專利名稱：：中藥材中殘留有機氯農(nóng)藥的檢測方法中藥材中殘留有機氯農(nóng)藥的檢測方法(-財支術(shù)領(lǐng)域，.本發(fā)明涉及一種檢測方法，M是中藥材中殘留有才幾氯農(nóng)藥的檢測方法。。
背景技術(shù)：
：有機氯農(nóng)藥具有顯著的殺蟲效果，曾是各國用量最大的殺蟲劑，我國于上世紀50至80年代曾大量生產(chǎn)和使用有機氯農(nóng)藥。有機氯農(nóng)藥的P爭解期長，并可通過食物鏈富集，其殘毒作用對環(huán)^t成污染，從而危害人體健康及食品安全。植物性中藥材(中草藥)的種植期較長，尤其是多年生的根類藥材，以及富含脂肪、蠟質(zhì)的組織，更易受到有才幾氯農(nóng)藥的污染。雖然有機氯農(nóng)藥在我國已禁用多年，但大量資料表明，中草藥中有機fc^藥殘留檢出率高達90%以上，甚至還有超標的情況，因此建立中草藥中有機氯農(nóng)藥殘留量的檢測方法，保證用藥安全，具有十分重要的現(xiàn)實意義。目前中藥材中有機氯農(nóng)藥的檢測主要是依據(jù)中華人民共和國藥典2005年版一部《藥材及制劑中有機氯農(nóng)藥殘留量測定法》及國標中(GB/T5009.145-2003)的規(guī)定來進行檢測。但通過近一年的檢測實踐發(fā)現(xiàn)藥典方法雖然提取效率較高，但存在下述不足(l)由于用二氯曱烷作提取劑，對有機氯的檢測存在一定的干擾，雖然用石油醚多次操作去除，但增加了操作步驟，一方面增加了工作量，另一方面也引入了誤差。(2)凈化環(huán)節(jié)用濃硫酸^t化后，直接取上清液進行濃縮、定容后ii/v氣相色語儀測定，樣品中殘余的濃疏酸對毛細管柱有較大的損害，P條低色i普柱的使用壽命；同時也會對儀器進樣口造成一定的污染。(3)過程復(fù)雜，操作繁瑣。而國標中有機氯殘留的檢測方法除操作煩瑣外，采用層析柱凈化方法并不適用于中草藥此類含大量色素、油脂、雜質(zhì)的樣品，凈化不當，多而大的雜質(zhì)峰將大大干拔檢測結(jié)果。曰
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對上述檢測方法中所存在的問題而提出的一種操作較筒單，對檢測目標物千擾少，數(shù)據(jù)結(jié)果穩(wěn)定，對檢測儀器無損害的中藥材中殘留有機磷農(nóng)藥的檢測方法。本檢測方法包括下述步驟(1)對照品溶液的制備分別準確吸取濃度為1000ug/ml的a-666、^-666、y-666、5-666、五氯硝基苯、p，p,-DDT、p，p,-DDD、p，p，-DDE、o，p，-DDT標準儲備液10ul于10ml容量瓶中，用正已烷定容至刻度，充分混勻，得濃度為lug/ml對照品混合溶液，備用；(2)色謙糾氣相色"il^f義Agilent6890N;檢測器微電子捕獲檢測器63Ni-pECD,溫度290"C，輔助氣N2;流量為25ml/min色譜柱彈性石英毛細管柱30mx0.32mmx0.25m加DB-1M;恒^Mt式，柱流量2.Oml/min,線速度38cm/sec。進樣口分流不分流進樣口，不分流模式，溫度200。C,壓力ll.37psi，總流量14.9ml/min柱溫程序升溫，初溫120。C,保留6min，以6。C/min升到230。C,保持lmirr，理論塔板數(shù)按a-BHC計算應(yīng)不低于lx106，兩個相鄰色i辨的分離度應(yīng)大于l.O(3)對照品溶液的檢測準確吸取上述有機氯農(nóng)藥對照品混合溶液60ul于樣品瓶中，加入正己烷540ul，充分混勻，得O.lug/ral有機氯農(nóng)藥對照品混合溶液，按上述色i瞽M進樣分析，得出對照品色圖譜；(4)供試品的制備取供試品于6(TC恒溫干燥，粉碎成細粉，稱取供試樣品粉末5g，精密稱定，于100ml具塞三角瓶內(nèi)，加入丙酮30ml，充分搖勻，浸泡過夜，超聲4l:取20min,2次，加入石油醚30ml，搖勻，超聲20min,靜置放冷，過濾入250ml分液漏斗，用石油醚10ml洗真塞三角瓶，濾渣仝部倒入三角漏斗內(nèi)，用石油醚10ml分次洗三角漏斗；量取100ml2%Na2S04水溶液于分液漏斗中，充分搖勻，靜置分層，將下層溶液轉(zhuǎn)入另一250inl分液漏斗中，用20ml石油醚萃取，合并三次萃取的石油醚層；小心加入濃硫酸10ml，劇烈振搖2min，充分靜置，分層，棄去下層，再磺化1次，禍；油醚層顏色深淺情況，可再磺化l次；用100ml2y。Na2S04水溶液洗去石油醚層中殘余的濃石克酸，水洗2-—3次；將分液漏斗中的石油醚層轉(zhuǎn)入茄形瓶中，用20ml石油醚分2次洗分液漏斗，并入茄形瓶中，于4(TC水浴上減壓濃縮至干，加入5g無水Na2S04脫水，用正已烷溶解，準確定容至5ml，得供試品溶液，待測。(5)供試品的檢測取上述待測供試品溶液lml,置于自動進樣器樣品瓶中，在上述相同的色諳M下自動進樣分析，得出供試品圖傳；(6)檢測結(jié)果分析將供試品檢測出的色譜圖與對照品色譜圖進行比對，若有相同的特征峰，即可說明供試品中殘留有該有機氯農(nóng)藥，并通過相應(yīng)峰面積計算出含量值。所使用的標準儲備液來源于國家農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測總站。所使用的丙酮是由美國天地公司生產(chǎn)的色語純；石油醚是由美國天地公司生產(chǎn)的35-60。C色謙純；正己烷是由美國天地^^司生產(chǎn)的色語純；濃石克酸由天津試劑廠生產(chǎn)的分析純。本發(fā)明主要在以下幾個方面作出了改進(l)利用有機氯農(nóng)藥具有極性小的特點，運用相似相溶原理，先用穿透力較強的丙酮浸泡提取，確保有機氯農(nóng)藥的提取效率達到藥典方法水平，再用極性較弱的石油醚提取，一次提取，完成六六六、滴滴涕、五氯硝基苯的殘留測定。用極性較弱的石油醚取代對檢測干擾較大的二氯甲烷，提高了檢測的準確度；(2)利用2%的疏酸鈉調(diào)節(jié)氷的極性，利用硫酸鈉氷溶波與濃硫酸相溶，而與石油醚不相溶的特點，靜置分層后，達到去除殘余濃硫酸而又不損失有機氯農(nóng)藥的目的。進一步起到凈化的作用，同時避免了殘余硫酸對儀器的損害。(3)省去了因去除二氯曱烷需反復(fù)操作的步驟，操作更筒單。以下是關(guān)于本發(fā)明方法的驗證實驗l.工作曲線、檢測限及精密度試驗準確配制O.002、0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、2ug/ml的有才幾氯標準混合溶液，在相同色譜條件下，進樣檢測。以峰面積A對相應(yīng)被測組分的濃度C進行線性回歸，繪制工作曲線，以3倍信噪比計算檢出限，計算精密度，驗證系統(tǒng)的重現(xiàn)性，結(jié)果如下表i工作曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)論通過以上驗證實驗，可以得出線性范圍寬，精度高，檢測p艮低的結(jié)論，表明色譜分離系統(tǒng)選擇性良好，條件科學(xué)合理。2.實驗試劑的^i正農(nóng)藥殘留檢測中，凈化是很關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，因》b寸實驗中提取、凈化、溶解用的各類試劑也提出了更高的要求，試劑不純，導(dǎo)入的雜質(zhì)勢必會影響分析檢測結(jié)果，所以對試劑進行驗證是必要的。(1)石油醚、丙酮、正已烷的純凈程度^i石油醚35—60°C，色謙純，產(chǎn)地美國天地7>司；丙酮色語純；產(chǎn)地美國天地；正已烷色語純；產(chǎn)地美國天地；分別取上述試劑20ml，濃縮至干，用對應(yīng)試劑溶解，定容至lml,于氣相色鐠上進樣分析，放大觀察其色諉流出曲線。結(jié)論以上試劑通過濃縮驗證，曲線較干凈，通過濃縮20倍后進樣分析，并與O.001ug/ml的有才幾氯混合標樣對比，對目標物質(zhì)無干擾，表明以上試劑符合應(yīng)用需求，作為色譜純，無需重蒸，可直接使用。(2)i^^L酸的純度,驗證在本研究中，有機氯殘留分析檢測過程中利用過量濃硫酸的磺tt取代芳香族化合物碳原子上的氫，通過>*化反應(yīng)達到去除雜質(zhì)的目的，因此要求濃硫酸自身不能帶入干擾物質(zhì)。^U克酸的騶^正方法在30ml已驗證的石油醚中加入^U克酸(分析純，天津試劑廠)10ml，磺化，按樣品分析方法進行實驗，色語進樣分析，得出其驗〖正曲線。結(jié)論對比有機氯混合標樣譜圖，該曲線顯然對結(jié)杲無千擾，表明濃硫酸質(zhì)量合格。3.整體實驗方法驗證(l)試驗藥材野生類藥材肉蓯蓉(產(chǎn)地新疆，批號20060425)按《中國藥典》2005年一部附錄規(guī)定的"藥材及制劑有機氯農(nóng)藥殘留量測定法"對2份平行樣進行檢測，未檢出有機氯農(nóng)藥，可以視為其無有機氯農(nóng)藥殘留(2)試g全方法回收率梯度試驗共設(shè)計三組實驗，每組平行稱取上述肉蓯蓉樣品5g,分別添加O.002ug/ml、0.02ug/ml、0.2ug/ml三個梯度的有機氯混合標樣，按本發(fā)明的方法試驗，結(jié)果如下加標回收試驗結(jié)果(n-5)加入量0.002ug/ml加入量0.02ug/ml加入量0.2ue/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以上試驗結(jié)果表明本方法用于中藥材中殘留有機氯農(nóng)藥的檢測，其數(shù)據(jù)結(jié)果穩(wěn)定，回收率高，精密度高，系統(tǒng)重現(xiàn)性與適用性均達到要求。線性范圍為O.002。2mg/L,相關(guān)系數(shù)為O.98141。0.99968，檢出限為O.0004816^0.001928ug/mL,加標回收率達74。102%,相對標準偏差為2.03。7,14。卿圖l是9種有機氯農(nóng)藥對照品溶液的氣相色譜圖；圖2是石油醚的^i正氣相色譜圖；圖3是丙酮的驗證氣相色語圖；圖4是正己烷的,驗證氣相色譜圖；圖5是i^U危酸的馬封正氣相色譜圖；圖6是黃芪藥材中殘留的有機氯農(nóng)藥的氣相色譜圖；圖7是當歸藥材中殘留的有機氯農(nóng)藥的氣相色譜圖。圖中l(wèi).a-666;2.0-666;3.y-666;4.5-666;5.五氯硝基苯；6.p，p，-DDT;7.p，p,-DDD;8.p,p，—DDE;9.o,p，—DDT。(S)具體實施例方式實施例1黃芪藥材中殘留的有機氯農(nóng)藥的檢測一、對照品溶液的制備分別精密吸取由國家農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測總站提供的濃度為1000ug/ml的a-666、p-666、y-666、5-666、五氯硝基苯、p，p，-DDT、p，p，-DDD、p，p，-DDE、o，p，-DDT標準儲備液(石油醚)10ul于10ml容量lf瓦中，用正已烷定容至刻度，于渦旋振蕩器上充分混勻，得濃度為lug/ml對照品混合溶液，置于冰箱中貯存?zhèn)溆谩?2)主要實驗儀器、色鐠條件和試劑a、實驗儀器氣相色謙4義Agilent6890N;彈性石英毛細管柱(30mxO.32mmx0.25jnm)DB-1MS檢測器微電子捕獲檢測器63Ni-jLiECD,溫度29(TC，輔助氣(N2)力t量25ml/min。色語柱彈性石英毛細管柱(30mx0.32mmx0.25,)DB-1MS,恒流才莫式，柱流量2.Oml/min,線速度38cm/sec。b、色語條件進樣口分流不分流進樣口，不分流(splitless)才莫式，溫度200°C,壓力ll.37psi，總流量14.9ml/min。柱溫一呈序升溫，初溫120。C，4呆留6min,以6。C/min升到230。C，保持lmin。理論塔板數(shù)按ct-BHC計算應(yīng)不低于1x106,兩個相鄰色镥峰的分離度應(yīng)大于l.Oc、試劑丙酮色i昝純；石油醚35""60。C，色語純；正已烷色語純；疏酸鈉分析純，55(TC灼燒4小時備用；濃石充酸分析純；水蒸餾水(3)對照品溶液的檢測準確吸取上述有機氯農(nóng)藥對照品混合溶液60ul于樣品瓶中，加入正已烷540ul，于渦旋振蕩器上充分混勻，得O.lug/inl有機氯農(nóng)藥對照品混合溶液，按上述色i普條件進樣分析，得出對照品色圖語。(4)供試品的制備取黃芪(產(chǎn)地甘肅，批號20060613)于60。C恒溫干燥，粉碎成細粉，稱取供試樣品粉末5g,精密稱定，于100ml具塞三角瓶內(nèi)，加入丙酮30ml，充分搖勻，浸泡過夜，超聲提取20min,2次，加入石油醚30ml，搖勻，超聲20min，靜置》欠冷，過濾入250ml分液漏斗，用石油醚10ffll洗具塞三角瓶，濾渣全部倒入三角漏斗內(nèi)，用石油醚10ml分次洗三角漏斗。量取100ml2%Na2S04水溶液于分液漏斗中，充分搖勻，靜置分層，將下層溶液轉(zhuǎn)入另一250ml分液漏斗中，用20ml石油醚萃取，合并三次萃取的石油醚層。小心加入濃硫酸10ml，劇烈振搖2min,充分靜置，分層，棄去下層，再磺化1次，視石油醚層顏色深淺情況，可再磺化l次；用100ml2°/Na2S04水溶液洗去石油醚層中殘余的濃石充酸，水洗2-3次。將分液漏斗中的石油醚層轉(zhuǎn)入茄形瓶中，用2Oml石油醚分2次洗分液漏斗，并入茄形瓶中，于4(TC水浴上減壓濃縮至千，加入5g無水Na2S04脫水，用正已烷溶解，準確定容至5ml，得供試品溶液，待測。(5)供試品的檢測取上述待測供試品溶液lml，置于自動進樣器樣品瓶中，在上述相同的色譜^ft下自動進樣分析，得出供試品圖鐠。(6)檢測結(jié)果分析將供試品檢測出的色謙圖與對照品色鐠圖用保留時間對比法進行比對，并確認相應(yīng)特征峰，可以看出有與9號峰o,p，-DDT相同的特征峰，說明本批次的黃芪藥材中有o，p,-DDT農(nóng)藥殘留。按外標法計算，o,p，-DDT含量為O.0102ug/ml,符合我公司關(guān)于《中藥材中有機氯農(nóng)藥殘留限量標準》中的規(guī)定。實施例2當歸藥材中殘留的有機氯農(nóng)藥的檢測(1)對照品溶液的制備同實施例l(2)實驗儀器、色語條件和試劑同實施例l(3)對照品溶液的檢測同實施例1(4)供試品的制備取當歸(產(chǎn)地甘肅，批號20060718)于60t:恒溫干燥，粉碎成細粉，稱取供試樣品粉末5g，精密稱定，于100ml具塞三角瓶內(nèi)，加入丙酮30ml，充分搖勻，浸泡過夜，超聲提取20min，2次，加入石油醚30ml，搖勻，超聲20rain,靜置放冷，過濾入250ml分液漏斗，用石油醚10ml洗具塞三角瓶，濾渣全部倒入三角漏斗內(nèi)，用石油醚10ml分次洗三角漏斗。量取100ml2%Na2S04水溶液于分液漏斗中，充分搖勻，靜置分層，將下層溶液轉(zhuǎn)入另一250ml分液漏斗中，用20ml石油醚萃取，合并三次萃取的石油醚層。小心加入濃硫酸10ml，劇烈振搖2inin,充分靜置，分層，棄去下層，再磺化l次，視石油醚層顏色深淺情況，可再磺化l次；用100ml2%Na2S04水溶液洗去石油醚層中殘余的濃疏酸，水洗2-3次。將分液漏斗中的石油醚層轉(zhuǎn)入茄形瓶中，用20ml石油醚分2次洗分液漏斗，并入茄形瓶中，于4(TC水浴上減壓濃縮至千，加入5g無水Na2S04脫水，用正已烷溶解，準確定容至5ml，得供試品溶液，待測。(5)供試品的檢測取上述待測供試品溶液lml,置于自動進樣器樣品瓶中，在上述相同的色語條件下自動進樣分析，得出供試品圖譜。(6)檢測結(jié)果分析將供試品檢測出的色謙圖與對照品色譜圖用保留時間對比法進行比對，并確認相應(yīng)特征峰，可以看出有與5號峰五氯硝基苯和8號峰p，p，-DDE相同的特征峰，說明本批次的當歸藥材中有五氯硝基苯和p,p,-DDE農(nóng)藥殘留。按外標法計算，五氯硝基苯含量為O.0140ug/ml，p,p,-DDE含量為O.0120ug/ml，符合我公司關(guān)于《中藥材中有機氯農(nóng)藥殘留限量標準》中的規(guī)定。權(quán)利要求1.中藥材中殘留有機氯農(nóng)藥的檢測方法，其特征在于包括下述步驟a.對照品溶液的制備分別準確吸取濃度為1000ug/ml的α-666、β-666、γ-666、δ-666、五氯硝基苯、p，p，-DDT、p，p，-DDD、p，p，-DDE、o，p，-DDT標準儲備液10ul于10ml容量瓶中，用正己烷定容至刻度，充分混勻，得濃度為1ug/ml對照品混合溶液，備用；b.色譜條件氣相色譜儀Agilent6890N-檢測器微電子捕獲檢測器63Ni-μECD，溫度290℃，輔助氣N2；流量為25ml/min；色譜柱彈性石英毛細管；DB-1MS；30m×0.32mm×0.25μm，恒流模式，柱流量2.0ml/min，線速度38cm/sec；進樣口分流不分流進樣口，不分流模式，溫度200℃，壓力11.37psi，總流量14.9ml/min；柱溫程序升溫，初溫120℃，保留6min，以6℃/min升到230℃，保持1min；理論塔板數(shù)按α-BHC計算應(yīng)不低于1×106，兩個相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.0c.對照品溶液的檢測準確吸取上述1ug/ml有機氯農(nóng)藥對照品混合溶液60ul于樣品瓶中，加入正己烷540ul，充分混勻，得0.1ug/ml有機氯農(nóng)藥對照品混合溶液，按上述色譜條件進樣分析，得出對照品色圖譜；d.供試品的制備取供試品于60℃恒溫干燥，粉碎成細粉，稱取供試樣品粉末5g，精密稱定，于100ml具塞三角瓶內(nèi)，加入丙酮30ml，充分搖勻，浸泡過夜，超聲提取20min，2次，加入石油醚30ml，搖勻，超聲20min，靜置放冷，過濾入250ml分液漏斗，用石油醚10ml洗具塞三角瓶，濾渣全部倒入三角漏斗內(nèi)，用石油醚10ml分次洗三角漏斗；量取100ml2％Na2SO4水溶液于分液漏斗中，充分搖勻，靜置分層，將下層溶液轉(zhuǎn)入另一250ml分液漏斗中，用20ml石油醚萃取，合并三次萃取的石油醚層；小心加入濃硫酸10ml，劇烈振搖2min，充分靜置，分層，棄去下層，再磺化1次，視石油醚層顏色深淺情況，可再磺化1次；用100ml2％Na2SO4水溶液洗去石油醚層中殘余的濃硫酸，水洗2-3次；將分液漏斗中的石油醚層轉(zhuǎn)入茄形瓶中，用20ml石油醚分2次洗分液漏斗，并入茄形瓶中，于40℃水浴上減壓濃縮至干，加入5g無水Na2SO4脫水，用正己烷溶解，準確定容至5ml，得供試品溶液，待測；e.供試品的檢測取上述待測供試品溶液1ml，置于自動進樣器樣品瓶中，在上述相同的色譜條件下自動進樣分析，得出供試品圖譜；f.檢測結(jié)果分析將供試品檢測出的色譜圖與對照品色譜圖進行比對，若有相同的特征峰，即可說明供試品中殘留有該有機氯農(nóng)藥，并通過相應(yīng)峰面積計算出含量值。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的中藥材中殘留有機氯農(nóng)藥的檢測方法，其特征在于所使用的標準儲備液來源于國家農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測總站。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的中藥材中殘留有機氯農(nóng)藥的檢測方法，其特征在于所使用的丙酮是由美國天地公司生產(chǎn)的色鐠純;石油醚是由美國天地公司生產(chǎn)的35-60°C色譜純；正己烷是由美國天地公司生產(chǎn)的色譜純；濃硫酸由天津試劑廠生產(chǎn)的分析純。全文摘要中藥材中殘留有機氯農(nóng)藥的檢測方法，包括下述步驟(1)制備一定濃度并包含有9種有機氯農(nóng)藥的對照品溶液；(2)在適當?shù)纳V條件下檢測對照品溶液，并得出對照品色譜圖；(3)制備供試品將供試品粉末以丙酮浸泡，石油醚超聲提取，濃硫酸磺化，減壓濃縮，即得；(4)在與對照品相同的色譜條件下對供試品進行檢測，得出供試品色譜圖；(5)將供試品檢測出的色譜圖與對照品色譜圖用保留時間對比法進行比對，并確認相應(yīng)特征峰，再通過外標法計算出含量值。本方法操作較簡單，對檢測目標物干擾少，數(shù)據(jù)結(jié)果穩(wěn)定，對檢測儀器無損害，回收率及精密度高，系統(tǒng)重現(xiàn)性與適用性均達到要求。文檔編號G01N30/00GK101241112SQ20071005152公開日2008年8月13日申請日期2007年2月7日優(yōu)先權(quán)日2007年2月7日發(fā)明者孫細珍申請人:勁牌有限公司