專利名稱：通過不同基因的五個SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測肺癌易感性的試劑盒，通過同時檢測多 聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶家族成員1 (poly(ADP-ribose) polymerase family, member l,PARPl,又簡寫為ADPRT)、 細胞色素P4501A1酶基因(cytochrome P450, family 1， subfamily A， polypeptide 1, CYPlAl )、 X射線交錯 互補修復基因1 (X-ray repair cross--complementing gene 1， XRCCO和切除修復復合物2 (Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2, ERCC2)的單核苷酸多態(tài)性位點 (SNP)來預測個體對肺癌的易感性。
背景技術(shù)：
原發(fā)性支氣管肺癌，簡稱肺癌，為當前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴重威脅人類健康和 生命的疾病。腫瘤細胞源于支氣管粘膜或腺體，常有區(qū)域性淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移，早期常有刺激性咳嗽、痰 中帶血等呼吸道癥狀，病情進展速度與細胞的生物特性有關(guān)。半個世紀以來，世界各國肺癌的發(fā)病率和病死率都有明顯增高趨勢。世界衛(wèi)生組織(WHO)2000年報告 1997年全世界死于惡性腫瘤的共706.5萬人，占死亡人數(shù)的12.6%,其中肺癌占惡性腫瘤死亡的19%,居 惡性腫瘤死因的第一位。我國1990 1992年的抽樣調(diào)査顯示，在城市人口的腫瘤死亡中，肺癌由原來的 第4位上升為第1位，農(nóng)村上升最快的也是肺癌。云南錫礦的肺癌發(fā)病率在1954 1959年間為28.02/10 萬，1960 1969年間為197.87/10萬，1970 1979年間上升到219.10/10萬，這在全世界也是罕見的。英國 著名腫瘤學家R.Peto預言如果我國不及時控制吸煙和空氣污染，到2025年我國每年肺癌將超過100萬， 成為世界第一肺癌大國。病因和發(fā)病機制迄今尚未明確。 一致認為肺癌的發(fā)病與下列因素有關(guān)①吸煙(包括主動吸煙和被動 吸煙)；②職業(yè)致癌因子，己被確認的致人類肺癌的職業(yè)因素包括石棉、無機砷化合物、二氯甲醚、鉻及 其化合物、鎳、氡、芥子氣、氯乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環(huán)芳烴、煙草的加熱產(chǎn)物等；③空氣污染 (包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染) 電離輻射⑤飲食與營養(yǎng)，美國紐約和芝加哥開展的前瞻性人群觀察的結(jié)果說明，食物中天然維生素A類、e胡蘿卜素的攝入量與十幾年后癌癥的發(fā)生呈負相關(guān)，其中最突出的是肺癌；⑥其他，美國癌癥學會將結(jié)核列為肺癌的發(fā)病因素之一。有結(jié)核病者患肺癌的危險性是 正常人群的10倍。其主要組織學類型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黃曲霉)、機體免疫功能低下、 內(nèi)分泌失調(diào)以及家族遺傳等因素，對肺癌的發(fā)生可能也起一定的綜合作用。近年研究表明，肺癌的發(fā)生與某些癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相關(guān)。己經(jīng)證明的幾個癌基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、機制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基因p53、 p16和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細胞肺癌中均有過度表達。 非小細胞肺癌中則?？梢妑as族基因的過度表達。這些深入的研究將為基因預防和治療肺癌提供理論基礎(chǔ)。SNP(single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態(tài)性標記，是一類基于單堿基變異引起的DNA 多態(tài)性，被遺傳學界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標記，占 大約90%。這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復雜疾病的易感 性和對環(huán)境因素、藥物反應的差異。PARPl基因位于第l號染色體lq41"q42位置，全長47,3kb， mRNA全長3861bp,共有23個外顯子， 編碼1015氨基酸的多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶蛋白。這種酶通過聚ADP核糖基化反應修正多種核蛋白。這種 修正以DNA為基礎(chǔ)，參與多種重要的細胞活動，例如分化，增殖，腫瘤轉(zhuǎn)移等，同時也參與分子水平 的活動，例如修復DNA受損的細胞等等。PARP1的主要功能通常被描述為3個方面1. DNA修復功能 (BER); 2.抑制受損DNA的轉(zhuǎn)錄；3.耗盡細胞中的能量，導致細胞凋亡；4.參與部分基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 這些功能可以修復細胞中受損的DNA,抑制破損DNA的轉(zhuǎn)錄，甚至殺死無法修復的細胞，達到抑制癌癥 發(fā)生的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PARP1功能缺失會提髙乳腺癌，肺癌等癌癥的發(fā)病率。
rel136410是位于第1號染色體上PARP1華但上的，個T/C多態(tài)，弓l起PARP1基因編碼的蛋白第762 個氨基酸由Val變?yōu)锳la。 NCBI公布的世界人fe中的該多態(tài)的頻率分布，T占0.808， C占0.192左右，雜 合度為0.311。分子生物學研究表明，PARP1上762號氨基酸由Val轉(zhuǎn)化為Ala,降低了瞎的活性，導致多 種癌癥的發(fā)生風險升高。大樣本的中國人群的關(guān)聯(lián)分析顯示，該位點的多態(tài)現(xiàn)象是中國人群中重要的肺癌影響因素之一。CYP1A1基因位于第15號染色體15q22-q24位置，全長6.0kb, mRNA全長2601bp，共有7個外顯子， 編碼513個氨基酸的細胞色素P450A1。 P4501A1是重要的活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類，被激活的 CYP1A1能將多種環(huán)境中的有機物質(zhì)如PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多環(huán)芬芳碳氣化合物轉(zhuǎn) 化為細胞毒素或其他致癌物質(zhì)，從而增加癌癥發(fā)生的危險。國內(nèi)外的眾多研究顯示CYP1A1的多態(tài)與野生 型相比有更高的酶接觸反應活性和可誘導性，從而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌等疾病的 危險度。細胞色素P450酶(CYP450)是細胞內(nèi)重要的I相代謝酶，在致癌物的活化和解毒過程中起著重 要的作用。P4501A1(CYP1A1)是活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要嗨類。CYP1A1作為一種微神經(jīng)元體細胞酶 與一些致癌物質(zhì)的生物激活有關(guān)，例如benzo[a]pyrene。同時，CYP1A1易于被TCDD和多環(huán)的芳香族化 合物所誘變，包括3-甲基膽葸等實驗室用致癌物質(zhì)。目前的動物實驗表明，CYP1A1的表達與芳基碳氣化 合物受體(AhR)和Arnt (AhR Nuclear Translocator)的激動劑，以及USF1 (Upstream Stimulatory Factor) 的拮抗劑有關(guān)。同時，CYP1A1通過C2羥基化作用參與雌激素的代謝活動。rsl048943是位于CYP1A1基因上的一個A/G多態(tài)，位于第7外顯子462號教基酸由lie轉(zhuǎn)化為Val。 目前NCBI公布的世界人口頻率A:G為0.896:0.104,雜合度0.186。世界人群的關(guān)聯(lián)分析表明，CYP1Ale462Val位點ValVal和Vallle基因型在肺癌病例組中的頻率明顯高于對照組，在女性中風險度尤其突出。 基于多個中國人群肺癌發(fā)病與CYP1A1 Ik462Val位點的關(guān)聯(lián)分析研究，上千例肺癌個體與健康對照個體的 分析，顯示CYPlAlHe462Val這種位于酶蛋白的血紅素結(jié)合區(qū)的變異，是中國人群中重要的肺癌遺傳易感 因素之一，在女性中尤為突出。酶動力學研究表明，3種基因型表達的酶活性存在差異。Val/Val活化毒物 的能力最強，Ile/Val次之，而lle/Ile最弱。研究顯示，CYPlAlVal.Val基因型是中國人群中重要的肺癌遺 傳易感因素之一。XRCC1位于第19號染色體19913.2-13.3位置，全長32.3kb， mRNA全長2087bp,共有17個外顯子， 編碼634個氨基酸的蛋白。XRCC1編碼的蛋白對因電離輻射和垸基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到有效 的修復作用。XRCCl編碼的蛋白與DNA連接瞎ffl、聚合酶e、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶交互作用，參與DM 的堿基切除修復(Base Excision R印air, BER)通路。眾多研究顯示，XRCC1基因上部分位點的多態(tài)性，與 癌癥發(fā)生有密切的關(guān)系。與XRCC1相關(guān)的癌癥主要有乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、食管癌、胃癌、結(jié) 腸癌、胰腺癌、肺癌等。rs25487是位于第19號染色體XRCC1基因上的一個G/A多態(tài)，弓l起XRCC1基因編碼的蛋白第399 個氨基酸由Arg變?yōu)镚ln。 Ai^399Gln位于第10號外顯子，XRCC〗蛋白BCRTI區(qū)域。在世界人群中的該 多態(tài)的頻率分布，G占0.72， A占0.28左右。中國人群中的分布G為0.68， A為0.32。分子生物學研究表 明，XRCC1基因上第399號氨基酸A屯-Gln的替代加強XRCC1蛋白與DNA-致癌物加合物的結(jié)合能力， 從而影響個體的腫瘤易感性。通過大量對于大規(guī)模人群的肺癌病例對照研究，XRCC1的399氨基酸突變 位點在做單因素分析時與肺癌發(fā)生相關(guān)，但是分層分析后發(fā)現(xiàn)在大量吸煙的人群中，肺癌發(fā)病風險降低。ERCC2,位于第19號染色體19ql3.3位置，共有23個外顯子，基因全長19.0kb, mRNA全長2355bp, 編碼含761個氨基酸的蛋白。由ERCC2編碼的蛋白參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的核苷酸切除修復，它可識別與修復結(jié) 構(gòu)無關(guān)的大范圍的損傷，如大的加合物和胸腺嘧啶二聚體，并且是基本轉(zhuǎn)錄因子復合物BTF2/TFnH的一 個組成成分。該蛋白具有ATP依賴性的DNA解旋活性，屬于RAD3/XPD解旋酶亞家族。ERCC2的功能 缺失導致基本轉(zhuǎn)錄因子復合物不能正確識別DNA損傷位點,從而使堿基切除修復無法正確進行,導致DNA 上的致癌損傷積累。ERCC2基因的突變或者失活可能導致的疾病包括癌癥、著色性干皮病、毛發(fā)硫營養(yǎng) 不良、柯凱因氏綜合癥。rsl3181是位于第19號染色體ERCC2基因第23號外顯子段Lys751Gln的T/G多態(tài)。世界人群中的頻 率約為T:G =0.798: 0.202，雜合度0.322，中國人群中的頻率約為T:G =0.91: 0.09。目前的多項研究表明， Lys751Gln的氨基酸替代位于ERCC2蛋白C-末端部，這個位點的多態(tài)性與肺癌、膀胱癌、乳腺癌、皮膚 罹等疾病有關(guān)。ERCC2Lys751Gln位點的多態(tài)現(xiàn)象與肺癌特別是肺鱗痛的發(fā)生存在顯著關(guān)聯(lián)。rel799793是位于第19號染色體ERCC2基因第10號外顯子段Asp312Asn的G/A多態(tài)。世界人群中 的頻率約為G:A=0.778:0.222，中國人群中的頻率約為G:A=0.94:0.06。目前的多項研究表明，該位點的多 態(tài)會導致ERCC2參與構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子復合物的性能發(fā)生弱化，從而使得對DNA損傷修復的能力下降，轉(zhuǎn) 錄因子的能力也同時發(fā)生下降，導致一系列諸如肺癌，前列腺癌等疾病的發(fā)生。ERCC2Asp312Asn多態(tài)性 與肺癌特別是肺鱗癌發(fā)生有顯著關(guān)聯(lián)，該位點的多態(tài)現(xiàn)象被認為是中國人群中肺癌遺傳易感因素之一。國內(nèi)外的大量的關(guān)聯(lián)分析表明，PARP1基因上的rsl136410號SNP位點基因型為C時肺癌的發(fā)生幾率 增加；CYP1A1基因上rsl048943號SNP位點基因型為G時肺癌的發(fā)生幾率增加；XRCC1基因上rs25487號 SNP位點基因型為A時肺癌的發(fā)生幾率增加；ERCC2基因上rsl3181號SNP位點基因型為G時肺痛的發(fā)生 幾率增加；ERCC2基因上rsl799793號SNP位點基因型為A時肺癌的發(fā)生幾率增加。這五個SNPs位點的 多態(tài)性可用于評估個體對肺癌的易感性。發(fā)明內(nèi)容基于PARPl基因上的rsll36410號SNP位點、CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上 的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl7997 3號SNP位點 的多態(tài)性可用于評估個體對肺癌的易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測PARP1基因上的rsl136410號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、檢測 CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、檢測XRCC1基因上的rs25487 號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、檢測ERCC2基因上的rs13181號SNP位點的特異性引物 對及特異性熒光探針、檢測ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、 Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對PARP1基因上的rsl136410號SNP位點、CYP1A1基因上的 rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2 基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能特異性擴增出耙位點的DNA片段。設計這類引物對是本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO: 1和2所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 7和8所示序列 的引物對以及具有SEQ ID NO: 9和10所示序列的引物對。特異性引物對可用常規(guī)的合成技術(shù)進行合成。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這五對引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對PARP1基因上的rsl 136410號SNP位點、CYPIAI基因上的 rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2 基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測出這五個SNPs '位點肺癌易 感基因型的探針。設計這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 11、 12、 13、 14和15所示序列的Taqnian探針。特異性熒光探針可用常規(guī)的合成技術(shù)進行合成。本領(lǐng)域的 技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這五條探針，所有可用于熒光定量PCR檢測PARPl基 因上的rsl136410號SNP位點、CYPIAI基因上的rsl048943號SNP位點、XRCCl基因上的rs25487號SNP 位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點的探針均在本發(fā)明 范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括lpl 10 X熒光定量PCR反應緩沖液，0. lpl 25niM dNTP混合液，0. 5nl 25mM MgCl2溶液，0.02nl (5units/jil) Taq DNA聚合酶，20(xM特異性引物對(十條)各0.225nl，10fiM特異性熒光探針(五條)各0.25nl，
去離子水2.88fil。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DM模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應使用可檢測肺癌易感性的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針:有義引物l:5，-TTTGCCATTCACTGTGTTGG -3，(SEQIDNO:1)Tm值為58'C反義引物l:5，-ATCCTTGCTGCTATCATCA -3，(SEQIDNO:2)Tin值為54°C有義引物2:5'-GTGTTMGTGAGMGGTGAT -3，(SEQIDNO:3)Tm值為56'C反義引物2:5，-AGGATAGCCAGGMGAGAAA -3'(SEQIDNO:4)Tm值為58T)有義引物3:5，-TAACTGGCATCTTCACTTCT -3'(SEQIDNO:5)Tm值為56'C反義引物3:5,-TCCAGATTCCTGGCATTGC -3'(SEQIDNO:6)Tm值為58'C有義引物4:5，-ACTCAGGAGTCACCAGGAA _3'(SEQIDNO:7)Tm值為58'C反義引物4:5，-TCTGTTCTCTGCAGGAGGA -3,(SEQIDNO:8)Tm值為58'C有義引物5:5，-ATCAAAGAGACAGACGAGCA -3，(SEQIDNO:9)Tm值為58°C反義引物5:5，-TCAGGMGCCCAGGAAAT -3'(SEQIDNO:10)Tm值為54'C熒光探針1:5，-CAGGCCMGGCGGAAATGCT -3,(SEQIDNO:11)Tm值為64'C熒光探針2:5，-TATCGGTGAGACCGTTGCCC -3，(SEQIDNO:12)Tm值為64'C熒光探針3:5，-CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3'(SEQIDNO:13)Tm值為64'C熒光探針4:5'- MTCTGCTCTATCCTCTGCAGC -3,(SEQIDNO:14)Tm值為66'C熒光探針5:5,-TGCCCMCGMGTGCTGCAG -3，(SEQIDNO:15)Tm值為64'C有義引物1，反義引物1和熒光探針1特異地針對檢測PARP1基因上的rsl 136410號SNP位點多態(tài)性； 有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異地針對檢測CYPlAl基因上的rsl048943號SNP位點多態(tài)性；有 義引物3，反義引物3和熒光探針3特異地針對檢測XRCCl基因上rs25487號SNP位點多態(tài)性；有義引物 4，反義引物4和熒光探針4特異地針對檢測ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點多態(tài)性；有義引物5, 反義引物5和熒光探針5特異地針對檢測ERCC2基因上的rel799793號SNP位點多態(tài)性。熒光定量PCR反應體系為總體積lO(il，包含濃度為20ng/nl的DM模板2^1、 ljil 10 X熒光定量PCR 反應緩沖液、0. ljd 25mM dNTP混合液、0.5^1 25mM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有義引物l、 2 、 3 、 4和5各0.225nl、 20fiM的反義引物l、 2 、 3、 4和5各0.225pl、 10nM的 熒光探針l、 2 、 3、 4和5各0.25^1,去離子水2.88nl。在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50'C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進行60個循環(huán)的 95r、 30秒，60C、 l分鐘。反應結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟3: SNP基因型分析 將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對照相對比，熒光探針1最終的熒光信號明顯髙于 正常對照，說明被檢測DM的PARPl基因上的rsll36410號SNP位點基因型攜帶有C型，為肺癌易感型； 熒光探針2最終的熒光信號明顯高于正常對照，說明被檢測DM的CYP1A1基因上rsl048943號SNP位點 基因型攜帶有G型，為肺癌易感型;熒光探針3最終的熒光信號明顯高于正常對照，說明被檢測DNA的XRCC1 基因上rs25487號SNP位點基因型攜帶有A型，為肺癌易感型；熒光探針4最終的熒光信號明顯高于正常 對照，說明被檢測DM的ERCC2基因上的rs13181號SNP位點基因型攜帶有G型，為肺癌易感型；熒光 探針5最終的熒光信號明顯高于正常對照，說明被檢測DNA的ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點基 因型攜帶有A型，為肺癌易感型。實施例2.指導人們主動預防肺癌的服務目前在上海主健生物工程有限公司己經(jīng)開展了這項服務。 步驟l: DNA提取對被檢測者進行服務前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習慣問巻調(diào)査表。依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。 步驟2:基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的PARP1基因上的rsl136410號SNP位點、CYP1A1基因上 rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2 基因上的rsl799793號SNP位點同時進行熒光定量PCR檢測，確定這五個SNPs位點的基因型。步驟3:指導人們主動預防肺癌通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健康指導報告?；?檢測報告詳細說明了被檢測者肺癌易感程度的高低以及患病的概率大小。個體化健康指導報告以被檢測者 的基因分型檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習慣問巻調(diào)査結(jié)果，評估被檢測者肺癌遺傳易感的相對風險。 同時制定出針對于被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習慣、生活方式上的改進建議等，并 為被檢測者普及預防肺癌的健康知識。
序列表〈110〉上海主健生物工程有限公司〈120>通過不同基因的五個SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒<160> 15<210〉 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 〈400〉 1tttgccattc actgtgttgg〈210〉 2 <211> 19 <212> ■ 〈213〉人工序列<220>〈223〉引物 <■> 2atccttgctg ctatcatca<210> 3 〈211〉 20 <212> DNA 〈213〉人工序列〈220〉<223>引物 <400> 3gtgttaagtg ag8aggtg8t201920 <210〉 4 <211〉 20 <212〉 ■ 〈213〉人工序列<220><223>引物 <柳〉4鵬3tagcca ggaagaga肪〈210〉 5 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列<220〉<223>引物 < 5taactggcat cttcacttct<210> 6 <211> 19 <212> DNA <213〉人工序列<220〉<223>引物 < 6tccagattcc tggcattgc<210> 7 <211> 19 <212〉DNA〈213>人工序列<220><223>引物
actcaggagt caccaggaa〈210> 8 <211> 19 <212> ■ <213>人工序列<220>〈223〉引物 〈400> 8tctgttctct gcaggagga<210〉 9 <211> 20 <212〉 DNA <213>人工序列<220>〈223〉引物 < 93tC3a8g8g8 Cag8CgagC3<210> 10 <211> 18 <212> DNA 〈213〉人工序列〈220><223>引物 <400> 10tcaggaagcc caggaaat<210〉 11 <211〉 20 〈212> DNA說明書第8/10頁191920<213〉人工序列 <220>〈223〉探針 <400> 11caggccsagg cggsaatgct 20<210> <211〉 〈212〉 〈213〉12 20 DNA人工序列<220〉<223>探針 <400> 12tatcggtgag accgttgccc 20<210〉 <211> <212> <213〉13 18 DNA人工序列<220><223>探針 ■> 13cggctgccct cccagagg 18<210> <211> <212> <213>1422 腿人工序列<220>〈223>探針 <400> 14aatctgctct atcctctgca gc 22<formula>formula see original document page 12</formula>
權(quán)利要求
1.一種檢測肺癌易感性的試劑盒，包括同時檢測PARP1基因上的rs1136410號SNP位點、CYP1A1基因上的rs1048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rs13181號SNP位點和ERCC2基因上的rs1799793號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對PARPl基因上的 rsl136410號SNP位點、CYPlAl基因上的rsl048943號SNP位點、XRCCl基因上的rs25487號SNP位點、 ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能特異性擴增出 包含PARPl基因上的rsl136410號SNP位點、CYPlAl基因上的rsl048943號SNP位點、XRCCl基因上的 rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點的 引物對。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對PARPl基因上的 rsl136410號SNP位點、CYPlAl基因上的rsl048943號SNP位點、XRCCl基因上的rs25487號SNP位點、 ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能通過熒光定量 PCR技術(shù)特異性檢測出這五個SNPs位點肺癌易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO: l和2所 示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對、 具有SEQ ID NO: 7和8所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO: 9和10所示序列的引物對。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQIDNO: 11、 12、 13、 14和15所示序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括ljil IOX熒光定量PCR反 應緩沖液，O.lnl 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCl2溶液,0,1 (5units/fd) Taq DNA聚合酶， 20nM特異性引物對(十條)各0.225nl， 10jiM特異性熒光探針(五條)各0.25pl，去離子水2.88nl。本 試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測PARP1基因上的rs1136410號SNP位點、CYP1A1基因上的rs1048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rs13181號SNP位點和ERCC2基因上的rs1799793號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時檢測分析個體的PARP1基因、CYP1A1基因、XRCC1基因和ERCC2基因上的SNPs位點基因攜帶型來預測個體對肺癌的易感性。
文檔編號G01N21/64GK101153846SQ200610116669
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司