專利名稱：：酶聯免疫體外診斷試劑中顯色劑的制備的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物體外診斷試劑
技術領域：
。具體涉及一種酶聯免疫體外診斷試劑中顯色劑的制備。
背景技術：
：酶聯免疫檢測方法(ELISA)由于具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，已被廣泛應用于抗原、抗體、細胞因子以及生化物質等的檢測。ELISA試劑的檢測方法有很多種，但各種方法都離不開酶結合物和顯色劑。在ELISA試劑中應用最廣泛的酶是辣根過氧化物酶(HRP)，HRP的底物是過氧化物，如過氧化氫，而該系統(tǒng)的顯色劑有多種，目前最常用的是3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)。相對于其他顯色劑來講，TMB有許多優(yōu)點，如不致癌性、穩(wěn)定性好等。檢測時，HRP催化過氧化物釋放出氧，無色的TMB被氧化成藍色的產物，加入酸性的終止液終止反應后，藍色溶液變成橙黃色，在450nm波長有最大吸收峰。通過測量吸光度，便可定性或定量判斷出被檢測物的含量。使用TMB作為顯色劑，其制備過程比較復雜。通常的制備方法為，先將TMB溶于有機溶劑(如二甲基亞砜，二甲基甲酰胺等)中，然后加熱使其充分溶解，配制成濃縮液，再邊攪拌邊緩慢加入到配制好的緩沖液中。整個制備過程要避光，不能有沉淀產生，操作比較繁瑣。由于TMB不溶于水，即使用有機溶劑助溶，在水中的溶解度也不高，配制的濃度不能過高，否則會有沉淀產生，因此制備的顯色劑靈敏度不高。除了靈敏度外，顯色背景也是ELISA試劑的一個很重要的指標，較高的顯色背景不僅使實驗結果難以判斷，而且容易造成錯誤的檢測結果。低顯色背景是高品質試劑的基本要求。而直接用市售TMB制備的顯色劑往往背景偏高。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，研究改進酶聯免疫體外診斷試劑中顯色劑的制備。本發(fā)明通過改變酶聯免疫體外診斷試劑中的顯色劑的配方來簡化顯色劑的配制過程并提高其靈敏度和改善顯色背景。本發(fā)明改變酶聯免疫體外診斷試劑中的顯色劑的組成，使用3，3'，5，5，-四甲基聯苯胺鹽酸鹽(3，3，，5，5，-Tetramethylbenzidlinedihydrochloride，TMB鹽酸鹽)代替3，3，，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)，使整個配制過程簡化。TMB鹽酸鹽可直接溶解到水溶液中，而不需要使用有機溶劑助溶。TMB鹽酸鹽在水中的溶解度可以達到1%，很容易就可根據試劑需要配制成濃度較高的溶液，獲得較高的靈敏度。而TMB即使使用有機溶劑助溶在水中的溶解度也比較低，通常在0.1%以下，為了獲得稍高的溶解度，需要增加有機溶劑用量，反過來有機溶劑用量加大又影響了顯色靈敏度。本發(fā)明使用的緩沖液為0.01-0.1MTris-HCl緩沖液，PH為2.05.0，或其他緩沖系統(tǒng)，如0.01-0.1M檸檬酸一乙酸鈉，PH為2.05.0，在該緩沖系統(tǒng)中通過加入EDTA二鈉鹽，可以增加顯色劑的穩(wěn)定性，使顯色劑的保存期延長。本發(fā)明在顯色劑中加入了青霉素鈉(或青霉素鉀、或氨芐青霉素)和羥胺來降低顯色背景同時增加其穩(wěn)定性。本發(fā)明提供了一種酶聯免疫體外診斷試劑中顯色劑的制備方法。本發(fā)明的顯色劑制備包括下列步驟(1)配制0.01-0.1MTris-HCl或檸檬酸一乙酸鈉緩沖液，pH值為2.05.0;(2)在該緩沖系統(tǒng)中加入乙二胺四乙酸二鈉鹽，終濃度為0.06g/L~0.32g/L，攪拌，使充分溶解；(3)加入青霉素鈉或青霉素鉀或氨芐青霉素，終濃度為0.02g/L~0.1g/L，攪拌，使充分溶解；(4)加入羥胺，終濃度為0.01ml/L0.06ml/L，攪拌，使充分溶解；(5)加入TMB鹽酸鹽，終濃度為0.3g/L~2.4g/L，使用時的具體濃度根據試劑所需靈敏度而定，攪拌，使充分溶解。本發(fā)明的顯色劑適用于以過氧化物為酶促反應底物的顯色系統(tǒng)中。其中所述的過氧化物為過氧化氫或過氧化脲，以此類物質為底物的酶為辣根過氧化酶(HRP)。本發(fā)明的有益效果(1)使用TMB鹽酸鹽，顯色靈敏度高。(2)顯色背景低。(3)配制過程簡單，去除了傳統(tǒng)方法中的有機溶劑溶解和配制濃縮液的過程，不用加熱來進行溶解和稀釋。(4)在試劑盒的保存溫度(28°C)下，穩(wěn)定性增加。本發(fā)明顯色劑與傳統(tǒng)顯色劑比較數據以雙抗體夾心ELISA法檢測HBsAg為例，在已包被抗體的微孔板中加入系列稀釋的抗原，按照常規(guī)反應過程進行試驗，分別對比傳統(tǒng)顯色劑和本發(fā)明顯色劑，用2M硫酸溶液終止反應后，在酶標儀上比色，結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例1:制備1L顯色劑，TMB鹽酸鹽濃度為0.04%:1、在容量瓶中加入約500ml蒸餾水，再依次加入下列物質，待前一種溶解后再加入后一種；Tris2.42g;HC1(36%-38%)2.4ml;EDTA二納鹽0.186g;青霉素鈉0.05g;羥胺0.03ml;TMB鹽酸鹽0.4g。待溶解后補足蒸餾水至1L。2、用HCl調整pH值為2.5。實施例2:制備1L顯色劑，TMB鹽酸鹽濃度為0.06%:1、在容量瓶中加入約500ml蒸餾水，再依次加入下列物質，待前一種溶解后再加入后一種；Tris2.42g;HC1(36%-38°/。)2.4ml;EDTA二納鹽0.186g;青霉素鈉0.05g;羥胺0.03ml;TMB鹽酸鹽0.6g。待溶解后補足蒸餾水至1L。2、用HCl調整pH值為2.5。實施例3:用濃度為0.06%TMB鹽酸鹽溶液為顯色劑，檢測血清或血漿標本中的HBsAg。(1)在己包被抗HBs的微孔板中依次加入標本50ul，同時做兩孔陰性對照、一孔陽性對照、一孔空白對照，然后每孔(除空白對照孔外)加入抗HBs-HRP酶結合物溶液50ul，置37'C保溫30分鐘。(2)棄去孔內液體，用洗滌液洗板5次。(3)各孔加底物溶液50ul，本發(fā)明實施例2制備的顯色劑50ul，置37t:保溫15分鐘。(4)各孔加終止液50ul，終止反應。(5)將反應板置酶標比色計450nm波長處用空白孔校零，讀取各孔OD值。(6)計算，CutOff值二陰性對照平均OD值X2.1，陰性對照平均OD值小于0.05按0.05計算，大于等于0.05按實際OD值計算。(7)結果判斷標本OD值大于或等于CutOff值為陽性，小于CutOff值為陰性。權利要求1、一種酶聯免疫體外診斷試劑中顯色劑的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)配制0.01-0.1MTris-HCl或檸檬酸-乙酸鈉緩沖液，pH值為2.0～5.0；(2)在該緩沖系統(tǒng)中加入乙二胺四乙酸二鈉鹽，終濃度為0.06g/L～0.32g/L，攪拌，使充分溶解；(3)加入青霉素鈉或青霉素鉀或氨芐青霉素，終濃度為0.02g/L～0.1g/L，攪拌，使充分溶解；(4)加入羥胺，終濃度為0.01ml/L～0.06ml/L，攪拌，使充分溶解；(5)加入TMB鹽酸鹽，終濃度為0.3g/L～2.4g/L，使用時的具體濃度根據試劑所需靈敏度而定，攪拌，使充分溶解。2、根據權利要求1所述的一種酶聯免疫體外診斷試劑中顯色劑的制備方法，其特征在于該方法制得的顯色劑適用于以過氧物為酶促反應底物的顯色系統(tǒng)中。3、根據權利要求2所述的過氧化物為過氧化氫或過氧化脲，以此類物質為底物的酶為辣根過氧化物酶。全文摘要本發(fā)明提供了一種酶聯免疫體外診斷試劑中顯色劑的制備方法。本發(fā)明方法改變了酶聯免疫體外診斷試劑中顯色劑的組成，使整個配制過程簡化，提高了顯色靈敏度，增加了顯色劑的穩(wěn)定性，并降低了顯色背景。有較大的臨床應用價值。文檔編號G01N21/77GK101101294SQ20061002862公開日2008年1月9日申請日期2006年7月5日優(yōu)先權日2006年7月5日發(fā)明者周興華申請人:上海華泰生物工程實業(yè)有限公司