調(diào)節(jié)膠體金pH為9.0， 分裝于十管，每管lml。梯度稀釋蛋白濃度后，分別加入上述十管中，每管加lml。 5min后， 在上述各管中加入lml 10^NaCl溶液，混勻后靜置2h，測其0D值。根據(jù)OD值可觀察得出穩(wěn)定 lml膠體金所需要的抗體量。
使用膠體金顆粒標記抗體。膠體金和一定濃度的抗體溶液分別以O(shè). 1Mol/L K2C03調(diào)pH至
9.0。電磁攪拌抗體溶液，逐滴加入膠體金溶液。繼續(xù)攪拌10min，加入5%的穩(wěn)定劑牛血清 白蛋白(BSA)以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀，再攪拌10min。
用超速離心法純化膠體金標記的抗體。用l 200r/min離心20min，去除大的聚合物(可 根據(jù)情況省略此步)。用13000g， 4"C離心40min，仔細吸出上清，沉淀物用含lXBSA的PBS 液(含0.02XNaN3)重懸，反復(fù)離心3次。將沉淀重懸為原體積的l / 10， 4'C保存。如在結(jié) 合物內(nèi)加50^甘油可貯存于-2(TC保存一年以上。
實施例三
檢測氧化低密度脂蛋白膠體金試紙條的制備及組裝 樣品吸收墊將玻璃纖維裁剪成l. 9cmX30cm大小備用。
金墊將切成O. 5mmX30cm的玻璃纖維浸泡于一定濃度的金標抗體溶液中2小時，37° C 干燥1小時，密封，4° C保存?zhèn)溆谩?br> 層析膜采用硝酸纖維素膜或者醋酸纖維素膜，裁剪成2.5cmX30cm大小。離膜下端 lcm處包被一定濃度的氧化低密度脂蛋白作為檢測帶，帶寬為2mm，向上間隔O. 5cm處包被 lmg/ml動物抗鼠(多為羊抗鼠)的IgG作為質(zhì)控帶。自然陰干后，用含P/。BSA， 0.01mol/L， pH7.4的PBS封閉2h，室溫陰干，密封備用。
吸水墊將玻璃纖維拆剪成4cmX 30cm大小備用。
將吸水墊，層析膜，金墊和樣品吸收墊從上至下依次重疊貼于PVC板上，重疊處約2mm寬 。并從層析膜下端2mm處開始，包括金墊和部分吸收墊，用膠帶固定相互之間的連接，并貼 上MAX線標貼。然后給吸水墊表面貼上色標貼。最后，將切成4mm的試紙條密封，放入干燥劑 保存。
實施例四
膠體金試紙條的使用細則
采樣于晨起7至10時空腹抽前臂血，立即加入抗氧化劑，以防低密度脂蛋白在體外繼 續(xù)被氧化。離心后取血漿備檢。
檢測檢測前將試紙連包裝取出，室溫放置5min左右，取出試紙。將樣品吸收墊浸入樣 品溶液中，液面不要超過MAX線標貼，或者平放試紙條于潔凈的工作臺上，滴加樣品溶液至
樣品吸收墊上。io分鐘后肉眼觀察結(jié)果。
觀察如果檢測帶不顯色，質(zhì)控帶顯色則證明樣品中的氧化低密度脂蛋白超過了限定值
，為陽性。如果檢測帶顯色，質(zhì)控帶顯色則證明樣品中的氧化低密度脂蛋白濃度未達到限定 值，為陰性。如果檢測帶和質(zhì)控帶均不顯色，則證明試紙條實效。
權(quán)利要求
1.一種半定量檢測微量氧化低密度脂蛋白膠體金試紙條，該試紙條包括基本支持片，以及在基本支持片依次排列的吸水墊，層析膜，金墊和樣品吸收墊。其特征在于固定只能結(jié)合約600μg/L濃度的金標抗體于金墊上，采用間接競爭法，使固定于層析膜上的氧化低密度脂蛋白與待測樣品中的氧化低密度脂蛋白競爭顯色。
全文摘要
本發(fā)明提供一種間接競爭法檢測微量氧化低密度脂蛋白膠體金試紙條。該試紙條采用競爭法，在金標抗體墊包被一定量的金標抗體，在檢測區(qū)包被氧化低密度脂蛋白。通過觀察檢測區(qū)是否顯色，從而檢測人血清或血漿中存在的氧化低密度脂蛋白是否高于正常水平。本發(fā)明能方便，快速，直觀的進行氧化低密度脂蛋白的檢測，從而對動脈粥樣硬化疾病的早期診斷提供了可靠的依據(jù)。
文檔編號G01N33/68GK101183108SQ20071020208
公開日2008年5月21日 申請日期2007年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月16日
發(fā)明者李紅玉, 瑜 陳 申請人:李紅玉;蘭州大學(xué)