專利名稱：使用nk細胞增效化合物提高治療性抗體功效的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及提高治療性抗體功效的方法和組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及治療性抗體與阻斷自然殺傷細胞的抑制性受體或刺激自然殺傷細胞的活化受體的化合物的聯(lián)合使用，從而使得哺乳動物患者的自然殺傷細胞的細胞毒性效用增強，尤其是通過提升ADCC機制以增強在人類患者中的治療功效。
背景技術(shù)：
人類的許多治療方案都是建立在使用治療性抗體的基礎(chǔ)之上。這些包括，例如使用已開發(fā)的治療性抗體來使靶細胞衰竭，特別是病態(tài)細胞如病毒侵染的細胞、腫瘤細胞或其它病源細胞。這些抗體是典型的IgG類的單克隆抗體，典型的是具有人IgG1或IgG3 Fc部分。這些抗體可以是天然抗體或重組抗體，并且通常是“人源化”的小鼠抗體(即，包括來自各種物種的功能域，典型的是人或非人靈長類的Fc部分、并帶有小鼠源的可變區(qū)或互補決定區(qū)(CDR))?？蛇x替代的是，該單克隆抗體可以在具有人Ig位點的轉(zhuǎn)基因的小鼠中通過免疫作用而完全人源化，或通過由衍生自人類細胞的cDNA文庫獲得。
該治療性抗體的一個特殊的例子是利妥昔單抗(rituximab)(美羅華Mabthera，Rituxan)，它是一種由人γ1和κ恒定區(qū)(因而帶有人IgG1 Fc部分)與帶有CD20特異性的鼠可變區(qū)連接成的嵌合抗-CD20單克隆抗體。在過去的幾年中，利妥昔單抗已經(jīng)極大地改變了對B淋巴細胞增生性癌變，尤其是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治療方案。人源化的IgG1抗體的其它例子包括用于治療B細胞惡性腫瘤(癌變)的阿來組單抗(alemtuzumab)(Campath-1H)、和用于治療乳腺癌的曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin)。開發(fā)中的治療性抗體的其它例子正在本領(lǐng)域中出現(xiàn)。
治療性抗體的作用機制仍然是一個爭論的話題。注入抗體，導致帶有被該抗體特異性識別抗原的細胞的衰竭。該衰竭作用可以通過至少3種機制來介導抗體介導的細胞毒性(ADCC)、補體依賴型溶解、和通過作為抗體靶標的抗原給出的信號對腫瘤生長的直接抗腫瘤抑制。
盡管這些抗體代表了一種人類治療，尤其是對于治療腫瘤，的全新和有效的方法，但是它們并不都具有很強的療效。例如，盡管利妥昔單抗單獨施用(給予)或與化療藥物聯(lián)合施用(給予)顯示出對于治療中低度和高度NHL有效，但是30％至50％的低度NHL患者對于利妥昔單抗沒有臨床反應(yīng)。有人提出淋巴細胞表面上的CD20表達水平、治療期間存在的高腫瘤負荷、或血清中利妥昔單抗的低濃度可以解釋為什么在一些患者中利妥昔單抗沒有療效。然而，治療失敗的實際原因在很大程度上仍然是未知的。
另外，由于施用治療性抗體的副作用，使得治療性抗體的使用受到了限制。例如，在患者中出現(xiàn)的發(fā)熱、頭痛、惡心、低血壓、哮喘、皮疹、感染和許多其它可能出現(xiàn)的副作用潛在地限制了施用抗體的可能劑量或頻率。
因此，提高治療性抗體的療效或者能夠減少抗體的使用劑量來實現(xiàn)療效從而盡量減少可能產(chǎn)生的副作用，是令人感興趣的。本發(fā)明將著手解決這些問題及其它需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明披露了增強治療性抗體功效的新方法。無須受下述理論的限制，我們認為使用本發(fā)明方法所得到驚人的結(jié)果是由于當注入治療性抗體時，它們在體內(nèi)能夠強化ADCC機制。實際上，本發(fā)明提供的全新的組合物和方法能夠克服目前與治療性抗體療效相關(guān)的困難。在本發(fā)明中可以看到來自個體的NK細胞由于缺少NK細胞的活化，即通過在抑制NK細胞上的抑制受體，而具有很差的治療性單克隆抗體(mAb)介導的ADCC。優(yōu)選地，ADCC機制的提高是通過施用阻斷在自然殺傷細胞上的抑制受體或刺激在自然殺傷細胞上的活化受體的化合物，從而促進哺乳動物患者增強自然殺傷細胞的細胞毒性作用來實現(xiàn)的。優(yōu)選的化合物是抗體或其片段。
所述抗體或其它化合物可以與NK細胞的抑制性受體(例如殺傷細胞抑制性受體(KIR或NKG2A/C)分子進行反應(yīng)，或與其活化受體(例如NK細胞上的NKp30、NKp44或NKp46這樣的NCR)反應(yīng)，從而中和細胞的抑制作用并且增加了其ADCC活性。
更具體而言，本發(fā)明披露了治療患者的方法，其中阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的化合物，優(yōu)選是抗體或其片段，與治療性抗體聯(lián)合施用于患者。本文中發(fā)明人證明了治療性抗體通過如共注射方式與優(yōu)選為抗體或其片段的這類化合物聯(lián)合施用，通過例如阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激NK細胞的活化受體而克服了NK細胞的抑制，從而可以極大地增強其治療功效。
本發(fā)明還涉及包括治療性抗體和阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激NK細胞活化受體的化合物的藥物組合物，該化合物優(yōu)選為抗體或其片段。本發(fā)明還涉及包括治療性抗體和阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激NK細胞的活化受體的化合物的試劑盒，該化合物優(yōu)選為抗體或其片段。
本發(fā)明還涉及將阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激NK細胞的活化受體的化合物(優(yōu)選為抗體或其片段)用于增加治療性抗體的治療功效，或用于提高用治療性抗體進行治療的患者體內(nèi)的ADCC的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物(優(yōu)選為抗體或其片段)和治療性抗體用于制備治療疾病的藥物中的應(yīng)用。更具體而言，該疾病的治療需要消除(耗盡)靶細胞，優(yōu)選為患病的細胞，如病毒感染的細胞、腫瘤細胞或其它病原細胞。優(yōu)選地，該疾病是癌、傳染性疾病或免疫疾病。更優(yōu)選的是，該疾病選自包括癌癥、自身免疫疾病、炎癥、和病毒性的一組病癥。該疾病還涉及移植排斥，更為具體的是同種異體移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)。
本發(fā)明還包括用于減少治療性抗體(例如通過Fcγ受體結(jié)合的抗體，優(yōu)選為CD16(FcγRIIIa))劑量的方法。例如，治療性抗體與阻斷NK細胞上的抑制性受體或刺激NK細胞上的活性受體的化合物的聯(lián)合施用可以允許使用低劑量的治療性抗體。這類抗體可以以比沒有該化合物時的推薦劑量少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低的劑量使用。
另外，本發(fā)明提供了用于測定治療性抗體(例如由CD16結(jié)合的抗體)的有效治療量和減小劑量的方法。該方法包括i)將第一濃度的治療性抗體與靶細胞和NK細胞共同孵育，并且沒有阻斷NK細胞上的抑制性受體或刺激其上的活化受體的化合物存在；ii)將第二較低濃度的治療性抗體與靶細胞和NK細胞共同孵育，并且存在阻斷NK細胞上的抑制性受體或刺激其上的活化受體的化合物；iii)測定步驟ii)中所觀察到的靶細胞的消除(耗竭)是否與步驟i)中所觀察到的消除一樣多。如果觀察到步驟ii)與步驟i)同樣有效，那么可以改變化合物和治療性抗體的相對濃度，并且觀察消除(耗竭)情況，從而確定適用于特定患者的不同條件，例如針對患者的不同需要最大程度地消除靶細胞，并盡量減少治療性抗體的劑量或盡量減少化合物的劑量。
在一個特定方面，本發(fā)明提供了一種在有需要的人類患者體內(nèi)治療疾病的方法，包括a)對所述患者施用阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物；以及b)對所述患者施用可以通過CD16進行結(jié)合的治療性抗體。
在一個實施例中，將該治療性抗體和化合物同時施用于患者。在另一實施例中，在施用治療性抗體1周內(nèi)、4日內(nèi)、3日內(nèi)或同日內(nèi)(即24小時內(nèi))將該化合物施用于該患者。在另一實施例中，該疾病是癌、傳染性(感染性)疾病或免疫疾病。
在一個實施例中，該方法進一步包括一個附加步驟，其中在施用該化合物之前或之后測量患者體內(nèi)的NK細胞的活性或數(shù)量。在另一個實施例中，該附加步驟包括i)在施藥之前從患者體內(nèi)獲得NK細胞；ii)在有該化合物/無該化合物的情況下，將NK細胞在存在一種或多種可被該治療性抗體識別的靶細胞的情況下孵育；以及iii)測量該化合物對NK細胞消除(消耗)靶細胞能力的影響；當發(fā)現(xiàn)該化合物增強了NK細胞消除靶細胞的能力時表明該化合物適用于該方法，并且該方法適用于該患者。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包括一治療性抗體(例如可以通過CD16結(jié)合的抗體)，一個抑制NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物，以及藥物可接受的一個載體。另一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，包括一治療性抗體(例如通過CD16結(jié)合的抗體)，以及一種或多種阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物。
對于任何上述方法、組合物、或試劑盒，在一個實施例中該治療性抗體具有人IgG1或IgG3 Fc片段。在另一個實施例中，該化合物是抗體或其片段。在另一個實施例中，該治療性抗體是單克隆抗體或其片段。在另一個實施例中，該治療性抗體不與放射性部分或毒性部分結(jié)合。在另一個實施例中，該化合物抑制NK細胞的抑制性受體。在另一個實施例中，該化合物刺激NK細胞的活化受體。在另一個實施例中，該化合物是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或其片段。在另一個實施例中，該治療性抗體或化合物可以是如Fab片段、Fab’2片段、CDR和ScFv的抗體片段或衍生物。
在一個實施例中，該治療性抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或其片段。在另一個實施例中，該治療性抗體是利妥昔單抗(rituximab)或坎帕斯(Campath)。在另一個實施例中，該抗體是利妥昔單抗，并且所述抗體以每周少于375mg/m2的劑量施用。在另一個實施例中，該抗體是坎帕斯，并且該抗體以每周少于90mg的劑量施用。
在一個實施例中，該化合物與NKG2、KIR2DL或KIR3DL人受體中的至少一個結(jié)合，并且抑制相關(guān)的NKG2-、KIR2DL-或KIR3DL-介導的NK細胞的細胞毒性抑制作用。在另一個實施例中，該化合物阻斷選自包括KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRB1、NKG2A、NKG2C、NKG2E和LILRB5的一組NK細胞的抑制性受體。在另一個實施例中，該化合物與KIR2DL人受體的共同決定簇結(jié)合，并且抑制KIR2DL介導的NK細胞細胞毒的抑制作用。在另一個實施例中，該化合物與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3人受體的共同決定簇結(jié)合，并且抑制KIR2DL1-、KIR2DL2-和KIR2DL3-介導的NK細胞的細胞毒性抑制作用。在另一個實施例中，該化合物抑制在第80位(位點80)具有賴氨酸(Lys)殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL1受體的結(jié)合，并且抑制在第80位(80位點)具有天冬酰胺(Asn)殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2和KIR2DL3受體的結(jié)合。在另一個實施例中，該化合物與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200結(jié)合到同一抗原決定簇上。在另一個實施例中，該化合物與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200競爭結(jié)合到人NK細胞在表面的KIR受體上。在另一個實施例中，該化合物是由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200或其片段。
在一個實施例中，該化合物與選自包括NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D的一組中的一個受體結(jié)合。在另一實施例中，該化合物是選自包括AZ20、A76、Z25、Z231、和BAB281的一組中的一個單克隆抗體衍生的，或與之競爭。
另一方面，本發(fā)明提供了一種選擇用于與治療性抗體聯(lián)合施用的化合物的方法，所述方法包括i)提供一種抑制NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的待測化合物；ii)在NK細胞存在的條件下，在有/無該待測化合物時，將治療性抗體與可被該治療性抗體特異性識別的靶細胞一起孵育；以及iii)測定該化合物對于NK細胞消除靶細胞能力的影響；其中測出該化合物增強NK細胞消除靶細胞的能力時，則表明該化合物適用于該方法。
在一個實施例中，該化合物將該治療性抗體摧毀靶細胞的能力增強50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高。在另一個實施例中，該化合物選自包括抗體、抗體片段、單克隆抗體、單克隆抗體片段、人源化抗體、嵌合抗體和人抗體的一組物質(zhì)。在另一個實施例中，該靶細胞是癌細胞、病毒感染的細胞、或構(gòu)成自身免疫疾病基礎(chǔ)的細胞。在另一個實施例中，該治療性抗體是利妥昔單抗(rituximab)或坎帕斯(CAMPATH)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種提高施用于患者體內(nèi)可以由CD16結(jié)合的治療性抗體的治療功效的方法，所述方法包括在施用所述治療性抗體之前、同時或之后對所述患者施用阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的有效治療量的化合物。在一個實施例中，該化合物通過增強所述患者的ADCC提高了治療功效。


圖1單克隆抗體DF200與不同人KIR2DL受體的一個共同決定簇相結(jié)合。
圖2用抗KIR2DL單克隆抗體(抗KIR2DL mAb)在C1R Cw4靶上以效應(yīng)物/靶比率為4/1進行溶解重構(gòu)。單克隆抗體DF200抑制KIR2DL-介導的在Cw4陽性靶細胞上的KIR2DL1陽性NK細胞的細胞毒性(重構(gòu)溶解)的抑制作用。
圖3通過將一個KIR2DL1陽性NK克隆的Rituxan介導到一個Cw4陽性EBV細胞系上，通過阻斷KIR/HLA相互作用來增強ADCC。針對在5ug/ml抗CD20抗體(美羅華，Rutixan)和10ug/mlEB6抗體(抗KIR2DL1)存在下；Rutixan單獨作用；EB6單獨作用；或沒有任何抗體存在下，以各種效應(yīng)物/靶比率(從1到4)對于Cw4陽性EBV轉(zhuǎn)化的(CD20陽性)靶細胞系測試KIR2DL1的NK克隆細胞溶解關(guān)系。當存在抗KIR2DL抗體(EB6)時，極大地增強了ADCC。
圖4通過將一個KIR2DL1陽性NK克隆的坎帕斯(Campath)介導到一個Cw4陽性EBV細胞系上，通過阻斷KIR/HLA相互作用來增強ADCC。針對在坎帕斯和100ug/ml EB6抗體(抗KIR2DL1)存在下；坎帕斯單獨作用；EB6單獨作用；或沒有任何抗體存在下，對Cw4陽性EBV轉(zhuǎn)化的(CD20陽性)靶細胞系測試KIR2DL1的NK克隆細胞溶解關(guān)系。當存在抗KIR2DL1抗體(EB6)時，極大地增強了ADCC。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了一種用于增加治療性抗體功效的方法。本發(fā)明尤其披露了一種化合物的應(yīng)用，該化合物優(yōu)選為抗體或其片段，它可增強NK細胞的效力，優(yōu)選通過阻斷NK細胞的抑制性受體或激活其活化受體可以顯著提高治療性抗體的功效。實際上，本發(fā)明人證明了多種治療性抗體的療效可以通過直接作用于NK細胞受體(如，抑制性受體)上抗體的共同作用而極大地增強。
因此，本發(fā)明涉及一種在有需要的患者體內(nèi)治療疾病的方法，包括a)給所述患者施用一種可以阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物，優(yōu)選為一種抗體或它的一個片段；以及b)對所述患者施用一種治療性抗體。
所述治療性抗體可以通過NK細胞的CD16結(jié)合，優(yōu)選通過它的Fc區(qū)域結(jié)合。
優(yōu)選地，所述治療性抗體具有人IgG1和IgG3 Fc部分，特別是單克隆抗體或它的片段，進一步優(yōu)選為人源化抗體、人抗體或嵌合抗體，或其片段，例如利妥昔單抗(rituximab)。
所希望的是阻斷NK細胞的抑制性受體的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段，可以在施用(給予)治療性抗體之前、同時、或之后施用于(給予)患者。不同抗體的施用方法依賴于它們的生物利用率和藥物代謝動力學。優(yōu)選在施用該化合物一周內(nèi)施用治療性抗體，該阻斷NK細胞的抑制性受體的化合物優(yōu)選為抗體或其片段，更優(yōu)選是在5天或2天內(nèi)施用。優(yōu)選地，該治療性抗體在施用阻斷NK細胞的抑制性受體的化合物之前或同時施用，優(yōu)選為抗體或其片段。
另一方面，本發(fā)明涉及一種在接受治療性抗體治療的患者體內(nèi)提高ADCC的方法，所述方法包括對所述患者施用所述治療性抗體之前、同時或之后施用足夠量的提高ADCC的化合物，該化合物阻斷NK細胞的抑制性受體，優(yōu)選為抗體或其片段。所述治療性抗體可以通過NK細胞上的CD16結(jié)合，優(yōu)選通過它的Fc區(qū)域結(jié)合。優(yōu)選地，所述治療性抗體是人IgG1或IgG3片段，特別是單克隆抗體或其片段，更優(yōu)選為個人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或其片段，例如利妥昔單抗。
另一方面，本發(fā)明涉及一種提高患者體內(nèi)的治療性抗體功效的方法，所述方法包括對所述患者施用所述治療性抗體之前、同時或之后施用一定量的阻斷NK細胞的抑制性受體的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段，該劑量足以提高所述治療性抗體的功效。所述治療性抗體可以通過CD16結(jié)合，優(yōu)選通過其Fc區(qū)域結(jié)合。優(yōu)選地，所述治療性抗體是人IgG1或IgG3Fc片段，特別是單克隆抗體或其片段，更優(yōu)選人抗體，人源化抗體或嵌合抗體，或其片段，例如利妥昔單抗。
定義在本文中，除非另有說明下面的術(shù)語具有其界定的含義。
本文中，“NK ”細胞是指與非常規(guī)性免疫相關(guān)的淋巴細胞亞群。NK細胞可以通過一定的特征和生物性能來加以識別如特異性表面抗原(包括CD16、CD56和/或CD57)的表達，在細胞表面上α/β或γ/δ TCR復合物的缺乏，聯(lián)接到不表達“自體”MHC/HLA抗原的細胞并通過激活特異性的細胞溶解酶殺死細胞的能力，殺死用于表達NK活化受體的配體的腫瘤細胞或其它病態(tài)細胞的能力，以及釋放被稱作細胞因子的蛋白分子以刺激或抑制免疫應(yīng)答的能力。利用本領(lǐng)域熟知的方法，任何這些特征和活性都可以用于識別NK細胞。
本文中使用的術(shù)語“抗體”是指多克隆或單克隆抗體。依賴于重鏈上恒定區(qū)的類型，抗體可分為5個主要類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些類別中的一些可以進一步劃分為亞類或同種型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等等。一種典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包括一個四聚物(四聚體)。每個四聚物由兩對同樣的多肽鏈對構(gòu)成，每對(多肽鏈)具有一個“輕”鏈(約25kDa)和一個“重”鏈(約50-70kDa)。每個鏈的N末端定義一個約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，該可變區(qū)主要負責抗原識別?？勺冚p鏈(VL)和可變重鏈(VH)兩術(shù)語分別是指這些輕鏈和重鏈。相應(yīng)于不同種類的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱作“α、”“δ、”“ε、”“γ”和“μ”。不同類別的免疫球蛋白的亞單位(亞基)結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象已為所公知。IgG和/或IgM是本發(fā)明中優(yōu)選的抗體類別，特別優(yōu)選為IgG，由于它們是在生理條件下是最常見的抗體，由于它們在實驗室條件下最容易制備，并且由于IgG可以被Fcγ受體特異性識別。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。特別優(yōu)選的是人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、或其它的-人-適宜的抗體。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“治療性的一個抗體或多個抗體”特別是指具有能夠消除(凋亡)患者體內(nèi)靶細胞功能的任何抗體。尤其是，治療性抗體特異性結(jié)合到存在于靶細胞表面的抗原上，如腫瘤特異性抗原主要或唯一出現(xiàn)在腫瘤細胞上。優(yōu)選地，治療性抗體包括人Fc部分或能夠與人Fc受體相互作用。治療性抗體可以通過如ADCC或其它各種方法(手段)對準靶細胞，并且可以是“裸露的”，即不帶有連接部分(conjuigated moieties)，或與諸如放射性標記物或毒素這些化合物結(jié)合。
術(shù)語“特異性結(jié)合到”是指抗體在競爭性結(jié)合測試中優(yōu)選可以結(jié)合到結(jié)合伴侶(binding partner)上，例如當用蛋白或其抗原決定部位的重組形式、或分離的NK或相關(guān)靶細胞的表面上存在的天然蛋白進行測試時的活性NK受體如NKp30、NKp44或NKp46，或人Fcγ受體。競爭性結(jié)合測試及用于測定特異性結(jié)合的其它方法在下文中會進一步描述，同時也是本領(lǐng)域所公知的。
“適用于人的”抗體是指可以安全用于人，例如本文中所描述的治療方法中的任何抗體、衍生抗體、或抗體片段。適用于人的抗體包括所有類型的人源化抗體、嵌合抗體、或完全的人抗體，或任何至少抗體的一部分來源于人的抗體或者是經(jīng)過修飾后的抗體從而避免當使用天然的非-人抗體時誘發(fā)免疫應(yīng)答。
“免疫原性片段”在本文中是指能夠激發(fā)免疫應(yīng)答的任意多肽或肽片段，如(i)抗體結(jié)合所述片段和/或結(jié)合含有所述片段的任何形式的分子(包括膜聯(lián)受體及由其衍生的突變體)的產(chǎn)生，(ii)涉及T-細胞與包括任何MHC分子及由所述片段衍生的肽的雙分子復合物反應(yīng)的T-細胞應(yīng)答的刺激，(iii)轉(zhuǎn)染的載體(如表達編碼哺乳動物免疫球蛋白基因的噬菌體或細菌)的結(jié)合?？蛇x替代的，免疫原性片段也可以指能夠激發(fā)免疫應(yīng)答如上文所述的任何結(jié)構(gòu)，如通過共價連接子(共價連接物)結(jié)合到載體蛋白上的肽片段，在氨基酸序列中包括所述肽片段的嵌合重組體多肽結(jié)構(gòu)，以及尤其包括用cDNA轉(zhuǎn)染的細胞，該cDNA的序列中包括所述片段的編碼。
對于本發(fā)明的目的，“人源化”抗體是指這樣的一個抗體，其中由一種或多種人免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)區(qū)和可變結(jié)構(gòu)區(qū)通過如CDR這樣的結(jié)合區(qū)與一種動物免疫球蛋白融合在一起。設(shè)計這樣的人源化抗體是為了保持非人抗體的結(jié)合特異性，從中導出各個結(jié)合區(qū)，但要避免對于非人抗體的免疫反應(yīng)。
“嵌合抗體”是指一種抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其一部分已經(jīng)被改變、替代或交換使得抗原結(jié)合位點(可變區(qū))是與一個不同的或改變后的類、效應(yīng)物功能和/或種、或者一個完全不同的分子的恒定區(qū)相連，這些分子可以為嵌合抗體如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等賦予全新的性能；或(b)可變區(qū)或其一部分被改變、替代或與一種具有不同的或經(jīng)改變的抗原特異性的可變區(qū)進行交換。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，嵌合抗體仍保存免疫球蛋白的Fc區(qū)域，優(yōu)選為人Fc區(qū)域，從而可以與靶細胞表面上的人Fc受體相互作用。
在本發(fā)明的上下文中，“增強、”“活性、”或“活化的”NK細胞是指生物活性的NK細胞，更特殊的是指具有溶解靶細胞能力的NK細胞。例如一種“活性”NK細胞能夠殺死表達NK活化受體-配體，并且不表達“自身”MHC/HLA抗原(KIR不相容細胞)的細胞。用于重新導向殺傷實驗的適宜的靶細胞的實例有P815細胞和K562細胞，但是很多細胞類型也可以使用并且是本領(lǐng)域所公知的(參見，如Sivori et al.(1997)J.Exp.Med.1861129-1136；Vitale etal.(1998)J.Exp.Med.1872065-2072；Pessino et al.(1998)J.Exp.Med.188953-960；Neri et al.(2001)Clin.Diag.Lab.Immun.81131-1135)?！霸鰪?、”“活性、”或“活化的”細胞也可以通過任何與NK活性相關(guān)的其它性能或本領(lǐng)域公知的活性來識別，如細胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)產(chǎn)生的細胞內(nèi)游離鈣含量的增加。針對本發(fā)明的目的，“增強、”“活性、”或“活化的”NK細胞尤其是指體內(nèi)的沒有通過刺激抑制性受體而被抑制的NK細胞、或在該細胞中例如通過刺激活化受體來克服這樣的抑制作用的NK細胞。
如本文中所使用的，術(shù)語“活性NK受體”是指NK細胞表面上的任意分子，當受刺激時，其引起與NK活性相關(guān)的、本領(lǐng)域所公知的性能或活性的可測量的增加，如細胞因子(如IFN-γ和TNF-α)的產(chǎn)生、細胞內(nèi)游離鈣含量的增加、在本說明書中的其它處描述的在重新導向殺傷實驗中導向靶細胞的能力、或刺激NK細胞增殖的能力。術(shù)語“活性KIR受體”包括但不局限于NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、IL-12R、IL-15R、IL-18R和IR-21R。如在本文中所使用的，術(shù)語“活性NK受體”不包括IL-2受體(IL-2R)。確定NK細胞是否有活性或增殖與否的方法在下文中將詳細描述，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
如在本文中所使用的，術(shù)語“抑制”或“抑制性”NK受體是指NK細胞表面上的任意分子，當受刺激時，其引起與NK活性相關(guān)的、領(lǐng)域所公知的特性或活性的可測量的減少，如細胞因子(如IFN-γ和TNF-α)的產(chǎn)生、細胞內(nèi)游離鈣含量的增加、或在本說明書中的其它處描述的在重新導向殺傷實驗中溶解靶細胞的能力。這樣的受體的實例包括KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRB1、NKG2A、NKG2C、NKG2E和LILRB5。確定NK細胞是否有活性的方法在下文中將加以詳細描述，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
在本發(fā)明中，術(shù)語“阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體”是指某些化合物(優(yōu)選為抗體、其片段或衍生物)的能力，優(yōu)選是指直接與至少一種如KIR、NKG2A/C、NKp30、NKp44、NKp46或其它本文中所列的抑制性或活性NK細胞受體的相互作用、或者中和來自受體的抑制性信號(在抑制性受體的情況下)或來自受體的刺激信號(在活化受體的情況下)。對于抑制性受體，優(yōu)選的化合物為能夠阻斷HLA和受體之間的相互作用的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段。當該化合物是抗體時，該抗體可以是多克隆抗體、或優(yōu)選為單克隆抗體。它們可以通過雜交瘤或通過基因工程化的用以表達所需的可變區(qū)和恒定區(qū)的重組(體)細胞來產(chǎn)生。該抗體可以是單鏈抗體或保留該抗原特異性以及如Fab片段、Fab’2片段、CDR和ScFv這些更低級的鉸鏈區(qū)或其可變區(qū)的其它抗體衍生物。這些可以是多功能抗體、重組(體)抗體、人源化抗體或它們的變體。
在本發(fā)明的上下文中，“共同決定簇”是指由一組相關(guān)受體如人KIR2DL受體組的多個成員共有的決定簇或抗原決定部分(簇)。該決定簇或抗原決定部分(簇)可以表現(xiàn)為由所述成員共有的肽片段或構(gòu)象抗原決定部分(簇)。在一個特定實施例中，該共同決定簇包括被單克隆抗體DF200、NKVSF1或EB6所識別的抗原決定部分(簇)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語抗體與一個共同決定簇的“結(jié)合”是指一個抗體與所述的決定簇具有特異性和/或親和性的結(jié)合，例如位于人NK細胞表面上的其它不相關(guān)的構(gòu)象或決定簇或結(jié)構(gòu)基本上是不通過高親和性或特異性結(jié)合的。更具體而言，根據(jù)本發(fā)明單克隆抗體對所述決定簇的結(jié)合可以與所述抗體與其它抗原決定部分或決定簇的結(jié)合區(qū)分開來。
能夠結(jié)合于NK細胞的抑制性受體并阻止其刺激作用的化合物從而成為“中和”或“抑制性”化合物，優(yōu)選為抗體，在這個意義上它們阻斷，至少部分阻斷通過NK細胞的抑制性受體(如KIR或NKG2A/C受體)所介導的抑制性信號通路。更為重要的是，該抑制性活性可以對于幾種類型的KIR或NKG2A/C受體表現(xiàn)出來，從而這些化合物(優(yōu)選為抗體)可以用于各種患者，并且具有很高的療效。
術(shù)語“重組(體)”，當用于如細胞、或核酸、蛋白、或載體時，是指該細胞、核酸、蛋白、或載體通過引入外源的核酸或蛋白或經(jīng)改造的天然核酸或蛋白而已經(jīng)被修飾，或該細胞衍生自經(jīng)這樣修改過的細胞。從而，例如，重組(體)細胞表達的基因在天然(非重組)形式的細胞中未發(fā)現(xiàn)，或表達的天然基因本應(yīng)為異常表達、低量表達或完全不表達。
在本發(fā)明的上下文中，病人或患者包括各種哺乳動物患者或病人，更優(yōu)選為人類患者或病人。
治療性抗體本發(fā)明涉及NK細胞增效化合物與治療性抗體的聯(lián)合使用。大量治療性抗體中的任意一種都可以用于本發(fā)明。基本上，任何抗體，無論是“裸露的”或與放射性標記物、毒素、或其它部分(moiety)結(jié)合的，或無論是全長或片段，或無論是真抗體或抗體的修飾衍生物都可以使用。優(yōu)選地，該方法是用于增強治療功效，在其中NK細胞的活性對所施用治療性抗體的療效起一定作用-但不必是唯一的，并且優(yōu)選的抗體或片段自然應(yīng)包括、或經(jīng)修改后包括人Fc區(qū)域或能夠被人Fc受體(如Fcγ受體)特異性抗體識別的其它區(qū)域。
本發(fā)明的化合物能用于增強治療性抗體消除表達被該治療性抗體特異性識別的抗原的靶細胞的能力。相應(yīng)地，至少部分是由能夠被治療性抗體作為靶標的細胞所引起或惡化的任何疾病或病癥都可以用本文中描述的方法來治療。靶細胞的特定例子包括與過敏、自身免疫疾病、同種異體反應(yīng)等相關(guān)的腫瘤細胞、病毒感染的細胞、同種異體細胞、病態(tài)的免疫活性細胞(如B淋巴細胞、T淋巴細胞、呈現(xiàn)抗原的細胞等)，或甚至是健康的細胞(如在抗血管生成治療方案中的內(nèi)皮細胞)。在本發(fā)明的上下文中，最優(yōu)選的靶細胞是腫瘤細胞和病毒感染的細胞。該治療性抗體可以，例如，介導細胞毒性作用或細胞溶解，特別是通過抗體依賴型細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)。
ADCC需要用于IgG的Fc部分的白細胞受體(FcγR)，其功能是將IgG致敏的+抗原與帶有FcγR的細胞毒性細胞結(jié)合，并且用以啟動細胞活化機制。因此，該治療性抗體能夠形成免疫復合物。例如，免疫復合物可以是被治療性抗體覆蓋的腫瘤靶點。更具體而言，該抗體能夠通過CD16結(jié)合，優(yōu)選通過它的Fc區(qū)域結(jié)合。確定治療性抗體是否與CD16這樣的Fcγ受體相結(jié)合可以使用任何適宜的方法來測試，例如通過確定與重組產(chǎn)生的CD16多肽或其片段的結(jié)合，可選固定在一個載體(支撐物)上，或例如通過確定該治療性抗體與已知表達CD16或懷疑其表達CD16的細胞的結(jié)合。
該治療性抗體可以是多克隆、或優(yōu)選為單克隆。它們可以由雜交瘤或通過基因工程化的用于表達所需的可變區(qū)和固定區(qū)的重組(體)細胞來產(chǎn)生。該抗體可以是單鏈抗體或保留有抗原特異性和低級鉸鏈區(qū)的其它抗體衍生物，或它們的變體。這些可以是多功能抗體、重組抗體、人源化抗體，它們的片段或變體。所述的其片段或衍生物優(yōu)先選自Fab片段、Fab’2片段、CDR和ScFv。優(yōu)選的片段是抗原結(jié)合片段。包括抗原片段的治療性抗體也可以包括但不限于雙特異性抗體；一種適宜的雙特異性抗體的例子是包括一個對CD16特異的抗原結(jié)合區(qū)和一個對腫瘤抗原特異的抗原結(jié)合區(qū)。其它的包括多片段的抗體形式包括將兩個不同抗體的結(jié)合區(qū)結(jié)合到一個單獨的多肽鏈上的重組(體)雙特異性抗體衍生物，也稱作BiTETM(Kufer P，et al TRENDS in Biotechnology 2004；22(5)238-244；和Baeuerle et al，Current Opinion in Molecular Therapeutics 2003；5(4)413-419，其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中。)治療性抗體通常對表面抗原(例如膜抗原)具有特異性。最優(yōu)選的治療性抗體是對腫瘤抗原(例如被腫瘤細胞特異性表達的分子)如CD20、CD52、ErbB2(或HER2/Neu)、CD33、CD22、CD25、MUC-1、CEA、KDR、αVβ3等，特別是對淋巴瘤抗原(例如CD20)具有特異性。該治療性抗體具有優(yōu)選為人或非人靈長類的IgG1或IgG3Fc部分，更優(yōu)選為人IgG1。
在一個實施例中，該抗體包括在其Fc部分的修飾，它們在ADCC時增強抗體與NK細胞的相互作用。這樣經(jīng)修飾的治療性抗體(“經(jīng)改變的抗體”)通常包括優(yōu)選在Fc區(qū)域的修飾，它們可以改進該抗體與一種或多種FcγR的結(jié)合親和性。用于改變抗體對于一種或多種FcγR的改變的結(jié)合方法在本領(lǐng)域是公知的，可以參見如PCT申請公開號為WO 2004/016750(國際申請?zhí)枮镻CT/US2003/025399)、WO 99/158572、WO 99/151642、WO98/123289、WO 89/107142、WO 88/107089和美國專利第5,843,597號和第5,642,821號，將它們的全部內(nèi)容通過引證合并于本申請中。
本發(fā)明中確認的治療性抗體，如用于治療風濕性關(guān)節(jié)炎的D2E7(Cambridge Antibody Technology Group，plc(Cambridge，UK)/BASF(Ludwigshafen，Germany))、或英利昔單抗(Infliximab)(Centocor，Inc.，Malvern，PA；用于治療克隆氏病(Crohn’s disease)和風濕性關(guān)節(jié)炎)、或在國際專利申請PCT/US2003/025399(將全部內(nèi)容以參考文獻方式合并于本申請中作為參考)中披露的抗體可以用在本專利申請的上下文中教導的方法加以修飾或改進，并且用于治療典型的使用這些抗體治療的疾病中。在一些實施例中，本發(fā)明提供了經(jīng)改變的抗體，它們對于活性FcγR(即FcγRIII)具有改變了的親和性(更高或更低的親和性)。在某些優(yōu)選的實施例中，提供了對于FcγR具有更高親和性的經(jīng)改變的抗體。優(yōu)選的是這樣的修改也具有改變的Fc-介導的效應(yīng)物(效應(yīng)因子)功能。
影響Fc-介導的效應(yīng)物(效應(yīng)子)功能的修改是本領(lǐng)域所公知的(參見，如美國專利第6,194,351號，將其全部內(nèi)容通過引證合并于本文中)。可以修飾的氨基酸包括但不限于脯氨酸329、脯氨酸331和賴氨酸322。脯氨酸329和/或331和賴氨酸322可以優(yōu)選被丙氨酸取代，然而，也可考慮用其它氨基酸取代。參見國際申請公開號WO 00/142072和美國專利第6,194,551號，將其全部內(nèi)容通過引證合并于本文中。
因此，F(xiàn)c區(qū)域的修改可以包括對在抗體Fc區(qū)域發(fā)現(xiàn)的氨基酸進行的一種或多種改變。這樣的改變可以導致抗體具有改進的抗體介導的效應(yīng)物(效應(yīng)子)功能、對其它Fc受體(如Fc活性受體)改進的結(jié)合能力、改進的ADCC活性、改進的Clq結(jié)合活性、改進的補體依賴型細胞毒活性、或它們的任意組合。
在一個實施例中，該抗體被Fcγ受體特異性識別，這樣的Fcγ受體如FCGR3A(也稱作CD16、FCGR3、免疫球蛋白GFc受體III；IGFR3、對于IgG的Fc片段的受體、低親和性IIIa；參見如OMIM146740)，F(xiàn)CGR2A(也稱作CD32、CDw32、對于IgG的Fc片段的受體、低親和性IIa、FCG2、免疫球蛋白G Fc受體II；參見如OMIM 146790)；FCGR2B(也稱作CD32、對于IgG的Fc片段的受體、低親和性IIb；FCGR2B、FC-γ-RIIB；參見如OMIM 604590)，F(xiàn)CG1RA(也稱作CD64；對于IgG的Fc片段的受體、高親和性Ia；IGFR1；參見如OMIM 146760；IgG的FCGR1片段、高親和性Ic、免疫球蛋白G Fc受體IC、IGFRC；參見如OMIM 601503)；或FCGR1B(也稱作CD64、對于IgG的Fc片段的受體、高親和性Ib；免疫球蛋白G Fc受體IB；IGFRB；參見如OMIM 601502)。
本發(fā)明典型的治療性抗體是利妥昔單抗(rituximab)、阿來組單抗(alemtuzumab)和曲妥珠單抗(trastuzumab)。這些抗體可以根據(jù)已經(jīng)批準用于人類患者的臨床規(guī)范進行使用。治療性抗體的其它特定的例子包括例如，抗CD22單克隆抗體(epratuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、達利珠單抗(daclizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、labetuzumab、司韋單抗(sevirumab)、tuvurimab、帕利珠單抗(palivizumab)、英利昔單抗(infliximab)、奧馬佐單抗(omalizumab)、依法珠單抗(efalizumab)、那他珠單抗(natalizumab)、克立昔單抗(clenoliximab)等?？蛇x地，當刺激NK細胞的活化受體的化合物是細胞因子時，該治療性抗體是除利妥昔單抗(rituximab)或赫賽汀(herceptin)之外的抗體，或者可選的是除抗-CD20或抗-HER2/神經(jīng)鞘(neu)抗體之外的抗體。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的治療性抗體的其它例子包括抗-鐵蛋白抗體(美國專利申請第2002/0106324號)、抗-p140和抗-sc5抗體(WO02/50122)、和抗-KIR(殺傷細胞抑制性受體)抗體(該KIR受體在Carrington和Norman的The KIR Gene Cluster，May 3，2003中加以描述，可以在以下網(wǎng)址得到http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books)，將上述每一文獻披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中。治療性抗體的其它例子列于下表中，其中任意一種(和其它種)都可以用于本方法。應(yīng)該明了，無論是否列于下表中或在本說明書的其它地方描述過，任何能夠消除靶細胞的抗體，優(yōu)選通過ADCC，都可從本方法受益，并且下表1對其中所列的抗體、所列的靶目標或抗體的表示說明均不是窮舉的。
表1治療性抗體





化合物調(diào)節(jié)NK細胞活性NK細胞活性是通過復雜的機制調(diào)節(jié)的，其涉及刺激信號和抑制信號。相應(yīng)地，有效的NK細胞介導的治療既可通過刺激這些細胞也可通過中和抑制性信號來實現(xiàn)。應(yīng)該注意到任何具有阻斷、抑制或其它的向下調(diào)節(jié)NK細胞的抑制性受體作用的化合物或激活、刺激或其它的促進NK細胞的活化受體的活性或表達作用的化合物都是可以使用的。這包括能夠結(jié)合于NK細胞受體并且直接阻斷或刺激它們的化合物，如細胞因子、以及小分子、多肽，和抗體。還應(yīng)該注意到，受體被阻斷或被刺激的機制對于本發(fā)明所提供的優(yōu)點不是最重要的。例如，該化合物可以增加活化受體的表達、或抑制抑制性受體的表達，該化合物可以阻止配體與抑制性受體之間的相互作用或增強配體與活化受體之間的相互作用，或者該化合物可以直接結(jié)合到受體上并抑制它們(在抑制性受體的情況下)或激活它們(在活化受體的情況下)。重要的參數(shù)是該化合物在體內(nèi)對治療性抗體消除靶細胞能力的作用。
任何NK細胞表面上的抑制性受體都可以作為本發(fā)明的化合物的靶標。NK細胞通過主要組織相容性復合體(MHC)類型I-特異抑制性受體進行負調(diào)節(jié)(Karre et al.，1986；hlen et al.，1989；將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中)。這些特異性受體結(jié)合于主要組織相容性復合體(MHC)類型I分子或HLA的多態(tài)決定簇，并且抑制自然殺傷(NK)細胞溶解。在人體中，稱作殺傷細胞Ig-樣受體(KIRs)的受體家族識別HLA類型I等位基因組。
有多個KIR受體組，包括KIR2DL、KIR2DS、KIR3DL和KIR3DS。具有兩個Ig結(jié)構(gòu)域(KIR2D)的KIR受體識別HLA-C同種異型KIR2DL2(以前命名為p58.1)或緊密相關(guān)的基因產(chǎn)物KIR2DL3識別與組2HLA-C同種異型(Cw1、3、7和8)共享的抗原決定部位，相反KIR2DL1(p58.2)識別與互補的(reciprocal)組1HLA-C同種異型(Cw2、4、5和6)共享的抗原決定部位。被KIR2DL1識別表明HLA-C等位基因的第80位(位點)存在賴氨酸(Lys)殘基。KIR2DL2和KIR2DL3的識別表明在第80位(位點)存在天冬酰胺(Asn)殘基。很重要的一點是大多數(shù)HLA-C等位基因在第80位(位點)具有天冬酰胺(Asn)或賴氨酸(Lys)殘基。具有3個Ig結(jié)構(gòu)域的一個KIR，KIR3DL1(p70)，識別一個與HLA-Bw4等位基因共享的抗原決定部位。最后，一種具有三個Ig結(jié)構(gòu)域的同源二聚體分子KIR3DL2(p140)識別HLA-A3和HLA-A11。
盡管KIR和其它類型-I抑制性受體(Moretta et al，1997；Valianteet al，1997；Lanier，1998；將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中)可以被NK細胞共同表達，但是在任意一個特定個體的NK表達譜(repertoire)中，有表達單獨KIR的細胞，因此相應(yīng)的NK細胞僅僅只被表達的一類特異性類型I等位基因組的細胞阻斷。相應(yīng)地，如下文所述，當抑制性受體作為靶標時，本方法將經(jīng)常涉及施用將多個抑制性受體作為靶標的的化合物，從而確保廣泛地影響達到最大范圍的NK細胞。
在某些實施例中，該化合物，優(yōu)選為抗體或其片段，阻斷NK細胞的抑制性受體，中和從包括KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL1、KIR3DL1、KIR3DL2、NKG2A和NKG2C的一組中任選的至少一個抑制性受體的抑制性信號。更優(yōu)選地，該阻斷NK細胞的抑制性受體的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段，是中和KIR2DL2、KIR2DL3和/或KIR2DL1的抑制性信號的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段。
本發(fā)明也可以考慮使用多種阻斷NK細胞的不同抑制性受體的化合物的組合，該化合物優(yōu)選為抗體或其片段，。優(yōu)選地，阻斷NK細胞的抑制性受體的化合物是從包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、NKG2A和NKG2C的一組中任選的一種特異性的抑制性受體，并且能夠抑制相關(guān)的KIR-或NKG2A/2C-介導的NK細胞的細胞毒性抑制作用，該化合物優(yōu)選為抗體或其片段。例如，阻斷NK細胞的抑制性受體的化合物可以包括一種對于KIR2DL具有特異性的抗體和另一種對于KIR2DL2和/或KIR2DL3具有特異性的抗體。更優(yōu)選，該阻斷NK細胞抑制性受體的化合物的組合能夠抑制KIR2DL1-、KIR2DL2-、和KIR2DL3-介導的NK細胞的細胞毒性抑制作用。在其它實施例中，可以施用將一種或多種抑制性受體作為靶標的一種或多種化合物，以及將一種或多種活化受體作為靶標的的一種或多種化合物的混合劑。
例如，對于KIR2DL1特異性的單克隆抗體已經(jīng)顯示出能夠阻斷KIR2DL1 Cw4(或類似的)等位基因(Moretta et al.，1993；將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中)。在另一個實例中，抗KIR2DL2/3的單克隆抗體也已經(jīng)被描述能阻斷KIR2DL2/3HLACw3(或類似的)等位基因(Moretta et al.，1993)。抗NKG2A抗體也已經(jīng)顯示出能夠阻斷NKG2A和HLA-E之間的抑制性相互作用。
可選地，該抗體可以選自GL183(KIR2DL2、L3，可獲自Immunotech，F(xiàn)rance and Beckton Dickinson，USA)；EB6(KIR2DL 1，可獲自Immunotech，F(xiàn)rance and Beckton Dickinson，USA)；AZ 138(KIR3DL1，可獲自Moretta et al，Univ.Genova，Italy)；Q66(KIR3DL2，可獲自Immunotech，F(xiàn)rance)；Z270(NKG2A，可獲自Immunotech，F(xiàn)rance)；P25(NKG2A/C，可獲自Moretta et al，Univ.Genova，Italy)和DX9，Z27(KIR3DL1，可獲自Immunotech，F(xiàn)ranceand Beckton Dickinson，USA)。
在一優(yōu)選方面，本發(fā)明使用單克隆抗體以及其片段和衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物與NK細胞表面上的多個KIR或NKG2A/C受體交叉反應(yīng)并且中和它們的抑制性信號。
在一個實施例中，本發(fā)明使用單克隆抗體，其結(jié)合人KIR2DL受體的共同決定簇并且抑制相應(yīng)的抑制性通道。優(yōu)選地，本發(fā)明使用單克隆抗體，其結(jié)合人NK細胞表面上的KIR2DL1和KIR2DL2/3受體，并且抑制KIR2DL1-和KIR2DL2/3-介導的NK細胞細胞毒的抑制作用。該抗體特異性地抑制HLA-c分子結(jié)合于KIR2DL1和KIR2DL2/3受體。更優(yōu)選，該抗體在體內(nèi)促進NK細胞活性。由于KIR2DL1和KIR2DL3(或KIR2DL2)足以覆蓋大多數(shù)的HLA-C同種異型，其分別是組1HLA-C同種異型和組2HLA-C同種異型，因此這樣的抗體可以用于增加在大多數(shù)人類個體中治療性抗體的功效，通常是在大約90％或更多的人類個體中。在這樣一個實施例中，于2004年7月1日提交的、名稱為“Composition and methods forregulating NK cell activity(用于調(diào)節(jié)NK細胞活性的組合物和方法)”的PCT專利申請PCT/FR 04/01702中描述的任何抗體都可以相應(yīng)地用于本發(fā)明，將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中。
在本發(fā)明的一個特定目的中，該阻斷NK細胞的抑制性受體的抗體是單克隆抗體，其中所述抗體結(jié)合KIR2DL人受體的共同決定簇，并且抑制KIR2DL-介導的NK細胞細胞毒性的抑制作用。該抗體更特異性地結(jié)合于與分別由雜交瘤DF200或NKVSF1產(chǎn)生的單克隆抗體DF200或NKVSF1相同的抗原決定部位，和/或與分別由雜交瘤DF200或NKVSF1產(chǎn)生的單克隆抗體DF200或NKVSF1競爭結(jié)合于人NK細胞表面上的KIR受體。如所討論的，抗體的例子、功能性測試以及確定抗體是否與所述抗體競爭結(jié)合的測試在PCT專利申請PCT/FR 04/01/01702中加以描述。
在一個特定實施例中，該單克隆抗體是由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200。在另一實施例中，該單克隆抗體是EB6，或該抗體結(jié)合于與單克隆抗體EB6相同的抗原決定部位，或與單克隆抗體EB6競爭結(jié)合。在其它實施例中，該抗體是抗體DF200或EB6的片段或衍生物。產(chǎn)生抗體DF200的雜交瘤已經(jīng)在CNCM培養(yǎng)物保藏中心保藏(CNCM culture collection)、識別號(Identification no.)“DF200”、登記號CNCM I-3224、于2004年6月10日登記，Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，Institut Pasteur，25，Rue du Docteur Roux，F(xiàn)-75724 Paris Cedex 15，F(xiàn)rance。抗體NKVSF1可從Serotec(Cergy Sainte-Christophe，F(xiàn)rance)獲得，目錄標號(Catalog ref no.)MCA2243。
在本發(fā)明的另一個實施例中，用于增強治療性抗體功效的化合物刺激NK細胞的活化受體?？梢允褂萌魏位罨荏w，如NKp30(參見如PCT WO 01/36630，將其披露的全部內(nèi)容通過引證合并于本文中)、NKp44(參見如Vitale et al.(1998)J.Exp.Med.1872065-2072，將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中)、NKp46(參見如Sivori etal.(1997)J.Exp.Med.1861129-1136；Pessino et al.(1998)J.Exp.Med.188953-960；將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中)、NKG2D(參見如OMIM 602892)、IL-12R、IL-15R、IL-18R、IL-21R或活化的KIR受體，例如KIR2DS4受體(Carrington and Norman，TheKIR Gene Cluster，May 3，2003可獲自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books)，或存在于NK細胞的主要片段上的任何其它抗體，并且它的活性導致細胞激活或增殖，優(yōu)選的是該細胞以前已經(jīng)被如抑制性KIR受體這樣的抑制性受體所抑制。該化合物可以是任何分子實體，包括多肽、小分子、和抗體。示例的化合物包括任何自然、重組或合成的配體，它們可以與活化受體相互作用。例如一種刺激NK細胞活化受體的化合物可以是如與IL-12受體(IL-12R)相互作用的IL-12、與IL-15受體(IL-15R)相互作用的IL-15、與IL-18受體(IL-18R)相互作用的IL-18、與IL-21受體(IL-21R)相互作用的IL-21等細胞因子。這樣的化合物已知來自IL-12(Research Diagnostics，NJ，DI-212)、IL-15(ResearchDiagnostics，NJ，RDI-215)、IL-21(Asano et al，F(xiàn)EBS Lett.2002；52870-6)。優(yōu)選刺激NK細胞活化受體的化合物是除IL-2之外的化合物。其它刺激NK細胞活化受體的示例性化合物包括結(jié)合NK細胞受體的、選自由NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、KIR2DS4和其它活化的KIR受體組成的組中的抗體。
在某些優(yōu)選實施例中，該活化的受體是在NK細胞上發(fā)現(xiàn)的自然細胞毒性受體(NCR)，優(yōu)選的NCR選自NKp30、NKp44或NKp46，并且該刺激活化受體的化合物是與選自AZ20、A76、Z25、Z231和BAB281的任意單克隆抗體結(jié)合于同一抗原決定部位、或與之競爭結(jié)合。
可以通過利用各種標準方法中的任意一種來測定任一化合物結(jié)合于本文所描述的任一NK細胞受體。例如，比色ELISA-類型測量方法可以用于測量免疫沉淀和放射性免疫分析?？梢允褂酶偁帨y試，例如比較待測化合物和已知化合物結(jié)合于NK細胞受體的結(jié)合性能，其中對照(例如BAB281，其特異性結(jié)合于NKp46)和待測化合物經(jīng)混合(或預吸收)并施用于含有包含抗原決定部位的蛋白(如在BAB281的情況下為NKp46)的樣本中?；诿嘎?lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫分析、蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)和BIACORE的實驗方法適用于這種簡單的競爭研究，并且為本領(lǐng)域所公知。
對于KIR-或NKG2A/C-介導的NK細胞的細胞毒性抑制作用的抑制，或?qū)τ贜Kp30、NKp44、NKp46或NKG2D-介導的激活NK細胞的刺激作用可以用各種檢驗或測試進行測定，如結(jié)合測試、細胞毒測試、或其它分子測試或細胞測試。
在一種特定的變化方案中，抑制性活性通過所述化合物(優(yōu)選為抗體)在HLA-C或HLA-E陽性靶目標上分別重構(gòu)KIR或NKG2A/C陽性NK克隆的溶解能力來加以說明。在另一個特定實施例中，該化合物(優(yōu)選為抗體)以抑制HLA-C分子結(jié)合于KIR2DL1和KIR2DL3(或緊密相關(guān)的KIR2DL2)受體來加以限定，更優(yōu)選地，以其改變由選自Cw1、Cw3、Cw7和Cw8(或選自在第80位具有天冬酰胺(Asn)殘基的HLA-c分子)的HLA-C分子結(jié)合于KIR2DL2/3的能力以及由選自Cw2、Cw4、Cw5和Cw6(或選自在第80位具有賴氨酸(Lys)殘基的HLA-c分子)的HLA-C分子結(jié)合于KIR2DL1的能力來加以限定。
本發(fā)明的化合物(優(yōu)選為抗體)的抑制性活性或增強的活性，可以用眾多方法中的任意一種來測定，例如通過如在Sivori et al.(1997)J.Exp.Med.1861129-1136所述的其對細胞外游離鈣離子的作用，將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中。NK細胞活性也可以利用基于細胞的細胞毒性測試進行檢測，例如測定鉻的釋放，如測量抗體刺激NK細胞殺傷如P815、K562或其它如在Sivori et al.(1997)J.Exp.Med.1861129-1136；Vitale et al.(1998)J.Exp.Med.1872065-2072；Pessino et al.(1998)J.Exp.Med.188953-960；Neriet al.(2001)Clin.Diag.Lab.Immun.81131-1135；Pende et al.(1999)J.Exp.Med.1901505-1516中所披露的適宜的腫瘤細胞這樣的靶細胞的能力，將其披露的全部內(nèi)容通過引證合并于本文中。在本發(fā)明說明書的實施例部分也給出了適宜的細胞毒測試。在一個優(yōu)選的實施例中，該抗體引起NK細胞毒至少10％的增強，優(yōu)選引起NK細胞毒至少40％或50％的增強，或更優(yōu)選引起NK細胞毒至少70％的增強。
NK細胞活性也可以用細胞因子-釋放測試進行說明，其中將NK細胞與抗體孵育以刺激NK細胞的細胞因子產(chǎn)生(例如IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生)。在一個示例性的方案中，由PBMC產(chǎn)生的IFN-γ用細胞表面和胞質(zhì)內(nèi)染色方法測定，并且在培養(yǎng)4天后用流式細胞計數(shù)法分析。簡單而言，將布雷菲德菌素A(Brefeldin A，SigmaAldrich)以終濃度為5μg/ml加入并培養(yǎng)至少4小時。然后，在滲透性作用(IntraPrepTM；Beckman Coulter)之前，將該細胞與抗-CD3和抗-CD56的單克隆抗體(mAb)孵育，并且用PE-抗-IFN-γ或PE-IgG1(Pharmingen)染色。由多克隆活性NK細胞產(chǎn)生的GM-CSF和IFN-γ的量可以用ELISA(GM-CSFDuoSet Elisa，R&D Systems，Minneapolis，MN；IFN-γOptE1A set，Pharmingen)測量上清液得到。
在一個優(yōu)選的實施例中，測定抗體對激活的人NK細胞的作用能力，當能夠激活人NK細胞的能力至少與激活非人NK細胞的能力一樣好時，表明該化合物適用于本發(fā)明。尤其是可以測定化合物用于增強治療性抗體在體內(nèi)或體外直接通過NK細胞消除(耗竭)適宜的靶細胞的能力。
本發(fā)明的化合物(優(yōu)選為抗體)可以具有部分抑制性或部分刺激活性，例如部分減少KIR2DL-介導的NK細胞細胞毒的抑制作用，或通過不同程度地刺激NCRs或其它受體而部分激活NK細胞。大多數(shù)優(yōu)選的化合物都能夠抑制(或在活化受體的情況下刺激)至少20％(優(yōu)選為至少30％、40％或50％或更高)的NK細胞活性，如在細胞毒測定中與沒有該化合物時的細胞進行比較。優(yōu)選地，該化合物還能使消除靶細胞程度相對于不存在該化合物時提高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。可選替換地，本發(fā)明優(yōu)選的化合物(優(yōu)選為抗體)能夠誘導匹配的或HLA相容的或自體靶細胞群的溶解，即在不存在所述抗體時不能被NK細胞有效溶解的細胞群。相應(yīng)地，本發(fā)明的化合物也可以用促進NK細胞在體內(nèi)的活性來限定。
本發(fā)明也可以包括這樣的實施例，其中刺激NK細胞活化受體或優(yōu)選阻斷其抑制性受體的化合物是具有基本上相同的抗原特異性的單克隆抗體片段，其包括但不限于Fab片段、Fab’2片段、CDR和ScFv。而且，該單克隆抗體可以是人源化的、人的或嵌合的(例如雙特異性或功能化的抗體)。雖然刺激活化受體的抗體也可以是片段，但優(yōu)選是全長的。衍生物(例如帶有修飾序列或帶有結(jié)合的雜源官能團或其它化合物)可以用于本文中所描述的任何抗體。
根據(jù)本發(fā)明，阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的抗體可以用本領(lǐng)域公知的各種技術(shù)方法來制備。通常是通過用包括KIR、NKG2A/C、NCR(例如NKp30、NKp44、NKp46)或NKG2D的多肽或任意這些多肽的免疫原片段的免疫原來免疫非人動物，并收集脾細胞(與適當?shù)募毎低ㄟ^融合來產(chǎn)生雜交瘤)來制備的。從各物種產(chǎn)生單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的(參見，如Harlow et al.，“AntibodiesA laboratory Manual”CSFH Press，1988；Goding，“Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice”AcademicPress，1986；將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中)。更具體而言，這些方法包括用抗原來免疫非人動物，隨后回收脾細胞，然后與獲得免疫(永生化)的細胞，如骨髓瘤細胞融合。得到的雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體，并且通過限制性稀釋用以分離單獨的克隆來進行選擇。也可以通過選擇免疫球蛋白組合文庫來產(chǎn)生抗體，例如Ward et al(1989)所述；將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的抗體通過用包括如KIR2DL多肽、更優(yōu)選為人KIR2DL多肽的活性或抑制性NK細胞受體的免疫原免疫來制備。該KIR2DL多肽可以包括人KIR2DL多肽的全長序列或其片段或衍生物，典型的免疫原片段，即包括抗原決定部分的多肽的一部分，優(yōu)選為T或B細胞抗原決定部分。這樣的片段通常含有其成熟多肽序列中的至少7個連續(xù)的氨基酸，更優(yōu)選的為至少其10個連續(xù)的氨基酸。它們基本上來自受體的細胞外結(jié)構(gòu)域。在一個優(yōu)選的實施例中，該免疫原包括野生型人KIR2DL、NCR、或其它脂膜中的多肽，通常位于細胞的表面。在一個特定的實施例中，該免疫原包括完整的NK細胞，特別是完整的人NK細胞，可選的是處理過或溶解過的。
雖然治療性抗體可以具有經(jīng)修飾的Fc區(qū)域以便增強它們通過如CD16這樣的受體的結(jié)合，但在某些實施例中NK細胞增強的抗體將具有改變的Fc區(qū)以便降低其對Fc受體的親和性，從而減少NK細胞被抗體結(jié)合的可能性，這將導致其自身被結(jié)合并溶解。
阻斷NK細胞的KIR2DL受體的抗體可以用以下方法制備，該方法包括i)用包括KIR2DL多肽的免疫原來免疫非人哺乳動物；ii)由所述經(jīng)免疫的動物制備單克隆抗體，其中所述單克隆抗體結(jié)合所述KIR2DL多肽；iii)從步驟ii)中選擇與至少兩個不同血清型的KIR2DL多肽交叉反應(yīng)的單克隆抗體；以及iv)選擇抑制KIR2DL-介導的NK細胞抑制作用的(c)的單克隆抗體。
步驟(iii)和(iv)的順序可以改變?？蛇x擇的是，如下所述，該方法可以進一步包括制造該單克隆抗體片段或衍生物的附加步驟。
在另一個變化方案中，該方法包括i)由文庫或表達譜中選擇一種與至少兩個不同血清型的KIR2DL多肽交叉反應(yīng)的單克隆抗體、或其片段或衍生物；并且從步驟i)中選出抑制KIR2DL-介導的NK細胞的抑制作用的抗體。
應(yīng)該注意到，這些方法的任意一種都可以用于選擇對共有一種或多種抗原決定部位的任何種類(抑制性或活性)的NK細胞受體具有特異性的抗體或抗體片段。例如，類似的方法可以用于制備阻斷NK細胞的KIR3DL或NKG2A/C受體或刺激NK細胞活化受體的抗體。
一個優(yōu)選的實施例中，這些方法中使用，或用于產(chǎn)生本文所述的任何抗體的非人動物是哺乳類的，如嚙齒類(如小鼠、大鼠等)、牛、豬、馬、兔、山羊、綿羊等。
此外，任何本文中所描述的抗體都可以通過遺傳修飾或基因工程化以適用于人類，如人源化抗體、嵌合抗體或人抗體。用于人源化抗體的方法是本領(lǐng)域所公知的。一般而言，根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體具有一個或多個由原始抗體引入的氨基酸殘基。這些鼠類或其它非人類氨基酸殘基通常被稱作“引入”殘基，它們通常是來自“引入”可變區(qū)。人源化基本上可以通過實施Winter及同事的以下方法來實現(xiàn)(Jones et al.(1986)Nature 321522；Riechmann et al.(1998)Nature 332323；Verhoeyen et al.(1998)Science 2391534(1998))。在一些情況下，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(Cabilly et al.美國專利第4,816,567號)，其中至少一個完整的人可變區(qū)已經(jīng)基本上被來自原始抗體的相應(yīng)序列所取代。實際上，根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體是典型的人抗體，其中有一些CDR殘基以及可能有一些FR殘基已經(jīng)被來自原始抗體中的類似位點的殘基所取代。
制造“人源化”單克隆抗體的另一種方法是用XenoMouse(Abgenix，F(xiàn)remont，CA)作為用于免疫的小鼠。XenoMouse是具有被功能性人免疫球蛋白基因取代的免疫球蛋白基因的鼠類宿主。因此，由該鼠或其雜交瘤產(chǎn)生的由該鼠的B細胞制造的抗體是已經(jīng)被人源化的。XenoMouse在美國專利第6,162,963中加以描述，將其披露的全部內(nèi)容通過引證合并于本文中。一種類似的方法可以利用HuMAb-MouseTM(Medarex)來實現(xiàn)。
人抗體也可以用各種其它的免疫技術(shù)來產(chǎn)生，如使用其它能夠表達人抗體表達譜的已經(jīng)被基因工程化的轉(zhuǎn)基因動物(Jakobovitz etal.，Nature 362(1993)255)，或用噬菌體顯示法選擇抗體表達譜。這種技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并且可以由本發(fā)明披露的單克隆抗體開始實施。
本發(fā)明的抗體也可以被推廣到“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與原始抗體中的相應(yīng)序列一致或同源，而鏈的其余部分與來自其它種屬的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類、以及這些抗體的片段的相應(yīng)序列一致或同源，只要它們呈現(xiàn)出所需的生物學活性(Cabilly et al.，supra；Morrison et al.，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.816851)。
還應(yīng)該注意到，當該阻斷NK細胞抑制性受體或刺激NK細胞活化受體的化合物是抗體時，這種抗體可以是多克隆或優(yōu)選是單克隆。該抗體可以由雜交瘤或通過基因工程化的重組體細胞表達所需的可變區(qū)和恒定區(qū)而得到。該抗體可以是單鏈抗體或保留抗原特異性和低級鉸鏈區(qū)的其它抗體衍生物或其變體。該抗體可以是多功能抗體、重組抗體、人源化抗體或其片段或衍生物。其所述片段或衍生物優(yōu)先選自Fab片段、Fab’2片段、CDR和ScFv。優(yōu)選的片段是抗原結(jié)合片段。包括抗體片段的抗體也可以包括但不限于雙特異性抗體。一個實例是包括一個對活化受體的特異性抗原結(jié)合區(qū)和一個對腫瘤抗原的特異性抗原結(jié)合區(qū)的雙特異性抗體(參見PCT申請公開第WO 01/71005號，將其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中)。
組合物和施用(給藥)本發(fā)明涉及一種組合物，包括至少一種阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的化合物(優(yōu)選為抗體或其片段)，和一種治療性抗體，使用該組合物用于提高該治療性抗體的療效、用于提高用治療性抗體治療的患者體內(nèi)的ADCC、或用于治療帶病的患者，尤其是需要消除(耗竭)作為靶標的細胞(優(yōu)選為病態(tài)的細胞，如病毒感染的細胞、癌細胞或其它病原細胞)的疾病。優(yōu)選地，該疾病選自癌(癥)、自身免疫性疾病、炎癥、病毒性疾病。該疾病還涉及移植排斥，更優(yōu)選為同種異體移植排斥、和移植物抗宿主疾病(GVHD)。
更具體而言，該疾病的治療需要消除作為靶標的細胞，優(yōu)選為如病毒感染的細胞、腫瘤細胞或其它病原細胞這樣的病態(tài)細胞。優(yōu)選地，該疾病是癌癥、傳染性或免疫疾病。更優(yōu)選，該疾病選自由癌癥、自身免疫疾病、炎癥、病毒性疾病組成的組。該疾病還涉及移植排斥，更優(yōu)選為同種異體移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)。
所述疾病包括造血細胞的贅生性增殖(neoplastic proliferation)。可選地，所述疾病可以選自包括淋巴性白血病、急性或慢性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤、和慢性淋巴細胞白血病的一組疾病。所述疾病還包括耳鼻喉(ENT)癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、上皮癌。所述疾病包括巨細胞病毒(CMV)感染和乙型肝炎。所述疾病包括克隆氏病、風濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、銀屑病(牛皮癬)、多發(fā)性硬化癥或糖尿病。尤其是可以治療前文表中所列舉的任何疾病。
所述治療性抗體可以通過CD16結(jié)合，優(yōu)選通過其Fc區(qū)域結(jié)合。優(yōu)選地，所述治療性抗體具有人IgG1或IgG3Fc部分，尤其是單克隆抗體或其片段，更優(yōu)選的是如利妥昔單抗這樣的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或其片段。
所述阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的化合物(優(yōu)選為抗體或其片段)與KIR、KNG2A/C、NCR或NKG2D人受體中的至少一種結(jié)合，并且或者抑制相關(guān)的KIR2DL、KIR3DL和/或NKG2A/C-介導的NK細胞的細胞毒性的抑制作用，或者刺激相關(guān)的NCR或NKG2D-介導的NK細胞的細胞毒性的活化作用。在一個優(yōu)選的實施例中，使用了一個KIR2DL人受體，例如選自包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3的一組人受體，或使用了一個KIR3DL人受體，例如選自包括KIR3DL1和KIR3DL2的一組人受體。
在一個優(yōu)選的實施例中，該NK細胞增效化合物結(jié)合至少一個KIR2DL人受體并且抑制相關(guān)的KIR2DL-介導的NK細胞的細胞毒性的抑制作用。優(yōu)選地，該KIR2DL人受體選自包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3的一組人受體。在一個優(yōu)選的實施例中，該化合物優(yōu)選為抗體或其片段，結(jié)合KIR2DL人受體的共同決定簇并且抑制KIR2DL-介導的NK細胞的細胞毒性的抑制作用。更優(yōu)選的是，所述化合物，優(yōu)選為抗體，結(jié)合KIR2DL 1、KIR2DL2、KIR2DL3人受體的共同決定簇并且抑制KIR2DL1-、KIR2DL2-、KIR2DL3-介導的NK細胞的細胞毒性的抑制作用。在一個特定實施例中，所述化合物(優(yōu)選為抗體)抑制在第80位具有賴氨酸(Lys)殘基的HLA-C等位基因分子結(jié)合于人KIR2DL1受體，以及在第80位具有天冬酰胺(Asn)殘基的HLA-C等位基因分子結(jié)合于人KIR2DL2和KIR2DL3受體。在另一個特定實施例中，這種抗體結(jié)合于與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200相同的抗原決定部位?？梢赃x擇地，該抗體與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200競爭結(jié)合于人NK細胞表面上的KIR受體。在一個優(yōu)選的實施例中，該抗體是由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200。在另一個實施例中，該抗體競爭結(jié)合或結(jié)合于與單克隆抗體EB6相同的抗原決定部位。
根據(jù)本發(fā)明，該組合物可以包括多種抑制NK細胞的不同抑制性受體和/或刺激NK細胞的一種或多種活化受體的化合物的組合，優(yōu)選為抗體或其片段。優(yōu)選地，阻斷NK細胞抑制性受體的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段，對選自KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、NKG2A和NKG2C的抑制性受體具有特異性，并且能夠抑制相關(guān)的KIR-或NKG2A/C-介導的NK細胞的細胞毒性的抑制作用。更優(yōu)選地，“中和”化合物的組合能夠抑制KIR2DL1-、KIR2DL2-和KIR2DL3-介導的NK細胞的細胞毒性的抑制作用。通過提供化合物的組合，會在最大數(shù)量的患者中阻斷最大數(shù)量的不同抑制性受體。同樣，可以使用刺激不同活性化合物的(或在抑制性受體存在時，結(jié)合于單一受體中的不同抗原決定部位)化合物組合，例如對選自NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D組成的組中的兩種或更多種受體的任意組合一起產(chǎn)生活化作用的化合物。此外，也可以使用包括一種或多種阻斷抑制性受體的化合物和一種或多種刺激活化受體的化合物的組合。如下所述，在一個優(yōu)選的實施例中，在使用本方法之前可以從患者處獲得一份NK細胞樣本，并且例如在存在靶細胞和治療性抗體時可以測定NK細胞對于不同的化合物組合的反應(yīng)。
本發(fā)明的組合物可以包括任何藥物可接受的載體或賦形劑、常用的緩沖液、等滲液、水性懸浮液、可選添加的穩(wěn)定劑、防腐劑等。常用的劑型包括鹽溶液，以及可選的保護或穩(wěn)定分子，如高分子量蛋白(例如人血清白蛋白)。
也可以提供包括一種或多種治療性抗體，一種或多種NK細胞增效化合物的任意組合，以及優(yōu)選具有它們的使用說明的試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物，阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段，以及治療性抗體以“有效”或“有效治療”量施用(給予)。
施用于接受者的治療性抗體的有效量可以是約0.1mg/kg至約20mg/kg。然而，抗體的有效量依賴于抗體的形式(全Ig、或片斷)，對每種特定的抗體必須測定單克隆抗體(mAb)的親和性和藥物動力學參數(shù)。
阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物(優(yōu)選為抗體或其片段)施用于接受者的有效量，可以在約0.1mg/kg到約20mg/kg之間。然而，抗體的有效量依賴于抗體的形式(全Ig、或片斷)，對每種特定的抗體必須測定單克隆抗體(mAb)的親和性和藥物動力學參數(shù)。
在本發(fā)明的一個重要的實施例中，使用本發(fā)明的化合物可以在降低的治療性抗體劑量的條件下達到治療效果。治療性抗體的使用(例如劑量、給藥處方)可能由于副作用而被限制，例如在施用利妥昔單抗的情況下出現(xiàn)的發(fā)熱、頭痛、哮喘、血壓降低、及其它癥狀。相應(yīng)地，本文中描述的NK細胞增效化合物可以與標準劑量(即，無任何其它化合物時的推薦劑量)的治療性抗體聯(lián)合施用于許多患者，從而增強了在原來需要更大療效的患者中標準劑量的療效，在另一些患者中，例如那些受副作用嚴重影響的患者，施用本化合物會使其在降低的治療性抗體劑量的條件下達到治療效果，從而避免了副反應(yīng)。實際上，一個熟練的醫(yī)療從業(yè)人員對于給定的患者能夠決定該治療性抗體和NK細胞增效化合物的理想劑量和施用處方，例如該治療方案對于患者的特殊需要和患者的整體病情而言都會是最適宜的。大量的參考文獻可用于指導決定治療性抗體和NK細胞增效化合物的適宜劑量，例如RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，by Gennaro(2003)，ISBN0781750253；Goodman andGilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics，by Hardman，Limbird & Gilman(2001)，ISBN0071354697；Rawlins E.A.，editor，“Bentley’s Textbook of Pharmaceutics”，LondonBailliere，Tindalland Cox，(1997)；以及其它文獻。
在一個實施例中，醫(yī)療從業(yè)人員可以逐步減少與任意一種本發(fā)明的NK細胞增效化合物聯(lián)合施用的給定的治療性抗體的量、或施藥劑量或施藥頻率，并且監(jiān)控該治療性抗體的療效，例如監(jiān)控NK細胞活性，監(jiān)控患者體內(nèi)存在的靶細胞，監(jiān)控各種臨床指標，或通過其它方法，并且相應(yīng)于監(jiān)控結(jié)果調(diào)節(jié)治療性抗體和/或NK增效化合物的相對濃度或施藥模式，從而使治療效果最佳并抑制副作用。
在另一組實施例中，在施用治療性抗體和NK細胞增效化合物之前(以及如果合適，在治療期間)將從患者處獲得NK細胞，并且測量，用以確定要使用的理想的化合物或化合物組的最大療效。例如NK細胞上存在的抑制性或活化受體的特征可以被確認，并且所施用的化合物其特異性地針對最重要的受體?？蛇x替換地，所得到的NK細胞可以與治療性抗體和靶細胞一起孵育，并且可以測定一種或多種化合物用以增強靶細胞消除的能力。無論一種或多種化合物的哪一種在增強體外消除(耗竭)能力最有效時，都可以被選擇用于本治療方法。
化合物和/或治療性抗體適宜的劑量一般也可以在體外或在動物模型中加以確定，例如在體外通過將各種濃度的治療性抗體在靶細胞、NK細胞(優(yōu)選為人NK細胞)、可選的其它免疫細胞存在下孵育，并改變一種或多種NK細胞增效化合物的濃度，并且用標準的測定方法(例如如實施例部分所描述的方法)測定在不同條件下靶細胞消除的程度和速率?？蛇x地，隨著改變本文所描述的化合物的劑量而改變可用抗體(例如在利妥昔單抗情況下用于NHL的動物模型)治療的疾病的動物模型所給予的治療性抗體的劑量，并測定治療動物中抗體的療效(例如由適宜的臨床、細胞或分子測定或標準來確定)。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以直接注入患者，一般是通過靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或經(jīng)皮途徑注入。一些單克隆抗體在臨床上顯示出療效，如Rituxan(利妥昔單抗)或Xolair(奧馬佐單抗)，以及類似的施藥(給藥)方案(如劑型和/或劑量和/或施藥方法)可以用于本發(fā)明的組合物。
此外，本發(fā)明的組合物可以進一步包括或可與其它活性試劑或治療方案聯(lián)合施用，如與化療或其它免疫療法，同時或隨后施用。
在一些優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的方法進一步包括一次或多次注射兩種或多種阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的化合物。因此，這兩種或多種化合物可以聯(lián)合使用。這可以用作引起ADCC和治療性抗體療效的更大增加，和/或可以用作減少特定的阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的化合物的劑量。例如，已知如IL-2這樣的化合物增加劑量使用時是有毒性的。因此，本發(fā)明優(yōu)先提供一種在有需要的患者體內(nèi)治療疾病的方法，包括a)對所述患者施用至少兩種阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的優(yōu)選為抗體或其片段的化合物；以及b)對所述患者施用一種治療性抗體。例如，一種優(yōu)選的方案為所述兩種化合物是(i)第一化合物選自由刺激NCR或NKG2D受體或活化的KIR受體的抗體、以及阻斷抑制性KIR受體或NKG2A的抗體組成的組中，以及(ii)第二化合物選自由IL-12、IL-15、IL-18和I1-21組成的組中。因此，本發(fā)明進一步提供了一種在有需要的患者體內(nèi)治療疾病的方法，包括a)根據(jù)本發(fā)明對所述患者施用一種阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的優(yōu)選為抗體或其片段的化合物；并且b)對所述患者使用一種治療性抗體；以及c)對所述患者施用IL-2。IL-2可以從Research Diagnostics，NJ，RDI-202，或Chiron Corp.(Emeryville，CA)得到。
根據(jù)任意適宜的施用方案可以施用細胞因子，并且可以在施用阻斷NK細胞抑制性受體或刺激其活化受體的化合物之前、同時和/或之后施用，以及在施用治療性抗體之前、同時和/或之后施用。在一個典型的例子中，該細胞因子在首次注射阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物的同一天被首次注射，并在5-10天內(nèi)每日施藥。所述方法可能包括由皮下途徑1或2次/天注射細胞因子。
細胞因子的劑量選擇依賴于待治療患者的病況。在一個優(yōu)選的實施例中，可以使用相對低劑量的細胞因子。例如，當含有細胞因子的藥物組合物用于每日的皮下注射時，有效劑量的a通常低于1百萬單位細胞因子/m2/天。在一個優(yōu)選的實施例中，IL-2以每日劑量低于1百萬單位/m2皮下注射5-10天。使用細胞因子的更詳細的情況參見國際專利申請公開PCT/EP/0314716和美國專利申請第60/435,344號，名稱為“Pharmaceutical compositons having an effecton the proliferation of NK cells and a method using the same”，將其披露的內(nèi)容以引用方式合并于本文中。應(yīng)該注意到治療性抗體和NK細胞增效化合物可以一同施用，例如同時注射，或可以同時施用但是以不同的劑型，或可以單獨施用，例如在化合物施用之前或之后數(shù)小時、數(shù)天、或數(shù)周施用該化合物。
本發(fā)明的進一步的方面和優(yōu)點在下面的試驗部分中加以公開，這應(yīng)當理解為是對本發(fā)明的例證但不限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1全KIR2DL抗體的產(chǎn)生PBL的純化及多克隆或克隆NK細胞系的產(chǎn)生PBL通過Ficoll Hypaque梯度法以及棄去貼壁細胞(plasticadherent cell)而得自健康的供者。為了獲得富集的NK細胞，PBL用抗CD3、抗CD4和抗HLA-DR的單克隆抗體(mAbs)孵育(4℃下30分鐘)，隨后用羊抗鼠磁珠(Dynal)(4℃下30分鐘)并用本領(lǐng)域已知的方法(Pende et al.，1999)進行免疫磁珠分選。將CD3缺陷細胞-(CD3 minus cell)、CD4缺陷細胞-、DR缺陷細胞在照射過的喂養(yǎng)細胞、和100U/ml白介素2(白細胞介素2)(Proleukin，Chiron Corporation)及1.5ng/ml植物血凝素A(Gibco BRL)上培養(yǎng)，從而得到多克隆NK細胞族。NK細胞通過限制性稀釋來克隆，并且NK細胞的克隆通過用于細胞表面受體表達的流式細胞計數(shù)法進行識別。
如下的克隆用于本研究中CP11、CN5和CN505是KIR2DL1的陽性克隆，并且被EB6或XA-141抗體染色。CN12和CP 502是KIR2DL3的陽性克隆，并且被GL183抗體染色。
流式細胞計數(shù)法分析所使用的單克隆抗體(mAb)是在本實驗室中制備的JT3A(IgG2a、抗CD3)、EB6和GL183(分別是IgG1抗KIR2DL1和抗KIR2DL3)、XA-141IgM抗KIR2DL1(與EB6、抗CD4(HP2.6)、抗DR(DR1.12、IgG2a)相比具有相同的特異性)。除了JT3A、HP2.6、DR1.12，具有相同特異性的可商購自加利福尼亞州富勒敦市的Beckman coulter公司的單克隆抗體可以用于實施例中。EB6和GL183是可以從加利福尼亞州富勒敦市的Beckman coulter公司商購的。XA-141是不可商購的，但是EB6可以用于控制在文獻(Moretta et al.，1993)中所描述的溶解的重構(gòu)。
流式細胞計數(shù)法將細胞用適當?shù)目贵w染色(4℃下30分鐘)，隨后通過PE或FITC結(jié)合多克隆抗鼠抗體(Southern Biotechnology Associates Inc)。將樣品在FACSAN設(shè)備上(Becton Dickinson，Mountain View，CA)通過細胞熒光測定分析法進行分析測試。
細胞毒性實驗NK克隆的細胞溶解活性通過標準的4小時51Cr釋放試驗進行檢測。其中將效應(yīng)物NK細胞在已知的對NK細胞溶解敏感的Cw3或Cw4陽性細胞系上進行測試。在微量滴定板的每個孔中所有靶細胞的用量約為5000個細胞，而在靶細胞上的效應(yīng)物的比率在圖中示出(通常每個靶細胞對應(yīng)4個效應(yīng)物)。在有或無所示的以1/2稀釋所述單克隆抗體上清的條件下進行細胞溶解試驗。該過程基本上與在文獻(Moretta et al.，1993)中所描述的一致。
新的單克隆抗體的產(chǎn)生單克隆抗體通過用如在文獻(Moretta et al.，1990；將其披露的內(nèi)容以引用方式合并于本文中)中所描述的活化的多克隆或單克隆NK細胞系免疫5周的Balb C小鼠產(chǎn)生。當不同的細胞融合后，單克隆抗體由于它們能夠與EB6和GL183陽性NK細胞系和克隆交叉反應(yīng)從而首先被挑選出來。陽性單克隆抗體由于能夠重構(gòu)分別由Cw4或Cw3陽性靶細胞的EB6陽性或GL183陽性NK克隆造成的溶解，從而進一步被篩選出來。
DF200，一種作用于KIR2DL人NK受體的共用決定區(qū)的新的單克隆抗體一種單克隆抗體DF200mAb，經(jīng)發(fā)現(xiàn)能與包括KIR2DL1、KIR2DL2/3的KIR家族的各成員反應(yīng)。對于用DF200mAb(KIR2DL1+和KIR2DL2/3+細胞)染色的NK細胞被明亮地著色。(圖1)
表達一種或另一種(或甚至兩種)HLA類I特異性抑制性受體的NK克隆用作表達一種或多種HLA-C等位基因的抗靶細胞的效應(yīng)物。正如所料，KIR2DL1+NK克隆對表達HLA-Cw4的靶細胞顯示出即便有也是極小的細胞溶解活性，同樣，KIR2DL3+NK克隆對Cw3陽性靶細胞也顯示出極小或沒有活性。然而，當存在DF200mAb(用于掩蔽它們的KIR2DL受體)時，NK克隆變得不能夠識別它們的HLA-C配體，并且在Cw3或Cw4靶上顯示出很強的細胞溶解活性。
例如，C1R細胞系(CW4+EBV細胞系，ATCC n°CRL 1993)沒有被KIR2DL1+NK克隆(CN5/CN505)殺死，但是該抑制作用通過使用DF200或傳統(tǒng)的抗KIR2DL1mAb可以被有效逆轉(zhuǎn)。另一方面，表達KIR2DL2/3+KIR2DL1-表型的NK克隆(CN12)有效地殺死C1R，而且這種致死不受DF200mAb的影響(圖2)。相似的結(jié)果可以用在Cw3陽性靶上的KIR2DL2-或KIR2DL3-陽性NK克隆得到。
DF200mAb/KIR 2DL 1和DF200mAb/KIR 2DL3相互作用的Biacore分析材料和方法重組體蛋白的生產(chǎn)及純化。KIR2DL1和KIR2DL3重組體蛋白在編碼KIR2DL和KIR 2DL3全部細胞外結(jié)構(gòu)域的E.coli.cDNA中產(chǎn)生，該KIR2DL和KIR 2DL3分別由pCDM8克隆47.11載體(Biassoni et al.，1993；將其披露的內(nèi)容以引用方式合并于本文中)和RSVS(gpt)183克隆6載體(Wagtman et al.，1995；將其披露的內(nèi)容以引用方式合并于本文中)，使用如下引物得到
有義(引物)5’-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3’反義(引物)5’-CCCAAGCTTGGGTTATGTGACAGAAACAAGCAGTGG-3’。
它們在閱讀框中用編碼生物素化信號的序列克隆在pML1表達載體中(Saulquin et al.，2003；將其披露的內(nèi)容以引用方式合并于本文中)。
在BL21(DE3)菌株(Invitrogen)內(nèi)完成蛋白表達。轉(zhuǎn)染的細菌在補充有氨比西林(100ug/ml)的培養(yǎng)液中于37℃生長到OD600＝0.6，并用1mM IPTG誘導。
在變性條件下(8M脲)從包含體中回收蛋白質(zhì)。重組蛋白的再折疊在含有L-精氨酸(400mM，Sigma)和β-巰基乙醇(1mM)的三羧甲基氨基甲烷(Tris)20mM、pH7.8、NaCl 150mM緩沖液中在室溫下通過在六步透析(分別是4、3、2、1、0.5和0M脲)中逐漸減少脲濃度來實現(xiàn)。在0.5和0M脲透析步驟時加入經(jīng)還原及氧化的谷胱甘肽(分別是5mM和0.5mM，Sigma)。最后，將蛋白在三羧甲基氨基甲烷(Tris)10mM、pH7.5、NaCl 150mM緩沖液中充分透析。將可溶性的再折疊蛋白經(jīng)濃縮后在Superdex 200排阻層析柱上純化(Pharmacia；AKTA系統(tǒng))。
Biacore分析。在一臺Biacore設(shè)備上(Biacore)進行表面等離子共振測定。在所有的Biacore試驗中，用補充有0.05％表面活性劑P20的HBS緩沖液作為運行緩沖液。
蛋白固定。將重組體KIR2DL1和KIR2DL3蛋白共價固定于在傳感器芯片CM5(Sensor Chip CM5)(Biacore)上的葡聚糖層中的羧基基團。該傳感器芯片表面用EDC/NHS(N-乙基-N’(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺，Biacore)活化。將在結(jié)合緩沖液(10mM乙酸鹽，pH4.5)中的蛋白注入。用100mM、pH為8的乙醇胺(Biocore)進行剩余的活性基團的失活。
親和力測量。為了進行動力學測量，將不同濃度的可溶性抗體(10-7到4×10-10M)施加到該經(jīng)固定的樣本上。以20ul/min的連續(xù)流速進行測量。對于每一循環(huán)，通過注入5μl的10mM、pH為11的NaOH對感應(yīng)芯片的表面進行再生。
將BIAlogue動力學評價程序(BIAevaluation 3.1，Biacore)用于數(shù)據(jù)分析。
結(jié)果將DF200mAb結(jié)合于經(jīng)固定的KIR 2DL1和KIR 2DL3的BIAcore分析。

KD離解常數(shù)。
將可溶性分析物(在不同濃度下為40μl)以在HBS緩沖液中20μl/min的流速注入到分別含有KIR 2DL1和KIR 2DL3為500或540反射單位(RU)、以及1000或700RU的葡聚糖層上。數(shù)據(jù)代表6個獨立的實驗。
實施例2美羅華(Rituxan)和抗KIR單克隆抗體(抗KIR mAb)聯(lián)合使用增強ADCC制備人NK克隆。將用陰性抗CD3免疫磁選擇方法(Miltenyi)去掉T細胞的血單核細胞在限制性稀釋的條件下鋪板，用植物血凝素A(PHA)(Biochrom KG，Berlin，Germany)活化，用白介素2(IL-2)(Chiron B.V.，Amsterdam，Netherlands)和照射過的喂養(yǎng)細胞培養(yǎng)。在所有的供體中克隆效率都是相等的，占鋪板的NK細胞的1/5到1/10之間?？寺〉腘K細胞通過對Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染的、已知的HLA類型的B淋巴母細胞系以效應(yīng)物對靶細胞比率為10∶1作用的標準51Cr釋放細胞毒(性)來篩選同種異體反應(yīng)性。顯示≥30％溶解的克隆被認為是具有同種異體反應(yīng)性的。作為判定標準，克隆指或者具有＜5％的顯示或者具有＞40％的溶解。
用美羅華(Rituxan)增強由KIR2DL1陽性NK細胞克隆介導的ADCC用標準4hr 51Cr釋放測試測定NK細胞的細胞溶解活性，其中效應(yīng)物NK細胞在Cw4或Cw3陽性EBV細胞系(CD20陽性)上進行測試，了解其對NK細胞溶解的敏感性。所有的靶細胞在微量滴定板以每孔5000個細胞以及效應(yīng)物(NK細胞克隆)在靶細胞上的比率如圖3中所示來使用。在一些實驗中，該治療性嵌合抗CD20利妥昔單抗(Rituxan，Idec)以5μg/ml加入到該效應(yīng)物靶細胞混合物中。在一些實驗中，EB6抗體(抗KIR2DL1)以10μg/ml加入到效應(yīng)物靶細胞混合物中。
本實驗顯示出單獨的美羅華(Rituxan)基本上不介導通過在Cw4陽性靶目標上KIR2DL1陽性NK克隆的ADCC。存在抗KIR2DL1抗體時，KIR2DL1陽性克隆的ADCC被極大地增強了。
實施例3由坎帕斯(Campath)通過KIR2DL1陽性NK細胞克隆介導的ADCC的增強在與實施例2所描述的類似的實驗中，將自體同源Cw4+PHA胚細胞在NK細胞加上阿來組單抗(alumtuzumab)(Campath，Berlex)、EB6抗體(100μg/ml)存在時，或坎帕斯(Campath)和EB6存在時孵育。如圖4所示，結(jié)果顯示EB6的存在極大地增強了NK細胞消除自體同源細胞的能力坎帕斯(Campaht)單獨存在時大約4％的靶細胞溶解，然而坎帕斯(Campath)加上EB6存在時超過30％的細胞溶解。
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P7176RWS.ST25SEQUENCE LISTING<110>依奈特制藥公司佩魯賈研究大學<120>使用NK細胞增效化合物提高治療性抗體功效的方法和組合物<130>P7176RWS<140>PCT/IB2004/002636<141>2004-07-23<150>US 60/489,489<151>2003-07-24<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>42<212>DNA<213>合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物-有義-5’至3’<400>1ggaattccag gaggaattta aaatgcatga gggagtccac ag 42<210>2<211>36<212>DNA<213>合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(36)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(36)<223>引物-反義-5’至3’<400>2cccaagcttg ggttatgtga cagaaacaag cagtgg3權(quán)利要求
1.一種在有需要的人類患者體內(nèi)治療疾病的方法，包括a)對所述患者施用一種阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激NK細胞的活化受體的化合物；并且b)對所述者施用一種能夠通過CD16結(jié)合的治療性抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述治療性抗體具有一個人IgG1或IgG3Fc的部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述化合物是一抗體、或包括它的一個抗原結(jié)合片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3所述的方法，其中所述治療性抗體是一單克隆抗體、或包括它的一個抗原結(jié)合片段。
5.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述治療性抗體不與放射性部分或毒性部分結(jié)合。
6.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述化合物抑制NK細胞的抑制性受體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的方法，其中所述化合物刺激NK細胞的活化受體。
8.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述化合物是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或包括它們的一個抗原結(jié)合片段。
9.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述治療性抗體是一人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或包括它們的一個抗原結(jié)合片段。
10.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述治療性抗體是利妥昔單抗或坎帕斯。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述抗體是利妥昔單抗，并且所述抗體以每周少于375mg/m2的劑量施用。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述抗體是坎帕斯，并且所述抗體以每周少于90mg的劑量施用。
13.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述化合物與NKG2、KIR2DL或KIR3DL人受體中的至少一種結(jié)合，并且抑制相關(guān)的所述NKG2、KIR2DL或KIR3DL介導的NK細胞的細胞毒性的抑制作用。
14.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述化合物阻斷選自包括KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRB1、NKG2A、NKG2C、NKG2E和LILRB5的一組NK細胞抑制性受體。
15.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述化合物與KIR2DL人受體的一個共同決定簇結(jié)合，并且抑制KIR2DL-介導的NK細胞的細胞毒性抑制作用。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述化合物與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3人受體的一個共同決定簇結(jié)合，并且抑制KIR2DL1-、KIR2DL2-和KIR2DL3-介導的NK細胞的細胞毒性抑制作用。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述化合物抑制在第80位具有賴氨酸殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL1受體結(jié)合、以及在第80位具有天冬酰胺殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2和KIR2DL3受體結(jié)合。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述化合物結(jié)合的抗原決定簇與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200、或單克隆抗體EB6相同。
19.根據(jù)權(quán)利要求13-17所述的方法，其中所述化合物與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200、或單克隆抗體EB6相競爭而結(jié)合在人NK細胞表面的KIR受體上。
20.根據(jù)權(quán)利要求13-17所述的方法，其中所述化合物是由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200或其片段或衍生物、或單克隆抗體EB6或其片段或衍生物。
21.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述化合物是一抗體、或包括它的一個抗原結(jié)合片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求7或21所述的方法，其中所述化合物與包括NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D的一組受體中任選的一個相結(jié)合。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述化合物衍生于包括AZ20、A76、Z25、Z231和BAB281的一組單克隆抗體中任選的一個、或與其競爭。
24.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述治療性抗體和所述化合物同時施用于所述患者。
25.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述化合物在施用所述治療性抗體一周內(nèi)施用于所述患者。
26.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述疾病是癌、傳染性疾病或免疫性疾病。
27.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，進一步包括一附加步驟，其中在施用所述化合物之前或之后測定所述患者NK細胞的活性或數(shù)量。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述附加步驟包括i)在所述施用之前由所述患者獲得NK細胞；ii)在存在一種或多種可被所述治療性抗體識別的靶細胞、存在/不存在所述化合物的情況下，孵育所述NK細胞；以及iii)測定所述化合物對于所述NK細胞消除所述靶細胞能力的影響；其中測出所述化合物增強所述NK細胞消除所述靶細胞的能力時，表明所述化合物適用于所述方法、并且所述方法適用于所述患者。
29.一種藥物組合物，包括(a)一種能夠通過CD16結(jié)合的治療性抗體，(b)一種阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激NK細胞的活化受體的化合物，以及(c)一種藥物學上可接受的載體。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述治療性抗體具有一個人或非人靈長類的IgG1或IgG3Fc部分。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的組合物，其中所述化合物是一抗體、或包括它的一個抗原結(jié)合片段。
32.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的組合物，其中所述化合物是一單克隆抗體、或包括它的一個抗原結(jié)合片段。
33.根據(jù)權(quán)利要求29-32任一項所述的組合物，其中所述化合物是一人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或包括它們的一個抗原結(jié)合片段。
34.根據(jù)權(quán)利要求29-33任一項所述的組合物，其中所述治療性抗體是一單克隆抗體、或包括它的一個抗原結(jié)合片段。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述治療性抗體是一人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或包括它們的一個抗原結(jié)合片段。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的組合物，其中所述抗體不與放射性部分或毒性部分結(jié)合。
37.根據(jù)權(quán)利要求29-36任一項所述的組合物，其中所述化合物抑制NK細胞的抑制性受體。
38.根據(jù)權(quán)利要求29-36任一項所述的方法，其中所述化合物刺激NK細胞的活化受體。
39.根據(jù)權(quán)利要求29-38任一項所述的組合物，其中所述治療性抗體是利妥昔單抗或坎帕斯。
40.根據(jù)權(quán)利要求29-37和39任一項所述的組合物，其中所述化合物阻斷包括KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRB1、NKG2A、NKG2C、NKG2E和LILRB5的一組的NK細胞抑制性受體中任選的一個。
41.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述化合物與KIR2DL人受體的一個共同決定簇結(jié)合，并且抑制KIR2DL-介導的NK細胞的細胞毒性抑制作用。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述化合物與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3人受體的一個共同決定簇結(jié)合，并且抑制KIR2DL1-、KIR2DL2-和KIR2DL3-介導的NK細胞的細胞毒性抑制作用。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述化合物抑制在第80位具有賴氨酸殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL1受體的結(jié)合、以及在第80位具有天冬酰胺殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2和KIR2DL3受體的結(jié)合。
44.根據(jù)權(quán)利要求29或40-43任一項所述的組合物，其中所述化合物結(jié)合的抗原決定簇與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200、單克隆抗體NKVSF1或單克隆抗體EB6相同。
45.根據(jù)權(quán)利要求29或40-43任一項所述的組合物，其中所述化合物與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200、單克隆抗體NKVSF1、或單克隆抗體EB6相競爭而結(jié)合在人NK細胞的表面KIR受體上。
46.根據(jù)權(quán)利要求29或40-43任一項所述的組合物，其中所述化合物是由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200或其片段或衍生物、單克隆抗體NKVSF1或其片段或衍生物、或單克隆抗體EB6或其片段或衍生物。
47.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述化合物結(jié)合于包括NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D的一組受體中任選的一個。
48.一種選擇與治療性抗體聯(lián)合施用的化合物的方法，所述方法包括i)提供一種抑制NK細胞的抑制性受體或刺激NK細胞的活化受體的待測化合物；ii)在存在NK細胞、并在存在/不存在所述待測化合物的情況下，將所述治療性抗體與可被所述治療性抗體特異性識別的靶細胞一同孵育；iii)測定所述化合物對于所述NK細胞消除所述靶細胞能力的影響；其中測出所述化合物增強所述NK細胞消除所述靶細胞的能力時，表明所述化合物適用于所述方法。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述化合物將所述治療性抗體摧毀所述靶細胞的能力增強30％。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述化合物將所述治療性抗體摧毀所述靶細胞的能力增強50％。
51.根據(jù)權(quán)利要求48-50任一項所述的方法，其中所述化合物選自包括抗體、抗體片段、單克隆抗體、單克隆抗體片段、人源化抗體、嵌合抗體和人抗體的一組物質(zhì)。
52.根據(jù)權(quán)利要求48-51任一項所述的方法，其中所述靶細胞是癌細胞、病毒感染的細胞或構(gòu)成自身免疫疾病基礎(chǔ)的細胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求48-52任一項所述的方法，其中所述治療性抗體是利妥昔單抗或坎帕斯。
54.一種增加涉及對患者施用可以由CD16結(jié)合的治療性抗體的治療功效的方法，所述方法包括在施用所述治療性抗體之前、同時、或之后對所述患者施用一種阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激NK細胞的活化受體的有效治療量的化合物。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述化合物通過強化所述患者的ADCC來增加所述治療功效。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及用于增加治療性抗體功效的方法和組合物。通過提高ADCC機制來增強它們的療效。更具體而言，本發(fā)明涉及將治療性抗體與阻斷NK細胞的抑制性受體或刺激其活性受體的化合物聯(lián)合使用，從而增加治療性抗體在人類患者體內(nèi)的治療功效。
文檔編號G01N33/50GK1829530SQ200480021421
公開日2006年9月6日 申請日期2004年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月24日
發(fā)明者安德烈亞·韋拉爾迪, 弗朗索瓦·羅馬涅 申請人:依奈特制藥公司, 佩魯賈研究大學