專利名稱：擴散阻擋層中的濃度測定的制作方法
相關(guān)申請的引用
本申請要求2004年10月12日提交的題為“擴散阻擋層中的濃度測定”的美國臨時申請第60/617,889號和2005年2月22日提交的題為“擴散阻擋層中的濃度測定”的美國臨時申請第60/655,180號，所述申請通過引用整體結(jié)合到本文中。
背景
在監(jiān)測醫(yī)療狀況和患者對治療效果的反應(yīng)時，需要給患者使用快速、準(zhǔn)確和便捷的分析方法。已將電化學(xué)方法用于定量檢測體液特別是血液樣品中的一些分析物。通常，這些生物分析物如葡萄糖當(dāng)與特定的酶接觸時會發(fā)生氧化還原反應(yīng)?？蓪⑦@種氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的電流與樣品中的生物分析物的濃度建立關(guān)聯(lián)。已開發(fā)出微小的電化學(xué)單元，便于患者不需要陪護人員或臨床技師就可以監(jiān)測血液分析物濃度。典型的患者操作電化學(xué)系統(tǒng)采用帶專用測量裝置的一次性傳感片(sensor strip)，所述測量裝置包括必要的電路和輸出系統(tǒng)。在進行分析時，將測量裝置連接到包括電極和試劑的一次性電化學(xué)傳感片，以測量施加到傳感片的樣品中的分析物濃度。這些微型電化學(xué)系統(tǒng)最常見的是測量血液葡萄糖水平的葡萄糖傳感器。理想的是，微型葡萄糖傳感器應(yīng)能通過分析一滴全血(通常1-15微升(μL))就可提供血液葡萄糖水平的準(zhǔn)確讀數(shù)。在典型的分析用電化學(xué)電池中，涉及分析物的氧化或還原半電池反應(yīng)分別產(chǎn)生或消耗電子。該電子流動是可以測量的，條件是電子能與接觸待分析樣品的工作電極發(fā)生相互作用。通過同樣接觸樣品的對電極，就構(gòu)成完全的電路。在對電極處也發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)的類型(氧化或還原)與工作電極處的反應(yīng)類型相反。因此，如果在工作電極處發(fā)生氧化反應(yīng)，則在對電極處發(fā)生還原反應(yīng)。參見例如Fundamentals Of Analytical Chemistry，4th Edition，D.A.Skoog andD.M.West；PhiladelphiaSaunders College Publishing(1982)第304-341頁。一些常規(guī)的微型化電化學(xué)系統(tǒng)包括真(true)參比電極。在這些系統(tǒng)中，真參比電極可以是工作電極和對電極之外的給系統(tǒng)提供非差異(non-variant)參比電位的第三電極。雖然參比電極材料已知有多種，但典型的是銀(Ag)和氯化銀(AgCl)的混合物。用以提供非差異參比電位的材料如銀和氯化銀的混合物，借助它們的不溶性或其它手段而與分析溶液中的反應(yīng)成分分隔開來。在其它微型電化學(xué)系統(tǒng)中，采用了對電極/參比電極組合。這些電化學(xué)傳感片通常是兩電極系統(tǒng)，包括工作電極和對電極/參比電極。當(dāng)真參比電極也用作對電極時，就可能出現(xiàn)對電極/參比電極組合。因為對電極/參比電極是真參比電極，它們通常是銀(Ag)和氯化銀(AgCl)的混合物，所述混合物因其在分析溶液的含水環(huán)境中的不溶性而顯示出穩(wěn)定的電化學(xué)特性。由于在短暫使用過程中Ag與AgCl的比率不發(fā)生顯著變化，電極的電位也不會顯著改變。電化學(xué)傳感片通常是通過將試劑層包覆到分析片的導(dǎo)體表面上來制作的。為使制造便利進行，試劑層可作為單層包覆到所有的電極上。試劑層可包含促進分析物的氧化或還原反應(yīng)的酶，以及幫助電子在分析物反應(yīng)和導(dǎo)體表面之間轉(zhuǎn)移的任何介質(zhì)(mediator)或其它物質(zhì)。試劑層還可包括將酶和介質(zhì)聯(lián)結(jié)在一起的粘合劑，從而使它們能包覆到電極上。全血(WB)樣品含有紅細胞(RBC)和血漿。血漿主要是水分，但還含有一些蛋白質(zhì)和葡萄糖。血細胞比容是RBC組分的體積與WB樣品的總體積之比，一般用百分比表示。全血樣品的血細胞比容通常在20-60％的范圍，平均約40％。用以測量WB中葡萄糖濃度的常規(guī)電化學(xué)傳感片的一個缺陷被稱之為“血細胞比容效應(yīng)(hematocrit effect)”。血細胞比容效應(yīng)是由RBC妨礙介質(zhì)或其它可測量物類(species)擴散到導(dǎo)體表面進行測量而引起的。由于每次樣品測試時測量都是進行相同的時間，因此RBC濃度不相同的各血液樣品會造成測量的不準(zhǔn)確。事實的確如此，因為在RBC干擾可測量物類向?qū)w表面擴散的情況下，傳感器不能區(qū)分較低的可測量物類濃度和較高的可測量物類濃度。因此，WB樣品中RBC濃度的差異導(dǎo)致葡萄糖讀數(shù)不準(zhǔn)確(血細胞比容效應(yīng))。如果對具有同一葡萄糖水平但血細胞比容各為20、40和60％的WB樣品進行測試，用基于一套校準(zhǔn)常數(shù)(例如斜率和截距)的常規(guī)系統(tǒng)，則會報告出三個不同的葡萄糖讀數(shù)。即使葡萄糖濃度是相同的，該系統(tǒng)還是會報告出，血細胞比容20％的樣品含有的葡萄糖比血細胞比容60％的樣品多，因為RBC干擾了可測量物類向?qū)w表面的擴散。常規(guī)系統(tǒng)通常設(shè)置成假定WB樣品的血細胞比容為40％來報告葡萄糖濃度，而不管血液樣品的實際血細胞比容。對于這些系統(tǒng)，在含有小于或大于40％血細胞比容的血液樣品上進行的任何葡萄糖測量，都會包含因血細胞比容效應(yīng)所致的一些誤差。減少安培傳感器的血細胞比容效應(yīng)的常規(guī)方法包括使用過濾器(如美國專利第5,708,247號和第5,951,836號所公開)；反轉(zhuǎn)讀脈沖的電位(如WO01/57510所公開)和借助使樣品的固有電阻最大化的方法(如美國專利第5,628,890號所公開)。雖然每個這些方法平衡了多個優(yōu)點和缺點，但它們沒有一個是理想的。由以上描述可見，仍不斷需要有改進的裝置和方法，用以測量生物分析物(包括葡萄糖)的濃度。本發(fā)明的裝置和方法可減少WB樣品的血細胞效應(yīng)或其它效應(yīng)所引入的誤差。
概述在一個方面，提供包括基體(base)和在所述基體上的第一電極和第二電極的電化學(xué)傳感片。所述第一電極包括至少一個在第一導(dǎo)體上的第一層，其中所述第一層包括氧化還原酶和粘合劑。選擇所述第一層的厚度，使得當(dāng)在使用過程中給所述第一電極和第二電極施加一讀脈沖時，可測量物類基本上在所述第一層當(dāng)中被檢測，而基本上不在所述第一層外部被檢測。在另一個方面，提供提高分析物定量測定的準(zhǔn)確度的方法。所述方法包括提供具有至少一個第一層的電化學(xué)傳感片，所述第一層包括氧化還原酶、介質(zhì)和粘合劑。然后將含分析物的樣品引入到電化學(xué)傳感片中，并以讀脈沖的形式施加一電位。讀脈沖的持續(xù)時間基本上檢測所述第一層當(dāng)中的離子化形式的介質(zhì)，同時基本上將所述第一層外部的離子化形式的介質(zhì)排除在檢測之外。在一個實施方案中，提供電化學(xué)傳感片，所述電化學(xué)傳感片包括基體；在所述基體上的第一電極，其中所述第一電極包括至少一個在第一導(dǎo)體上的第一層，所述第一層包括試劑層；和在所述基體上的第二電極，選擇所述第一層的厚度，使得在使用過程中施加給所述第一電極和第二電極的讀脈沖基本上檢測所述第一層當(dāng)中的可測量物類，而基本上不檢測所述第一層外部的可測量物類。在另一個實施方案中，所述電化學(xué)傳感片進一步包括在所述第一導(dǎo)體和第一層之間的第二層，選擇所述第二層的厚度，使得在使用過程中給所述第一電極和第二電極施加的讀脈沖基本上檢測所述第二層當(dāng)中的可測量物類，而基本上不檢測所述第二層外部的可測量物類(包括所述第一層當(dāng)中的可測量物類)，其中不選擇所述第一層的厚度使得在使用過程中給所述第一電極和第二電極施加的讀脈沖基本上檢測所述第一層當(dāng)中的可測量物類。所述第二層可至少為5μm厚或者8-25μm厚。在另一個方面，所述第二層可至少為1μm厚或者5-25μm厚。所述第二層可不包含氧化還原酶和/或介質(zhì)，但可包括高分子材料。在另一個實施方案中，提供提高分析物定量測定的準(zhǔn)確度的方法，所述方法包括提供電化學(xué)傳感片，所述電化學(xué)傳感片包括基體、在所述基體上的第一導(dǎo)體、在所述基體上的第二導(dǎo)體和至少一個在至少所述第一導(dǎo)體上的第一層，其中所述至少一個第一層包括包含粘合劑的試劑層；將具有液體成分的含分析物的樣品引入到所述電化學(xué)傳感片，其中所述樣品提供所述第一導(dǎo)體和第二導(dǎo)體之間的電接通；在所述第一導(dǎo)體和第二導(dǎo)體之間施加讀脈沖形式的電位，所述讀脈沖施加的持續(xù)時間基本上檢測所述第一層當(dāng)中的可測量物類，而基本上不檢測所述第一層外部的可測量物類；測量所述讀脈沖，以提供所述樣品中分析物濃度的定量數(shù)值，這樣測量的準(zhǔn)確度比基本上檢測所述第一層外部的可測量物類的電化學(xué)傳感片要高。在施加讀脈沖之前可施加初始脈沖和時間延遲。在另一個實施方案中，提供電化學(xué)傳感片，所述電化學(xué)傳感片包括基體；在所述基體上的第一電極，其中所述第一電極包括至少一個在第一導(dǎo)體上的第一層，所述第一層包括介質(zhì)、粘合劑以及葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶和它們的混合物之至少一者；和在所述基體上的第二電極，所述第二電極包括可溶性氧化還原物類，所述可溶性氧化還原物類包括有機過渡金屬絡(luò)合物、過渡金屬配位化合物和它們的混合物之至少一者，選擇所述第一層的厚度，使得在使用過程中給所述第一電極和第二電極施加的讀脈沖基本上檢測所述第一層當(dāng)中的可測量物類，而基本上不檢測所述第一層外部的可測量物類。電化學(xué)傳感片的所述第二電極可包括在第二導(dǎo)體上的第二氧化還原物類，其中所述可溶性氧化還原物類是包括第一物類和第二物類的氧化還原對中的第一氧化還原物類，且其中所述第一氧化還原物類與所述第二氧化還原物類的摩爾比大于約1.2∶1。在另一個實施方案中，提供電化學(xué)傳感片，所述電化學(xué)傳感片包括基體；接觸所述基體以確定間隙的蓋；在所述基體上的包括第一導(dǎo)體的第一電極；在所述第一導(dǎo)體上的第二層，其中在所述第一導(dǎo)體和第二層之間不存在試劑層；在所述基體上的第二電極；和在所述間隙中的試劑層，選擇所述第二層的厚度，使得在使用過程中給所述第一電極和第二電極施加的讀脈沖基本上檢測所述第二層當(dāng)中的可測量物類，而基本上不檢測所述第一層外部的可測量物類。為對本說明書和權(quán)利要求書有清楚一致的理解，提供了以下定義。術(shù)語“系統(tǒng)”定義為通過其導(dǎo)體與電子測量裝置成電接通的電化學(xué)傳感片，所述裝置周以定量檢測樣品中的分析物。術(shù)語“測量裝置”定義為可給電化學(xué)傳感片的導(dǎo)體施加電位并測量隨后電流的電子裝置。測量裝置還可包括處理能力，以響應(yīng)所測量到的電流而確定一種或多種分析物的存在和/或濃度。術(shù)語“樣品”定義為含有未知量的目標(biāo)分析物的組合物。通常，進行電化學(xué)分析的樣品為液體形式，優(yōu)選樣品是含水混合物。樣品可以是生物樣品，如血液、尿液或唾液。樣品可以是生物樣品的衍生物，如提取物、稀釋液、過濾液或復(fù)水的沉淀物。術(shù)語“分析物”定義為樣品中所存在的一種或多種物質(zhì)。測量過程即是確定樣品中所存在的分析物的存在、數(shù)量、數(shù)目或濃度。分析物可與分析過程中所存在的酶或其它物類發(fā)生相互作用。術(shù)語“準(zhǔn)確度”定義為傳感片所測量到的分析物量對應(yīng)樣品中分析物的真實量的接近程度。術(shù)語“精密度”定義為同一樣品進行的多次分析物測量的接近程度。術(shù)語“導(dǎo)體”定義為在電化學(xué)分析過程中保持不變的導(dǎo)電物質(zhì)。導(dǎo)體材料的實例包括固體金屬、金屬漿、導(dǎo)電碳、導(dǎo)電碳漿和導(dǎo)電聚合物。術(shù)語“非離子化材料”定義為在對分析物的電化學(xué)分析過程中不發(fā)生電離的材料。非離子化材料的實例包括碳、金、鉑和鈀。術(shù)語“可測量物類”定義為可在適當(dāng)電位下在電化學(xué)傳感片的電極表面處被氧化或還原的任何電化學(xué)活性物類。可測量物類的實例包括分析物、底物或介質(zhì)。術(shù)語“穩(wěn)態(tài)”定義為可測量物類向擴散阻擋層(DBL)中的擴散速度基本上恒定時。術(shù)語“氧化還原酶”定義為促進可測量物類的氧化或還原的任何酶類。氧化還原酶為試劑。術(shù)語氧化還原酶包括“氧化酶”，其促進以分子氧為電子受主的氧化反應(yīng)；“還原酶”，其促進分析物被還原而分子氧不是分析物的還原反應(yīng)；和“脫氫酶”，其促進分子氧不是電子受主的氧化反應(yīng)。參見例如Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology，Revised Edition，A.D.Smith，Ed.，New YorkOxford University Press(1997)的第161、476、477和560頁。術(shù)語“介質(zhì)”定義為能被氧化或還原且能在第一物質(zhì)和第二物質(zhì)之間轉(zhuǎn)移一個或多個電子的物質(zhì)。介質(zhì)在電化學(xué)分析中屬試劑，不是目標(biāo)分析物，但提供分析物的間接測量。在簡單化的系統(tǒng)中，在氧化還原酶通過與適當(dāng)?shù)姆治鑫锘虻孜锝佑|而被還原或氧化后，介質(zhì)與該氧化還原酶進行氧化還原反應(yīng)。該被氧化或還原的介質(zhì)在工作電極處發(fā)生相反的反應(yīng)，而再生到它原來的氧化值。術(shù)語“電活性有機分子”定義為不含金屬而又能夠進行氧化或還原反應(yīng)的有機分子。電活性有機分子可表現(xiàn)為氧化還原物類或為介質(zhì)。電活性有機分子的實例包括輔酶吡咯并喹啉醌(PQQ)、苯醌和萘醌、N-氧化物、亞硝基化合物、羥胺、8-羥基喹啉、黃素、吩嗪、吩噻嗪、靛酚和吲達胺。術(shù)語“粘合劑”定義為與工作電極的試劑層中所采用的試劑化學(xué)上相容，在容納電極導(dǎo)體上的試劑的同時給試劑提供物理載體(support)的材料。術(shù)語“平均初始厚度”指層在引入液體樣品前在其干燥狀態(tài)下的平均高度。使用術(shù)語“平均”是因為層的上表面并不平坦，而是有峰有谷。術(shù)語“氧化還原反應(yīng)”定義為涉及至少一個電子從第一物類向第二物類轉(zhuǎn)移的兩種物類之間的化學(xué)反應(yīng)。因此，氧化還原反應(yīng)包括氧化和還原。所述反應(yīng)的氧化部分涉及到所述第一物類失去至少一個電子，還原部分涉及到所述第二物類加入至少一個電子。被氧化的物類的離子電荷其正電性增加量等于所轉(zhuǎn)移的電子數(shù)目。同樣，被還原的物類的離子電荷其正電性減少量等于所轉(zhuǎn)移的電子數(shù)目。術(shù)語“氧化值”定義為化學(xué)物類如原子的形式離子電荷。氧化值較高(如(III))，則正電性較大，氧化值較低(如(II))，則正電性較小。中性物類的離子電荷為零(0)。物類的氧化導(dǎo)致該物類的氧化值升高，物類的還原導(dǎo)致該物類的氧化值下降。術(shù)語“氧化還原對”定義為具有不同氧化值的化學(xué)物質(zhì)的兩種共軛物類。氧化值較高的物類的還原產(chǎn)生氧化值較低的物類。或者，氧化值較低的物類的氧化產(chǎn)生氧化值較高的物類。術(shù)語“可氧化物類”定義為氧化還原對中氧化值較低并因此能夠被氧化成氧化值較高的物類的物類。類似地，術(shù)語“可還原物類”定義為氧化還原對中氧化值較高并因此能夠被還原成氧化值較低的物類的物類。術(shù)語“可溶性氧化還原物類”定義為能夠進行氧化或還原且在水(pH7，25℃)中以至少1.0克/升的溶解水平可溶的物質(zhì)。可溶性氧化還原物類包括電活性有機分子、有機過渡金屬絡(luò)合物和過渡金屬配位化合物。術(shù)語“可溶性氧化還原物類”排除元素金屬和孤金屬離子，尤其是在水中不可溶或難溶者。術(shù)語“有機過渡金屬絡(luò)合物”也稱為“OTM絡(luò)合物”，定義為過渡金屬通過δ鍵或π鍵鍵合到至少一個碳原子的絡(luò)合物(通過δ鍵鍵合到過渡金屬的碳原子上的形式電荷為-1，通過π鍵鍵合到過渡金屬的碳原子上的形式電荷為0)。例如，二茂鐵是OTM絡(luò)合物，其具有兩個環(huán)戊二烯基(Cp)環(huán)，每個環(huán)通過其五個碳原子籍兩個π鍵和一個δ鍵鍵合到鐵中心。OTM絡(luò)合物的另一個實例是鐵氰化物(III)及其還原的相對物即亞鐵氰化物(II)，其中六個氰基配位體(6個配位體的每一個上的形式電荷都是-1)通過氰基碳原子籍δ鍵鍵合到鐵中心。術(shù)語“配位化合物”定義為具有明確的配位幾何，如八面體或平面正方形幾何形狀的絡(luò)合物。與通過其鍵合情況定義的OTM絡(luò)合物不同，配位化合物是通過其幾何形狀定義的。因此，配位化合物可以是OTM絡(luò)合物(如前面提到的鐵氰化物)，或者是碳以外的非金屬原子(如包括氮、硫、氧和磷在內(nèi)的雜原子)以給予方式(datively)鍵合到過渡金屬中心的絡(luò)合物。例如，六胺釕(ruthenium hexaamine)是具有明確的八面體幾何形狀的配位化合物，其中六個NH3配位體(6個配位體的每一個上的形式電荷都是0)以給予方式鍵合到釕中心。有關(guān)有機過渡金屬絡(luò)合物、配位化合物和過渡金屬鍵合的更完全討論可參見Collman et al.，Principles and Applications of OrganotransitionMetal Chemistry(1987)和Miessler&Tarr，Inorganic Chemistry(1991)。術(shù)語“在......上”定義為“處在上方”，是相對于所描述的方向而言。例如，如果第一要素(element)沉積在至少一部分第二要素的上方，則說所述第一要素“沉積在”所述第二要素“上”。又例如，如果第一要素存在于至少一部分第二要素的上方，則說所述第一要素“在”所述第二要素“上”。使用術(shù)語“在......上”并不排除所描述的上方要素和下方要素之間存在著物質(zhì)。例如，第一要素在其上表面可能覆蓋有覆層，但位于至少一部分所述第一要素及其上覆層的上方的第二要素可被描述為“在”所述第一要素“上”。因此，使用術(shù)語“在......上”可能或可不意味著所涉及的兩個要素的相互物理接觸。
附圖簡述參考以下附圖和描述，可更好地理解本發(fā)明。圖中的各部件不一定按比例繪制，而是重在說明本發(fā)明的原理。此外，在各圖中，同樣的旁注數(shù)字一般都指不同視圖中的相應(yīng)部分。

圖1是容納工作電極和對電極的傳感器基體的頂視圖。圖2是圖1的傳感器基體的端視圖。圖3是傳感器基體和在介電層下方的電極的頂視圖。圖4-6是三電極傳感片的頂視圖。圖7是圖5的傳感器基體的端視圖，描繪了第三電極。圖8是裝配完整的傳感片的透視圖。圖9A和9B描繪了施加長和短的讀脈沖過程中具有導(dǎo)體表面和DBL的工作電極。圖10A和10B這兩個圖說明了當(dāng)按本發(fā)明將DBL與短讀脈沖結(jié)合時測量準(zhǔn)確度的改進。圖11A和11B這兩個圖證實了當(dāng)采用DBL時由讀脈沖持續(xù)時間減少引起的準(zhǔn)確度改進。圖12的表格比較了用具有擴散阻擋層的多種類型傳感片以1秒和10秒讀脈沖進行的多個分析的偏差結(jié)果。圖13A-13C這三個圖說明了本發(fā)明具有DBL的傳感片采用短讀脈沖準(zhǔn)確測量樣品的真實葡萄糖濃度的能力。圖14A-14F這六個圖顯示了當(dāng)采用不同厚度的DBL/試劑層組合及連續(xù)的1秒讀脈沖時，多個葡萄糖濃度的衰減圖譜(decayprofile)。圖14G顯示了在1-2μm的DBL/試劑層組合及初始1秒讀脈沖、然后連續(xù)的0.25秒讀脈沖下，多個葡萄糖濃度的衰減圖譜。圖15比較了當(dāng)施加1、5、10和15秒讀脈沖時，具有DBL和1、3、5和10mL間隙體積的各傳感片之間的精密度。詳述微型電化學(xué)電池給患者提供幾乎即時測量其葡萄糖水平的好處。這些測量中產(chǎn)生誤差的一個主要原因血細胞比容效應(yīng)。當(dāng)紅細胞隨機影響可測量物類向工作電極的導(dǎo)體表面的擴散時，就發(fā)生血細胞比容效應(yīng)。通過測量位于擴散阻斷層(DBL)中的可測量物類，而基本上排除位于DBL外部的可測量物類，就可減少由血細胞比容和制造差異引入的測量誤差。對DBL外部的可測量物類的基本排除可通過在讀脈沖持續(xù)時間的基礎(chǔ)上選擇DBL的厚度或者通過在DBL的厚度的基礎(chǔ)上選擇讀脈沖的持續(xù)時間來實現(xiàn)。圖1是具有導(dǎo)體12和14的傳感器基體10的頂視圖，其容納工作電極20和對電極30。圖2是傳感器基體10的端視圖，描繪了工作電極20和對電極30。工作電極20可包括第一主導(dǎo)體22，而對電極30可包括第二主導(dǎo)體32。任選地，表面導(dǎo)體24和34可分別位于主導(dǎo)體22和32上。擴散阻斷層(DBL)28也可位于工作電極20的主導(dǎo)體22上。在一個方面，主導(dǎo)體22和32可包括金屬箔，其與包括一層或多層導(dǎo)電碳粉的表面導(dǎo)體24和34接觸。工作電極20可包括位于第一主導(dǎo)體22上的第一試劑層26，而對電極30可包括位于第二主導(dǎo)體32上的第二試劑層36。在另一個方面，對電極30可以是對電極/參比電極或包覆著具有已知氧化或還原電位的可溶性氧化還原物類的對電極。傳感器基體10可具有其它的構(gòu)造，包括如本領(lǐng)域所公知具有更少的部件或另外的部件的構(gòu)造。有關(guān)另外的傳感器設(shè)計，參見例如美國專利第5,120,420號和第5,798,031號，這兩個專利通過引用結(jié)合到本文中。傳感器基體10優(yōu)選是可將電化學(xué)系統(tǒng)與其周圍環(huán)境隔開的電絕緣體。在使用時，工作電極20和對電極30分別通過導(dǎo)體12和14與測量裝置(未顯示)電接通。測量裝置可在工作電極20和對電極30之間施加電位。測量裝置然后可定量測定在工作電極20、樣品(未顯示)和對電極30之間流動的電流。樣品可建立電極20和30之間的電接通。電極20和30的主導(dǎo)體22和32和任選的表面導(dǎo)體24和34可含有任何導(dǎo)電物質(zhì)，包括金屬、導(dǎo)電聚合物和導(dǎo)電碳。導(dǎo)電物質(zhì)的實例包括金屬如金、銀、鉑、鈀、銅或鎢的薄層以及導(dǎo)電碳粉的薄層。優(yōu)選的是，在傳感器的使用過程中與樣品接觸的導(dǎo)體由惰性材料制成，使得導(dǎo)體在分析過程中不發(fā)生凈氧化或凈還原。更優(yōu)選的是，在傳感器的使用過程中與樣品接觸的導(dǎo)體由非電離材料如碳、鉑和鈀制成。金屬可通過金屬箔的沉積、通過化學(xué)氣相沉積或通過金屬漿液的沉積來沉積在基體10上。導(dǎo)電碳可例如通過含碳材料的熱解或通過碳粉漿液的沉積來沉積在基體10上。所述漿液可含有超過一種類型的導(dǎo)電物質(zhì)。例如，漿液可同時含有鈀和碳粉。在漿液沉積的情況下，流體混合物可如美國專利第5,798,031號所述作為墨水施加到基體材料。當(dāng)表面導(dǎo)體24和34沉積在主導(dǎo)體22和32上時，優(yōu)選制作表面導(dǎo)體的物質(zhì)是非電離導(dǎo)電材料。當(dāng)使用主導(dǎo)體22和32而沒有獨立的表面導(dǎo)體24和34時，優(yōu)選制作主導(dǎo)體的導(dǎo)電材料是非電離材料。更優(yōu)選的是，對電極30接觸第二試劑層36的部分(主導(dǎo)體32或表面導(dǎo)體34)是非電離材料。DBL可與試劑層26構(gòu)成一整體，或者可以是圖2所描繪的獨立的層28。因此，DBL可形成為導(dǎo)體表面上的試劑/擴散阻斷層組合；形成為導(dǎo)體表面上的獨立的層；形成為導(dǎo)體表面上的獨立的層，其上是試劑層；或者形成為試劑層上的獨立的層。DBL提供具有內(nèi)部體積的多孔空間，可測量物類可位于其中。選擇DBL的孔，使得可測量物類可擴散到DBL中，而實體上較大的樣品組分如RBC基本上被排斥在外。雖然常規(guī)的傳感片已使用多種材料來將RBC過濾排除出工作電極，但本發(fā)明的DBL另外提供了內(nèi)部多孔空間來容納一部分可測量物類并使其與樣品主體(sample volume)分離。通過控制導(dǎo)體表面處的測量反應(yīng)的時間長短，傳感片可以測量DBL內(nèi)部的可測量物類，而將DBL外部的可測量物類排除在測量之外。相對于導(dǎo)體表面，DBL的內(nèi)部體積會改變其所容納的可測量物類的擴散速度相對于DBL外部可測量物類的擴散速度的物理參數(shù)。由于DBL內(nèi)部的可測量物類與DBL外部的可測量物類以不同的速度擴散到導(dǎo)體表面，工作電極處的測量反應(yīng)的時間長短決定優(yōu)先測量哪類可測量物類。DBL內(nèi)部和外部的可測量物類雖然從分子的角度來看完全相同，但它們不同的擴散速度決定了它們的本質(zhì)區(qū)別。由于工作電極20的試劑層26可包括粘合劑，在施加讀脈沖前不溶解到樣品中的任何粘合劑部分都可充當(dāng)DBL。當(dāng)將試劑與粘合材料組合在一起以提供對試劑的支撐并提供DBL時，粘合材料優(yōu)選是至少部分水溶性的高分子材料。這樣，一部分粘合材料能溶解，而粘合材料的其余部分可保持在主電極22上充當(dāng)DBL。合適的部分水溶性高分子材料包括但不限于聚環(huán)氧乙烷(PEO)、羧甲基纖維素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氨基酸如聚賴氨酸、聚磺苯乙烯、明膠、丙烯酸、甲基丙烯酸、淀粉及它們的馬來酐鹽、它們的衍生物和它們的組合。以上當(dāng)中，優(yōu)選存在PEO、PVA、CMC和HEC，其中特別優(yōu)選存在CMC和PEO。常規(guī)上用來形成將RBC排除出工作電極的過濾器的材料也可用于DBL中。相對于當(dāng)材料用作過濾器時，這可通過增加材料的厚度或通過減少工作電極處測量反應(yīng)的時間長短來實現(xiàn)。還可通過以改變材料粘度的方式形成材料來實現(xiàn)，粘度的改變例如通過引入鹽如氯化鈉或氯化鉀來進行。在另一個方面，DBL可以是獨立的DBL28。獨立的層28的平均初始厚度可至少為5μm，優(yōu)選8-25μm，更優(yōu)選8-15μm。在另一個方面，獨立的層28的平均初始厚度可至少為1μm，或優(yōu)選5-25μm。當(dāng)DBL是獨立的層時，它可由部分可溶性高分子材料制成，所述高分子材料例如是在試劑層26中用作粘合劑的相同材料，但不含試劑。獨立的層28可以是任何能提供所需的孔空間，但在傳感器的使用過程中部分或緩慢溶于水的材料。雖然在圖中沒有顯示，但當(dāng)DBL是獨立的層28時，試劑層26可不位于獨立的層28上。相反，試劑層26可位于任何允許試劑溶解于樣品中的傳感片部分上。例如，如下文針對圖8的描述，試劑層26可位于傳感器基體10上或蓋50上。在一個方面，第一和第二試劑層可包含相同的組分，且可都位于第一和第二主導(dǎo)體22和32上。當(dāng)分別用于工作電極20和對電極30的試劑層26和36具有不同的組成時，每個電極的試劑層可單獨進行最優(yōu)化。因此，第一試劑層26可含有促進分析物反應(yīng)和該反應(yīng)結(jié)果向第一主導(dǎo)體22通訊的成分。類似地，第二試劑層36可含有促進電子在所分析樣品和第二主導(dǎo)體32之間自由流動的成分。例如，摻入到第二試劑層36中的可溶性氧化還原物類可進行與分析物相反的氧化還原反應(yīng)。盡管氧化還原物類在使用過程中被消耗(即轉(zhuǎn)化成其對應(yīng)物類)，但它可在第二試劑層36中以足夠高的濃度存在，以在分析的時標(biāo)內(nèi)提供相對恒定的測量電流與分析物濃度間的線性關(guān)系。因此，與兩種電極采用同樣的試劑層的傳感片相比，通過對試劑層26和36進行單獨最優(yōu)化可獲得改進的性能。放置在對電極30上的可溶性氧化還原物類的摩爾比率較大，可增加傳感片的保存限期。在傳感片的制造和應(yīng)用于樣品之間的時間里，可能發(fā)生輕微程度的可溶性氧化還原物類向其對應(yīng)物類的自發(fā)轉(zhuǎn)化。由于可溶性氧化還原物類過量，相對濃度還會保持很高，故傳感器在保存后還可產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果。位于第一主導(dǎo)體22上的第一試劑層26可包括氧化還原酶。氧化還原酶可對目標(biāo)分析物具有特異性。氧化還原酶可對底物具有特異性，這樣氧化還原酶與其底物的反應(yīng)受目標(biāo)分析物的存在或量影響。雖然在形式意義上底物受分析物的量影響，但在本說明書和所附權(quán)利要求書中，除非另有規(guī)定，否則術(shù)語分析物意在包括樣品中存在的實際分析物或其底物。下表I中給出各種氧化還原酶及其特異性分析物的實例。
表I 例如，可將醇氧化酶用于試劑層中，以提供對樣品中醇的存在靈敏的傳感器。這種系統(tǒng)在測量血液醇濃度方面會很有用。在另一個實例中，可將葡萄糖脫氫酶或葡萄糖氧化酶用于試劑層中，以提供對樣品中葡萄糖的存在靈敏的傳感器。該系統(tǒng)在測量血液葡萄糖濃度方面，例如在已知或懷疑患糖尿病的患者中會很有用。如果兩種不同物質(zhì)的濃度通過已知的關(guān)系互相關(guān)聯(lián)，那么通過一種物質(zhì)與氧化還原酶的相互作用對其進行測量，就可計算出另一種物質(zhì)濃度。例如，氧化還原酶可提供對特定底物靈敏的傳感器，然后就可用該底物的測量濃度來計算目標(biāo)分析物的濃度。第一試劑層26可包括介質(zhì)。雖然不想受任何解釋理論的約束，但還是認(rèn)為介質(zhì)可在初始酶促反應(yīng)中充當(dāng)氧化還原輔因子，或者在與分析物的反應(yīng)發(fā)生后充當(dāng)氧化還原收集器(collector)，接受電子于或供給電子給酶或其它物類。在氧化還原輔因子的情況下，介質(zhì)據(jù)認(rèn)為是平衡分析物的氧化還原反應(yīng)的物類。因此，如果分析物被還原，那么介質(zhì)就被氧化。在氧化還原收集器的情況下，另一物類可先被氧化或還原，以平衡分析物的氧化還原反應(yīng)。該物類可以是氧化還原酶本身，或者可以是另一物類如氧化還原輔因子。酶促電化學(xué)電池中的介質(zhì)在例如美國專利第5,653,863號中有描述，該專利通過引用結(jié)合到本文中。在一些情況下，介質(zhì)可起到使氧化還原酶再生的作用。在一個方面，如果酶將分析物氧化，則酶本身被還原。該酶與介質(zhì)的相互作用可導(dǎo)致介質(zhì)被還原，同時酶被氧化回到其原始的未反應(yīng)狀態(tài)。介質(zhì)與工作電極20在適當(dāng)?shù)碾娢幌碌南嗷プ饔媚軐?dǎo)致一個或多個電子釋放到電極，同時介質(zhì)被氧化回到其原始的未反應(yīng)狀態(tài)。介質(zhì)的實例包括OTM和配位化合物，包括二茂鐵化合物如1，1′-二甲基二茂鐵；和包括美國專利第5,653,863號中描述的絡(luò)合物，如亞鐵氰化物和鐵氰化物。介質(zhì)的實例還包括電活性有機分子，包括輔酶如吡咯并喹啉醌(PQQ)；美國專利第4,746,607號(其通過引用結(jié)合到本文中)公開的取代的苯醌和萘醌；EP 0354441(其通過引用結(jié)合到本文中)具體公開的N-氧化物、亞硝基化合物、羥胺和8-羥基喹啉；EP 0330517(其通過引用結(jié)合到本文中)具體公開的黃素、吩嗪、吩噻嗪、靛酚和取代的1，4-苯醌和吲達胺；和美國專利第3,791,988號(其通過引用結(jié)合到本文中)公開的吩嗪鹽和吩嗪鹽。有關(guān)生物氧化還原系統(tǒng)的電化學(xué)介質(zhì)的綜述可參見AnalyticaClinica Acta.140(1982)第1-18頁。電活性有機分子介質(zhì)的實例還包括美國專利第5,520,786號(其通過引用結(jié)合到本文中)描述的介質(zhì)，包括3-苯基亞氨基-3H-吩噻嗪(PIPT)和3-苯基亞氨基-3H-吩嗪(PIPO)。第二試劑層36可包括可溶性氧化還原物類?？扇苄匝趸€原物類進行與氧化還原酶的分析物反應(yīng)相對的氧化還原反應(yīng)，并因此被轉(zhuǎn)化成氧化還原對中的其對應(yīng)物類。例如，如果分析物被還原，則可溶性氧化還原物類被氧化；而如果分析物被氧化，則可溶性氧化還原物類被還原。氧化還原對的對應(yīng)物類也可存在于所述層中，但優(yōu)選以低于第一(primary)氧化還原物類的濃度的濃度存在。更優(yōu)選的是，對電極上試劑層中的氧化還原物類專門是進行與氧化還原酶底物反應(yīng)相對的反應(yīng)的可溶性氧化還原物類。可溶性氧化還原物類可以是電活性有機分子、有機過渡金屬絡(luò)合物、過渡金屬配位化合物或者它們的組合。合適的電活性有機分子可包括輔酶吡咯并喹啉醌(PQQ)、取代的苯醌和萘醌、N-氧化物、亞硝基化合物、羥胺、8-羥基喹啉、黃素、吩嗪、吩噻嗪、靛酚、吲達胺、吩嗪鹽和吩嗪鹽。合適的可溶性氧化還原物類還可以是OTM絡(luò)合物或過渡金屬配位化合物。許多過渡金屬作為與氫、氧、硫或其它過渡金屬的化合物的形式天然存在，通常觀察到這些過渡金屬處在一個或多個氧化態(tài)。例如，通常發(fā)現(xiàn)鐵、鉻和鈷處在+2(即II)或+3(即III)氧化態(tài)。因此，鐵(II)和鐵(III)是氧化還原對的兩個物類。許多元素金屬或金屬離子只微溶于含水環(huán)境中。該溶解性的缺乏限制了它們在電化學(xué)分析系統(tǒng)中作為氧化還原物類平衡氧化還原反應(yīng)的效用。本來微溶的金屬或金屬離子的溶解性可通過與配位體的鍵合或配位來改進。通常，有機過渡金屬絡(luò)合物或過渡金屬配位化合物中的金屬，是在傳感片的使用過程中絡(luò)合物中實際發(fā)生還原或氧化的部分。例如，二茂鐵[Fe(II)(C5H6)2]和亞鐵氰化物[Fe(II)(CN)6]4-中的鐵中心處在+2形式氧化態(tài)，而鐵氰化物[Fe(III)(CN)6]3-則含有處于+3形式氧化態(tài)的鐵。亞鐵氰化物和鐵氰化物一起形成氧化還原對。取決于工作電極試劑層中存在的氧化還原酶的類型，這兩個金屬絡(luò)合物之任一者都可用作對電極上試劑層中的可溶性氧化還原物類。含有過渡金屬配位化合物的氧化還原對的實例是兩種六胺釕物類[Ru(III)(NH3)6]3+和[Ru(II)(NH3)6]2+的組合?？扇苄匝趸€原物類在電化學(xué)傳感片的使用過程中能夠形成氧化還原對。存在于對電極30上試劑層36中的該氧化還原對物類(稱為第一物類)，優(yōu)選以比同一氧化還原對中的對應(yīng)物類(即第二物類)更大的摩爾數(shù)量存在。優(yōu)選的是，第一物類與第二物類的摩爾比為至少1.2∶1。更優(yōu)選的是，第一物類與第二物類的摩爾比為至少2∶1。再更優(yōu)選的是，第一物類與第二物類的摩爾比至少為10∶1或至少100∶1。在目前特別優(yōu)選的一個方面，在傳感片用于分析前氧化還原對的第二物類以至多千分之一(1ppt)或至多百萬分之一(1ppm)的量存在。優(yōu)選的是，可溶性氧化還原物類溶解于樣品中，并與分析物和其它樣品組分混合?？扇苄匝趸€原物類隨時間推移會與酶和介質(zhì)混合，盡管這在分析的進程中可能不會發(fā)生到任何可測量程度。可溶性氧化還原物類不被機械屏障將其與液體樣品分離開來，也不會由于其在與液體樣品不同的單獨相中的存在而與液體樣品分離開來。在一個優(yōu)選實施方案中，選擇相對于標(biāo)準(zhǔn)氫電極(SHE)具有+0.24伏或更高的標(biāo)準(zhǔn)還原電位的可溶性氧化還原物類。在另一個優(yōu)選實施方案中，選擇相對于SHE具有+0.35伏或更高的標(biāo)準(zhǔn)還原電位的可溶性氧化還原物類。在又一個優(yōu)選實施方案中，選擇相對于SHE(0.01MHCl中)具有約+0.48伏還原電位的氧化還原物類。因此，有很多種氧化還原酶、介質(zhì)和可溶性氧化還原物類組合可用來制備電化學(xué)分析傳感器。氧化值相對于氧化還原對中的對應(yīng)物類較高或較低的可溶性氧化還原物類的使用，受在工作電極處要進行的反應(yīng)類型支配。在一個實施例中，分析物通過與氧化酶或脫氫酶的相互作用而發(fā)生氧化。在該情況下，對電極上的較為濃縮的氧化還原物類具有較高的氧化值。該情形的一個具體實例是用葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶分析葡萄糖。在另一個實施例中，分析物通過與還原酶的相互作用而受到還原。在該情況下，對電極上的較為富集的氧化還原物類具有較低的氧化值。在任一個這些實施例中，介質(zhì)可以是和對電極上較為富集的氧化還原物類相同的物質(zhì)，或者是另一氧化還原對的氧化還原物類。圖3是傳感器基體10的頂視圖，包括在介電層40下方的導(dǎo)體12和14以及電極20和30。介電層40可部分覆蓋電極20和30，且可由任何合適的介電層如絕緣聚合物制成。介電層40可將電極接觸到第一和第二試劑層26和36的部分與電極接觸到導(dǎo)體12和14的部分分隔開來。如果存在介電層40，可在分別用試劑層26和36包覆電極20和30之前、過程中或之后將其沉積在傳感器基體10上。可通過任何便利的方法，如印刷沉積、液體沉積或噴墨沉積，用試劑層26、36包覆電極20、30。在一個方面，試劑層通過印刷法沉積在電極20、30上。在其它因素相當(dāng)?shù)臈l件下，印刷刀片的角度會逆向影響位于電極20、30上的試劑層的厚度。例如，當(dāng)?shù)镀源蠹s82°角度向傳感器基體10移動時，所得的一層或多層試劑層可具有大約10μm的厚度。類似地，當(dāng)采用朝向傳感器基體10大約為62°的刀片角度時，則可產(chǎn)生更厚的30μm層。在這個方面，較低的刀片角度可提供較厚的試劑層。除刀片角度外，其它因素也會影響所得的試劑層26、36的厚度，包括構(gòu)成試劑層的材料的厚度。圖4-6是三電極傳感片的頂視圖，每個傳感片都具有傳感器基體10、工作電極20、對電極30、導(dǎo)體12和14、導(dǎo)體13和第三電極70。第三電極70可通過導(dǎo)體13與測量裝置(未顯示)電接通。測量裝置可測量在工作電極20、第三電極70和建立電極間電連通的樣品(未顯示)之間的電位流動。在另一個方面，測量裝置可給工作電極20、第三電極70和樣品施加電位并進行測量。傳感器基體10可具有其它的構(gòu)造，包括如本領(lǐng)域所公知具有更少的部件或另外的部件的構(gòu)造。圖7是圖5的傳感器基體10的端視圖，描繪任選第三電極70。在一個方面，任選第三電極70可以是真參比電極。在另一個方面，第三電極70可以用包含可溶性氧化還原物類的第三試劑層76進行包覆。任選第三電極表面導(dǎo)體74可位于第三主導(dǎo)體72上。在一個方面，第三主導(dǎo)體72包括金屬箔，而表面導(dǎo)體74包括一層或多層導(dǎo)電碳粉。第三試劑層76和第二試劑層36可包括相同的組分，或者具有不同的組分，這取決于預(yù)定的用途。在一個方面，第三試劑層76是第二試劑層36的一部分，第二試劑層36沉積在主導(dǎo)體32和72上。當(dāng)表面導(dǎo)體74沉積在主導(dǎo)體72上時，優(yōu)選制作表面導(dǎo)體的物質(zhì)是非電離導(dǎo)電材料。當(dāng)使用主導(dǎo)體72而沒有獨立的表面導(dǎo)體層74時，優(yōu)選制作主導(dǎo)體的導(dǎo)電材料是非電離材料。更優(yōu)選的是，第三電極70接觸第三試劑層76的部分(主導(dǎo)體72或表面導(dǎo)體74)是非電離材料。第三試劑層76可包括與第一和第二試劑層26(未顯示)和36相同的組分。在另一個方面，第三試劑層76可包括與第二試劑層36相同的組分。在又一個方面，第三試劑層76可包括專門適用于促進電子在待分析樣品和第三主導(dǎo)體72之間自由流動的成分。試劑層76可含有如上針對圖2所述的可溶性氧化還原物類。優(yōu)選第三電極70的試劑層76在組成上與對電極30的試劑層36完全相同。如果第三電極和對電極上的試劑層完全相同，那么用單獨一份試劑層組合物來包覆這兩個電極是適宜的。第三電極70的使用對于一些應(yīng)用來說是適宜的。所施加的電壓準(zhǔn)確度提高，能使分析物的測量準(zhǔn)確度更好。當(dāng)使用第三電極70時，還有可能做到減少對電極30的尺寸或者施加更少量的氧化還原物類到對電極。如果如圖6所示將第三電極70安置在對電極30的上游，則當(dāng)施加到傳感片的樣品不足時(這種情況稱之為“未充滿”)也有可能進行檢測。當(dāng)有充足的樣品來使工作電極20和第三電極70之間的電路完整，但沒有充足的樣品來覆蓋對電極30時，會出現(xiàn)未充滿檢測的情況。電池中電流的缺乏會被以電子方式轉(zhuǎn)換成信號送給使用者，指示使用者給傳感片添加更多的樣品。圖8是裝配好的傳感片800的透視圖，所述傳感片包括傳感器基體10，其至少部分上被蓋50覆蓋，所述蓋包括出口54、凹入?yún)^(qū)52和輸入端開口60。優(yōu)選蓋50覆蓋但不接觸試劑層26和36(未顯示)，從而提供蓋50和電極之間的間隙56?？赏ㄟ^將液體樣品引入到傳感片800的開口60，將生物樣品轉(zhuǎn)移到電極。液體將間隙56充滿，同時通過出口54將間隙56先前包含的空氣排出。這樣，樣品造成電極間的電接通。間隙56可含有幫助將液體樣品保留在間隙中的物質(zhì)(未顯示)，所述保留通過將樣品及其內(nèi)容物固定化在電極上方區(qū)域中來進行。這種物質(zhì)的實例包括水可溶脹聚合物如羧甲基纖維素和聚乙二醇；和多孔聚合物基質(zhì)如葡聚糖和聚丙烯酰胺。如果通過開口60引入的樣品含有氧化還原酶所作用的分析物，則一旦試劑層和樣品發(fā)生接觸，分析物和該酶之間的氧化還原反應(yīng)就會開始。所發(fā)生的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生或消耗的電子可通過在工作電極和對電極之間施加電位(即電壓)并測量電流來定量。可將該電流測量與樣品中的分析物濃度關(guān)聯(lián)起來，條件是系統(tǒng)已用含有已知量分析物的類似樣品進行過校準(zhǔn)。或者，可用第三電極70(圖4-7)來監(jiān)測所施加的電壓。電位預(yù)定值的任何偏移都可通過第三電極給電路提供反饋，使電壓能得到適當(dāng)調(diào)整。測量裝置優(yōu)選具有必要的電路和微處理器來提供有用的信息，如樣品中的分析物濃度、患者體內(nèi)的分析物濃度或者與被測分析物相關(guān)的另一物質(zhì)的相應(yīng)濃度。一旦通過開口60引入樣品，樣品就開始溶解并與試劑層26、36和任選的76發(fā)生反應(yīng)。在施加電位前提供一“孵化期”是有利的，在這期間試劑將一部分分析物轉(zhuǎn)化成可測量物類。雖然可采用較長的孵化期，但優(yōu)選在通過開口60引入樣品的同時或緊接之后，就給傳感片800初始施加電壓。對孵化期的更為深入的論述可在美國專利第5,620,579號和第5,653,863號中找到。初始施加的電壓可維持設(shè)定的時間段，如對于常規(guī)傳感片為約10秒，然后停止。然后在設(shè)定的延遲時間段可不施加電壓，例如常規(guī)傳感片的約10秒。在該延遲時間后，可在傳感片的工作電極和對電極之間施加恒定的電位或“讀脈沖”，以測量分析物的濃度。對于常規(guī)的安培傳感器，施加該讀脈沖，同時在5-10秒的讀時間內(nèi)監(jiān)測電流。就間隙56所容納的樣品體積而言，5-10秒的讀脈沖是相當(dāng)長的。與常規(guī)的5-10秒的讀脈沖不同，當(dāng)工作電極20(圖2)配置本發(fā)明的DBL時，優(yōu)選較短的讀時間。圖9A和9B描繪了在施加長和短的讀脈沖過程中具有導(dǎo)體表面930和DBL 905的工作電極900。樣品(未顯示)施加到工作電極900，包括位于DB L905上的RBC920、位于樣品中的外部可測量物類910和位于DBL 905當(dāng)中的內(nèi)部可測量物類915。如圖9A所示，當(dāng)將長的10秒讀脈沖施加到工作電極900時，外部和內(nèi)部可測量物類910和915都通過氧化態(tài)的變化在導(dǎo)體表面930的表面處被測量。在該測量過程中，外部可測量物類910擴散通過保留著RBC 920的樣品區(qū)和通過DBL 905，從而在表面930處被測量。如前面所討論，測量過程中外部可測量物類910通過RBC920的擴散會引入血細胞比容效應(yīng)。此外，如圖9A所描繪，施加到具有DBL的傳感片的長讀脈沖的運行方式與施加到無DBL的傳感片的短讀脈沖相似。相似是因為可測量物類在讀脈沖期間要擴散通過RBC才在導(dǎo)體表面處被測量。在任一情況下，讀脈沖期間所測量到的物類基本上來源于測試樣品。和圖9A不同，圖9B描繪的情況是讀脈沖施加到具有本發(fā)明的DBL 905的傳感片900。在這種情況下，DBL 905中存在的內(nèi)部可測量物類915在表面930處發(fā)生氧化態(tài)的變化。在讀脈沖期間基本上所有的位于DBL 905外部的可測量物類910要么仍保持在DBL的外部，要么基本上沒有擴散通過DBL 905到達導(dǎo)體表面930。因此，本發(fā)明基本上將外部可測量物類910排除在測量之外，而是測量位于DBL 905內(nèi)部的可測量物類915。圖10A和10B這兩個圖說明了當(dāng)按本發(fā)明將DBL與短讀脈沖結(jié)合時測量準(zhǔn)確度的改進。將全血樣品與亞鐵氰化物以5∶1稀釋比組合，以代表潛在的葡萄糖濃度，并以1秒讀脈沖進行測量。因此，初始的20％、40％和60％血細胞比容全血樣品被稀釋成16％、32％和48％血細胞比容(所有三個血細胞比容值都減少20％)。20％、40％和60％圖線代表血細胞比容分別為16％、32％和48％的血液樣品所測量到的電流。圖10A顯示由沒有DBL的裸導(dǎo)體傳感片因血細胞比容和其它效應(yīng)所引入的誤差。誤差以20％和60％血細胞比容圖線之間的差異(總血細胞比容偏差范圍)表示，代表了可歸因于血細胞比容效應(yīng)的最大測量誤差。偏差值越小則代表結(jié)果越準(zhǔn)確。如上文針對圖9A所討論，當(dāng)使用DBL和較長的讀脈沖時，觀察到類似的表現(xiàn)。相反，圖10B顯示當(dāng)將本發(fā)明的DBL與1秒讀脈沖結(jié)合時，20％和60％校準(zhǔn)圖線之間的距離明顯減少。將PEO聚合物和10％KCl的獨立DBL(不含試劑)印刷在上文圖10A所用的導(dǎo)體表面上。令人驚訝的是，DBL/短讀脈沖情況下的血細胞比容總偏差范圍比無DBL的總偏差范圍少了差不多三分之二。因此，本發(fā)明與常規(guī)的裸導(dǎo)體電極相比顯著增加了測量準(zhǔn)確度。雖然不想受任何具體理論的約束，但目前還是認(rèn)為，通過相對于DBL厚度限制讀時間的長度，本發(fā)明可利用到這樣的現(xiàn)象可測量物類擴散到DBL孔中的速度是可變的，而可測量物類從DBL的內(nèi)部體積向?qū)w表面的擴散速度是恒定的。認(rèn)為由全血基質(zhì)造成的向DBL中擴散程度的變化產(chǎn)生了血細胞比容效應(yīng)。因此，由包括RBC的樣品組分引入的測量誤差(偏差)，可通過基本上將測量限制于DBL內(nèi)部體積中存在的可測量物類(其據(jù)認(rèn)為具有相對恒定的擴散速度)來減少。圖11A和11B這兩個圖證實了當(dāng)采用DBL時由讀脈沖持續(xù)時間的減少引起的準(zhǔn)確度改進。圖11A顯示在無DBL情況下，0.9、5、10和15秒讀脈沖下的偏差幾乎完全相同。不管讀脈沖的長度如何，總偏差范圍值為～40％和以上(平均50％)，因為介質(zhì)到達導(dǎo)體表面的能力受到樣品組分(包括RBC)的影響。但是，如圖11B所示，當(dāng)采用DBL時，取決于亞鐵氰化物濃度，0.9秒讀脈沖的偏差總體上是5秒讀脈沖所觀察到的偏差的一半以下，且可比常規(guī)的10秒讀脈沖所觀察到的偏差低2.5倍。當(dāng)與DBL結(jié)合時優(yōu)選小于5秒的讀脈沖，更優(yōu)選小于3秒的讀脈沖。在另一個方面，優(yōu)選0.1-2.8或0.5-2.4秒的讀脈沖。在又一個方面，優(yōu)選0.05-2.8或0.1-2.0秒的讀脈沖。目前，更優(yōu)選0.8-2.2或0.8-1.2秒的讀脈沖，尤其優(yōu)選0.1-1.5或0.125-0.8秒的讀脈沖。可選擇施加讀脈沖過程中存在的DBL的厚度，使得在脈沖過程中基本上阻止位于DBL外部的可測量物類擴散到導(dǎo)體表面。圖12這個表格比較了用多種類型具有DBL的傳感片進行的多個分析得到的，1秒和10秒讀脈沖的偏差結(jié)果。該表顯示了含有50、100、200和400mg/dL葡萄糖的全血樣品的總偏差范圍值。50mg/dL樣品列出的是絕對偏差值，而100、200和400mg/dL樣品則顯示％偏差。對于10秒和1秒讀脈沖，都對各個葡萄糖濃度的偏差值取平均值。較短的1秒讀脈沖與常規(guī)的10秒都脈沖相比，使偏差值極大地降低，降低率為約21％至約90％。對于所進行的36個試驗，總體的平均偏差降低率為約50％。因此，本發(fā)明的DBL與短讀脈沖的組合顯著地提高了測量準(zhǔn)確度。圖13A-13C這三個圖說明了具有DBL的傳感片采用短讀脈沖準(zhǔn)確測量樣品的真實葡萄糖濃度的能力。這些圖的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)通過測量含有作為可測量物類的亞鐵氰化物的全血和血漿溶液中的電流來收集。由于血漿樣品缺乏RBC，血漿測量沒有因血細胞比容效應(yīng)而引入的誤差。相反，在全血樣品上所作的測量包括了血細胞比容效應(yīng)所引入的誤差。圖13A將裸導(dǎo)體傳感片在1秒讀脈沖下收集到的血漿和全血測量值建立關(guān)聯(lián)。所得相關(guān)性圖線的斜率只有0.43，表明全血樣品中存在的可測量物類平均只有43％被測量到。與此對比，圖13B將具有DBL的傳感片在1秒讀脈沖下收集到的血漿和全血測量值建立關(guān)聯(lián)。所得相關(guān)性圖線的斜率為明顯較高的0.86，表明全血樣品中存在的可測量物類有86％被測量到。因此，與裸導(dǎo)體相比，相對全血樣品中實際分析物濃度，本發(fā)明短的讀脈沖結(jié)合DBL可提供測量的100％改進。圖13C說明讀脈沖持續(xù)時間降低能提高配置有本發(fā)明DBL的傳感片的測量性能。圖中顯示了前面針對圖13A和13B描述的全血和血漿樣品中獲得的1、5和10秒讀脈沖測量值的相關(guān)性圖線。1、5和10秒脈沖的相關(guān)性圖線斜率分別為0.86、0.78和0.71。因此，讀脈沖持續(xù)時間的降低能減少測量誤差。當(dāng)使用DBL/試劑層組合時，初始脈沖和延遲的長度影響到在以后施加的讀脈沖過程中的DBL厚度。如前面所討論，DBL/試劑層組合依賴于能在施加讀脈沖前部分溶解到樣品中的水溶性粘合材料。在讀脈沖過程中仍保持的含試劑的粘合材料充當(dāng)著DBL。由于樣品一通過開口60(圖8)引入，粘合材料就開始溶解，在初始脈沖和延遲期過程中所經(jīng)過的時間影響到有多少組合層在讀脈沖過程中仍保持導(dǎo)體表面上。因此，為確保有充足的粘合材料保持在導(dǎo)體上充當(dāng)有效的DBL，可優(yōu)選較短的初始脈沖和延遲時間。但是，取決于讀脈沖的持續(xù)時間，DBL厚度存在著優(yōu)選的上限，因為DBL厚度增加可能導(dǎo)致傳感器系統(tǒng)未能在施加讀脈沖前達到“穩(wěn)態(tài)”。在傳感器系統(tǒng)達到穩(wěn)態(tài)前，DBL中的可測量物類的濃度并不準(zhǔn)確地代表樣品中的可測量物類的濃度。在一個方面，DBL和樣品中可測量物類濃度間的該差異可歸因于DBL復(fù)水狀態(tài)的變化。因此，如果在達到穩(wěn)態(tài)條件前施加讀脈沖和進行記錄，所測量到的可測量物類的濃度可能與樣品中的濃度不相關(guān)。DBL和樣品中可測量物類濃度間的相關(guān)性的該缺乏可能會給測量引入誤差，從而抵消掉通過將位于DBL外部的可測量物類排除在測量之外所另外獲得的準(zhǔn)確度改進。圖14A至14F這六個圖說明了當(dāng)采用不同初始厚度的DBL/試劑層組合及連續(xù)的1秒讀脈沖時，所獲得的多個葡萄糖濃度結(jié)果。數(shù)據(jù)是采用多個200mV讀脈沖獲得的，每個讀脈沖持續(xù)時間1秒，被0.5秒等待時間隔開。下表II列出了每個圖的大約平均DBL/試劑層厚度和達到穩(wěn)態(tài)的大約時間。當(dāng)單個讀脈沖獲得的最后時間數(shù)據(jù)點代表了任何單個讀脈沖獲得的最后時間數(shù)據(jù)點中的最大電流值時，可觀察到穩(wěn)態(tài)條件的大致開始。因此，對于圖14F，在約1.5秒時起始的讀脈沖的最后時間(最右邊)～1750nA數(shù)據(jù)點確定出，穩(wěn)態(tài)在674.8mg/dL葡萄糖濃度下在約2.5秒時達到。
表II 表II的數(shù)據(jù)確定，對于0.5秒延遲后1秒讀脈沖來說，DBL/試劑層組合的平均初始厚度優(yōu)選小于30或23微米(μm)，更優(yōu)選小于16μm。0.5-5秒延遲后0.5-1.2秒讀脈沖時所用的DBL/試劑層組合的優(yōu)選平均初始厚度是5-15μm或11-14μm。0.5-5秒延遲后0.05-2.8秒讀脈沖時所用的DBL/試劑層組合的更優(yōu)選平均初始厚度是1-15μm或2-5μm。因此，對于0.8-1.2秒讀脈沖來說，這些厚度在讀脈沖過程中基本上將可測量物類排除在導(dǎo)體表面之外，同時讓傳感器系統(tǒng)達到穩(wěn)態(tài)。雖然施加到導(dǎo)體的試劑層的優(yōu)選初始厚度決定于初始脈沖長度、延遲時間和讀脈沖的持續(xù)時間，但對于5秒以下的讀脈沖持續(xù)時間，優(yōu)選5-30μm或1-20μm的試劑層厚度。此外，對于持續(xù)時間1.5秒或以下的讀脈沖，優(yōu)選試劑層厚度為1-10μm或2-5μm?？筛鶕?jù)何時達到穩(wěn)態(tài)，給特定的讀脈沖長度(如表II的1秒讀脈沖)選擇所需的DBL/試劑層組合平均初始厚度。在一個方面，優(yōu)選6秒以下的初始脈沖和延遲時間。更優(yōu)選初始脈沖時間1-4秒，延遲時間0.5-5秒。在一個更優(yōu)選的方面，選定初始脈沖和延遲時間，使得當(dāng)施加讀脈沖時，至少有50％的DBL/試劑層組合平均初始厚度仍保持在導(dǎo)體表面上。在另一個方面，當(dāng)施加讀脈沖時，有60-85％或70-80％的組合層平均初始厚度仍保持在導(dǎo)體表面上。對于特定的讀脈沖長度，優(yōu)選的DBL厚度還可能取決于DBL的性質(zhì)。測量過程中可測量物類移動通過DBL越慢，所需的DBL越薄。但是，如果可測量物類擴散通過DBL太慢，則可能難以獲得所需的穩(wěn)態(tài)條件?？蓽y量物類擴散通過DBL的速度，還可用會影響測試樣品和/或DBL孔內(nèi)部的離子強度的添加劑來改變。在一個方面，添加劑可以是鹽如氯化鈉或氯化鉀，其以1-2摩爾的濃度存在于沉積溶液/漿中。也可使用化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的影響測試樣品離子強度的其它鹽和組合物。以3秒以下的讀脈沖測量DBL中可測量物類的另一個優(yōu)點是，因傳感片800(圖8)的間隙56中樣品體積不同造成的測量不精確得以減少。如果讀脈沖持續(xù)到基本上所有間隙56中存在的可測量物類都被測量，則所作測量不再代表樣品中可測量物類的濃度，相反是在測量間隙56中的可測量物類的量；這是完全不同的測量。當(dāng)讀脈沖相對于間隙56的體積來說變長時，電流測量將決定于間隙56的體積而不是潛在的分析物濃度。因此，如果脈沖長度“超越(overshoot)”間隙56中存在的可測量物類，則較長的讀脈沖可導(dǎo)致出現(xiàn)對分析物濃度而言十分不準(zhǔn)確的測量。因此，電化學(xué)傳感片中間隙56的體積的任何差異，都可能導(dǎo)致測量不精確，因為測量裝置中的電子器件對每個測試都施加相同的電位和執(zhí)行相同的計算。因此，對于相同的樣品，如果讀脈沖超越間隙體積，間隙體積較大的常規(guī)傳感片顯示的分析物濃度高于間隙體積較小的傳感片。通過將測量基本上限制于DBL中存在的可測量物類，本發(fā)明可減少由間隙體積不同的各個傳感片所引入的不精確。這樣就可減少其它情況下傳感片的制造差異對測量結(jié)果產(chǎn)生的影響。圖15比較了當(dāng)施加1、5、10和15秒讀脈沖時，具有DBL和1、3、5和10mL間隙體積的各傳感片之間的精密度。表A給出的數(shù)據(jù)是在2秒前脈沖和4秒延遲后緊接著1、5、10和15秒讀脈沖時收集的數(shù)據(jù)。表B給出的數(shù)據(jù)是在4秒前脈沖和2秒延遲后緊接著1、5、10和15秒讀脈沖時收集的數(shù)據(jù)。對于每個間隙體積和讀脈沖持續(xù)時間的組合，各校準(zhǔn)圖線的斜率和截距間的差異以％-CV表示。表A和B的％-CV值表明，隨著讀脈沖持續(xù)時間的增加，因間隙體積的差異造成的測量不精確也增加。對于兩種脈沖順序，各間隙體積之間的偏差對～1秒讀脈沖來說最小，對15秒讀脈沖來說最大。這些結(jié)果進一步證實了按本發(fā)明采用DBL與短脈沖長度的好處。當(dāng)測量間隙56(圖8)中存在的可測量物類時，除了血細胞比容效應(yīng)和間隙體積差異之外，如果液體樣品在測量過程中移動，也會引入分析物讀數(shù)正誤差。樣品的該移動會將新分析物引入到工作電極周圍已經(jīng)存在恒定擴散模式的區(qū)域，從而使測量歪曲。本發(fā)明通過測量DBL內(nèi)部的具有相對恒定擴散速度的可測量物類，同時基本上將DBL外部的擴散速度可變的可測量物類排除在測量之外，可進一步減少由樣品移動引入的測量誤差。雖然已描述了本發(fā)明的各種實施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)還可能有其它實施方案和實施方式。因此，除所附權(quán)利要求及其等同權(quán)利要求外，本發(fā)明不受其它限制。
權(quán)利要求
1.一種電化學(xué)傳感片，所述傳感片包括基體；在所述基體上的第一電極，所述第一電極包括至少一個在第一導(dǎo)體上的第一層，所述第一層包括試劑層；和在所述基體上的第二電極，選擇所述第一層的厚度，使得分析物分析過程中給所述第一電極和第二電極施加的讀脈沖基本上檢測在所述第一層當(dāng)中的可測量物類，而基本上不檢測所述第一層外部的可測量物類。
2.權(quán)利要求1的電化學(xué)傳感片，其中所述試劑層包含氧化還原酶和粘合劑。
3.前述權(quán)利要求中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述第二電極包括在第二導(dǎo)體上的第一層。
4.前述權(quán)利要求中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述讀脈沖的持續(xù)時間在5秒以下。
5.權(quán)利要求1-3中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述讀脈沖的持續(xù)時間在3秒以下。
6.權(quán)利要求1-3中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述讀脈沖的持續(xù)時間為0.05秒至2.8秒。
7.權(quán)利要求1-3中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述讀脈沖的持續(xù)時間為0.1秒至1.5秒。
8.前述權(quán)利要求中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述第一層的平均初始厚度為至少1μm。
9.權(quán)利要求1-7中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述第一層的平均初始厚度在30μm以下。
10.權(quán)利要求1-7中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述第一層的平均初始厚度為1-30μm。
11.權(quán)利要求1-7中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述第一層的平均初始厚度為5-25μm。
12.前述權(quán)利要求中任一項的電化學(xué)傳感片，其中進一步選擇所述第一導(dǎo)體上的第一層的平均初始厚度，使得當(dāng)施加讀脈沖時至少50％的厚度保持在所述導(dǎo)體上。
13.權(quán)利要求1-11中任一項的電化學(xué)傳感片，其中進一步選擇所述第一導(dǎo)體上的第一層的平均初始厚度，使得當(dāng)施加讀脈沖時70-80％的厚度保持在所述導(dǎo)體上。
14.一種電化學(xué)傳感片，所述傳感片包括基體；在所述基體上的第一電極，其中所述第一電極包括至少一個在第一導(dǎo)體上的第一層，所述第一層包括試劑層和在所述第一導(dǎo)體與所述第一層之間的第二層；和在所述基體上的第二電極，選擇所述第二層的厚度，使得分析物分析過程中給所述第一電極和第二電極施加的讀脈沖基本上檢測所述第二層當(dāng)中的可測量物類，而基本上不檢測所述第二層外部的可測量物類。
15.權(quán)利要求14的電化學(xué)傳感片，其中所述第二層的平均初始厚度為至少1μm。
16.權(quán)利要求14的電化學(xué)傳感片，其中所述第二層的平均初始厚度為5-25μm。
17.權(quán)利要求14-16中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述第二層不包括大量的氧化還原酶和介質(zhì)之至少一者。
18.權(quán)利要求14-17中任一項的電化學(xué)傳感片，其中所述第二層包含聚合物材料。
19.權(quán)利要求18的電化學(xué)傳感片，其中所述所述聚合物材料包括聚環(huán)氧乙烷、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、它們的衍生物和它們的組合之至少一者。
20.權(quán)利要求18的電化學(xué)傳感片，其中所述所述聚合物材料部分溶于水。
21.一種提高定量分析物測定的準(zhǔn)確度的方法，所述方法包括將具有液體成分的含分析物的樣品引入到電化學(xué)傳感片，所述傳感片具有基體、在所述基體上的第一導(dǎo)體、在所述基體上的第二導(dǎo)體和至少一個在至少所述第一導(dǎo)體上的第一層，其中所述至少一個第一層包括包含粘合劑的試劑層，而樣品提供所述第一導(dǎo)體和第二導(dǎo)體之間的電接通；在所述第一導(dǎo)體和第二導(dǎo)體之間施加讀脈沖形式的電位，所述讀脈沖施加的持續(xù)時間基本上檢測所述第一層當(dāng)中的可測量物類，而基本上不檢測所述第一層外部的可測量物類；測量所述讀脈沖，以提供所述樣品中分析物濃度的定量數(shù)值，所述測量相對于基本上檢測所述第一層外部的可測量物類的電化學(xué)傳感片具有提高的準(zhǔn)確度。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述提高的準(zhǔn)確度至少部分由通過液體移動效應(yīng)引入到分析物濃度測定的誤差的減少所導(dǎo)致。
23.權(quán)利要求21-22中任一項的方法，所述方法進一步包括改進多個電化學(xué)傳感片之間的分析物濃度定量值的精密度，其中所述樣品位于每個傳感片的基底和蓋之間形成的間隙中，所述間隙的體積在所述多個電化學(xué)傳感片的個體之間有變化。
24.權(quán)利要求21-23中任一項的方法，所述方法進一步包括在施加讀脈沖之前施加初始脈沖和時間延遲。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述初始脈沖為1-4秒。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述時間延遲為2-4秒。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進的電化學(xué)生物傳感片和測定樣品中分析物濃度的方法。通過選擇性測量位于擴散阻擋層中的可測量物類，而基本上排除位于擴散阻擋層外部的可測量物類，可減少由樣品組成(如紅細胞)和制造差異引入的測量誤差。
文檔編號G01N33/487GK101073000SQ200580042103
公開日2007年11月14日 申請日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月12日
發(fā)明者伍煥平 申請人:拜爾健康護理有限責(zé)任公司