專利名稱：?jiǎn)伟费趸冈\斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定 單胺氧化酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單胺氧化酶(MAO)測(cè)定可分為化學(xué)分光光度法、熒光法、免疫抑 制法及現(xiàn)在申請(qǐng)專利的酶法。 一般多用化學(xué)分光光度法，單胺氧化酶 反應(yīng)底物以芐胺(Benzylamine)和對(duì)苯甲胺-P -偶氮萘酚，也可應(yīng)用 單胺氧化酶催化胺類釋放出的HA氧化發(fā)色劑，如10-N-甲基氨基甲酰 基-3， 7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)。除此之外，單胺氧化酶反 應(yīng)底物還有丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、 P -苯乙基 胺(b-phenylethylamine )、酪胺(tyramine : 3-對(duì)羥基苯乙胺 3-parahdroxyphenyle"thylaniine)、 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine) 等，丁基胺、戊基胺、6-苯乙基胺約為3-對(duì)羥基苯乙胺活性的30%， 通常應(yīng)用苯甲胺作為底物比其他底物的單胺氧化酶活性要高。目前單 胺氧化酶測(cè)定多用芐胺和對(duì)苯甲胺-P -偶氮萘酚為底物，但對(duì)苯甲胺-
偶氮萘酚芐胺法需要用環(huán)乙垸提取，限制了該方法的實(shí)用性，且不 能應(yīng)用全自動(dòng)生化儀分析；芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用 下生成芐醛，然后在強(qiáng)堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng)，生 成醛苯腙，在生化儀上測(cè)定也較困難。
熒光法檢測(cè)單胺氧化酶是以8 -苯乙胺作為底物，其在l(TlOOmg 時(shí)Km最大，高于節(jié)胺和5-羥色胺的Km值。
免疫學(xué)方法是利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng)，作用 后進(jìn)行單胺氧化酶同工酶測(cè)定。目前應(yīng)用較多的單克隆抗體是 MAO-A3C9、 MAO-A4F10、 MAO-A7B10、 MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法
(Enzymatic Recycling Method)、 酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)通過酶聯(lián)反應(yīng) 生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)， 所導(dǎo)致在400——700nm波長處吸光度的上升，得以測(cè)定單胺氧化酶 活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的單胺氧化 酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動(dòng) 生化分析儀上進(jìn)行單胺氧化酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、靈敏 度大、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法原理如下
胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨離子
+過氧化氫
氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸
+水+輔酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+
過氧化氫
過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亞胺色原+水
單胺氧化酶(monoamine oxidase ; EC 1.4.3.4 ; EC 1.4.3.6)和丙氨 酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4丄1)作為作用酶，功能為 將胺類化合物經(jīng)過二步酶解產(chǎn)生丙氨酸。甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)作為循環(huán)酶甘氨酸氧化酶的酶促作用使丙氨 酸產(chǎn)生過氧化氫、氨離子和丙酮酸，使氨離子不斷地被丙氨酸脫氫酶 重復(fù)循環(huán)利用，也不斷地生成過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)作為顯色酶，最終通過和過氧化氫的作用將無色的還原 型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在 400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處，測(cè)定染料， 吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)，含量 高低的光吸收大小，通過測(cè)量400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的 不同而定)處吸光度上升的速度，可以測(cè)算單胺氧化酶的活性濃度大 小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷試劑盒較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
過氧化物酶 30000 U/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
胺類化合物 12 mmol/L
丙酮酸
甘氨酸氧化酶 還原型色原體組合
16 mmol/L 12000U/L 謂0 U/L 2 mmol/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個(gè)組合中的任-
個(gè)組合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基~■N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2.4- 雙氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3.5- 雙氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基一(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 雙甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-徑基_3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺。 本發(fā)明的單胺氧化酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、
甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液
體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶、胺類化合 物、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、丙氨酸脫 氫酶、甘氨酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮
酸、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、胺類化合物、丙酮酸。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮
酸、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
過氧化物酶
還原型輔酶
胺類化合物
丙酮酸
甘氨酸氧化酶 4-氨基抗砒
石碳酸
50 mmol/L 30000 U/L 0.25 mmol/L 12 mmol/L 16 mmol/L 12000U/L 8000 U/L 2 mmol/L 10 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑;
使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，測(cè) 試主波長505nm,測(cè)試副波長600nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑的 體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分 鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長505nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧 化酶的活性濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 胺類化合物 丙酮酸
2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
0.25 mmol/L 16 mmol/L 20 mmol/L 0.2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 過氧化物酶
50 mmol/L 40000 U/L
甘氨酸氧化〖
16000U/L
6000 U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試
主波長546nm，測(cè)試副波長600nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑的體
積比例為1/20，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘
左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化
分析儀下，檢測(cè)主波長546nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧
化酶的活性濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑l
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
雙甲基苯胺
50 mmol/L
0.25 mmol/L
2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 胺類化合物
50 mmol/L
10 mmol/L
丙酮酸 12 mmol/L
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
過氧化物酶 25000 U/L
丙氨酸脫氫酶 14000 U/L
甘氨酸氧化酶 9000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試 主波長578nm，測(cè)試副波長660nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑的體 積比例為1/30，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘 左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長578nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧 化酶的活性濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí) 施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源 物質(zhì)量污染。
權(quán)利要求
1.一種酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法，其方法原理如下胺類化合物+水+氧 單胺氧化酶 相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨離子 +過氧化氫氨離子+丙酮酸+還原型輔酶 丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸 +水+輔酶丙氨酸+水+氧 甘氨酸氧化酶 氨離子+丙酮酸+ 過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測(cè)400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收大小，得出單胺氧化酶活性濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑盒，主要成分包括 緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1-50 mmol/L還原型輔酶 0.1-0.35 mmol/L胺類化合物 1-30mmol/L丙酮酸2-30mmol/L丙氨酸脫氫酶 4000-20000 U/L甘氨酸氧化酶 2000-12000U/L過氧化物酶 50O——80000 U/L 還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸、丙氨酸脫 氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成單劑試 劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、、丙氨酸脫氫 酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶組成。過氧化物酶、還原型色原體 組合、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸 氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸、丙氨酸脫 氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成多劑試 劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、還原型色原體組合 組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、胺類化合物、丙酮酸、還原型 色原體組合組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶組成。過氧化物酶、還原型色原體組合、 還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個(gè)組合中的任一個(gè)組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唾酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2'-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4- 雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3.5- 雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測(cè)定染料含量的高低，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/78GK101173900SQ200610097328
公開日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
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