專利名稱：：一種測(cè)定血清中鎂含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血清中鎂含量的測(cè)定，具體的說(shuō)是一種血清中鎂含量測(cè)定的方法。
背景技術(shù)：
：鎂是生命過(guò)程所必需的元素，對(duì)動(dòng)植物的許多生理機(jī)能起著重要的作用，主要表現(xiàn)在①鎂對(duì)心臟活動(dòng)具有重要的調(diào)節(jié)作用它通過(guò)對(duì)心肌的抑制，使心臟的節(jié)律和興奮傳導(dǎo)減弱，從而有利于心臟的舒張與休息；②鎂對(duì)心血管系統(tǒng)亦有很好的保護(hù)作用它可減少血液中膽固醇的含量，防止動(dòng)脈硬化，同時(shí)還能擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加心肌供血量，進(jìn)而有利于預(yù)防高血壓及心肌梗塞；③鎂也具有使神經(jīng)和肌肉正常運(yùn)作的功能，因此能協(xié)助抵抗憂郁癥，解除肌肉痙攣；④鎂離子是許多酶的激活劑如生命賴以生存的氧化磷酸化酶的代謝就必須有鎂的參與才能進(jìn)行；⑤在生物學(xué)上，鎂的作用也極為重要因?yàn)樗侨~綠素分子的核心原子，葉綠素結(jié)構(gòu)以鎂原子鋏狀結(jié)合為其分子的母核，此鎂原子鋏狀結(jié)合具有強(qiáng)力催化作用。鎂元素含量的分析測(cè)定除了經(jīng)典的靜態(tài)平衡體系測(cè)定方法外，目前比較集中的領(lǐng)域是流動(dòng)態(tài)非平衡體系的測(cè)定方法。非平衡態(tài)測(cè)定體系的誕生顛覆了支撐化學(xué)學(xué)科的四大平衡理論，使科研工作者重新審視評(píng)價(jià)化學(xué)反應(yīng)以及化學(xué)學(xué)科，同時(shí)也豐富了化學(xué)學(xué)科。流動(dòng)態(tài)非平衡體系是指在流動(dòng)注射(文獻(xiàn)1:RuzickaJ，HansenEH，F(xiàn)lowinjectionanalyses:PartI.Anewconceptoffastcontinuousflowanalysis,AnalyticaChimicaActa，78(1975):145-157)分析技術(shù)，以及在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第二代順序注射(文獻(xiàn)2:RuzickaJ，MarshallGD，Sequentialinjection:anewconceptforchemicalsensors,processanalysisandlaboratoryassays,AnalyticaChimicaActa,237(1990):329-343)和第三代順序注射-"閥上實(shí)驗(yàn)室"(文獻(xiàn)3:WangJH，HasenEH，Sequentialinjectionlab-on-valve:thethirdgenerationofflowinjectionanalysis,TrACTrendsinAnalyticalChemistry,22(2003):225-231)分析技術(shù)。例如使用流動(dòng)注射-原子吸收光譜法(文獻(xiàn)4:ZikriArslan，JulianF.Tyson,Determinationofcalcium,magnesiumandstrontiuminsoilsbyflowinjectionflameatomicabsorptionspectrometry,Talanta，50(1999):929-937)和順序注射-熒光光度法(文獻(xiàn)5:ArmasG,CladeraA,BecerraE，EstelaJM,CerdSV，F(xiàn)luorimetricsequentialinjectiondeterminationofmagnesiumusing8-hydroxiquinoline-5-sulfonicacidinamicellarmedium,，Talanta,52(2000):77-82)測(cè)定水中的鎂。查閱大量文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，使用流動(dòng)注射進(jìn)樣系統(tǒng)與監(jiān)測(cè)器聯(lián)用測(cè)定血清和全血中鎂含量的研究有一些，而使用順序注射進(jìn)樣系統(tǒng)和順序注射-"閥上試驗(yàn)室"進(jìn)樣系統(tǒng)則一篇沒有。本發(fā)明就是利用順序注射進(jìn)樣系統(tǒng)與熒光分光光度計(jì)聯(lián)用，探索出順序注射體系下測(cè)定血清中鎂含量的最佳實(shí)驗(yàn)條件，人血清樣品回收率實(shí)驗(yàn)以及牛血清標(biāo)準(zhǔn)參考物對(duì)照實(shí)驗(yàn)都取得了良好的結(jié)果，為順序注射流動(dòng)體系下測(cè)定血清中鎂元素含量開辟了新的道路。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是找到在順序注射-熒光光度分析體系中測(cè)定鎂含量的最佳條件。以鎂與8-羥基喹啉-5-磺酸(HQS)在堿性溶液中反應(yīng)可以產(chǎn)生熒光為基礎(chǔ)，乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)作為掩蔽劑，十六烷基三甲基氯化銨(HTAC)為增敏劑，將順序注射分析與熒光光度檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，建立了測(cè)定血清樣品中鎂含量的靈敏的自動(dòng)分析方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的試驗(yàn)技術(shù)方案如下一種測(cè)定血清中鎂含量的方法，采用順序注射的方式與熒光分光光度計(jì)聯(lián)用測(cè)定血清中鎂含量，1)a.順序注射的進(jìn)樣順序?yàn)橄任胧榛谆然@(HTAC)/乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入8-羥基喹啉-5-磺酸(HQS)/緩沖溶液；各溶液的濃度分別為HTAC溶液質(zhì)量濃度0.1-0.25%，EGTA溶液3-10><l(r3mol/l，HQS溶液0.5-2.5x10—3mol/l，緩沖體系為pH=10.0的硼砂-硼酸-KCl溶液；進(jìn)樣體積均為150pl;系統(tǒng)流速為1.75-2.5ml/min;b.對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)定；血清樣品按1-20倍的體積稀釋比例逐級(jí)稀釋，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；c.采用步驟a的操作條件對(duì)質(zhì)量濃度為8-1200ng/ml鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)鎂質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)從該曲線上找到所測(cè)血清樣品的相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的鎂質(zhì)量濃度；以鎂質(zhì)量濃度在45-75ng/ml范圍內(nèi)的測(cè)定結(jié)果為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其值準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)①本方法引入了順序注射進(jìn)樣系統(tǒng)，使樣品和試劑的混合完全由軟件控制，操作簡(jiǎn)單方便，大大減少了操作中的人為干擾。②本方法試樣和試劑的消耗量很小，適用于長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和試劑或試樣昂貴或來(lái)源受到限制的分析。③本方法靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速。在采樣頻率為60樣/小時(shí)的分析速度下，對(duì)500ng/ml的M^+標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%，對(duì)20ng/ml的Mg^標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%。④本方法實(shí)現(xiàn)了熒光分光光度法與順序注射進(jìn)樣技術(shù)相結(jié)合用于血清中鎂離子濃度的測(cè)定，為測(cè)定血清中的鎂元素含量建立了新的分析方法。圖1為1號(hào)人血清樣品鎂含量與回收率的關(guān)系圖；圖2為2號(hào)人血清樣品鎂含量與回收率的關(guān)系圖。具體實(shí)施方式發(fā)明綜述1)順序注射是在流動(dòng)注射的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，雖然它們都是在流動(dòng)非平衡體系中依靠?jī)x器的穩(wěn)定性，高重現(xiàn)性完成對(duì)樣品的測(cè)定過(guò)程，但不同的是，流動(dòng)注射機(jī)理是試樣區(qū)帶和試劑區(qū)帶在蠕動(dòng)泵的驅(qū)動(dòng)下來(lái)回往復(fù)運(yùn)動(dòng)，于管道中完成混合和反應(yīng)過(guò)程，可以說(shuō)使用流動(dòng)注射進(jìn)樣，溶液區(qū)帶之間的混合和重疊非常充分，稀釋過(guò)程也非常充分，同樣使用流動(dòng)注射在線完成試樣的稀釋目前也在廣泛的應(yīng)用中。而由于順序注射硬件特點(diǎn)不能像流動(dòng)注射一樣采用匯合流的方式完成試樣與試劑的混合和反應(yīng)過(guò)程，而是需要順序的吸入試樣與試劑，再反方向推向監(jiān)測(cè)器，使試樣和試劑區(qū)帶在管道中停留的時(shí)間很短，因此使用順序注射進(jìn)樣時(shí)，試樣與試劑區(qū)帶的混合、反應(yīng)以及稀釋程度都較流動(dòng)注射要小很多，測(cè)定黏度比較大的樣品時(shí)比較難。而順序注射一"閥上實(shí)驗(yàn)室"進(jìn)樣系統(tǒng)中，試樣與試劑區(qū)帶流經(jīng)的管道距離更小，更不利于反應(yīng)的發(fā)生和血液的稀釋，測(cè)定難度更大。這也是為什么目前使用流動(dòng)注射結(jié)合監(jiān)測(cè)裝置測(cè)定血清以及全血中鎂含量的文章有一些，但是使用順序注射和順序注射一"閥上實(shí)驗(yàn)室"測(cè)定血清以及全血中鎂含量的文章卻沒有。2)血清中含有大量的蛋白質(zhì)等有機(jī)物，粘度大，雖然順序注射進(jìn)樣技術(shù)對(duì)樣品有稀釋作用，但是如果樣品本身的稀釋程度不夠，測(cè)定結(jié)果依舊不理想。如果稀釋程度小，血清黏度很大，在較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)不易被顯色劑區(qū)帶滲透，反應(yīng)程度受到抑制，測(cè)定結(jié)果偏??；另外，稀釋倍數(shù)小，血清中鎂含量增大，干擾物質(zhì)的濃度也很大，在它們同時(shí)與顯色劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的過(guò)程中，由于各反應(yīng)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的差異，使得干擾離子對(duì)結(jié)果的影響影響很大，測(cè)定結(jié)果偏小很多，且有隨著稀釋倍數(shù)減小，測(cè)定值偏離參考值越嚴(yán)重的情況。但是如果稀釋倍數(shù)過(guò)大，血清黏度很小，但是鎂含量也很小，在固定進(jìn)樣量的情況下，掩蔽劑對(duì)鎂的掩蔽作用就不能忽略掉，況且各干陽(yáng)離子與顯色劑反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)條件不盡相同，也會(huì)使測(cè)定偏離正常值。因此可以看出，使用該方法對(duì)血清中鎂含量進(jìn)行測(cè)定，一定會(huì)存在一個(gè)最佳稀釋倍數(shù)或范圍，使得血清黏度適當(dāng)，與試劑區(qū)帶的滲透充分，其中的干擾離子對(duì)測(cè)定不產(chǎn)生干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。偏離該點(diǎn)或該范圍都會(huì)使測(cè)定結(jié)果較參考值低。3)對(duì)血清樣品的逐級(jí)稀釋發(fā)現(xiàn)，只有稀釋一定倍數(shù)，才能得到令人滿意的測(cè)定結(jié)果。對(duì)人血清樣品來(lái)說(shuō)，稀釋倍數(shù)在200-240和200-250倍，稀釋后鎂離子濃度在45-60ng/ml和60-75ng/ml范圍內(nèi)測(cè)定結(jié)果良好。牛血清標(biāo)準(zhǔn)品是固體樣品，和液體樣品的稀釋概念不同，以其被定容的體積作為稀釋倍數(shù)。當(dāng)牛血清被稀釋750-1000倍時(shí)，其中鎂離子濃度在44-60ng/ml范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果良好。無(wú)論是人血清還是牛血清，雖然稀釋倍數(shù)有差別，但是鎂離子含量卻相差不大，這也驗(yàn)證了在測(cè)定血清過(guò)程中會(huì)存在一個(gè)最好稀釋范圍或鎂離子濃度范圍的論證，為流動(dòng)非平衡體系中，相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)測(cè)定血清中鎂含量提供了借鑒依據(jù)。4)血清中鎂含量的測(cè)定為了驗(yàn)證所建立方法的可靠性，申請(qǐng)人做了測(cè)定人血清中鎂離子的回收率試驗(yàn)以及牛血清標(biāo)準(zhǔn)品中鎂離子含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例l在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，即進(jìn)樣順序?yàn)橄任際TAC/EGTA溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入HQS/緩沖溶液；各溶液的濃度分別為HTAC溶液0.15%(w/w)，EGTA溶液7x10—3mol/l，HQS溶液1.0xl(r3mol/l;進(jìn)樣體積均為15(Hil;系統(tǒng)流速為2.5ml/min;以60樣/h的實(shí)驗(yàn)頻率對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)定，包括測(cè)定人血清樣品中鎂離子的回收率以及牛血清標(biāo)準(zhǔn)品中鎂離子的含量。(pH40.0的緩沖體系根據(jù)按照克拉克-魯布斯緩沖溶液的配制方法配制，即0.2mol/l的NaOH溶液43.9ml，0.2mol/l的硼酸(12.405克H3BO3+14.912克KCl/升)50.00ml定容至200ml容量瓶中。)①人血清中鎂離子回收率的測(cè)定人血清樣品采自東北大學(xué)醫(yī)院，均為當(dāng)日采集，處理和離心的血清。測(cè)定血清中鎂離子回收率的試驗(yàn)過(guò)程是先做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定血清中鎂離子含量，另取一份血清樣品，向該樣品中加入一定濃度的鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定該混合溶液的總的鎂離子含量，兩相相減的差值與加入的鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的比值，就是該樣品中鎂的回收率。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟是在上述最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)一系列濃度的鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，750ng/ml，1000ng/ml，1200ng/ml。以測(cè)得的相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)鎂質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程為AF=1.403+0.0123xC，相關(guān)系數(shù)11=0.9994(11=7)。通過(guò)測(cè)定血清中鎂離子回收率發(fā)現(xiàn)，血清樣品稀釋倍數(shù)對(duì)樣品回收率有很大影響，結(jié)果見圖1和圖2。稀釋倍數(shù)偏大偏小都不能得到很好的回收率結(jié)果，只有稀釋倍數(shù)在一定范圍內(nèi)，回收率結(jié)果誤差才能小于5%。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1號(hào)人血清樣品稀釋倍數(shù)在200-250倍之間，回收率結(jié)果為97-99%，2號(hào)人血清樣品稀釋倍數(shù)在200-240倍之間，回收率結(jié)果為99-102%。具體操作步驟如下1)優(yōu)化試驗(yàn)使用單因素優(yōu)化試驗(yàn)方法對(duì)試驗(yàn)所需參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到各項(xiàng)參數(shù)的最佳值，結(jié)果見表l。表l單因素優(yōu)化結(jié)果對(duì)照表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2)共存物質(zhì)的影響在測(cè)定結(jié)果允許誤差不超過(guò)一5%的范圍內(nèi)，對(duì)lpg/ml的Mg"進(jìn)行測(cè)定，各物質(zhì)允許存在倍數(shù)如表2所示。表2各中共存物質(zhì)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3)分析性能在上述經(jīng)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，即進(jìn)樣順序?yàn)橄任際TAC/EGTA溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入HQS/緩沖溶液；各溶液的濃度分別為HTAC溶液0.15%(w/w)，EGTA溶液7x10—3mol/l，HQS溶液1.0xl(T3mol/l;進(jìn)樣體積均為15(Hil;系統(tǒng)流速為2.5ml/min;以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)Mg^質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，回歸方程為AF=1.403+0.0123xC，相關(guān)系數(shù)R=0.9994(n=7)，線性響應(yīng)范圍為8-1200ng/ml。在采樣頻率為60樣/小時(shí)的分析速度下，對(duì)500ng/ml的Mg^標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%，以二次去離子水代替Mg^標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行l(wèi)l次平行測(cè)定，以測(cè)定結(jié)果的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的濃度作為檢出限，結(jié)果為4ng/ml。4)人血清樣品中鎂離子的回收率試驗(yàn)先以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)鎂質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到一標(biāo)準(zhǔn)曲線△F=1.762+0.0129xC，相關(guān)系數(shù)R=0.9989(n=6)，線性區(qū)間上限為1200ng/ml，將血清樣品的測(cè)定結(jié)果帶入到方程中，求出該樣品所對(duì)應(yīng)的濃度。將血清樣品稀釋200倍進(jìn)行測(cè)定，另取一份樣品向其中加入一定量鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)行測(cè)定，將兩濃度的差值除以加入的鎂標(biāo)準(zhǔn)的濃度，得到該樣品鎂含量的回收率，結(jié)果見表4?；厥章式Y(jié)果誤差在5%范圍內(nèi)，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)條件下干擾離子對(duì)測(cè)定鎂含量不產(chǎn)生影響。表3人血清樣品中鎂含量的的回收率實(shí)驗(yàn)人血清樣品測(cè)得量(ng/ml)(n=3)加標(biāo)(ng/ml)測(cè)得總量(ng/ml)(n=4)回收(%)血清中含量(嗎/ml)人血清樣叩1人血清樣品274.9±14.0100172.7±10.597.814.98±2.8055.4±2.4200258.2±7.1101.411.08±0.48②牛血清標(biāo)準(zhǔn)品鎂含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)本文采用標(biāo)準(zhǔn)參考物(牛血清(凍干)成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)090006])對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該方法測(cè)定血清中Mg"含量的準(zhǔn)確性。1)牛血清標(biāo)準(zhǔn)品的前處理過(guò)程將凍干血清(2ml/瓶)轉(zhuǎn)移至小燒杯中，加少許硝酸(0.5mol/l)后，于恒溫電熱板(6(TC)加熱30min，待溶解成均勻無(wú)沉淀的液體后，用適量NaOH顆粒調(diào)節(jié)pH值至中性，定容至100ml容量瓶。對(duì)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋然后測(cè)定。2)測(cè)定條件上述最優(yōu)化試驗(yàn)條件即順序注射系統(tǒng)進(jìn)樣順序?yàn)橄任際TAC/EGTA溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入HQS/緩沖溶液；各溶液的濃度分別為HTAC溶液0.15Q/。(w/w)，EGTA溶液7xl(T3mol/l，HQS溶液1.0xl(T3mol/l;進(jìn)樣體積均為150^1;系統(tǒng)流速為2.5ml/min。對(duì)牛血清標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行的鎂含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了同樣的問題，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。標(biāo)準(zhǔn)參考物對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示了同樣的結(jié)果，稀釋倍數(shù)在750-1000倍，樣品的測(cè)定結(jié)果與參考值相符，稀釋倍數(shù)在該區(qū)間外，測(cè)定結(jié)果與參考值不符。表4牛血清樣品鎂離子濃度與鎂含量測(cè)定結(jié)果關(guān)系稀釋倍數(shù)參考濃度(ng/ml)測(cè)定濃度(ng/ml)400011.2±0.98.4±0.4200022.3±1.819.5±0.5100044.6±3.646.5±1.075059.5±4.861.6±0.850089.2±7.247.9±0.9400111.5±9.057.0±1.2其中稀釋1000倍，得到結(jié)果與參考值相符，說(shuō)明該方法測(cè)定血清中Mg^結(jié)果見表5。表5牛血清標(biāo)準(zhǔn)品中鎂的分析結(jié)果含量結(jié)果準(zhǔn)確可靠樣品編號(hào)測(cè)定值^g/ml)參考值(Mg/ml)[GBW(E)090006]23.3±0.522.3±1.8實(shí)施例2在改變的實(shí)驗(yàn)條件下，即進(jìn)樣順序?yàn)橄任際TAC/EGTA溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入HQS/緩沖溶液；各溶液的濃度分別為HTAC溶液0.25%(質(zhì)量濃度)，EGTA朵液7xl(T3mol/l，HQS溶液1.0x1(T3mol/l;進(jìn)樣體積均為150h1;系統(tǒng)流速為2.5ml/min;以60樣/h的實(shí)驗(yàn)頻率對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)定，包括測(cè)定人血清樣品中鎂離子的回收率以及牛血清標(biāo)準(zhǔn)品中鎂離子的含量。①人血清中鎂離子回收率的測(cè)定改變?cè)雒魟〩TAC的溶液濃度，其他條件不改變，測(cè)定血清中鎂離子含量的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加增敏劑的濃度，僅增大了相對(duì)熒光強(qiáng)度，況且標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度與樣品的測(cè)定值相應(yīng)增大，對(duì)樣品中鎂離子濃度的測(cè)定沒有影響。具體操作步驟如下先以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)鎂質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到一標(biāo)準(zhǔn)曲線AF=1.971+0.0127xC，相關(guān)系數(shù)R=0.9991(n=7)。將血清樣品的測(cè)定結(jié)果帶入到方程中，求出該樣品所對(duì)應(yīng)的濃度。將血清樣品稀釋200倍進(jìn)行測(cè)定，另取一份樣品向其中加入一定量鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)行測(cè)定，將兩濃度的差值除以加入的鎂標(biāo)準(zhǔn)的濃度，得到該樣品鎂含量的回收率，結(jié)果見表4?；厥章式Y(jié)果誤差在5°/。范圍內(nèi)，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)條件下干擾離子對(duì)測(cè)定鎂含量不產(chǎn)生影響。表4人血清樣品中鎂含量的的回收率實(shí)驗(yàn)人血清樣品(ng/ml)(n=3)加標(biāo)量(ng/ml)測(cè)得總量(ng/ml)(n=4)回收率血清中含量(Hg/ml)人血清樣人血清樣品274.4士10.355.5±2.6100200173.7士7.9253.4士7.499.314.88±2.0696.21U0士0.52②牛血清標(biāo)準(zhǔn)品鎂含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)使用上述條件及擬合方程測(cè)定稀釋1000倍的牛血清標(biāo)準(zhǔn)品，得到結(jié)果23.1士0.6與參考值相符，說(shuō)明改變?cè)雒魟〩TAC溶液濃度，測(cè)定血清中Mg2+含量結(jié)果依舊準(zhǔn)確可靠。說(shuō)明只減小增敏劑HTAC溶液濃度(質(zhì)量濃度1%)也不會(huì)改變血清樣品的測(cè)定結(jié)果，所以改變?cè)雒魟〩TAC溶液濃度不會(huì)改變血清樣品的測(cè)定結(jié)果。雖然目前對(duì)增敏劑的增敏劑的增敏機(jī)理尚處于研究階段，但是可以肯定的是，增敏劑無(wú)論是從改變外部環(huán)境改變熒光強(qiáng)度還是從參與化學(xué)組成改變絡(luò)合物本身的熒光效率，其對(duì)絡(luò)合物的增敏效果都有一適應(yīng)范圍，在該范圍內(nèi)測(cè)定血清中鎂含量都可行。實(shí)施例3改變掩蔽劑EGTA濃度，其他試驗(yàn)條件不變，即進(jìn)樣順序?yàn)橄任際TAC/EGTA溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入HQS/緩沖溶液；各溶液的濃度分別為HTAC溶液0.15%(w/w)，EGTA溶液3xl(T3mol/l，HQS溶液1.0xl(T3mol/l;進(jìn)樣體積均為150^1;系統(tǒng)流速為2.5ml/min;以60樣/h的實(shí)驗(yàn)頻率對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)定，包括測(cè)定人血清樣品中鎂離子的回收率以及牛血清標(biāo)準(zhǔn)品中鎂離子的含量。①人血清中鎂離子回收率的測(cè)定改變掩蔽劑EGTA濃度，其他試驗(yàn)條件不變，測(cè)定人血清樣品中鎂離子的回收率。試驗(yàn)結(jié)果顯示減小掩蔽劑的濃度，相對(duì)熒光強(qiáng)度稍微減小，對(duì)測(cè)定血清中鎂離子的回收率也沒有影響。具體操作步驟如下先以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)鎂質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到一標(biāo)準(zhǔn)曲線AF=1.535+0.0128xC，相關(guān)系數(shù)R=0.9992(n=7)。將血清樣品的測(cè)定結(jié)果帶入到方程中，求出該樣品所對(duì)應(yīng)的濃度。將血清樣品稀釋200倍進(jìn)行測(cè)定，另取一份樣品向其中加入一定量鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)行測(cè)定，將兩濃度的差值除以加入的鎂標(biāo)準(zhǔn)的濃度，得到該樣品鎂含量的回收率，結(jié)果誤差在5%范圍內(nèi)，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)條件下干擾離子對(duì)測(cè)定鎂含量不產(chǎn)生影響。②牛血清標(biāo)準(zhǔn)品鎂含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)使用上述條件及擬合方程測(cè)定稀釋1000倍的牛血清標(biāo)準(zhǔn)品，得到結(jié)果22.9±0.8與參考值相符，說(shuō)明改變掩蔽劑EGTA溶液濃度，測(cè)定血清中Mg2+含量結(jié)果依舊準(zhǔn)確可靠。說(shuō)明本方法使用乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)掩蔽Ca2+，兩種離子與EGTA的絡(luò)合常數(shù)差6個(gè)數(shù)量級(jí)，符合掩蔽劑的選擇性滴定原理。在優(yōu)化掩蔽劑濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，掩蔽劑濃度在3-10xl(^mol/l時(shí)，掩蔽劑對(duì)Ca"的掩蔽效果都非常理想，選擇7xl(T3mol/l作為最佳濃度，因?yàn)樵谠摑舛葍煞N絡(luò)合物相對(duì)熒光強(qiáng)度差值達(dá)到最大。而3xl(T3mol/l和10xl(^mol/l的濃度不會(huì)影響血清中鎂的測(cè)定結(jié)果。實(shí)施例4減小系統(tǒng)流速，其他試驗(yàn)條件不變，即進(jìn)樣順序?yàn)橄任際TAC/EGTA溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入HQS/緩沖溶液；各溶液的濃度分別為HTAC溶液0.15%(w/w)，EGTA溶液7xl(T3mol/l，HQS溶液1.0xl(T3mol/l;進(jìn)樣體積均為150nl;系統(tǒng)流速為1.75ml/min;以40樣/h的實(shí)驗(yàn)頻率對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)定，包括測(cè)定人血清樣品中鎂離子的回收率以及牛血清標(biāo)準(zhǔn)品中鎂離子的含量。①人血清中鎂離子回收率的測(cè)定改變系統(tǒng)流速，其他試驗(yàn)條件不變，測(cè)定人血清樣品中鎂離子的回收率。試驗(yàn)結(jié)果顯示減小系統(tǒng)流速，相對(duì)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但對(duì)測(cè)定血清中鎂離子的回收率也沒有影響。具體操作步驟如下先以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)鎂質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到一標(biāo)準(zhǔn)曲線AF=2.013+0.0128xC，相關(guān)系數(shù)R=0.9997(n=7)。將血清樣品的測(cè)定結(jié)果帶入到方程中，求出該樣品所對(duì)應(yīng)的濃度。將血清樣品稀釋200倍進(jìn)行測(cè)定，另取一份樣品向其中加入一定量鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)行測(cè)定，將兩濃度的差值除以加入的鎂標(biāo)準(zhǔn)的濃度，得到該樣品鎂含量的回收率，結(jié)果誤差在5%范圍內(nèi)，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)條件下干擾離子對(duì)測(cè)定鎂含量不產(chǎn)生影響。②牛血清標(biāo)準(zhǔn)品鎂含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)使用上述條件及擬合方程測(cè)定稀釋1000倍的牛血清標(biāo)準(zhǔn)品，得到結(jié)果22.7±0.5與參考值相符，說(shuō)明改變掩蔽劑EGTA溶液濃度，測(cè)定血清中Mg2+含量結(jié)果依舊準(zhǔn)確可靠。說(shuō)明系統(tǒng)流速會(huì)影響試樣與試劑在管道中的停留時(shí)間，近而影響試樣與試劑的反應(yīng)程度。系統(tǒng)流速小，試樣與試劑在管道中的停留時(shí)間長(zhǎng)，試樣與試劑的反應(yīng)更加徹底，熒光強(qiáng)度增加，反之亦然。從試驗(yàn)頻率與測(cè)定精度綜合考慮，本方法選擇2.5ml/min，因?yàn)樵摿魉偈窍到y(tǒng)所能承受的最大流速，而且在該流速下試驗(yàn)頻率最大，最省時(shí)，況且熒光強(qiáng)度也不會(huì)減小很多。減小系統(tǒng)流速，雖然可以使測(cè)定精度增加，可是會(huì)減小測(cè)定頻率，但是對(duì)測(cè)定結(jié)果并不會(huì)產(chǎn)生影響。權(quán)利要求1.一種測(cè)定血清中鎂含量的方法，其特征在于采用順序注射的方式與熒光分光光度計(jì)聯(lián)用測(cè)定血清中鎂含量，1)a.順序注射的進(jìn)樣順序?yàn)橄任胧榛谆然@/乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入8-羥基喹啉-5-磺酸/緩沖溶液；各溶液的濃度分別為HTAC溶液質(zhì)量濃度0.1-0.25％，EGTA溶液3-10×10-3mol/l，HQS溶液0.5-2.5×10-3mol/l，緩沖體系為pH＝10.0的硼砂-硼酸-KCl溶液；進(jìn)樣體積均為150μl；系統(tǒng)流速為1.75-2.5ml/min；b.對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)定；血清樣品按1-20倍的體積稀釋比例逐級(jí)稀釋，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；c.采用步驟a的操作條件對(duì)質(zhì)量濃度為8-1200ng/ml鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)鎂質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)從該曲線上找到所測(cè)血清樣品的相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的鎂質(zhì)量濃度；以鎂質(zhì)量濃度在45-75ng/ml范圍內(nèi)的測(cè)定結(jié)果為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其值準(zhǔn)確可靠。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中，步驟a.順序注射的進(jìn)樣順序?yàn)橄任際TAC/EGTA溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入HQS/緩沖溶液；各溶液的濃度分別為HTAC^溶液重量濃度0.15%，EGTA溶液7xl(r3mo1/1，HQS溶液1.0x10'3mol/l，緩沖體系為pH=10.0的硼砂-硼酸-KCl;進(jìn)樣體積均為150pl;系統(tǒng)流速為2.5ml/min。全文摘要本發(fā)明涉及血清中鎂離子濃度的測(cè)定，1)a.順序注射的進(jìn)樣順序?yàn)橄任際TAC/EGTA溶液，再吸入樣品溶液，最后吸入HQS/緩沖溶液；b.對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)定；血清樣品按體積稀釋比例逐級(jí)稀釋，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；c.采用步驟a的操作條件對(duì)鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)鎂質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)從該曲線上找到所測(cè)血清樣品的相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的鎂質(zhì)量濃度；以鎂質(zhì)量濃度在45-75ng/ml范圍內(nèi)的測(cè)定結(jié)果為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其值準(zhǔn)確可靠。結(jié)果驗(yàn)證了在測(cè)定血清過(guò)程中會(huì)存在一個(gè)最好稀釋范圍的論證，為流動(dòng)非平衡體系中，相對(duì)較短反應(yīng)時(shí)間內(nèi)測(cè)定血清中鎂含量提供了借鑒依據(jù)。文檔編號(hào)G01N33/84GK101210930SQ20061013510公開日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年12月27日優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日發(fā)明者樺周,宇萬(wàn)太,璐張,強(qiáng)馬申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所