專利名稱：良性前列腺增生(bph)的人蛋白標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)良性前列腺增生(BPH)的新的蛋白標(biāo)記以及檢測(cè)BPH的方法。
背景技術(shù)：
良性前列腺增生(BPH)是一種常見(jiàn)的、與日益增長(zhǎng)的年齡相關(guān)的前列腺紊亂。很高比例的年齡超過(guò)50歲的男性(68％)具有良性前列腺增生的組織學(xué)證據(jù)，截至70歲，百分之四十三(43％)的男性具有臨床上明顯的前列腺增大。該疾病的特征是前列腺的尿道周圍與過(guò)渡區(qū)域處的腺體及肌纖維組織逐漸增大，從而導(dǎo)致膀胱出口梗阻的癥狀。僅僅在美國(guó)，每年為BPH要進(jìn)行350,000至400,000例手術(shù)，這使得它成為美國(guó)最常見(jiàn)的治療，總花費(fèi)達(dá)45億美元。BPH的發(fā)病率遠(yuǎn)高于前列腺癌，但對(duì)其病因幾乎沒(méi)有什么了解。不過(guò)，普遍認(rèn)為高齡男性中睪酮與雌激素之間平衡的細(xì)微變化可能會(huì)引發(fā)前列腺的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致BPH。良性(或惡性)疾病引起的前列腺腫大一般導(dǎo)致前列腺部尿道順應(yīng)性降低并增加膀胱出口梗阻。結(jié)果經(jīng)常在膀胱中發(fā)生次級(jí)變化。這些變化包括膀胱壁肥大以及小梁與憩室的形成。逼肌的次級(jí)變化主要是與前列腺梗阻、遺尿、尿頻尿急相關(guān)的最為棘手的癥狀相關(guān)。根本的機(jī)制仍然具有爭(zhēng)論，但可能同梗阻膀胱中逼肌發(fā)育不穩(wěn)定有部分關(guān)聯(lián)。
導(dǎo)致膀胱出口梗阻的BPH傳統(tǒng)上通過(guò)經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)(TURP)來(lái)治療。盡管TURP被認(rèn)為是BPH外科處理中的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但存在高頻率的并發(fā)癥。例如，70％的切除案例受到不同程度的逆行性射精的困擾，1-2％導(dǎo)致尿失禁。作為選擇，BPH可以通過(guò)施用諸如α-受體阻滯劑這類藥物或者通過(guò)使用非那雄胺(Proscar)阻滯睪酮對(duì)前列腺的活性來(lái)進(jìn)行治療。后一種藥物是通過(guò)抑制5-α還原酶的活性阻止睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢僦械幕钚孕问紻HT來(lái)發(fā)揮作用的。利用這種手段，可以阻止前列腺受到男性激素的刺激，防止其進(jìn)一步生長(zhǎng)，這樣來(lái)預(yù)防臨床BPH的發(fā)展。然而，在長(zhǎng)至可檢測(cè)的大小或者發(fā)展至需要進(jìn)行外科手術(shù)的癥狀之前，尚無(wú)可靠的標(biāo)記來(lái)檢測(cè)BPH。而到了可檢測(cè)的時(shí)候，在絕大多數(shù)情況下，膀胱逼肌已經(jīng)被損害，其中相當(dāng)數(shù)量即便在TURP后也無(wú)法獲得改善?，F(xiàn)有的那些眾所周知的標(biāo)記——前列腺酸性磷酸酶(PAP)及前列腺特異抗原(PSA)，盡管可用于檢測(cè)前列腺癌，但在BPH早期檢測(cè)方面并不是非常有用。PSA是當(dāng)前最好的最有用處的用于檢測(cè)前列腺癌的標(biāo)記。不過(guò)，由于BPH與前列腺癌在PSA水平上有很大重疊，在那些兩可病例中尤為如此(PSA水平范圍為4-10ng/ml)，因此無(wú)法精確區(qū)分BPH與前列腺癌。已經(jīng)嘗試通過(guò)測(cè)量游離PSA(PSA沒(méi)有與蛋白酶抑制劑結(jié)合)與總PSA(游離PSA加上與α-1-抗糜蛋白酶[ACT]結(jié)合的PSA)的比例，或者聯(lián)合PSA與hK2，來(lái)改善兩可區(qū)域診斷的精確度。不過(guò)，相當(dāng)數(shù)量的受試者仍然被錯(cuò)誤分類。
近來(lái)全世界幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了一些嘗試，其焦點(diǎn)是用于BPH的特異性標(biāo)記。Mikolajczyk與其同事已報(bào)道來(lái)自BPH病人前列腺組織過(guò)渡區(qū)域的一種游離PSA修飾形式有所升高，他們稱之為BPSA(BPH相關(guān)PSA)。
他們進(jìn)一步報(bào)道了在精漿中存在BPSA。BPSA用作BPH標(biāo)記的潛力正在積極探索中。目前對(duì)前列腺癌發(fā)生的研究證實(shí)通過(guò)皮下注射睪酮(T)及苯甲雌二醇(E2)可輕易誘發(fā)前列腺癌。這與分泌蛋白譜的并發(fā)變化、許多多肽生長(zhǎng)因子的改變表達(dá)、間質(zhì)平滑肌紊亂以及包括在動(dòng)物模型的前列腺癌及人前列腺癌的發(fā)育及發(fā)展過(guò)程中Id-1基因過(guò)量表達(dá)在內(nèi)的差異基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。通過(guò)將Id-1基因轉(zhuǎn)然已知的人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中對(duì)該基因的功能進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)它通過(guò)滅活p161NK4a/RB可在無(wú)血清培養(yǎng)基中刺激癌細(xì)胞增殖，其中包括激活MAPK及NF-KB途徑。通過(guò)使用激素誘發(fā)的前列腺癌Noble大鼠模型，發(fā)現(xiàn)施用激素膠囊后2-3個(gè)月在前列腺中首先檢測(cè)到發(fā)育異常。發(fā)育異常/癌的發(fā)展與一種新的分泌蛋白，與人激肽釋放酶2(hK2)同源并且是前列腺特異抗原(PSA)基因家族成員的一種的激肽釋放酶樣蛋白的出現(xiàn)同時(shí)發(fā)生。盡管PSA(hK3)在前列腺癌診斷方面有用，但它并不是腫瘤特異性的。為了找到更好且更特異的用于前列腺癌的腫瘤標(biāo)記進(jìn)行了全球范圍的廣泛檢索，其中hK2是候選之一，因?yàn)樗乃脚c前列腺癌更直接線性相關(guān)，表現(xiàn)出了更多的腫瘤特異性。目前的研究表明在人BPH中，分泌蛋白譜有相類似的改變，其中可能會(huì)分泌能夠在前列腺分泌物和/或血清中可檢測(cè)的特異蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種診斷受試者是否患有良性前列腺增生(BPH)的方法，該方法包括從受試者獲取前列腺液樣品、以及分析該前列腺液樣品以檢測(cè)BPH蛋白標(biāo)記存在與否從而確定受試者是否患有BPH。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種診斷受試者是否患有良性前列腺增生(BPH)的方法，該方法包括從受試者獲取血清樣品、以及分析該血清樣品以檢測(cè)BPH蛋白標(biāo)記存在與否從而確定受試者是否患有BPH。
最后，本發(fā)明提供一種含有BPH蛋白標(biāo)記與使用說(shuō)明書(shū)的用于檢測(cè)良性前列腺增生(BPH)標(biāo)記的診斷試劑盒，以及含有針對(duì)PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白的抗體與使用說(shuō)明書(shū)的用于檢測(cè)良性前列腺增生(BPH)標(biāo)記的診斷試劑盒。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1是BPH及非BPH對(duì)照的人前列腺液(EPS)中分泌蛋白的雙向電泳分析。根據(jù)等電點(diǎn)(pI，pH3-10)及分子量分離200μg蛋白，凝膠用銀染來(lái)處理。所示的是來(lái)自年輕組(A)、同齡對(duì)照組(B)及BPH患者(C)的具有代表性的凝膠。箭頭指示僅在BPH樣品中存在的(斑點(diǎn)1-3)、在BPH中高表達(dá)的(斑點(diǎn)4)以及在BPH及正常對(duì)照中均表達(dá)的(斑點(diǎn)或者斑痕5-8)蛋白斑。
圖2所示的是經(jīng)ESI-MS/MS后斑點(diǎn)1(PSP94的同種異型，[iPSP94]，即PSP61)的譜圖。圖表頂部所示的是MS/MS離子，圖表底部包含MasEnt43譜圖。
圖3是經(jīng)ESI-MS/MS后斑點(diǎn)1(iPSP94，[即PSP61])的片段序列，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后確認(rèn)為PSP94，但其僅有61氨基酸，因此為PSP61。
圖4所示的是經(jīng)ESI-MS/MS后斑點(diǎn)2(血清白蛋白)的譜圖。圖表頂部所示的是MS/MS離子，圖表底部包含MasEnt43譜圖。
圖5是經(jīng)ESI-MS/MS后斑點(diǎn)2(血清白蛋白)的片段序列，圖表頂部所示的是MS/MS離子，圖表底部包含MasEnt43譜圖。
圖6所示的是低分子量PSA(lwPSA)的片段序列。
圖7是斑點(diǎn)3中αs1-酪蛋白的譜圖。圖表頂部所示的是MS/MS離子，圖表底部包含MasEnt43譜圖。
圖8為斑點(diǎn)3中αs1-酪蛋白的片段序列。
圖9是經(jīng)MALDI-MS后斑點(diǎn)5中多肽的譜圖。譜圖是在反射模式、質(zhì)量范圍為600-3400Da的條件下獲得的。所提取多肽的譜圖經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后鑒定為鋅-α-2-糖蛋白。
圖10是經(jīng)MALDI-MS后斑點(diǎn)6中多肽的譜圖。譜圖是在反射模式、質(zhì)量范圍為600-3400Da的條件下獲得的。所提取多肽的譜圖經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后鑒定為微精漿蛋白(microseminoprotein)(PSP94)。
圖11是經(jīng)MALDI-MS后斑點(diǎn)8中多肽的譜圖。譜圖是在反射模式、質(zhì)量范圍為600-3400Da的條件下獲得的。所提取多肽的譜圖經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后鑒定為前列腺酸性磷酸酶(PAP)。
圖12是經(jīng)MALDI-MS后斑點(diǎn)4(乳鐵傳遞蛋白)的譜圖。圖表頂部所示的是MS/MS離子，圖表底部包含MasEnt43譜圖。
圖13經(jīng)ESI-MS/MS后斑點(diǎn)4(乳鐵傳遞蛋白)的片段序列，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后確認(rèn)為乳鐵傳遞蛋白。
圖14所示的是在人正常前列腺、BPH及前列腺癌樣品中αs1-酪蛋白的免疫染色(A×100；B×200；C、D、E、F，×400)。
圖15是在人正常前列腺、BPH及前列腺癌中αs1-酪蛋白的免疫反應(yīng)性。所有正常前列腺與70％的前列腺癌樣品的αs1-酪蛋白反應(yīng)為陰性。僅30％的前列腺癌樣品分別表現(xiàn)出輕度至中等的αs1-酪蛋白免疫反應(yīng)性。相反，91％的BPH樣品表現(xiàn)出中等至強(qiáng)烈的αs1-酪蛋白免疫反應(yīng)性，其中36％為++并且55％為+++水平。
發(fā)明的詳細(xì)描述定義在本申請(qǐng)的用法中，其中如果沒(méi)有另外特別說(shuō)明，下述每個(gè)術(shù)語(yǔ)均為下文所闡述的意思。
在本文用法中，“受試者”可以是諸如靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、豚鼠或者兔子等任何動(dòng)物。在優(yōu)選實(shí)施例中，受試者是人。
在本文用法中，“蛋白標(biāo)記”指所發(fā)現(xiàn)的蛋白其水平與模式癌癥相關(guān)?！癇PH蛋白標(biāo)記”是其水平與BPH診斷相關(guān)的蛋白。
發(fā)明的實(shí)施例本發(fā)明提供了一種診斷受試者是否患有良性前列腺增生(BPH)的方法，該方法包括從受試者獲取前列腺液樣品、以及分析該前列腺液樣品以檢測(cè)BPH蛋白標(biāo)記存在與否從而確定受試者是否患有BPH。在優(yōu)選實(shí)施例中，受試者為人類男性。通過(guò)直腸途徑手指擠壓病人的前列腺可獲得分泌的前列腺液樣品。在一個(gè)實(shí)施例中，使用雙向電泳法與質(zhì)譜分析來(lái)檢測(cè)標(biāo)記蛋白。針對(duì)這些標(biāo)記蛋白的特異的抗血清增加了?？梢允褂冕槍?duì)蛋白標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)蛋白標(biāo)記。在優(yōu)選實(shí)施例中，蛋白標(biāo)記包括PSP61、lwPSA或者αs1-酪蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種診斷受試者是否患有良性前列腺增生(BPH)的方法，該方法包括從受試者獲取血清樣品、以及分析該血清樣品以檢測(cè)BPH蛋白標(biāo)記存在與否從而確定受試者是否患有BPH。在優(yōu)選實(shí)施例中，受試者為人類男性，蛋白標(biāo)記包括PSP61、lwPSA或者αs1-酪蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以應(yīng)用使用抗體的免疫放射分析來(lái)檢測(cè)蛋白標(biāo)記。這些抗體可以是針對(duì)PSP61、lwPSA或者αs1-酪蛋白的單克隆抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于檢測(cè)良性前列腺增生(BPH)標(biāo)記的診斷試劑盒。在一個(gè)實(shí)施例中，該診斷試劑盒含有BPH蛋白標(biāo)記與使用說(shuō)明書(shū)。在另一個(gè)實(shí)施例中，用于檢測(cè)良性前列腺增生(BPH)的診斷試劑盒包括針對(duì)PSP61、lwPSA或者αs1-酪蛋白的抗體以及使用說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體是單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，抗體吸附在某種基質(zhì)上。
下述的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)用以說(shuō)明如何實(shí)施本發(fā)明，其不應(yīng)被視為以任何形式限制了本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)已經(jīng)進(jìn)行了廣泛研究用以分析通過(guò)直腸指檢(DRE)直接擠壓前列腺所獲得的前列腺分泌物。已知通過(guò)以上過(guò)程收集的分泌物為前列腺液(EPSs)。正常人前列腺(年輕組及同齡對(duì)照組)與BPH的EPS樣品分別與蛋白酶抑制劑混合，冷凍條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。通過(guò)雙向電泳對(duì)正常前列腺及BPH的EPS進(jìn)行的比較分析表明，在BPH分泌物中有多種蛋白被差異表達(dá)。特別地，僅僅在BPH樣品中發(fā)現(xiàn)了稱為斑點(diǎn)1、2和3的三個(gè)主要斑點(diǎn)，而在正常/同齡樣品中則完全缺失或者以極低以至無(wú)法檢測(cè)的水平表達(dá)(圖1)。盡管還有其它的差異表達(dá)的斑點(diǎn)(即，斑點(diǎn)4等)，但目前關(guān)注的焦點(diǎn)仍然是這三個(gè)主要斑點(diǎn)(斑點(diǎn)1-3)。利用質(zhì)譜檢測(cè)以及mass sequencing(在悉尼Macquarie大學(xué)澳大利亞蛋白質(zhì)組分析研究組[APAF]的協(xié)助下)對(duì)這些差異表達(dá)的斑點(diǎn)進(jìn)行分析，表明斑點(diǎn)1為PSP94的“同種異型物”(iPSP94；MW 14kDa，pI 4.5)或者是β-微精漿蛋白，即已知的類抑制素多肽(3-抑制素)。我們進(jìn)一步鑒定了該蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白實(shí)際上含有61個(gè)氨基酸(而非PSP94的94個(gè)氨基酸)(參見(jiàn)圖2和3)，因此應(yīng)該更確切的稱之為PSP61。斑點(diǎn)2(MW為9kDa，pI 5-5.5)被證實(shí)為血清白蛋白(圖4、5)，而斑點(diǎn)3(MW 10kDa，pI 8.5-9.3)含有兩種蛋白一種是低分子量的PSA(lwPSA)(圖6)，另一種為αs1-酪蛋白(圖7、8)。
為了檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的有效性和可靠性，對(duì)在正常、同齡對(duì)照及BPH樣品中均存在的幾個(gè)主要蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行了分析。例如，斑點(diǎn)5為鋅-α-2-糖蛋白(圖9)，斑點(diǎn)6至8分別為PSP94(圖10)、PSA[數(shù)據(jù)未列出，由Western blotting證實(shí)]及前列腺酸性磷酸酶[PAP](圖11)。進(jìn)一步注明斑點(diǎn)4實(shí)際上是乳鐵傳遞蛋白(圖12、13)。已經(jīng)證實(shí)這些蛋白可以同特異的抗血清作用，而且它們?cè)粓?bào)道為前列腺的分泌成分。
在本研究中，使用了年輕成年男性(40歲以下)的EPS樣品與同齡未患有BPH的EPS。來(lái)自已確認(rèn)患有前列腺癌的病人的EPSs沒(méi)有包括在內(nèi)，原因是因?yàn)榻^大多數(shù)患有前列腺癌的病人其BPH程度總是變化的。因此，如果包括來(lái)自前列腺癌病人的EPSs只會(huì)多余地在初期搞亂BPH信號(hào)。三個(gè)前列腺癌細(xì)胞系，LNCaP(PSA+)、PC3(PSA-)及DU145(PSA-)的上清，經(jīng)雙向電泳分析后發(fā)現(xiàn)，LNCaP(連同其它兩個(gè)細(xì)胞系)對(duì)于lwPSA是陰性的，在所有三個(gè)細(xì)胞系中沒(méi)有或者僅僅是痕量PSP94被檢出。在人體中，已報(bào)道PSP94在前列腺癌中被下調(diào)。這有助于支持我們的假設(shè)——lwPSA與PSP94及PSP61在前列腺癌細(xì)胞中不在任何重要途徑中表達(dá)。
I BPH分泌物中特異性標(biāo)記蛋白的鑒定及特征A.收集前列腺分泌物從10名年齡為40歲或以下(正常)的男性、50歲同齡對(duì)照及50名年齡在60-70歲之間并確診患有BPH的男性中收集前列腺液(EPSs)。在著手進(jìn)行任何治療方案之前，從正常組、同齡對(duì)照組(未患有BPH)與BPH病人(已確診)中獲得EPS樣品(每份約1ml)，分別與蛋白酶抑制劑混合，冷凍條件下(-80℃)儲(chǔ)存?zhèn)溆?。它們分別稱作非BPH(正常的與同齡對(duì)照)及BPH-EPS(BPH)。
B.雙向凝膠電泳采用根據(jù)Wilkins等編輯的書(shū)所述的方案(31)總結(jié)在下面幾個(gè)段落中，使用IPGphor Isoelectric Focusing System與垂直SDS-PAGE，對(duì)來(lái)自正常組、同齡對(duì)照組及BPH病人的EPS進(jìn)行雙向凝膠電泳。
1.第一向——等電聚焦(IEF)使用固定pH梯度(IPG)膠條(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行等電聚焦。將5μl EPS溶解或稀釋在250μl再水化液(8M尿素，2％CHAPS，0.5％IPG緩沖液)中，含有樣品的水化液加入到IPG膠條中，使其再水化14h。EPS樣品在從100V(2h)、500V(1h)1000V(1h)至8000V(4h)逐漸增高的電壓下進(jìn)行電泳。在第一向IEF中，蛋白根據(jù)其pH值進(jìn)行分離。
2.第二向——SDS-PAGE在平衡緩沖液(50mM Tris-Cl，6M尿素，30％甘油，2％SDS，DTT 10mg/ml或者碘乙酰胺25mg/ml，以及示蹤染料)中平衡IPG膠條30分鐘。隨后，將IPG膠條置于垂直SDS-PAGE體系(Hoefer SE600)中，根據(jù)分子量通過(guò)電泳來(lái)分離蛋白。所獲得的凝膠利用銀染試劑盒(Amersham)進(jìn)行銀染。在ImageMaster 2D Elite凝膠分析軟件(Amersham)的協(xié)助下對(duì)來(lái)自年輕組和同齡對(duì)照組及BPH組的EPS的雙向凝膠進(jìn)行比較，以顯示差異表達(dá)蛋白概況。
C.質(zhì)譜分析Young CYF，Seay T，Higen K，Charlesworth MC，RochePC，Klee GG，Tindall D，Prostate[Suppl]717-24(1996)中所述的實(shí)驗(yàn)步驟如下。
1.襯質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)方法為了進(jìn)行質(zhì)譜分析，電泳圖可用銀或考馬斯亮藍(lán)來(lái)染色。確定雙向凝膠上差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)，切下用于質(zhì)譜分析。在質(zhì)譜分析中，我們請(qǐng)求澳大利亞蛋白質(zhì)組分析研究組(APAF)給予協(xié)助。使用的是MALDI-MS方法。所分離的蛋白斑點(diǎn)首先于37C進(jìn)行膠內(nèi)胰蛋白酶切。所獲得的多肽使用10％乙腈、1％TFA溶液從膠中提取，用ZipTip進(jìn)行純化。多肽從基質(zhì)上洗脫，置于MALDI靶上并風(fēng)干。然后使用一臺(tái)Micromass ToF Spec 2E飛行時(shí)間質(zhì)譜學(xué)進(jìn)行MALDI-MS。使用氮激光器(337nm)照射樣品，通過(guò)反射模式在600-3400Da的質(zhì)量范圍獲得譜圖。利用近點(diǎn)校正，可以給出典型的～100ppm或者更低的質(zhì)量精度。然后可獲得來(lái)自樣品多肽的單一同位素峰列表(圖10-12)。用Peptldent對(duì)SWISS-PROT和TREMBL中智人(Homo sapiens)的肽質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行檢索。這可以基于肽指紋給出最相似的候選蛋白。
2.電噴霧離子化質(zhì)譜/Mass Sequencing(ESI-MS/MS)差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)的性質(zhì)進(jìn)一步通過(guò)ESI-MS/MS來(lái)確認(rèn)。經(jīng)16h胰蛋白酶消化后，所獲得的多肽使用ZipTip純化以濃縮并除去鹽分。利用配備納米噴霧源(nanospray source)的Micromass Q-TOF MS通過(guò)ESI-TOF MS/MS分析樣品，使用硼硅酸毛細(xì)管手動(dòng)獲得數(shù)據(jù)。獲取m/z范圍超過(guò)400-1800的數(shù)據(jù)，以選取用于MS/MS分析的多肽。選定多肽后，將機(jī)器調(diào)節(jié)到質(zhì)譜/Mass Sequence模式，在多種碰撞能量設(shè)置下收集m/z范圍50-2000的數(shù)據(jù)。生成多肽片段及片段離子(Y系列離子用于所關(guān)注多肽的測(cè)序)的譜圖。通過(guò)這些收集的數(shù)據(jù)，可以確定所關(guān)注多肽的氨基酸序列?；谒x取多肽的氨基酸序列數(shù)據(jù)，可以確定最可能的蛋白。
II特異標(biāo)記蛋白的細(xì)胞來(lái)源通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜對(duì)這些差異表達(dá)蛋白的性質(zhì)進(jìn)行了鑒定，使用免疫組織化學(xué)和原位雜交方法對(duì)三個(gè)特異蛋白的細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行檢測(cè)，并評(píng)估這些蛋白標(biāo)記在BPH中的特異性。
A.抗血清的生成為了確定這些蛋白的細(xì)胞來(lái)源，生成了針對(duì)這些蛋白的抗血清。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)步驟，采用了Alpha Diagnostic International，SanAntonio，TX，USA的服務(wù)，在基于標(biāo)記蛋白通過(guò)大量測(cè)序所確定的已知氨基酸序列的基礎(chǔ)上生成特異性針對(duì)這些蛋白的抗體。
B.免疫組織化學(xué)(IHC)抗血清的特異性首先針對(duì)相應(yīng)差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)。然后將這些抗血清用于正常人前列腺、同齡對(duì)照組、BPH組及前列腺癌樣品的IHC。結(jié)果表明BPH的前列腺上皮細(xì)胞對(duì)這些標(biāo)記蛋白表現(xiàn)出陽(yáng)性反應(yīng)，而基質(zhì)組織則是陰性的(圖14、15)。這表明特異性的標(biāo)記蛋白是由BPH上皮細(xì)胞分泌的。
III.蛋白標(biāo)記的檢測(cè)最后階段就是檢測(cè)PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白是否存在于BPH病人的血清中，以開(kāi)發(fā)出一種通過(guò)檢測(cè)血清中是否存在這些蛋白來(lái)診斷BPH的方法，并特別在臨界情形下評(píng)估新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記與PSA水平的相關(guān)性。
A.簡(jiǎn)介由于血檢是最便利的臨床檢測(cè)方法之一，因此本計(jì)劃的最后一步就是檢測(cè)這三個(gè)蛋白能否在BPH病人的血液中檢出，以及它們是否是BPH病人所特有的。同時(shí)也將檢驗(yàn)PSA水平，并研究PSA水平與這三個(gè)蛋白水平之間的關(guān)聯(lián)。我們預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)PSA與PSP94將會(huì)是陽(yáng)性的，因?yàn)橐阎鼈兪谴嬖谟谘逯小ｎA(yù)計(jì)這些分子的變體(即PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白)也將會(huì)進(jìn)入血液，因此能夠在血清中檢出。一旦獲得確認(rèn)，這將被證明在臨床癥狀尚未出現(xiàn)前的早期BPH診斷中是非常有用的。然后可以考慮生產(chǎn)檢驗(yàn)試劑盒。
B.收集用于化驗(yàn)的血液從新近被診斷患有BPH的100個(gè)病人中按標(biāo)準(zhǔn)方式收集靜脈血(20ml)。為了進(jìn)行比較，還收集了20個(gè)正常男子(年齡40歲以下)與50個(gè)同齡對(duì)照的血液。此外，為了進(jìn)行比較，從50個(gè)PSA水平范圍在4-10nm/ml的病人中收集血液樣品。樣品在室溫下放置1小時(shí)，然后在3500rpm離心10分鐘，使血清與其它血液組分分離。之后將樣品保存在20℃?zhèn)溆谩?br> C.確定PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白血清濃度通過(guò)免疫反射分析(Tandem-R PSA，Hybritech，Inc.)或者Labrie等描述的方法(34)對(duì)樣品進(jìn)行分析，用于不含PSA的常規(guī)血清及總PSA的檢驗(yàn)。對(duì)這些方法通過(guò)使用所生成的特異的單克隆抗體(即lwPSA、PSP61及αs1-酪蛋白)來(lái)代替原始抗體進(jìn)行了調(diào)整，用來(lái)檢驗(yàn)血清lwPSA、PSP61及αs1-酪蛋白。所獲得的數(shù)據(jù)同常規(guī)PSA或PSP94的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。一旦確立了檢驗(yàn)方法，便可進(jìn)行大規(guī)模的血清檢查以確定這些蛋白作為BPH標(biāo)記的特異性。
D.特異性BPH標(biāo)記的水平與特別涉及PSA水平臨界高度(即，4-10ng/ml)的血清PSA水平的關(guān)系評(píng)估所有確診為BPH的病人(100)的PSA水平，并比較這些PSA水平與本研究中確定的BPH標(biāo)記。對(duì)PSA水平為臨界高度的病人體內(nèi)的BPH特異標(biāo)記，也通過(guò)確定其特異BPH標(biāo)記(即PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白)的血清水平來(lái)進(jìn)行了評(píng)估。通過(guò)比較BPH病人中PSA水平與特異BPH標(biāo)記以及血清PSA為臨界高度的患者中的這些標(biāo)記，可以確定后者是否患有前列腺癌。PSA(臨界高度)與特異標(biāo)記同時(shí)升高的病人可能僅患有BPH。在另一方面，特異BPH標(biāo)記降低或者為無(wú)法檢測(cè)水平的病人更可能患有前列腺癌。
下列參考文獻(xiàn)在本說(shuō)明書(shū)種引用。這些參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為背景和現(xiàn)有技術(shù)引入本發(fā)明。
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權(quán)利要求
1.一種診斷受試者是否患有良性前列腺增生(BPH)的方法，包括(a)從受試者獲取前列腺液樣品，以及(b)分析該前列腺液樣品以檢測(cè)BPH蛋白標(biāo)記存在與否從而確定受試者是否患有BPH。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中受試者為人類男性，并且通過(guò)擠壓受試者前列腺來(lái)獲得樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中前列腺液樣品通過(guò)雙向電泳與質(zhì)譜進(jìn)行分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中BPH蛋白標(biāo)記使用針對(duì)BPH蛋白標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中蛋白標(biāo)記包括PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白。
6.一種診斷受試者是否患有良性前列腺增生(BPH)的方法，包括(a)從受試者獲取血清樣品，以及(b)分析該血清樣品以檢測(cè)BPH蛋白標(biāo)記存在與否從而確定受試者是否患有BPH。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中的方法，其中受試者為人類男性。
8.根據(jù)權(quán)利要求6中的方法，其中使用免疫放射分析來(lái)檢測(cè)蛋白標(biāo)記。
9.根據(jù)權(quán)利要求6中的方法，其中BPH蛋白標(biāo)記使用針對(duì)BPH蛋白標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6中的方法，其中蛋白標(biāo)記包括PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白。
11.一種用于檢測(cè)良性前列腺增生(BPH)標(biāo)記的診斷試劑盒，其包含BPH蛋白標(biāo)記與使用說(shuō)明書(shū)。
12.一種用于檢測(cè)良性前列腺增生(BPH)標(biāo)記的診斷試劑盒，其包含針對(duì)PSP61、lwPSA及αs1-酪蛋白的抗體及使用說(shuō)明書(shū)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的診斷試劑盒，其中抗體是單克隆抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的診斷試劑盒，其中抗體吸附在基質(zhì)上。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種診斷受試者是否患有良性前列腺增生(BPH)的方法，該方法包括從受試者獲取前列腺液樣品、以及分析該前列腺液樣品以檢測(cè)BPH蛋白標(biāo)記存在與否從而確定受試者是否患有BPH。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種診斷受試者是否患有良性前列腺增生(BPH)的方法，該方法包括從受試者獲取血清樣品、以及分析該血清樣品以檢測(cè)BPH蛋白標(biāo)記存在與否從而確定受試者是否患有BPH。最后，本發(fā)明提供一種含有BPH蛋白標(biāo)記與使用說(shuō)明書(shū)的用于檢測(cè)良性前列腺增生(BPH)標(biāo)記的診斷試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/567GK1849511SQ200480025775
公開(kāi)日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2004年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者王云川, 許克新, 王向紅 申請(qǐng)人:香港大學(xué)