專利名稱：錳診斷/測(cè)定試劑盒及錳濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種錳診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定錳濃度 的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
錳作為一種微量元素在人體中是不可或缺的必需成分，同時(shí)也是對(duì)人 體有毒的物質(zhì)。在自然狀態(tài)下，以兩價(jià)、三價(jià)和四價(jià)形式存在，氧化程度 越低，毒性越高。通常錳有八種不同的氧化狀態(tài)。錳的生物學(xué)意義是作為
人體中輔助因子有多種多樣的功能。然而，在許多酶反應(yīng)激活中，Mn2+ 和Mg2+可互相替代。
常用石墨爐原子吸收分光光度測(cè)定法、原子發(fā)射ICP-OES。中子激發(fā) 分析(NAA)是最好的方法，但僅能在一些條件好的實(shí)驗(yàn)室才能測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè) 定錳濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的錳診斷/測(cè)定 試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分 析儀上進(jìn)行錳濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí) 的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明錳濃度測(cè)定方法原理如下
草酰乙酸草酰乙酸脫羧酶/Mt^ 丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+ L-精氨酸+還原型輔酶
N2-(D-l-羧乙基)-L-精氨酸+輔酶+水
這個(gè)方法應(yīng)用需要錳離子激活的草酰乙酸脫羧酶(oxaloacetate decarboxylase ; EC 4.1.1.3 )(偶)聯(lián)章魚堿脫氫酶(octopine dehydrogenase ; ECL5丄11)酶促反應(yīng)速率比色法。草酰乙酸脫羧酶促使草酰乙酸發(fā)生脫 羧作用產(chǎn)生丙酮酸，再通過章魚堿脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nrn處沒有吸收峰)，從而得以 測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測(cè)量340nm處吸光 度下降的速度，可以測(cè)算錳的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明,從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明錳診斷/測(cè)定試劑盒 較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
草酰乙酸 25mmol/L 精氨酸 40 mmol/L
草酰乙酸脫羧酶 12000 U/L
章魚堿脫氫酶 16000 U/L
本發(fā)明的錳診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脫羧 酶、章魚堿脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、精氨酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶、章魚堿脫氫酶。 還原型輔酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脫羧酶、章魚堿脫氫酶在 試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、草酰乙酸、精氨酸。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶、章魚堿脫氫酶。
還原型輔酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脫羧酶、章魚堿脫氫酶在 試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定錳濃度的方法，其還原型輔
酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一
本實(shí)施例的錳診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25mmol/L
草酰乙酸 25 mmol/L
精氨酸 40 mmol/L
草酰乙酸脫羧酶 12000 U/L
章魚堿脫氫酶 16000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使 用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸 光度1.8士0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm,被測(cè)錳樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1 分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出錳的濃度大 小。實(shí)施例二
本實(shí)施例的錳診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 草酰乙酸
0.25mmol/L
20 mmol/L
30 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
草酰乙酸脫羧酶
100mmol/L 50 mmol/L 16000U/L 24000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸
光度1.8士0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)錳樣品與試
劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延
遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分
析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出錳的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的錳診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 精氨酸 30 mmol/L
草酰乙酸 40 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
草酰乙酸脫羧酶 24000 U/L
章魚堿脫氫酶 36000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定錳濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37-C,反應(yīng)時(shí)間IO 分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被 測(cè)錳樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)?負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出錳的濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類 同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳濃度測(cè)定方法，其方法原理如下草酰乙酸 草酰乙酸脫羧酶/Mn2+ 丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+L-精氨酸+還原型輔酶 章魚堿脫氫酶N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+輔酶+水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出錳的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2.結(jié)果。一種錳診斷/測(cè)定試劑盒， 緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 草酰乙酸主要成分包括:20--500 mmol/L0.1-50 mmol/L"0.35 mmol/L50 mmol/L50 mmol/L草酰乙酸脫羧酶 章魚堿脫氫酶1000--80000 U/L1000-80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脫羧 酶、章魚堿脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脫羧 酶、章魚堿脫氫酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原 型輔酶、草酰乙酸、精氨酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰 乙酸脫羧酶、章魚堿脫氫酶組成。還原型輔酶、草酰乙酸、精氨酸、 草酰乙酸脫羧酶、章魚堿脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脫羧 酶、章魚堿脫氫酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原 型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、草酰乙酸、精氨酸組成；試劑3，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶、章魚堿脫氫酶組成。還原型輔酶、 草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脫羧酶、章魚堿脫氫酶在試劑1、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 劑1~"4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定錳濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脫羧酶、章魚堿脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出錳的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/84GK101173946SQ20061009732
公開日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司