專利名稱：用于dna和蛋白質微陣列的可著色微球的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及生物學微陣列技術。具體而言，本發(fā)明涉及固定在基片上的微球陣列以及將該微球表面暴露于測試樣品中所含的分析物的方法。該微球包含潛在著色劑，當顯示出顏色時所述著色劑可識別所述微球。該微球在表面上還攜帶俘獲劑(也稱作探針)。
背景技術：
現(xiàn)有技術已經采用了多種方法制備微陣列。例如，美國專利No.5143854、5412087和5489678證實了可以采用光刻法制備肽和DNA微陣列。該專利教導了采用對光不穩(wěn)的保護基團，通過光刻法在1cm×1cm芯片上連續(xù)循環(huán)去除對某限定點的保護，然后在整個表面灌滿活性氨基酸或DNA堿基，來制備肽和DNA微陣列。重復這種方法，使得能夠構建出在陣列上不同點處具有數(shù)千個任意不同肽或寡核苷酸序列的肽或DNA微陣列。這種方法成本很高。其它研究人員正在采用噴墨方法(例如，美國專利No.6079283、6083762和6094966)來制備空間可尋址陣列，但是這種技術也受到高制造成本的困擾，而且陣列點的尺寸相對較大，為40-100微米。
可替換空間可尋址方法的方法是采用整合了熒光染料的聚合物微球來制備生物多重陣列的概念。美國專利No.5981180公開了組合采用顏色編碼的微球和流式細胞儀來進行多重生物學測定的方法。表面上綴合有DNA或單克隆抗體探針的微球采用各種比例的兩種不同熒光染料進行內部染色。允許數(shù)百“空間尋址”微球和生物樣品反應，并通過讓一個微球通過流式細胞儀室來解碼樣品信息對“液體陣列”進行分析。美國專利No.6023540公開了采用在遠端具有預蝕刻的微孔的光纖束來組裝加載了染料的微球。在每個空間尋址微球表面附著獨特的生物活性劑，且使數(shù)千個攜帶不同生物活性探針的微球組合起來在光纖束的預蝕刻微孔上形成“微球陣列”。最近，通過使用整合入微球中的不同大小的具有硫化鋅蓋層的硒化鎘(zinc-sulfide-capped cadmium selenide)納米晶體(nanocrystal)，實現(xiàn)了新型光學編碼的微球方法(NatureBiotech.，19，631-635，(2001))?？紤]到這些納米晶體具有窄帶寬，所以這種方法顯著擴大了微球中的光譜條型碼編碼容量(barcodingcapacity)。
即使該“光譜尋址微球”法和制備微陣列的傳統(tǒng)“空間可尋址”方法相比，在簡單性上確實有優(yōu)勢，但是本領域仍然需要在制備生物學微陣列時難度下降且成本降低。
USSN 09/942241提供了一種微陣列，和那些現(xiàn)在已經公開的相比，它由于載體無需修飾，所以制備成本較低并且較容易；不過，微球在基片中保持固定。USSN 09/942241提供的微陣列包括涂覆有組合物的基片，所述組合物包括分散在含有膠凝劑或膠凝劑前體的流體中的微球，其中所述微球固定在基片的隨機位置上?；喜缓O計成和微球發(fā)生物理或化學相互作用的受體。該發(fā)明采用唯一的涂覆組合物和技術以在無需預蝕刻微孔或者以任何方式預標記上位點來吸引微球的基片上制備微陣列，所述預蝕刻或預標記如同本領域所公開的那樣。
USSN 09/942241教導了各種涂覆方法，而且給出了機器涂覆的例子，由此在載體上涂覆了含有分散在明膠中的微球的流體涂覆組合物。在涂覆后，即刻使載體通過涂覆機中的激冷凝固室(chill-setchamber)，在此明膠快速凝膠化并使微球固定。
盡管該發(fā)明和那時候的現(xiàn)有技術相比，在制備上具有巨大的優(yōu)勢，但是也有一些限制。和許多目前制備基于微球的微陣列的方法一樣，它涉及采用來自整合在微球里的著色劑的唯一可檢測光信號對各個微球進行顏色條型碼編碼，而且顏色強度與色調和共價附著在微球表面的唯一生物學探針相關。但是，這種方法有兩個問題(1)著色劑自身發(fā)射熒光，這對生物學相互作用產生的熒光信號產生干擾；(2)當條型碼編碼染料的吸附波長和該生物學相互作用的熒光發(fā)射成互補關系時，熒光信號強度會受到顯著抑制。問題1嚴重限制了微球顏色條型碼編碼多樣性，問題2顯著降低了微陣列系統(tǒng)的動態(tài)范圍和檢測下限。
發(fā)明概述本發(fā)明通過公開基于微球的微陣列系統(tǒng)解決了上述問題，其中所述微陣列系統(tǒng)由包括下列的微陣列組成載體，在其上設置攜帶生物學探針的微球層；其中所述微球包括至少一種具有能顯色并用來識別所述微球的潛在顏色的材料。
本發(fā)明還公開了利用這種微陣列的方法，一種方法包括下列步驟提供包括潛在著色劑和生物學探針的微球陣列；使所述微球和所述生物分析物接觸，其中分析物用發(fā)光標簽標記；使生物分析物和探針相互作用；洗滌陣列從而去除沒有結合的分析物；記錄來自發(fā)光標簽的信號，所述信號源自探針和分析物的結合，并將所述信號記錄下來作為圖像A；使微球上的潛在化合物顯色得到可檢測的光標記；記錄該光標記作為圖像B；和比較圖像A和B，以確定生物靶的特征和濃度。
可替換的方法公開了下列步驟提供在其表面上含有潛在著色劑并攜帶生物學探針的微球；使所述微球和分析物接觸，其中所述分析物用發(fā)光標簽標記；使生物學探針和分析物相互作用；洗滌微球去除沒有結合的分析物；將所述微球固定在載體的二維表面上形成微陣列；測量來自發(fā)光標簽的信號，所述信號源自探針和分析物的相互作用，并將所述信號記錄下來作為圖像A；使微球上的潛在著色劑顯色得到可檢測的光標記，記錄該標記作為圖像B；比較圖像A和B，以確定分析物的特征和濃度。
發(fā)明的有利效果本發(fā)明包括多個優(yōu)點，不是所有的優(yōu)點都整合于單一實施方案中。一個優(yōu)點是，本發(fā)明的微球可以克服一個有關“光譜尋址微球”的具體問題，其中微球中常用的著色化合物通常是熒光的，因此當在微陣列上進行熒光測定時這些化合物產生過量的“背景噪聲”。這個問題可以通過采用潛在著色劑來解決，該潛在著色劑在化學反應、物理觸發(fā)或某種環(huán)境刺激下“打開”為著色狀態(tài)之前保持無色和相對非發(fā)射狀態(tài)。另一個優(yōu)點是，使用潛在著色劑顯著擴大了微球的“光譜條型碼編碼”容量，這使得能夠生成大量的微球多樣性。因此，可以采用單一陣列在單次試驗中測量數(shù)目更多的靶分析物。本發(fā)明的另一優(yōu)點是，無色編碼使得微球不產生可以檢測到的背景熒光，所以顯著改善了檢測的界限。同樣，另一個優(yōu)點是根據(jù)本發(fā)明制備的微陣列還為靶分析物的測量提供了寬的動態(tài)范圍。
附圖簡述

圖1A示意性示出了微陣列載體1，其上固定了整合有潛在著色劑的微球2。在每個微球表面上附著有生物學探針3。
圖1B示意性示出了含有整合了潛在著色劑的微球2的微陣列；有些微球2在表面上結合了用發(fā)射標簽標記的分析物4。
圖1C示意性示出了微陣列，其中每個微球2內部的潛在著色劑已經通過物理或化學方式轉換成可檢測到的光標記。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了在載體上的基于微球的微陣列，也稱作基于“珠子”的微陣列。微陣列中的每個微球都具有獨特的光標記，所述光標記可以將該微球和具有不同光標記的其它微球區(qū)分開-也就是說，該標記是獨特的。同樣，本發(fā)明提供了一種微陣列，其包括具有以隨機或有序分布模式固定在二維平面里的微球層的載體。
此處所用的術語“微陣列”或“陣列”是指多個隨機或有序分布在載體上的二維平面里的微球。微球整合有一種或不止一種的化合物，其中該化合物是通過化學或物理方式可以顯色的潛在著色劑。生物活性探針可以而且通常附著到微球的表面上。此處所用的生物活性探針包括但不限于多核苷酸、多肽、多糖和能夠與特定生物學靶發(fā)生特異性相互作用的小合成分子。優(yōu)選的生物活性探針是核酸和蛋白質。微陣列通常包括具有不止一種著色劑類型，并具有不止一種類型的生物活性探針的微球。陣列的大小和形狀可以隨著組成和目的用途而變。另外，陣列可以包括不同格式的多個子陣列。
在本發(fā)明中，微球在載體上的分布或模式可以有序或者完全隨機。微球固定在載體表面的二維平面內?？赡艿妮d體包括但不限于玻璃、金屬、聚合物和半導體。載體可以透明或不透明，可以是柔性的或者剛性的。在有些情況下，載體可以是多孔膜，比如硝基纖維素和聚二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)。微球通過其和載體之間的物理或化學相互作用固定到載體的表面上。為了提高堅固性和可再現(xiàn)性，更理想的做法是將微球固定到采用某些化學功能劑修飾的表面上，即，該表面通過化學處理或修飾后使得微球可以附著。如同本領域熟練技術人員會認識到的那樣，該表面也可以經修飾后提供使得微球可以附著到這種修飾后表面的物理力，例如靜電力、磁力、壓縮力和粘著力等。載體表面通常是平面的，但是，也可以是包含規(guī)則或不規(guī)則三維構造的修飾表面，比如微孔或凹槽可以用來通過將微球嵌入孔里將其固定在表面上。也可以通過使得微球可以流過限定的空間例如管、腔室，而該限定空間使得微球可以組裝成二維陣列，從而將微球固定在二維平面里。
在優(yōu)選實施方案中，采用涉及“溶膠至凝膠”轉變過程的涂覆方法將微球固定在表面上。此處所用的術語“溶膠至凝膠轉變”或“凝膠化”，是指顆粒的流體溶液或懸浮液形成顯示出非穩(wěn)態(tài)流動的連續(xù)三維網絡的過程。這種現(xiàn)象可以通過以下方式在聚合物中發(fā)生通過存在多功能單體時的聚合；通過具有反應性側鏈的溶解的聚合物的共價交聯(lián)；以及通過溶液中聚合物分子之間的二次鍵合，比如氫鍵。聚合物比如明膠表現(xiàn)出屬于最后一種類型的熱凝膠化。凝膠化或凝固過程的特征在于粘度出現(xiàn)非連續(xù)增加。(參見P.I.Rose，“The Theory of the PhotographicProcess”，第4版，T.H.James編輯，第51-67頁)。
此處所用術語“膠凝劑”是指可以承受上述凝膠化的物質。例子包括承受熱凝膠化的材料，比如明膠、水溶性纖維素醚或聚(n-異丙基丙烯酰胺)，或者可以通過硼酸鹽化合物化學交聯(lián)的物質，比如聚(乙烯醇)。其它膠凝劑為可以通過輻射比如紫外線輻射進行交聯(lián)的聚合物。膠凝劑的例子包括阿拉伯膠(acacia)、褐藻酸、膨潤土、卡波姆、羧甲基纖維素鈉、十六醇十八醇混合物、膠體二氧化硅、乙基纖維素、明膠、瓜耳膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、硅酸鋁鎂、麥芽糖糊精、甲基纖維素、聚乙烯醇、聚烯吡酮、藻酸丙二酯、褐藻酸鈉、羥基乙酸(glycolate)淀粉鈉、淀粉、黃蓍膠和黃原膠。(對膠凝劑的進一步討論，請參見所附參考文獻Secundum Artem，vol.4，No.5，Lloyd V.Allen)。優(yōu)選的膠凝劑是堿預處理過的明膠。
Edward Cohen和Edgar B.Gutoff在“Modern Coating And DryingTechnology”第一章，(Interfacial Engineering Series；v.1)，(1992)，VCH Publishers Inc.，New York，NY中廣泛描述了涂覆方法。對單層格式而言，合適的涂覆方法可以包括浸涂、棒涂(rod coating)、刮涂、葉片涂覆(blade coating)、氣刀涂覆(air knife coating)、照相凹版涂覆(gravure coating)、正向和反向輥涂(forward andreverse roll coating)和開槽與擠出涂覆(slot and extrusioncoating)。
干燥方法也可以變化，有時具有令人驚奇的變化結果。例如，當流體明膠/微球組合物通過激冷凝固而快速干燥時，在明膠有時間從微球的突出表面上流動之前發(fā)生了凝膠化，導致形成阻止微球表面和將在其上沉積的任何試劑之間直接接觸的明膠層。當使得流體組合物可以在環(huán)境溫度下更加緩慢干燥時，明膠從微球表面上流動，使得微球基本上沒有明膠?！盎旧蠜]有”是指微球表面上基本上不含與其上附著的探針或試劑相互作用的明膠。
微球或珠子可以包括，但不限于，聚合物、玻璃或陶瓷。優(yōu)選微球由聚合物材料制成。制備聚合物微球的合適方法是如I.Piirma在“Emulsion Polymerization”，Academic Press，New York(1982)所述的乳狀液聚合法，或者T.H.Whitesides和D.S.Ross在J.ColloidInterface Science，Vol.169，第48-59頁(1985)所述的有限聚結法。用來制備顆?；蛭⑶虻木唧w聚合物是可以著色的水不混溶型合成聚合物。優(yōu)選聚合物是任何無定形水不混溶型聚合物。有用的聚合物類型的例子是聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)或聚(丙烯酸丁酯)。也可以采用共聚物，比如苯乙烯和丙烯酸丁酯的共聚物。采用聚苯乙烯聚合物很方便。
形成的微球和不溶性的潛在著色劑整合，所述著色劑是有機或者無機的并且在后續(xù)處理過程中不溶解。合適的化合物實際上可以是油溶性的。優(yōu)選該化合物在整合到微球中時是非熒光的。雖然由于制備容易而優(yōu)選基本上為曲線形狀的微球或顆粒，但是也可以采用其它形狀的顆粒，比如橢圓體或者立方體顆粒。
理想情況下，形成的微球平均直徑為1-50微米；更優(yōu)選3-30微米，最優(yōu)選5-20微米。優(yōu)選微球在涂層中的濃度是100-1000000/cm2，更優(yōu)選是1000-200000/cm2，且最優(yōu)選是10000-100000/cm2。
在微球表面上附著生物活性探針。此處所用的生物活性探針包括但不限于多核苷酸、多肽、多糖和能夠與特定生物學靶發(fā)生特異性相互作用的小合成分子。優(yōu)選的生物活性探針是核酸和蛋白質。
核酸是攜帶遺傳信息的多核苷酸生物分子。有兩種基本類型的核酸，即脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA分子由四種核苷酸堿基，A、T、G和C組成，這四種堿基以線性方式共價連接；而RNA分子由四種堿基，A、U、G和C組成，這四種堿基以線性方式共價連接。四種堿基之間的相互作用遵循“沃森-克里克(Watson-Crick)”堿基配對原則，即A和T(U)以及G和C由氫鍵介導。當兩個單鏈DNA分子具有完美的“沃森-克里克”堿基配對匹配時，將它們稱作互補鏈。兩個互補鏈之間的相互作用稱作雜交。同樣，單鏈DNA或RNA可以用作生物活性探針來與其互補鏈相互作用。有時候，互補鏈也可以包括一個或多個堿基配對錯配。
可用于本發(fā)明的一些常用核酸生物活性探針包括但不限于DNA和DNA片段、RNA和RNA片段、合成寡核苷酸和肽核酸。在本發(fā)明的另一實施方案中，核酸生物活性探針可以是任何能夠識別特定DNA序列的蛋白質支架或合成分子部分。核酸生物活性探針可以進行末端修飾，以使其包含一種或不止一種的可用來附著到另一個分子或表面的化學官能團。一些常用的末端修飾包括但不限于氨基、硫醇、羧基、生物素和洋地黃毒苷。
蛋白質分子由20種線性共價連接的氨基酸組成。有些蛋白質可以通過包括磷酸化和糖基化的翻譯后加工在選定的氨基酸處進一步修飾。蛋白質分子可以用作生物活性探針。蛋白質生物活性探針可以和蛋白質發(fā)生高親和力和高特異性的相互作用。通常理想的情況是，蛋白質生物活性探針和靶蛋白質之間的親和性結合常數(shù)大于106M-1。有數(shù)類分子可以用作蛋白質微陣列上的蛋白質生物活性探針。
抗體是能夠和靶高親和力和特異性結合的一類天然存在的蛋白質分子?？贵w性質和使用抗體的規(guī)程參見“Using Antibodies；A LaboratoryManual”，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor，NY 1999)。
如果抗體是預期的檢測靶，也可以采用抗原作為蛋白質生物活性探針。蛋白質支架比如整個蛋白/酶或它們的片段也可以用作蛋白質生物活性探針。例子包括磷酸酶(phosphotases)、激酶、蛋白酶、氧化酶、水解酶、細胞因子、趨化因子或者合成肽。核酸配體在針對其和特定靶的結合親和力以及特異性進行體外選擇和富集后，可以用作蛋白質生物活性探針。這種選擇方法的原則請參見Science，Vol.249，505-510，1990和Nature，Vol.346，818-822，1990。美國專利No.5110833公開了可替換種類的合成分子，它們可以模仿抗體結合親和力和特異性，且可以很容易通過所謂的Molecular Imprinting Polymer(MIP)制備。Chem.Rev.Vol.100，2495-2504，2000對這種技術進行了綜述。
可以根據(jù)本領域公開的方法，將核酸生物活性探針和蛋白質生物活性探針附著到化學官能化的微球表面(Bangs Laboratories，Inc.，Technote #205)。一些常用在微球表面的化學官能團包括但不限于羧基、氨基、羥基、酰肼、酰胺、氯甲基、環(huán)氧、醛等。
在優(yōu)選實施方案中，一個微球僅僅和一種類型的生物活性探針結合。優(yōu)選生物活性探針首先合成，然后共價附著到微球上。但是，如同本領域技術人員會認識到的那樣，生物活性探針也可以在微球上原位合成。通過這兩種方法中的任一種，都可以采用各種長度的接頭將生物活性探針和微球連接起來，以提供能夠使生物活性探針和靶分子之間相互作用最優(yōu)化的靈活性。
根據(jù)本發(fā)明，微球還包括一種或不止一種的潛在著色劑作為光標記。此處所用的術語“潛在著色劑”是指具有吸附和發(fā)射性質而且其吸附和發(fā)射性質可以通過化學或物理方法調制的分子。優(yōu)選潛在著色劑應該無色而且不發(fā)熒光。在優(yōu)選的實施方案中，采用一種潛在著色劑或不止一種潛在著色劑的混合物生成光標記。此處所用術語“光標記”是指可以通過光學方法檢測和/或測量的吸附或發(fā)射信號。這些信號包括但不限于吸附、熒光和化學發(fā)光。
根據(jù)本發(fā)明，微球還包括一種或不止一種的潛在著色劑在微球中充當光標記。此處所用的術語“潛在著色劑”是指其吸附和發(fā)射性質可以通過化學或物理方法調制的分子。優(yōu)選潛在著色劑無色而且不發(fā)熒光。在優(yōu)選的實施方案中，光標記通過一種潛在著色劑或不止一種潛在著色劑的混合物生成。此處所用的術語“光標記”是指可以通過光學方法測量的吸附或發(fā)射信號。這種信號包括但不限于吸附、熒光和化學發(fā)光。單一潛在著色劑的濃度或者潛在著色劑的比例(當采用不止一種的潛在著色劑時)都可以改變，以生成具有獨特光標記編碼的微球庫，同樣該庫中的每個微球和附著在該微球上的獨特生物活性探針結合。例如，當標記源自單一潛在著色劑時，整合到微球里的潛在著色劑的量指定獨特的微球亞群，所述微球表面具有特殊類型的生物活性探針。對于源自不止一種潛在著色劑的標記而言，化合物的比例，例如對兩種潛在著色劑而言是1∶2，或者對三種潛在著色劑而言是1∶2∶1，可以用來指定獨特的微球亞群，所述微球表面具有特殊類型的生物學探針。潛在著色劑可以是有機、無機和聚合物的。潛在著色劑通過共價結合或者非共價相互作用與微球相連，或者位于微球表面，或者整合到微球內部。在優(yōu)選實施方案中，采用加載方法將潛在著色劑整合到微球里。在另一優(yōu)選實施方案中，在微球的合成方法中將可著色化合物整合到微球里。
為了確定可著色化合物在微球中的量和比例，需要將該可著色化合物轉變成可檢測的光信號。一般而言，這個轉變可以通過化學方法或者物理方法實現(xiàn)。一些將潛在著色劑轉變成可測量的光標記的化學方法包括但不限于縮合反應、酸-堿反應、氧化還原反應、奪取反應、加成反應、消除反應、鏈增長反應、配位反應、分子偶聯(lián)反應、重排反應，和前述兩種或更多種反應的組合。一些將潛在著色劑轉變成可測量的光標記的物理方法可以通過電磁作用或者粒子輻射實現(xiàn)，比如光引發(fā)方法、熱引發(fā)方法、X射線引發(fā)方法、電子束引發(fā)方法、電引發(fā)方法、壓力引發(fā)方法、磁引發(fā)方法，和前述兩種或更多種方法的組合。優(yōu)選的物理方法包括光引發(fā)方法、熱引發(fā)方法、電離輻射引發(fā)方法、電子束引發(fā)方法、電引發(fā)方法、壓力引發(fā)方法、磁引發(fā)方法、超聲引發(fā)方法，和兩種或更多種前述方法的組合。如同本領域技術人員可以認識到的那樣，化學方法也可以和物理方法組合。一般而言，如果采用化學方法，則采用顯影劑溶液，可以將整合到微球中的潛在著色劑轉變成可測量的光標記。此處使用的術語“顯影劑”是指含水或有機溶液，它和整合有潛在著色劑的微球接觸時，會將該潛在著色劑轉變成可測量的光標記。
在優(yōu)選實施方案中，pH值變化可以用作將潛在著色劑轉變成可檢測的光標記的化學方法，例如，美國專利No.5053309所述，具有下列結構的無色染料前體可以作為潛在著色劑整合到微球里，而且這些整合微球的無色染料前體和酸性顯影劑接觸時可以轉變成可測量的光標記。此處所用的在所有化學結構中所示的R、R1、R2、R3、R4和R5是一般的取代基，它由以下組成，但不限于下列這些單鍵、氫原子、碳原子、氧原子、硫原子、羰基 羧酸酯基團 羧酸酰胺基團 磺酰基 氨磺?；?乙烯氧基、聚乙烯氧基或者氨基 其中取代基X、Y和Z每個獨立是氫原子、或者具有1-10個碳原子的烷基；和具有1-10個碳原子的線性或支鏈的、飽和或不飽和烷基(比如甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、己基、癸基、苯甲基、甲氧基甲基、羥乙基、異丁基和正丁基)；具有6-14個碳原子的取代或未取代的芳基(例如，苯基、萘基、蒽基、甲苯基、二甲苯基、3-甲氧基苯基、4-氯苯基、4-甲氧甲酰苯基和4-氰苯基)；和具有5-14個碳原子的取代或未取代的環(huán)烷基，(比如環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)辛基)；取代或未取代的、飽和或不飽和的雜環(huán)基(比如吡啶基、primidyl、嗎啉代和呋喃基)；氰基。
青色無色染料前體 X＝S，O黃色無色染料前體
在另一優(yōu)選實施方案，氧化還原反應用作將潛在著色劑轉變成可檢測的光標記的化學方法，比如具有下述結構的照相偶合劑(photographic couplers)可以作為潛在著色劑整合到微球里。這些偶合劑，如同F(xiàn)riedrich，L.E.和Kapecki，J.A.在Handbook of ImagingMaterials第二版，Diamond和Weiss編輯，Marcel Dekker，Inc.，NewYork(2001)的第二章所述，在和醌二亞胺(quinonediimine)或者醌二亞胺衍生物發(fā)生氧化還原偶聯(lián)時，可以形成青色、品紅色和黃色作為可測量的光標記。優(yōu)選的氧化還原偶合劑包括但不限于N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽(KODAK Color Developing Agent CD-2)、4-氨基-3-甲基-N-(2-甲基亞磺酰氨基乙基)苯胺硫酸鹽、4-(N-乙基-N-β-羥乙基氨基)-2-甲基苯胺硫酸鹽(KODAK Color DevelopingAgent CD-4)、對-羥乙基乙氨基苯胺硫酸鹽、4-(N-乙基-N-2-甲基亞磺酰氨基乙基)-2-甲基苯二胺倍半硫酸鹽(KODAK ColorDeveloping Agent CD-3)、4-(N-乙基-N-2-甲基亞磺酰氨基乙基)-2-甲基苯二胺倍半硫酸鹽，和其它本領域技術人員很容易了解的那些。另一類可以和青色、品紅色和黃色偶合劑反應形成各種顏色染料的有用氧化還原偶合劑是重氮鹽。這些偶聯(lián)反應已描述在T.H.James編輯的“The Theory of the Photographic Process”的第11章和12章。
黃色偶合劑 X＝C，Y＝Nor X＝N，Y＝C品紅色偶合劑 青色偶合劑 X＝C，Y＝Nor X＝N，Y＝C青色偶合劑在另一優(yōu)選實施方案中，配位反應用作將潛在著色劑轉變成可檢測光標記的化學方法，例如，在美國專利No.4555478、4568633和4701420中所述，可以形成絡合了結構 均含亞鐵配體來生成各種顏色。就這些配體而言，當作為潛在著色劑整合到微球中時，在和含有亞鐵離子的顯影劑接觸后，就可以形成不同的顏色，作為可測量的光標記。這種配體的幾個例子包括但不限于下列結構 在另一優(yōu)選實施方案中，光引發(fā)方法用作將潛在著色劑轉變成可檢測光標記的物理方法。幾個例子包括但不必限于美國專利No.3394391、3394392、3394395、3410687、3413121所描述的以及Wainer，E.在SPSESymposium No.III，Unconventional Photographic Systems，Washington D.C.(1971)，pp39-41所綜述的光自由基(photo radical)引發(fā)的染料形成，和Jacobson，R.E.在Photopolymerization andPhotoimaging Science and Technology，Allen，N.S.編輯，ElsevierApplied Science，London，(1989)和Ichimura，K.在Photochromism，Durr和Bouas-Laurent編輯，Elsevier，Amsterdam，(1990)中所綜述的光引發(fā)的光致變色染料形成。下面給出了可以導致形成可區(qū)別的顏色作為可測量光標記的反應方案。本領域技術人員可以認識到，這些化合物可以容易地整合到微球中作為潛在著色劑，并且在光引發(fā)后可以轉變成可測量的光標記。
在和本申請同一日期提交的、共同擁有的Docket No.85507公開并要求對光致變色染料用途的保護。其公開內容在此全文引入。
方案1光自由基引發(fā)的染料。
方案2光致變色染料。
方案3光致變色染料
在另一優(yōu)選實施方案中，熱引發(fā)方法，如同Day，J.H.在Chem.Rev.，63，65，(1963)，68，649，(1968)，Mustafa，A.在Chem.Rev.，43，509，(1948)和Bergman，E.等在J.Am.Chem.Soc.81，5605(1959)中所述，可以用作物理方法將潛在著色劑轉變成可檢測的光標記。可以在熱引發(fā)后導致形成顏色作為可測量光標記的一些例子包括但不限于方案4所示的化合物。如同本領域技術人員可認識到的那樣，這些化合物可以容易地整合到微球中作為潛在著色劑，并在熱引發(fā)后可以轉變成可測量地光標記。
方案4具有熱引發(fā)性質的化合物 無色→紫-綠色無色→籃-紅色 無色→紫-紅色無色→黃色 無色→紅-紫色 無色→紫羅蘭色如同本領域所認識的那樣，上面公開的采用潛在著色劑形成顏色的各種方法可以單獨使用，或者組合使用來生成顏色編碼的微球庫。
一旦潛在著色劑整合到微球里，就可以在任何時間通過物理或化學方法將潛在著色劑轉變成可測量的光標記，從而區(qū)分每種類型微球的特征。每一種微球可以如上所述在其表面上附著有“生物活性探針”。所以，具有獨特的潛在著色劑組成的每個微球可以對應于特定的生物活性探針。這些微球可以等量混合，并且可以通過將這些混合的微球以上述單層或多層格式固定到二維表面上來制備微陣列。
本發(fā)明進一步公開了使用這種微陣列的方法。在一般微陣列分析方法中，含有分析物混合物的生物樣品溶液均勻標記上“發(fā)射標簽”，其中“分析物”或“分析物分子”是指其存在、量和/或特征將要確定的分子，通常是大分子，比如多核苷酸、多肽和多糖。一些常用的發(fā)射標簽包括但不限于熒光劑(fluorescer)、化學發(fā)光劑、放射性分子、酶、酶底物，和其它光譜可檢測的標簽?；蛘撸部梢詫⒃诤推渌肿咏Y合后可以發(fā)射熒光、化學發(fā)光或者光譜可檢測信號的分子用作為發(fā)射標簽。
一旦選擇了發(fā)射標簽，標記核酸的方法就如同Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A Laboratoiy Manual，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(2001)；Kambara，H.等Bio/Technology 6816~821，(1988)和Smith，L.等在Nuc.Acids Res.132399-2412，(1985)所述；標記多肽的方法如同Allen，G.在Sequencing of Proteins and Peptides，Elsevier，New York(1989)和Greenstein和Winitz在Chemistry of the Amino Acids，Wiley andSons，New York(1961)中所述；且標記多糖的方法由Chaplin和Kennedy在Carbohydrate AnalysisA practical Approach，IRL Press，Oxford(1986)所述。當生物樣品中的靶分析物用發(fā)射標簽標記后，就可以將其施加到基于微球的微陣列里。
在傳統(tǒng)的基于微球的微陣列中，首先測量來自“顏色可尋址的”聚合物微球的信號，然后測量由標記的分析物和微球表面上的生物學探針發(fā)生相互作用產生的發(fā)射標簽信號。在本發(fā)明中，首先測量由標記的分析物和微球表面上的生物學探針發(fā)生相互作用產生的發(fā)射標簽信號，然后通過化學或物理方法將整合在微球里的潛在著色劑轉變成可檢測光信號。圖1示意性示出了本發(fā)明的方法。
在圖1A中，制備含有微球的微陣列。微陣列由微陣列載體1組成，在載體1上固定了整合有潛在著色劑的微球2。生物學探針3附著到微球的表面上。
在圖1B中，將含有用發(fā)射標簽標記的分析物4的溶液施加到微陣列上。這個步驟要求在微陣列和承載分析物的樣品之間有良好的物理接觸；這種接觸可能通過在微陣列上鋪展樣品溶液層或者將微陣列浸入樣品溶液中進行。在用緩沖溶液多次洗滌微陣列的步驟中，去除沒有結合的分析物(例如，分析物和探針不是特異性互補關系)。通過成像系統(tǒng)測量由于分析物和微球2表面的探針發(fā)生相互作用產生的發(fā)射標簽4信號。記錄下的圖像記為IMAGE1，并保存在計算機中。
在圖1C中，通過化學或物理方法將微球2中的潛在著色劑轉變成顏色。采用亮場照明條件捕獲有顏色的微球圖像，從而得到固定在微陣列的微球中的光標記/條型碼信息；該圖像記為IMAGE2并保存在計算機里。
最后，可以用圖像處理算法分析和解碼IMAGE1和IMAGE2，并通過比較IMAGE1和IMAGE2鑒別和定量該未知的分析物。
使用本發(fā)明的可替換方法涉及到對上述方法的一些略微修改。在優(yōu)選實施方案中，使得含有微球庫(每個微球攜帶有獨特的生物活性探針)的懸浮液和用發(fā)射標簽標記的靶分析物相互作用。在通過離心和過濾將微球旋轉到下部后去掉上清液，去除沒有結合的分析物。在微球和用發(fā)射標簽標記的分析物之間的相互作用完成后，所得到的微球固定在載體的二維表面上。在這一點上，該替換方法如上所述繼續(xù)進行，具體如下所示。
通過成像系統(tǒng)測量由于分析物和微球2表面的探針發(fā)生相互作用產生的發(fā)射標簽4信號。記錄下的圖像記為IMAGE1，并保存在計算機中。
在圖1C中，通過化學或物理方法將微球2中的潛在著色劑轉變成顏色。采用亮場照明條件捕獲有顏色的微球圖像，從而得到固定在微陣列的微球中的光標記/條型碼信息；該圖像記為IMAGE2并保存在計算機里。
最后，可以用圖像處理算法分析和解碼IMAGE1和IMAGE2，并通過比較IMAGE1和IMAGE2鑒別和定量該未知的分析物。在用光學系統(tǒng)將圖像放大后，通過電荷耦合的設備測量和分析來自微球的發(fā)射標簽信號和光信號。在美國專利申請No.10/036828中詳細描述了這種成像系統(tǒng)的要求和規(guī)格。
參考下面的具體實施例，可以更好理解本發(fā)明。
實施例1本實施例闡述了兩種將照相偶合劑作為潛在著色劑加載到聚苯乙烯微球中的方法。
加載方法1就一般制備過程而言，采用單一偶合劑、或者固定比例的不止一種偶合劑、和不同比例的偶合劑、偶合劑溶劑和輔助偶合劑溶劑，來制備微球樣品。采用超聲處理法加載青色偶合劑CYAN1，具體如下將0.08g CYAN1攪拌溶于0.8g環(huán)己酮和0.08g磷酸三(甲苯酯)(tricresolphosphate)。然后將此油相加到0.48g FAC-0064(表面活性劑)和6.52g水的含水相中，其中于室溫攪拌。將樣品超聲處理1分鐘，得到乳狀的白色分散體，然后攪拌。在該超聲處理后的樣品中加入等量8.0g 4％的10微米聚苯乙烯微球?；旌虾?，將樣品倒入滲濾袋，并洗滌6小時。滲濾后，攜帶偶合劑的微球就可以進行下一步使用了。
加載方法2就一般制備過程而言，采用單一偶合劑、或者固定比例的不止一種偶合劑、和不同比例的偶合劑、偶合劑溶劑和輔助偶合劑溶劑，來制備微球樣品。采用下述方法加載品紅色偶合劑MAG1和黃色偶合劑YEL1將1.0g MAG1攪拌溶于10g環(huán)己酮和1.0g磷酸三(甲苯酯)溶劑。在偶合劑溶解后，采用預混合器將此油相加到6.0g FAC-0064和81.5g水的含水相中。在7000磅/英寸2(psi)下將制備的乳狀分散體一次通過微流化器(microfluidizer)。將各4克微流化的樣品和4％的10微米聚苯乙烯微球混合，并在滲濾袋中洗滌6小時。滲濾后，攜帶偶合劑的微球就可以進行下一步使用了。
采用上述方法，可以將所有三種顏色的偶合劑以及這三種偶合劑的混合物加載到聚苯乙烯微球中。
實施例2這些實施例闡述了采用原位聚合方法將照相偶合劑作為潛在著色劑加載到聚苯乙烯微球中的方法。
表1單體-偶合劑1 單體-偶合劑2 單體-偶合劑3(青色)(黃色)(品紅色)
表2
表2.制備含有單體-結合偶合劑的珠子中所用的試劑和特征數(shù)據(jù)珠子1-3，分別含有青色、品紅色和黃色偶合劑(偶合劑1-3)，都采用表2列出的試劑和量通過相同方法合成。將聚丙烯酸(3.75g，Mw＝450K)溶解在配有氮氣入口、機械攪拌器和回流冷凝器的500ml 3頸圓底燒瓶中的67.5ml的無水乙醇中。加入125ml的甲基溶纖劑，將所得溶液置于65℃的恒溫水浴，并采用氮氣起泡脫氣10分鐘。將單體-偶合劑獨立溶解在剩下的乙醇(20.0ml)和36.6ml苯乙烯的溶液中，其中輕微加熱。在該單體溶液回到室溫后，加入0.38g AIBN，攪拌溶液直到完全溶解，同樣采用氮氣起泡脫氣10分鐘。一次將單體/引發(fā)劑溶液全部加入燒瓶中。15分鐘之內，反應物變得輕微混濁。將反應物在65℃以250RPM攪拌2小時，然后在75℃攪拌過夜(大約16小時)。通過離心然后傾析上清液并重新分散在甲醇中，來純化產物珠子。重復3-4次，其中最后重新分散步驟采用水。將珠子以在水中5-20％w/w的分散體的形式保存。
實施例3本實施例闡述了將預合成的單鏈寡核苷酸探針附著到整合有偶合劑的微球表面。
將100μl整合有偶合劑的微球(4％w/v)在乙酸鹽緩沖液(0.01M，pH5.0)中沖洗三次，并與100μl的20mM 2-(4-二甲基氨基甲酰基-吡啶并)-乙烷-1-磺酸鹽和10％聚乙烯亞胺組合?；旌衔镌谑覝財嚢?小時，并用硼酸鈉緩沖液(0.05M，pH8.3)沖洗三次。將珠子重新懸浮在硼酸鈉緩沖液中。
將用5’-氨基-C6修飾的寡核苷酸DNA探針溶解在100μl的硼酸鈉緩沖液里，得到40nmol的最終濃度。將20μl氰尿酰氯的乙腈溶液加到該DNA探針溶液里，并采用硼酸鈉緩沖溶液將總體積加成250μl。所得溶液在室溫攪拌1小時，然后在室溫用1升硼酸緩沖液透析3小時。
將100μl透析后的DNA溶液和200μl的珠子懸浮液混合。所得混合物在室溫攪拌1小時，并用磷酸鈉緩沖液(0.01M，pH7.0)沖洗3次。
實施例4本實施例闡述了將抗體生物活性探針附著到整合有偶合劑的微球表面。
將100μl的整合有偶合劑的微球(4％w/v)在乙酸鹽緩沖液(0.01M，pH5.0)中沖洗3次，并和1ml的50mM 2-(4-二甲基氨基甲酰基-吡啶并)-乙烷-1-磺酸鹽組合。將混合物在室溫攪拌1小時，并用乙酸鈉緩沖液(0.01M，pH5.0)沖洗3次。將1mg的山羊-抗-小鼠和1ml的乙酸鈉緩沖液(0.01M，pH5.0)一起加到微球中。將混合物在室溫攪拌1小時，并用0.01M的磷酸鹽鹽水緩沖液pH7.0沖洗3次。這種抗體修飾后的微球已經可以進一步使用。
實施例5本實施例闡述了將靶核酸序列雜交到玻璃載體上的涂覆有明膠的微球上，并進行檢測。
將具有5’-Cy3標記的寡核苷酸DNA溶解在含有0.9M NaCl、0.06MNaH2PO4、0.006M EDTA和0.1％SDS，pH7.6(6XSSPE-SDS)的雜交溶液中，使最終濃度為1M，所述寡核苷酸DNA具有和附著在實施例3所示的微球表面上的DNA探針互補的序列。通過將50μl 2.5％明膠溶液鋪展在玻璃載玻片的表面，首先在顯微鏡玻璃載玻片上涂覆一層明膠。在涂覆了該明膠后，將根據(jù)實施例3制備的含有0.5％雙(乙烯基磺酰基)甲烷的1％微球懸浮液施加到該預涂覆明膠的玻璃載玻片上，使其干燥以將微球固定在玻璃載玻片的2維表面上。將涂覆了珠子的玻璃載玻片在雜交溶液中雜交，所述雜交在室溫下開始，持續(xù)1小時。雜交后，將載玻片在0.5XSSPE-SDS中洗滌三次，每次15分鐘。
用Olympus BH-2熒光顯微鏡(Diagnostic Instruments，Inc.SPOT照相機，CCD分辨率為1315×1033像素)獲取完成雜交后的載玻片的圖像，以檢測DNA在微球表面雜交形成的熒光信號。
實施例6本實施例闡述了檢測附著到玻璃載體上的涂覆有明膠的微球的蛋白質靶分子。
在0.05M磷酸鹽緩沖液中制備用Cy3或Cy5標記的0.001mg/mL小鼠IgG，并組合實施例4所述的1％山羊-抗-小鼠修飾的微球的懸浮液，得到1ml的總體積。將混合物在室溫下溫育1小時，同時輕微攪拌。溫育后，將珠子離心，并在磷酸鹽緩沖液pH7.00.1％tween 20中沖洗3次。首先通過將50μl的2.5％明膠溶液鋪展在玻璃載玻片表面上以在該顯微鏡玻璃載玻片上涂覆明膠層。涂覆明膠后，在該預涂覆明膠的玻璃載玻片上施加1％的含有0.5％雙(乙烯基磺?；?甲烷的微球懸浮液，并使其干燥以將微球固定在玻璃載玻片的2維表面上。
干燥后，用Olympus BH-2熒光顯微鏡(Diagnostic Instruments，Inc.SPOT照相機，CCD分辨率為1315×1033像素)獲取玻璃載玻片的圖像，以檢測微球表面上蛋白質相互作用形成的熒光信號。
實施例7本實施例闡述了在涂有明膠的玻璃載體上，使整合有偶合劑的微球顯色。
對于每個樣品的顯色，用pH 10.10，0.1M的碳酸鈉緩沖液洗滌1mL微球兩次，然后將微球重新懸浮在0.6mL的純碳酸鹽緩沖液或者含有小百分比苯甲醇(3.5％)的碳酸鹽緩沖液中。隨即加入0.2mL的顯影劑溶液，所述顯影劑溶液具有3.5g/L的對苯二胺在脫氣水中的溶液，然后加入0.2ml的氧化溶液，所述氧化溶液是20g/L的K2S2O8水溶液。微球混合物在室溫下反應30分鐘，同時攪拌。然后離心該微球懸浮液1.5分鐘，并用水沖洗兩次。
首先通過將50μl的2.5％明膠溶液鋪展在玻璃載玻片表面上以在該顯微鏡玻璃載玻片上涂覆明膠層。涂覆明膠后，在該預涂覆明膠的玻璃載玻片上施加1％的含有0.5％雙(乙烯基磺?；?甲烷的微球懸浮液，并使其干燥以將微球固定在玻璃載玻片的2維表面上。
干燥后，用Olympus BH-2熒光顯微鏡(Diagnostic Instruments，Inc.SPOT照相機，CCD分辨率為1315×1033像素)獲取玻璃載玻片的圖像，以檢測微球內偶合劑顯影形成的顏色信號。
權利要求
1.一種微陣列，其包括載體；在其上設置有；攜帶生物學探針的微球層，其中所述微球包括至少一種具有潛在顏色的材料，所述材料可以顯影并用來鑒別所述微球。
2.權利要求1的微陣列，其中所述微球以隨機或有序分布形式排列在載體上。
3.權利要求1的微陣列，其中所述潛在著色劑能夠顯影成光標記。
4.權利要求3的微陣列，其中所述光標記是熒光、吸收或化學發(fā)光。
5.權利要求3的微陣列，其中所述潛在著色劑能夠通過化學或物理方法顯影成光標記。
6.權利要求5的微陣列，其中所述化學方法是縮合反應、酸-堿反應、氧化還原反應、奪取反應、加成反應、消除反應、協(xié)同反應、鏈增長反應、配位反應、分子偶聯(lián)反應、重排反應，或前述兩種或更多種反應的組合。
7.權利要求5的微陣列，其中所述物理方法是光引發(fā)方法、熱引發(fā)方法、電離輻射引發(fā)方法、電子束引發(fā)方法、電引發(fā)方法、壓力引發(fā)方法、磁引發(fā)方法，超聲引發(fā)方法，或前述兩種或更多種方法的組合。
8.權利要求3的微陣列，其中所述光標記可以用來鑒別靶分析物。
9.權利要求1的微陣列，其中所述具有潛在顏色的材料是無色染料、無色染料前體、照相偶合劑、金屬絡合配體、光致變色染料或者熱致變色染料。
10.權利要求1的微陣列，其中所述生物學探針是生物活性的。
11.權利要求10的微陣列，其中所述生物活性探針包括多核苷酸、多肽、多糖或小的合成分子。
12.權利要求1的微陣列，其中所述微球通過化學或物理方法固定在二維載體上。
13.權利要求1的微陣列，其中所述微球通過凝膠化方法固定在二維載體上。
14.權利要求1的微陣列，其中所述微球的平均直徑為1-50微米。
15.權利要求1的微陣列，其中所述微球的平均直徑為5-20微米。
16.權利要求1的微陣列，其中所述微球在載體上的濃度是100-1000000/cm2。
17.權利要求1的微陣列，其中所述微球在載體上的濃度是10000-100000/cm2。
18.鑒別生物學分析物的方法，所述方法包括下列步驟提供包括潛在著色劑和生物學探針的微球陣列；使所述微球和所述生物學分析物接觸，其中所述分析物用發(fā)光標簽標記；使所述生物學分析物和探針相互作用；洗滌陣列以去除沒有結合的分析物；記錄來自發(fā)光標簽的信號，所述信號源自探針和分析物的結合，并將所述信號記錄下來作為圖像A；使微球上的潛在化合物顯色得到可檢測的光標記；記錄所述光標記作為圖像B；和比較圖像A和B，以確定生物學靶的特征和濃度。
19.鑒別生物學分析物的方法，所述方法包括下列步驟提供在表面上含有潛在著色劑并攜帶生物學探針的微球；使所述微球和分析物接觸，其中所述分析物用發(fā)光標簽標記；使生物學探針和分析物相互作用；洗滌微球以去除沒有結合的分析物；將所述微球固定在載體的二維表面上以形成微陣列；測量來自發(fā)光標簽的信號，所述信號源自探針和分析物的相互作用，并將所述信號記錄下來作為圖像A；使微球上的潛在著色劑顯色得到可檢測的光標記，并記錄該標記作為圖像B；和比較圖像A和B，以確定分析物的特征和濃度。
全文摘要
一種微陣列，其包括載體；在其上設置有攜帶生物學探針的微球層；其中所述微球包括至少一種具有潛在顏色的材料，所述材料可以顯影并用來鑒別所述微球。還公開了用該微陣列鑒別生物學分析物的方法。
文檔編號G01N33/58GK1826171SQ200480021032
公開日2006年8月30日 申請日期2004年7月14日 優(yōu)先權日2003年7月23日
發(fā)明者T·A·喬, J·W·萊昂, K·M·施勒德 申請人:伊斯曼柯達公司