專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)多種抗eb病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地是涉及檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
鼻咽癌是流行于我國(guó)南方的一種惡性腫瘤，其中又以廣東最為常見(jiàn)，年發(fā)病率達(dá)30-50/10萬(wàn)。早期鼻咽癌放療后5年生存率可達(dá)80-90％；而晚期鼻咽癌僅為20％。因此加強(qiáng)鼻咽癌的二級(jí)預(yù)防，即早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高鼻咽癌治療效果的關(guān)鍵。
鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染密切相關(guān)。雖然普通人群中90％以上建立了EB病毒終生潛伏狀態(tài)感染，但是鼻咽癌患者的多種EB病毒抗體水平要明顯高于非患者。研究表明，鼻咽癌病人在臨床癥狀出現(xiàn)前三年(平均)時(shí)，就可觀察到其血清中多種抗EB病毒抗原抗體顯著升高，因此免疫血清學(xué)檢測(cè)EB病毒感染是目前篩查鼻咽癌最常用的手段。臨床上普遍使用的檢測(cè)指標(biāo)是VCA/IgA、EA/IgA。VCA/IgA，其檢測(cè)具有很高的靈敏度，但缺乏特異性，通常被用于篩查以排除鼻咽癌的診斷；而EA/IgA檢測(cè)具有很高的特異度，但缺乏靈敏性而被用于鼻咽癌的確定性檢測(cè)，兩者可相互補(bǔ)充。近些年來(lái)，多種EB病毒基因工程重組抗原或化學(xué)合成多肽已被用于血清學(xué)檢測(cè)，研究者發(fā)現(xiàn)了EBNA1、p18、p23、Rta、DNA聚合酶等若干種具有潛在診斷價(jià)值的EB病毒抗原。由于不同的鼻咽癌病人的抗體譜不完全相同，因此多種抗原抗體的聯(lián)合檢測(cè)可進(jìn)一步提高其診斷性能。EBNA1/IgA、EBNA1/IgG、Zta/IgG單獨(dú)檢測(cè)時(shí)，其敏感度和特異度均在80-88％，比傳統(tǒng)的VCA/IgA檢測(cè)敏感性(93％)較低，但有較高的特異性；而比EA/IgA的特異性(97％)較低，但敏感性較高。當(dāng)三者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其敏感度和特異度不但大大提高，分別為92％、93-99％，而且可以用于鼻咽癌高發(fā)區(qū)健康人群篩查的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，兩種或三種抗體陰性時(shí)，其風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)為0.009-0.3，兩種陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)為4-10，而三者均陽(yáng)性時(shí)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)達(dá)到了138。由此可見(jiàn)，多種抗體聯(lián)合檢測(cè)比單獨(dú)檢測(cè)效果更好。
自從EB病毒與鼻咽癌的關(guān)系被揭示以后，間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)血清VCA/IgA、EA/IgA被廣泛采用。IFA的優(yōu)點(diǎn)在于比較敏感特異，但是其結(jié)果的判斷帶有主觀性，不易標(biāo)準(zhǔn)化，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展創(chuàng)新，研究者正在努力以其它技術(shù)如免疫斑點(diǎn)、免疫印跡、ELISA等代替IFA，其中ELISA方法最受重視。ELISA簡(jiǎn)單、快速、敏感，并且易于自動(dòng)化，適于大規(guī)模篩選樣本。已報(bào)道用于ELISA的EBV抗原包括感染EBV細(xì)胞的提取物、重組的EBV蛋白以及合成的多肽。ELISA每次一般只能對(duì)一種抗原/抗體進(jìn)行分析，而單個(gè)指標(biāo)不足以對(duì)所有鼻咽癌進(jìn)行有效診斷。雖然有研究用ELISA法同時(shí)檢測(cè)兩種抗原獲得了理想效果，但是三種以上同時(shí)包被同一個(gè)ELISA板還未見(jiàn)報(bào)道。如果要對(duì)多種抗原抗體同時(shí)進(jìn)行分析，工作量就要大幅度增加，質(zhì)控的難度也增加。
如何高效快速地對(duì)多種EB病毒的抗體進(jìn)行檢測(cè)，是目前研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。多功能液相懸浮芯片(Multi-Analyte Suspension Array)是最近幾年發(fā)展的高通量的分子診斷平臺(tái)，其有機(jī)整合了流式細(xì)胞術(shù)、ELISA技術(shù)和芯片技術(shù)，一次可同時(shí)分析100種不同的因子。與其它檢測(cè)方法相比，液相芯片技術(shù)具有靈敏度高，靈活性好，操作簡(jiǎn)便、快捷，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)外已有多種臨床檢測(cè)試劑盒面世，如腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、過(guò)敏原篩查、病原體的快速檢測(cè)等。由于EB病毒感染引起鼻咽癌具有很強(qiáng)的地域特點(diǎn)，主要高發(fā)于我國(guó)南部，因此其早期診斷的技術(shù)在歐美國(guó)家并沒(méi)有引起高度重視。由于EB病毒感染引起鼻咽癌具有很強(qiáng)的地域特點(diǎn)，主要高發(fā)于我國(guó)南部，因此其早期診斷的技術(shù)在歐美國(guó)家并沒(méi)有引起高度重視。目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有用于早期診斷鼻咽癌的液相芯片試劑盒商品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的需要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是針對(duì)現(xiàn)有血清學(xué)檢測(cè)方法上存在的不足，提供一種準(zhǔn)確快速檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒。
實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下一種檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒，主要包括有至少一種以上的包被有天然的或基因工程抗原的偶聯(lián)羥基微球；和/或至少一種以上包被有合成多肽的偶聯(lián)有親和素的微球，其中，所述天然抗原是EB病毒總抗原裂解物或殼抗原VCA；基因工程抗原是系列表中NO.33～NO.37中的任一種的氨基酸系列；所述合成多肽是具有系列表中NO.1～NO.32中任一種的氨基酸系列。
優(yōu)選地，主要包括有分別包被有系列表中NO.9、NO.10、NO.12、NO.15、NO.18、NO.21、NO.23、NO.26或NO.30的合成多肽的偶聯(lián)有親和素的多色微球；和分別包被有EB病毒總抗原裂解物、殼抗原VCA、或系列表中NO.33～NO.37的氨基酸系列的偶聯(lián)羥基的多色微球。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒的制備方法。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種制備上述的檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒的方法，主要包括以下步驟(1)包被天然的或基因工程抗原將0.5ml(共含有1.1×106個(gè)-1.3×106個(gè)微球)偶聯(lián)羥基的多色微球放入Ep管中，室溫離心；棄上清，重懸于activation buffer中；加入10μl 50mg/mlS-NHS、10μl 50mg/ml EDC，混勻，室溫避光孵育30±15min；離心；棄上清，用coupling buffer洗滌，每次100-300μl，離心；加入任一終濃度50-200μg/ml的所述天然的或基因工程抗原中250μl，混勻，室溫避光反應(yīng)1-3hr；離心，棄上清；用wash buffer洗1-3次，12000rpm，4min離心；加入blocking buffer 200μl，多色微球終濃度為2000-2500個(gè)/μl，室溫，搖床搖30±15min；離心，棄上清；得到天然的或基因工程抗原包被于不同的偶聯(lián)羥基微球；和/或(2)包被合成多肽取出0.1-0.4ml偶聯(lián)親和素的多色微球放入Ep管中；加入任一等體積的storage buffer稀釋的終濃度為8-12μg/ml的上述合成多肽)，4℃避光過(guò)夜；離心，棄上清；用洗脫緩沖液洗1-5次，離心，；加入storage buffer 200-500μl，多色微球終濃度為1200-1500個(gè)/μl；得到多肽包被的偶聯(lián)有親和素的微球。
本發(fā)明所述的檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒，涉及39種抗原，其中，包括2種天然成分，即EB病毒總抗原裂解物和殼抗原VCA；5種基因工程抗原，EA-D(即系列表中NO.33)、EBNA-1全長(zhǎng)(即系列表中NO.37)、EBNA-1片段(即系列表中NO.34)、p18(即系列表中NO.35)、p23(即系列表中NO.36)；32種合成多肽，包括堿性DNA酶2條、胸腺激酶2條、DNA聚合酶2條、Zebra(BZLF1)2條、Gp350/220(BLLF1)、P54/47(BMRF1)、EBNA1(BKRF1)、gp110/gp125(BALF4)、P18(BFRF3)、gN(BLRF1)、EBNA2(BYRF1)、EBNA-3a(BLRF3)、EBNA-3c(BERF3)、EBNA-LP、核糖核酸還原酶(BORF2)、p138(BALF2)、Rta(BRLF1)、p150/160(BcLF1)、p143(BNRF1)、p40(BdRF1)、dUTPase(BLLF3)、gp78(BILF2)、P33(BARF1)、EA-D p17(BMLF1-BSLF2)、gp140(BALF1-1)、P23(BLRF2)、P38(BFRF1)、BFLF2各1條。將上述2種EB病毒、5種基因工程抗原或32種多肽分別包被不同的多色微球，然后對(duì)偶聯(lián)微球進(jìn)行不同組合，開(kāi)展多種EB病毒血清學(xué)檢測(cè)(包括對(duì)以上39種抗原的所有IgA、IgG抗體，以及2種天然成分和5種基因抗原的IgM抗體的檢測(cè))。其中抗原抗體檢測(cè)對(duì)鼻咽癌有診斷價(jià)值的有天然成分lysate/IgA、lysate/IgG、lysate/IgM、VCA/IgA；基因工程EA-D/IgA、EA-D/IgG、EBNA1/IgA、EBNA1fragment/IgA、p18/IgA、p18/IgM、p23/IgA、p23/IgM；多肽類(lèi)p47/54/IgA、p47/54/IgG、EBNA1/IgA、EBNA1/IgG、p18/IgA、gp78/IgA、gp78/IgG、p143/IgG、EBNA2/IgG、EBNA-LP/IgG、dUTPase/IgG、Rta/IgG。
本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)鼻咽癌病人的血清EB病毒抗體譜并不完全一致，因此單一指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)有一定局限性，而對(duì)血清中的多個(gè)抗EB病毒抗原抗體指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析就可以彌補(bǔ)此缺陷。本發(fā)明的在對(duì)EB病毒基因組分析的水平上，篩選出了有診斷價(jià)值的指標(biāo)，并建立了聯(lián)合檢測(cè)多種抗EB病毒抗原的抗體的多色微球液相芯片。所述多色微球液相芯片試劑盒可適用于人群的篩查、鼻咽癌的高發(fā)性評(píng)估、診斷以及預(yù)后效果評(píng)價(jià)、觀察，還可以直接應(yīng)用于早期診斷鼻咽癌、判斷患者預(yù)后狀況等方面，具有快速性、客觀性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)。其與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果1通量大?？梢酝瑫r(shí)檢測(cè)同一樣本中的數(shù)十種EB病毒抗體。
2.所需樣品量少。本發(fā)明只需要1μl的血清樣本就可以完成多種抗EB病毒抗原抗體的檢測(cè)。
3.簡(jiǎn)單快捷。本發(fā)明的檢測(cè)不需反復(fù)洗滌，不到2小時(shí)就可完成。
4.適合一般分子生物學(xué)檢驗(yàn)人員使用，不要求豐富的專(zhuān)業(yè)知識(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由相應(yīng)的分析儀自動(dòng)讀取，排除了主觀性。
5.不涉及有毒、有害的試劑。
具體實(shí)施例方式
本實(shí)施例所使用天然或基因工程抗原可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)得到，其中，EB抗原中殼抗原gp125是通過(guò)單抗與P3H3細(xì)胞裂解液親和層析純化而得到，殼抗原p18(1-119aa)，即系列表中的NO.35、p23(即系列表中的NO.36)、核抗原EBNA-1全長(zhǎng)系列表中的NO.37及核抗原EBNA-1(1-90，408-498aa)(即系列表中的NO.34)、EA-D(EBV early antigen D(EA-D)recombinant，即系列表中的NO.33)是在大腸桿菌中表達(dá)后純化得到，EB病毒總抗原是從P3H3細(xì)胞裂解液得到，此外還合成了32條多肽，包括堿性DNA酶2條、胸腺激酶2條、DNA聚合酶2條、Zebra(BZLF1)2條、Gp350/220(BLLF1)、P54/47(BMRF1)、EBNA1(BKRF1)、gp110/gp125(BALF4)、P18(BFRF3)、gN(BLRF1)、EBNA2(BYRF1)、EBNA-3a(BLRF3)、EBNA-3c(BERF3)、EBNA-LP、核糖核酸還原酶(BORF2)、p138(BALF2)、Rta(BRLF1)、p150/160(BcLF1)、p143(BNRF1)、p40(BdRF1)、dUTPase(BLLF3)、gp78(BILF2)、P33(BARF1)、EA-D p17(BMLF1-BSLF2)、gp140(BALF1-1)、P23(BLRF2)、Gp115(BGLF1)、P38(BFRF1)、BFLF2各1條。本實(shí)施例所使用的多肽為免疫原性強(qiáng)、疏水性及表面暴露概率高的氨基酸序列；這些多肽可以與生物素、親和素、熒光劑等進(jìn)行偶聯(lián)。每種多肽的氨基末端分別偶聯(lián)六個(gè)碳原子和生物素。合成多肽序列如下alkaline DNase(BGLF5)TP-17，Biotin-Ahx-TAPWVPSGLFADDESTPalkaline DNase(BGLF5)LP-20，Biotin-Ahx-LRSPETEAFVRNLDRPPQMPthymidine kinase(BXLF1)DD-18，Biotin-Ahx-DWAGLSKVISDFERGNRDthymidine kinase(BXLF1)RY-18，Biotin-Ahx-RKCQEDESPENERHENFYDNA polymerase(BALF5)FR-18，Biotin-Ahx-FLRPNKGLLKKPDKEYLRDNA polymerase(BALF5)DF-20，Biotin-Ahx-DNNSGAALSVLQNFTARPPFZebra(BZLF1)MV-19，Biotin-Ahx-MDPNSTSEDVKFTPDPYQVZebra(BZLF1)AE-17，Biotin-Ahx-AAPARRTRKPQQPESLEP54/47(BMRF1)RQ-20，Biotin-Ahx-RKRTSSEARQKQKHPKKVKQEBNA1(BKRF1)GS-18，Biotin-Ahx-GSGPRHRDGVRRPQKRPS
gp110/gp 125(BALF4)AA-19，Biotin-Ahx-ARDRFPGLRRRRYHDPETAP18(BFRF3)GQ-17，Biotin-Ahx-GGGQPHDTAPRGARKKQgN(BLRF1)TS-18，Biotin-Ahx-TEAQDQFYSYTCNADTFSGp350/220(BLLF1)HK-20，Biotin-Ahx-HHAEMQNPVYLIPETVPYIKEBNA2(BYRF1)LT-19，Biotin-Ahx-LTHQSTPNDPDSPEPRSPTEBNA-3a(BLRF3)MV-19，Biotin-Ahx-MDKDRPGPPALDDNMEEEVEBNA-3c(BERF3)AY-19，Biotin-Ahx-APQAPYQGYQEPPAPQAPYEBNA-LPRR-20，Biotin-Ahx-RRHRSPSPTRGGQEPRRVRR核糖核酸還原酶(BORF2)RA-21，Biotin-Ahx-REEQNERSPAEQMPPRPMEPAp138(BALF2)EL-18，EDDGQRPDDEPRYTYWQLRta(BRLF1)YD-22，Biotin-Ahx-YSPKDEQRDIAEVLDHLKTNRDp150/160(BcLF1)AN-20，Biotin-Ahx-APRDRRETYSLQHRRPNHMNp143(BNRF1)LE-18，Biotin-Ahx-LRGTNNDPRPQRQERAREp40(BdRF1)GL-22，Biotin-Ahx-GPREDTNPQQPTTEGHHRGKKLdUTPase(BLLF3)LI-18，Biotin-Ahx-LQNQRRYNSTLRPSELKIgp78(BILF2)TK-19，Biotin-Ahx-TSTSHRPHRRPVSKRPTHKP33(BARF1)CV-13，Biotin-Ahx-CVGKNDKEEAHGVEA-Dp17(BMLF1-BSLF2)RF-22，Biotin-Ahx-RSTRKQARQERSQRPLPNKPWFgp140(BALF1-1)PD-21，Biotin-Ahx-PTPPNDEERESNEEPPPPYED
P23(BLRF2)TK-25，Biotin-Ahx-TRPRESNDPNATRRARSRSRGREAKBFLF2RA-23，Biotin-Ahx-RQQRPADPALRRLMHPHHRNYTAP38(BFRF1)PH-17，Biotin-Ahx-PIRRHRTRETRRMRGSHAhx＝6個(gè)碳，以上所列合成多肽(系列表中NO.1～NO.32)由深圳翰宇生物工程有限公司合成。
天然抗原1.EBV antigen(P3H3 cell lysate即EB病毒總抗原裂解物)購(gòu)自Biodesign；EBV viral capsid antigen(VCA gp125即殼抗VCA)購(gòu)自Biodesign；基因工程抗原EBV early antigen D(EA-D)recombinant購(gòu)自Biodesign；EBV p23 recombinant購(gòu)自Biodesign；EBV nuclear antigen-1(EBNA-1)recombinant購(gòu)自Biodesign；Recombinant EBV mosaic EBNA-1(1-90，408-498aa)購(gòu)自ProSpec-Tany TechnoGEne Ltd；Recombinant EBV p18(1-119aa)購(gòu)自ProSpec-Tany TechnoGEne Ltd；Goat anti human IgG，F(xiàn)cγspecific R-PE(羊抗人IgG，F(xiàn)cγ段，R-PE標(biāo)記)購(gòu)自JacksonImmunoResearch；Donkey anti-hu IgM，F(xiàn)c5ufragment R-PE(驢抗人IgM，F(xiàn)c5u段，R-PE標(biāo)記)購(gòu)自JacksonImmunoResearch；R-Phycoerythrin-AffiniPure Goat Anti-Human Serum IgA，alpha Chain Specific(羊抗人IgA，α鏈，R-PE標(biāo)記)購(gòu)自Jackson ImmunoResearch。
多色微球液相芯片的制備本實(shí)施例所使用的多色微球?yàn)長(zhǎng)uminex公司的偶聯(lián)羥基及親和素的多色微球，每種天然的或基因工程抗原包被于不同的偶聯(lián)羥基微球，而化學(xué)合成的多肽(系列表中1-32)包被于偶聯(lián)有親和素的微球。其實(shí)驗(yàn)操作步驟如下包被天然或基因工程抗原取出0.5ml(含有1.25×106個(gè)微球)偶聯(lián)羥基的多色微球放入1.5ml進(jìn)口光滑Ep管中，室溫離心12000rpm，4min；棄上清，重懸于80μl activation buffer(10mM NaH2PO4，pH6.3)中；加入10μl 50mg/ml S-NHS、10μl 50mg/ml EDC，混勻，室溫避光孵育20min；離心，12000rpm，4min；棄上清，用coupling buffer(10mM NaH2PO4，150mM NaCl，pH6.3)洗2次，每次200μl，12000rpm，4min；加入終濃度50-200μg/ml的對(duì)應(yīng)的一種抗原(上述39種抗原中的任一種)250μl，混勻，室溫避光反應(yīng)2hr；離心，12000rpm，4min，棄上清；用wash buffer(PBS，0.05％Tween-20，pH 7.4)500μl洗2次，12000rpm，4min離心；加入blocking buffer(PBS，1％BSA，0.05％NaN3，pH 7.4)200μl，室溫，搖床搖30min；離心，12000rpm，4min，棄上清；加入storage buffer(PBS，1％BSA，0.05％NaN3，pH 7.4)500μl，4℃保存?zhèn)溆?；包被合成多肽取?.3ml偶聯(lián)親和素的多色微球放入1.5ml進(jìn)口光滑Ep管中；加入300μl 10μg/ml的多肽，4℃避光過(guò)夜；12000rpm，4min，棄上清；用洗脫緩沖液1000μl洗3次，離心，12000rpm，4min；加入storage buffer 500μl；取10μl涂于計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)；4℃保存?zhèn)溆谩?br> 檢測(cè)血清EB病毒抗體步驟如下血清樣本用含1％BSA的1×PBS緩沖液以20∶1稀釋血清樣本；Millipore板每個(gè)檢測(cè)孔加入稀釋后的血清樣本20μl；每種包被有抗原或合成多肽的多色微球以storage buffer稀釋到多色微球個(gè)數(shù)為1000-1500個(gè)/50μl；每孔加入50μl稀釋好的多色微球；室溫遮光孵育30min；用wash buffer洗脫3次；加入PE標(biāo)記的抗人IgA或IgG或IgM，室溫，遮光靜置30min；Luminex多功能液相芯片分析儀讀取數(shù)值。
數(shù)據(jù)分析每個(gè)樣本測(cè)兩次，取平均值，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異及ROC曲線(xiàn)分析，其結(jié)果如表1。ROC曲線(xiàn)下面積在0.5-0.7間說(shuō)明診斷效果較差，0.7-0.9間診斷效果中等，大于0.9則診斷效果較好。我們選取ROC曲線(xiàn)下面積在0.7以上、靈敏度和特異度均可以達(dá)到70％以上的作為檢測(cè)指標(biāo)，如果ROC曲線(xiàn)下面積大于0.7，則其可以作為診斷鼻咽癌的指標(biāo)，進(jìn)而對(duì)其靈敏度和特異度進(jìn)行評(píng)價(jià)，找出最佳交叉點(diǎn)作為其臨界值。
在所述多色微球液相芯片試劑盒的應(yīng)用中，被檢血清的每個(gè)指標(biāo)結(jié)果可與其相對(duì)應(yīng)的參考臨界值作比較，用以輔助鼻咽癌的早期診斷。本發(fā)明的所有診斷價(jià)值高的指標(biāo)均可自由組合，用于不同的檢測(cè)目的，不同組合所對(duì)應(yīng)的判別函數(shù)不同。例如，對(duì)于EA-D/IgA和EBNA-1/IgA的檢測(cè)熒光強(qiáng)度平均值，可代入判別分析函數(shù)，Y1＝0.000×EA-D/IgA+0.001×EBNA1/IgA-4.323；Y2＝3.475×10-5EA-D/IgA+0.000×EBNA1/IgA-1.221。若Y1＞Y2，則疑為鼻咽癌，需進(jìn)一步進(jìn)行檢查；若Y2＞Y1，則為健康者。
本實(shí)施例對(duì)上述39種抗原均進(jìn)行了鼻咽癌病人及健康志愿者血清學(xué)IgA、IgG檢測(cè)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異及ROC曲線(xiàn)分析，其結(jié)果如表1和表2。ROC曲線(xiàn)下面積在0.5-0.7間說(shuō)明診斷效果較差，0.7-0.9間診斷效果中等，大于0.9則診斷效果較好。我們選取ROC曲線(xiàn)下面積在0.7以上、靈敏度和特異度均可以達(dá)到70％以上的作為檢測(cè)指標(biāo)，包括天然成分或基因工程類(lèi)，EA-D/IgA、EA-D/IgG、EBNA-1/IgA、EBNA-1 fragment/IgA、VCA/IgA、lysate/IgA、lysate/IgG、lysate/IgM、p18/IgA、p23/IgA；多肽類(lèi)，p47/54/IgA、p47/54/IgG、EBNA-1/IgA、p18/IgA、gp78/IgA、gp78/IgG、dUTPase/IgG、EBNA-LP/IgG、EBNA-2/IgG、p143/IgG、Rta/IgG?？梢宰鳛樵\斷指標(biāo)的IgA共11種，IgG共10種，IgM 3種。
表1.液相芯片技術(shù)檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體在鼻咽癌和健康人中統(tǒng)計(jì)學(xué)分析




表2.EB病毒抗原抗體作為診斷鼻咽癌指標(biāo)的臨界值、敏感度、特異度


本發(fā)明利用液相芯片技術(shù)的高通量特點(diǎn)，檢測(cè)了多種抗EB病毒抗原抗體在鼻咽癌病人和健康人中的分布，篩選到了有診斷價(jià)值的抗原抗體，并建立了同時(shí)檢測(cè)多種EB病毒抗原/抗體的試劑盒。試劑盒在對(duì)鼻咽癌高危人群篩查中，可以提高鼻咽癌的早發(fā)現(xiàn)率，使患者及時(shí)采取治療措施，進(jìn)而提高其生存率和生活質(zhì)量。
系列表<110>中山大學(xué)腫瘤防治中心<120>檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒及其制備方法<160>37<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>17<212>PRT<213>EB病毒<400>1Thr Ala Pro Trp Val Pro Ser Gly Leu Phe Ala Asp Asp Glu Ser Thr Pro1 510 15<210>2<211>20<212>PRT<213>EB病毒<400>2Leu Arg Ser Pro Glu Thr Glu Ala Phe Val Arg Asn Leu Asp Arg Pro Pro Gln Met Pro15 10 15 20<210>3<211>18<212>PRT<213>EB病毒<400>3Asp Trp Ala Gly Leu Ser Lys Val Ile Ser Asp Phe Glu Arg Gly Asn Arg Asp15 10 15<210>4<211>18<212>PRT
<213>EB病毒<400>4Arg Lys Cys Gln Glu Asp Glu Ser Pro Glu Asn Glu Arg His Glu Asn Phe Tyr15 10 15<210>5<211>18<212>PRT<213>EB病毒<400>5Phe Leu Arg Pro Asn Lys Gly Leu Leu Lys Lys Pro Asp Lys Glu Tyr Leu Arg15 10 15<210>6<211>20<212>PRT<213>EB病毒<400>6Asp Asn Asn Ser Gly Ala Ala Leu Ser Val Leu Gln Asn Phe Thr Ala Arg Pro Pro Phe15 10 15 20<210>7<211>19<212>PRT<213>EB病毒<400>7Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp Pro Tyr Gln Val15 10 15<210>8<211>17<212>PRT<213>EB病毒<400>8
Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu15 10 15<210>9<211>20<212>PRT<213>EB病毒<400>9Arg Lys Arg Thr Ser Ser Glu Ala Arg Gln Lys Gln Lys His Pro Lys Lys Val Lys Gln1 5 10 15 20<210>10<211>18<212>PRT<213>EB病毒<400>10Gly Ser Gly Pro Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser1 5 10 15<210>11<211>19<212>PRT<213>EB病毒<400>11Ala Arg Asp Arg Phe Pro Gly Leu Arg Arg Arg Arg Tyr His Asp Pro Glu Thr Ala15 10 15<210>12<211>17<212>PRT<213>EB病毒<400>12Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
15 1015<210>13<211>18<212>PRT<213>EB病毒<400>13Thr Glu Ala Gln Asp Gln Phe Tyr Ser Tyr Thr Cys Asn Ala Asp Thr Phe Ser15 10 15<210>14<211>20<212>PRT<213>EB病毒<400>14His His Ala Glu Met Gln Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile Lys15 10 15 20<210>15<211>19<212>PRT<213>EB病毒<400>15Leu Thr His Gln Ser Thr Pro Asn Asp Pro Asp Ser Pro Glu Pro Arg Ser Pro Thr15 10 15<210>16<211>19<212>PRT<213>EB病毒<400>16Met Asp Lys Asp Arg Pro Gly Pro Pro Ala Leu Asp Asp Asn Met Glu Glu Glu Val15 10 15<210>17
<211>19<212>PRT<213>EB病毒<400>17Ala Pro Gln Ala Pro Tyr Gln Gly Tyr Gln Glu Pro Pro Ala Pro Gln Ala Pro Tyr15 10 15<210>18<211>20<212>PRT<213>EB病毒<400>18Arg Arg His Arg Ser Pro Ser Pro Thr Arg Gly Gly Gln Glu Pro Arg Arg Val Arg Arg1 5 10 15 20<210>19<211>21<212>PRT<213>EB病毒<400>19Arg Glu Glu Gln Asn Glu Arg Ser Pro Ala Glu Gln Met Pro Pro Arg Pro Met Glu Pro1 5 10 15 20Ala<210>20<211>18<212>PRT<213>EB病毒<400>20Glu Asp Asp Gly Gln Arg Pro Asp Asp Glu Pro Arg Tyr Thr Tyr Trp Gln Leu1 5 10 15<210>21<211>22<212>PRT
<213>EB病毒<400>21Tyr Ser Pro Lys Asp Glu Gln Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Asp His Leu Lys Thr Asn15 10 15 20Arg Asp<210>22<211>20<212>PRT<213>EB病毒<400>22Ala Pro Arg Asp Arg Arg Glu Thr Tyr Ser Leu Gln His Arg Arg Pro Asn His Met Asn1 5 10 15 20<210>23<211>18<212>PRT<213>EB病毒<400>23Leu Arg Gly Thr Asn Asn Asp Pro Arg Pro Gln Arg Gln Glu Arg Ala Arg Glu1 5 10 15<210>24<211>22<212>PRT<213>EB病毒<400>24Gly Pro Arg Glu Asp Thr Asn Pro Gln Gln Pro Thr Thr Glu Gly His His Arg Gly Lys1 5 101520Lys Leu<210>25<211>18<212>PRT
<213>EB病毒<400>25Leu Gln Asn Gln Arg Arg Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Pro Ser Glu Leu Lys Ile1 5 10 15<210>26<211>19<212>PRT<213>EB病毒<400>26Thr Ser Thr Ser His Arg Pro His Arg Arg Pro Val Ser Lys Arg Pro Thr His Lys15 10 15<210>27<211>13<212>PRT<213>EB病毒<400>27Cys Val Gly Lys Asn Asp Lys Glu Glu Ala His Gly Val15 10<210>28<211>22<212>PRT<213>EB病毒<400>28Arg Ser Thr Arg Lys Gln Ala Arg Gln Glu Arg Ser Gln Arg Pro Leu Pro Asn Lys Pro1 5 10 15 20Trp Phe<210>29<211>21<212>PRT<213>EB病毒
<400>29Pro Thr Pro Pro Asn Asp Glu Glu Arg Glu Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu15 10 15 20Asp<210>30<211>25<212>PRT<213>EB病毒<400>30Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg15 10 15 20Gly Arg Glu Ala Lys25<210>31<211>23<212>PRT<213>EB病毒<400>31Arg Gln Gln Arg Pro Ala Asp Pro Ala Leu Arg Arg Leu Met His Pro His His Arg Asn15 10 15 20Tyr Thr Ala<210>32<211>17<212>PRT<213>EB病毒<400>32Pro Ile Arg Arg His Arg Thr Arg Glu Thr Arg Arg Met Arg Gly Ser His15 10 15<210>33<211>404<212>PRT<213>EB病毒
<400>33Met Glu Thr Thr Gln Thr Leu Arg Phe Lys Thr Lys Ala Leu Ala Val Leu Ser Lys Cys15 10 15 20Tyr Asp His Ala Gln Thr His Leu Lys Gly Gly Val Leu Gln Val Asn Leu Leu Ser Val25 30 35 40Asn Tyr Gly Gly Pro Arg Leu Ala Ala Val Ala Asn Ala Gly Thr Ala Gly Leu Ile Ser45 50 50 60Phe Glu Val Ser Pro Asp Ala Val Ala Glu Trp Gln Asn His Gln Ser Pro Glu Glu Ala65 70 75 80Pro Ala Ala Val Ser Phe Arg Asn Leu Ala Tyr Gly Arg Thr Cys Val Leu Gly Lys Glu85 90 95 100Leu Phe Gly Ser Ala Val Glu Gln Ala 5er Leu Gln Phe Tyr Lys Arg Pro Gln Gly Gly105 110 115 120Ser Arg Pro Glu Phe Val Lys Leu Thr Met Glu Tyr Asp Asp Lys Val Ser Lys Ser His125 130 135 140His Thr Cys Ala Leu Met Pro Tyr Met Pro Pro Ala Ser Asp Arg Leu Arg Asn Glu Gln145 150 155 160Met Ile Gly Gln Val Leu Leu Met Pro Lys Thr Ala Ser Ser Leu Gln Lys Trp Ala Arg165 170 175 180Gln Gln Gly Ser Gly Gly Val Lys Val Thr Leu Asn Pro Asp Leu Tyr Val Thr Thr Tyr185 190 195 200Thr Ser Gly Glu Ala Cys Leu Thr Leu Asp Tyr Lys Pro Leu Ser Val Gly Pro Tyr Glu205 210 215 220Ala Phe Thr Gly Pro Val Ala Lys Ala Gln Asp Val Gly Ala Val Glu Ala His Val Val225 230 235 240Cys Ser Val Ala Ala Asp Ser Leu Ala Ala Ala Leu Ser Leu Cys Arg Ile Pro Ala Val245 250 255 260Ser Val Pro Ile Leu Arg Phe Tyr Arg Ser Gly Ile Ile Ala Val Val Ala Gly Leu Leu265 270 275 280Thr Ser Ala Gly Asp Leu Pro Leu Asp Leu Ser Val Ile Leu Phe Asn His Ala Ser Glu285 290 295 300Glu Ala Ala Ala Ser Thr Ala Ser Glu Pro Glu Asp Lys Ser Pro Arg Val Gln Pro Leu305 310 315 320Gly Thr Gly Leu Gln Gln Arg Pro Arg His Thr Val Ser Pro Ser Pro Ser Pro Pro Pro325 330 335 340Pro Pro Arg Thr Pro Thr Trp Glu Ser Pro Ala Arg Pro Glu Thr Pro Ser Pro Ala Ile345 350 355 360Pro Ser His Ser Ser Asn Thr Ala Leu Glu Arg Pro Leu Ala Val Gln Leu Ala Arg Lys365 370 375 380Arg Thr Ser Ser Glu Ala Arg Gln Lys Gln Lys His Pro Lys Lys Val Lys Gln Ala Phe385 390 395 400Asn Pro Leu Ile<210>34
<211>181<212>PRT<213>EB病毒<400>34Gln Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu Lys Gly Asp Thr15 10 15 20Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly25 30 35 40Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser45 50 50 60Gly Ser Gly Pro Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile65 70 75 80Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr85 90 95 100His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly105 110 115 120Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly125 130 135 140Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys145 150 155 160Phe Glu Asn Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg Thr165 170 175 180Thr<210>35<211>119<212>PRT<213>EB病毒<400>35Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala Asp Phe Pro Asp1 5 10 15 20Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe25 30 35 40Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr45 50 50 60Val Gln Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala65 70 75 80Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln85 90 95 100Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser105 110 115
<210>36<211>162<212>PRT<213>EB病毒<400>36Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp Met Ser Met Glu15 10 15 20Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val25 30 35 40Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro45 50 50 60Glu Pro Leu Thr Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala65 70 75 80Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr85 90 95 100Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu105 110 115 120Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro125 130 135 140Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile145 150 155 160Ser Asp<210>37<211>641<212>PRT<213>EB病毒<400>37Gln Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu Lys Gly Asp Thr15 10 15 20Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly25 30 35 40Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser45 50 50 60Gly Ser Gly Pro Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile65 70 75 80Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala85 90 95 100Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly105 110 115 120
Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly125 130 135 140Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly145 150 155 160Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly165 170 175 180Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly185 190 195 200Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala205 210 215 220Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala225 230 235 240Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly245 250 255 260Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala265 270 275 280Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala285 290 295 300Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly305 310 315 320Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly325 330 335 340Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg345 350 355 360Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg365 370 375 380Pro Arg Ser Pro Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro385 390 395 400Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr His Gln Glu405 410 415 420Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp425 430 435 440Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys445 450 455 460Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn465 470 475 480Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg Thr Thr Asp Glu485 490 495 500Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu505 510 515 520Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro525 530 535 540Phe Gly Met Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys545 550 555 560Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys Asp Ala Ile Lys565 570 575 580Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe
585 590 595 600Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu605 610 615 620Gly Asp Asp Gly Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln625 630 635 640Glu
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒，其特征是，主要包括有至少一種包被有合成多肽的偶聯(lián)親和素的多色微球，和/或至少一種以上包被有天然的和/或基因工程抗原的偶聯(lián)羥基多色微球；其中，天然抗原是EB病毒總抗原裂解物或殼抗原VCA；基因工程抗原是系列表中NO.33～NO.37中的任一種的氨基酸系列；所述合成多肽是具有系列表中NO.1～NO.32中任一種的氨基酸系列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒，其特征是，每種合成多肽的氨基末端分別偶聯(lián)六個(gè)碳原子和生物素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒，其特征是，包括有分別包被有系列表中NO.9、NO.10、NO.12、NO.15、NO.18、NO.21、NO.23、NO.26或NO.30的合成多肽的偶聯(lián)有親和素的多色微球；和分別包被有EB病毒總抗原裂解物殼抗原VCA或系列表中NO.33～NO.37的氨基酸系列的偶聯(lián)羥基的多色微球。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒的方法，其特征是，主要包括以下步驟(1)包被天然的或基因工程抗原將共含有1.1×106個(gè)-1.3×106個(gè)微球的0.5ml偶聯(lián)羥基的多色微球放入Ep管中，室溫離心；棄上清，重懸于activation buffer中；加入10μl 50mg/mlS-NHS、10μl 50mg/ml EDC，混勻，室溫避光孵育30±15min；離心；棄上清，用coupling buffer洗滌，每次100-300μl，離心；加入任一終濃度50-200μg/ml的所述天然的或基因工程抗原中250μl，混勻，室溫避光反應(yīng)1--3hr；離心，棄上清；用wash buffer洗1-3次，12000rpm，4min離心；加入blocking buffer 200μl，微球終濃度為2000-2500個(gè)/μl，，室溫，搖床搖30±15min；離心，棄上清；得到天然的或基因工程抗原包被于不同的偶聯(lián)羥基微球；和/或(2)包被合成多肽取出0.1-0.4ml偶聯(lián)親和素的多色微球放入Ep管中；加入任一等體積的storage buffer稀釋的終濃度為8-12μg/ml的合成多肽，4℃避光過(guò)夜；離心，棄上清；用洗脫緩沖液洗1-5次，離心，；加入storage buffer 200-500μl，微球終濃度為1200-1500個(gè)/μl，；得到多肽包被的偶聯(lián)有親和素的微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征是主要包括以下步驟(1)包被天然的或基因工程抗原將共含有1.1×106個(gè)-1.3×106個(gè)多色微球的0.5ml偶聯(lián)羥基的多色微球放入Ep管中，室溫離心；棄上清，重懸于activation buffer中；加入10μl 50mg/mlS-NHS、10μl 50mg/ml EDC，混勻，室溫避光孵育30±15min；離心；棄上清，用coupling buffer洗滌，每次100-300μl，離心；加入任一終濃度20-200μg/ml的所述天然的或基因工程抗原中250μl，混勻，室溫避光反應(yīng)1--3hr；離心，棄上清；用wash buffer洗1-3次，12000rpm，4min離心；加入blocking buffer 200μl，多色微球終濃度為2000-2500個(gè)/μl，室溫，搖床搖30±15min；離心，棄上清；得到天然的或基因工程抗原包被于不同的偶聯(lián)羥基微球；和/或(2)包被合成多肽取出0.1-0.4ml偶聯(lián)親和素的多色微球放入Ep管中；加入任一等體積的storage buffer稀釋的終濃度為10μg/ml的合成多肽，4℃避光過(guò)夜；離心，棄上清；用洗脫緩沖液洗1-5次，離心，；加入storage buffer 200-500μl，多色微球的終濃度為1200-1500個(gè)/μl，得到多肽包被的偶聯(lián)有親和素的微球。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒及其制備方法，該試劑盒主要包括有至少一種包被有合成多肽的偶聯(lián)親和素的多色微球，和/或至少一種以上包被有天然的和/或基因工程抗原的偶聯(lián)羥基多色微球；其中，天然抗原是EB病毒總抗原裂解物或殼抗原VCA；基因工程抗原是系列表中No.33～No.37中的任一種的氨基酸系列；所述合成多肽是具有系列表中No.1～No.32中任一種的氨基酸系列。它可適用于人群的篩查鼻咽癌的高發(fā)性評(píng)估診斷以及預(yù)后效果評(píng)價(jià)觀察，可以直接應(yīng)用于早期診斷鼻咽癌判斷患者預(yù)后狀況等方面。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101063683SQ20071002784
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者曾益新, 谷愛(ài)娣, 謝彥博 申請(qǐng)人:中山大學(xué)腫瘤防治中心