專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定 單胺氧化酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單胺氧化酶(MAO)測定可分為化學(xué)分光光度法、熒光法、免疫抑 制法及現(xiàn)在申請專利的酶法。 一般多用化學(xué)分光光度法，單胺氧化酶 反應(yīng)底物以芐胺(Benzylamine)和對(duì)苯甲胺-P -偶氮萘酚，也可應(yīng)用 單胺氧化酶催化胺類釋放出的&02氧化發(fā)色劑，如10-N-甲基氨基甲酰 基-3， 7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)。除此之外，單胺氧化酶反 應(yīng)底物還有丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、日-苯乙基 胺(b-phenylethylamine )、酪胺(tyramine : 3-對(duì)羥基苯乙胺 3-parahdroxyphenylethylamine)、 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine) 等，丁基胺、戊基胺、3-苯乙基胺約為3-對(duì)羥基苯乙胺活性的30%， 通常應(yīng)用苯甲胺作為底物比其他底物的單胺氧化酶活性要高。目前單 胺氧化酶測定多用芐胺和對(duì)苯甲胺-e-偶氮萘酚為底物，但對(duì)苯甲胺-e-偶氮萘酚芐胺法需要用環(huán)乙垸提取，限制了該方法的實(shí)用性，且不 能應(yīng)用全自動(dòng)生化儀分析；芐胺法的原理是節(jié)胺在單胺氧化酶的作用 下生成芐醛，然后在強(qiáng)堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng)，生 成醛苯腙，在生化儀上測定也較困難。
熒光法檢測單胺氧化酶是以e-苯乙胺作為底物，其在l(TlOOmg 時(shí)Km最大，高于芐胺和5-羥色胺的Km值。
免疫學(xué)方法是利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng)，作用 后進(jìn)行單胺氧化酶同工酶測定。目前應(yīng)用較多的單克隆抗體是 MAO-A3C9、 MAO-A4F10、 MAO-A7B10、 MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimefric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù) 監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化， 得以測定單胺氧化酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí) 現(xiàn)該方法的單胺氧化酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可 見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行單胺氧化酶活性濃度測定， 而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法原理如下
胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨離子
+過氧化氫
氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸
+水+輔酶
這種方法應(yīng)用單胺氧化酶(偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測 法。單胺氧化酶解胺類化合物反應(yīng)產(chǎn)生氨離子，再通過(偶)聯(lián)合丙 氨酸脫氣酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化 成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔
酶在340mn處吸光度下降的速度，通過測量340nrn處吸光度下降的速 度，可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶 診斷試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
胺類化合物 8 mmol/L
丙氨酸脫氫酶 12000 U/L
本發(fā)明的單胺氧化酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙氨酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、胺類化合物、丙氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位
置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也
可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、胺類化合物。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶。
還原型輔酶、胺類化合物、丙氨酸脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定單胺氧化酶活性濃度的方 法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的--種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑，包括-
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
胺類化合物 8 mmol/L
丙氨酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑;
使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺 氧化酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))， 延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右，理論K值一4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生 化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺 氧化酶的活性濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
胺類化合物
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 12 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙氨酸脫氫酶
100 mmol/L 50 mmol/L 16000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺
氧化酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng) (下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右，理論 K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧 化酶的活性濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑1
緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶 試劑2
緩沖液
穩(wěn)定劑
胺類化合物 試劑3
緩沖液
穩(wěn)定劑
丙氨酸脫氫l
10Ommol/L
50 mmol/L
0.25 mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 6 mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定單胺氧化酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm， 測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑1 、試劑2、試劑3的 體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約 l分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧 化酶的活性濃度大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源 物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法原理如下胺類化合物+水+氧 單胺氧化酶 相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨離子+過氧化氫氨離子+丙酮酸+還原型輔酶 丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸 +水+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出單胺氧化酶的活性濃度大小測定結(jié)果。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——50mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L胺類化合物 1——30 mmol/L丙氨酸脫氫酶 1000——50000 U/L其特征在于試劑盒可以是千粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.1)組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖敏、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.1)組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、 胺類化合物組成；試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶組成。 還原型輔酶、胺類化合物、丙氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙氨酸脫氫酶(EC 1.4丄1)組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶 組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、胺類化合物組成；試劑3，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、胺類化合物、 丙氨黢脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6, 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、胺類化合物、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N21/25GK101173890SQ20061009732
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司