專利名稱:單克隆抗體與產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種特異性識別人表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin,hEPR)的單克隆抗體(MoAb),一種產(chǎn)生該MoAb的雜交瘤,以及一種通過使用能識別hEPR的多克隆抗體(hEPR-PoAb)及MoAb來特異性檢測樣品中hEPR的免疫測量法。
背景技術(shù):
已知在癌細(xì)胞中會特異性地及高頻率地發(fā)生某些基因異常,如果找到某種由基因異常產(chǎn)生的蛋白(或多個蛋白),則該蛋白可用作癌癥診斷及治療的靶分子。在這些蛋白中,屬于表皮生長因子(EGF)家族的一類分子與其受體ErbB家族分子由于與癌細(xì)胞生長關(guān)系密切并同惡性腫瘤相關(guān),已在癌癥診斷與治療中用作靶分子(J.Clin.Oncol.,17,2639-2648(1999);Biochem.Biophys.Acta.,1198,165-184(1994);Science,244,707-712(1989);Anticancer Res.,2091-95(2000);Front.Biosci..,1;6D685-707(2001))。
已有報道表明表皮調(diào)節(jié)素(EPR)作為EGF家族的一個成員,在體外具有促進(jìn)正常細(xì)胞生長并抑制某些癌細(xì)胞生長的雙功能特征;而且在除胎盤與單核細(xì)胞之外的正常細(xì)胞中EPR(mRNA)的表達(dá)水平非常低,但在某些癌細(xì)胞中則很高(參見,例如,The Journal ofBiological Chemistry,1995,Vol.270,p.7495-7500;The BiochemicalJournal,1997,Vol.326,p.69-75)。
進(jìn)一步地,在臨床領(lǐng)域,已表明由于表皮調(diào)節(jié)素在膀胱癌與胰腺癌中的表達(dá)量很高,因此它可以作為癌癥診斷中的有用標(biāo)記(參見,例如,Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,Vol.14,273(3),p.1019-1024;AntiCancer Research,2000,Jan-Feb,201A9p.91-95;Cancer Research,2001,Vol.61,p.6227-6233)。
到目前為止,已有使用識別人表皮調(diào)節(jié)素(hEPR)的多克隆抗體(hEPR-PoAb)檢測EPR多肽的報道(參見,例如,The Journal ofBiological Chemistry,1995,Vol.270,p.7495-7500;The BiochemicalJournal,1997,Vol.326,p.69-75),但由于需要濃縮操作、使用放射性同位素標(biāo)記及其他類似操作,這些報道并不是高靈敏度及高通量方法;而且也沒有在活體中檢測EPR多肽的報道。因此,建立一種簡單且具高靈敏度的檢測hEPR的方法,作為一種癌癥診斷方法,可以為癌癥早期檢測提供有用的手段。
發(fā)明的簡要描述已知在EPR與其它EGF家族成員蛋白之間氨基酸序列同源性為24至50%(參見The Journal of Biological Chemistry,1995,Vol.270,p.7495-7500)。而且,EPR序列的同源性在種間非常高,例如,人與小鼠的EPRs在46個氨基酸殘基中僅有6個不同。使用前文描述的多克隆抗體來檢測EPR的方法需要復(fù)雜的程序,而且不能區(qū)分人與小鼠的EPR。此外,傳統(tǒng)檢測方法的靈敏度為至多1ng/ml,因此不可能在活體中檢測EPR。
本發(fā)明的目標(biāo)是建立一種簡單且具高靈敏度的檢測hEPR的方法,并將該方法應(yīng)用于人類腫瘤的檢測。特別地,本發(fā)明提供了一種在皮克級水平上檢測hEPR的簡單方法,可用于檢測腫瘤等。
本發(fā)明作者通過認(rèn)真研究解決了前文所述問題并最終獲得兩株能夠產(chǎn)生特異性識別hEPR的單克隆抗體(MoAb)的雜交瘤(1C3,3E8)。此外,通過MoAb與hEPR-PolyAb的結(jié)合建立了夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法(S-ELISA),其是一種高靈敏度及高通量的檢測系統(tǒng)。
因此,本發(fā)明提供了下面所述的(1)至(9)的內(nèi)容。
(1)產(chǎn)生能特異性識別人表皮調(diào)節(jié)素(hEPR)的單克隆抗體的雜交瘤。
(2)(1)中所述的雜交瘤,其保藏號為FERM BP-08647。
(3)(1)中所述的雜交瘤,其保藏號為FERM BP-08648。
(4)(1)至(3)任何一項中的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體。
(5)一種單克隆抗體,它能識別(2)或(3)中的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體所識別的表位,并特異性地識別hEPR。
(6)一種體外特異性地檢測樣品中hEPR的方法,其特征是使用了(4)中的單克隆抗體及識別hEPR的多克隆抗體(hEPR-PoAb)。
(7)一種體外檢測hEPR表達(dá)細(xì)胞的方法,其特征是使用了(4)中的單克隆抗體。
(8)(7)中的方法,其中hEPR表達(dá)細(xì)胞是人腫瘤。
(9)一種包含(4)中的單克隆抗體的用來檢測人腫瘤的試劑盒。
作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請No.2003-070864中的詳述和/或附圖的內(nèi)容,全部引入本文作為參考。
附圖的簡要描述
圖1顯示的是本發(fā)明中的雜交瘤所產(chǎn)生的抗-hEPR單克隆抗體在ELISA方法中滴度測量結(jié)果。
圖2顯示的是生物素化抗hEPR多克隆抗體滴度測量結(jié)果。
圖3顯示的是使用逐步法和同步法夾心ELISA(S-ELISA)系統(tǒng)的檢測靈敏度。
圖4顯示的是本方法中使用1C3單克隆抗體作為一抗的特異性檢驗結(jié)果。在本系統(tǒng)中,單克隆抗體僅同hEPR反應(yīng),不與EGF家族分子或者小鼠EPR反應(yīng),。
圖5顯示的是人血清中的hEPR進(jìn)行Western blot分的析結(jié)果。分子量標(biāo)記(kDa)的位置在左側(cè)表示。
圖6顯示的是使用S-ELISA檢測人血清中的hEPR。
圖7顯示的是檢測多種細(xì)胞培養(yǎng)基中的hEPR。
實現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選實施例在本發(fā)明下文的詳細(xì)描述中,本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域中的已知技術(shù)在不同的實施方案中實現(xiàn)本發(fā)明,此外本發(fā)明并不局限于以下所列舉的實施方案。
本文所用的術(shù)語“hEPR”,除非另有說明,指的是人表皮調(diào)節(jié)素的前體、成熟形式或片段?!扒绑w”是指酶剪切之前的膜結(jié)合型,“成熟形式”指從細(xì)胞膜釋放的具有46個氨基酸殘基的多肽(SEQ IDNO1)。片段包含20或者更多個氨基酸殘基,或者優(yōu)選地,帶有多肽的30個或更多的氨基酸殘基,而且必須包含人表皮調(diào)節(jié)素的特異序列。人表皮調(diào)節(jié)素的特異序列不意味著限定,而是包括,例如,包含SEQ ID NO1的氨基酸序列的第2、第11、第26至29以及第39位的氨基酸的序列,已知當(dāng)人表皮調(diào)節(jié)素與小鼠表皮調(diào)節(jié)素相比較時這些位點(diǎn)是不同的。在相同申請人的專利申請WO94/29340中描述了人與小鼠之間在這些位點(diǎn)上的氨基酸是不同的這個事實。當(dāng)來源于人和小鼠的EPR片段相比較時,具有含這些位點(diǎn)在內(nèi)的氨基酸序列的片段的高級結(jié)構(gòu)不同?!叭吮砥ふ{(diào)節(jié)素”和“小鼠表皮調(diào)節(jié)素”分別指在人與小鼠中與天然存在的EPR具有相同氨基酸序列的多肽。不過,它們并不一定限定于從自然來源中提取的蛋白,還意指包括,例如,重組體及合成的多肽。
本文所用的術(shù)語“特異性識別”指hEPR被識別(或者結(jié)合),但是EGF家族的其它蛋白或者諸如小鼠EPR等的非人類EPR基本上不被識別(結(jié)合)。這意味著,例如,hEPR的前體、成熟蛋白與片段多肽可被識別(結(jié)合),但是EGF、TGF-α、小鼠EPR等基本上不被識別(不結(jié)合)。特別地。這意味著特異性識別的結(jié)合親和力,比EGF家族的其它蛋白或者諸如小鼠EPR的非人類EPR的結(jié)合親和力要高100倍或者更高,優(yōu)選地為1000倍或者更高,更優(yōu)選地是10000倍以上。
本文所用的術(shù)語“基本上不被識別(結(jié)合)”是指通過本領(lǐng)域中或者本發(fā)明的常規(guī)檢測手段無法確認(rèn)發(fā)生結(jié)合。特別地,這表示hEPR的前體、成熟蛋白及片段多肽在夾心ELISA(S-ELISA)方法、Westernblot方法或其他類似方法中表現(xiàn)出陽性反應(yīng),但是EGF家族的EGF與TGF-α以及其他非人類哺乳動物,例如小鼠來源的EPR,表現(xiàn)為沒有反應(yīng)(沒有檢測到)。
本文所用的術(shù)語“抗體”是指能夠與完整的全長度的hEPR分子或者h(yuǎn)EPR片段特異性結(jié)合的多克隆抗體(PoAb)或者單克隆抗體(MoAb),或者是這些抗體的部分片段(例如,通過使用木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶,或者其他類似酶的消化所獲得的片段(Fab或F(ab’)2或者Fab’)),它們可以通過下文所述的生產(chǎn)方法來產(chǎn)生。
本發(fā)明中的雜交瘤與單克隆抗體可以通過下文所述的方法生產(chǎn)。進(jìn)一步地,本領(lǐng)域中的熟練人員可以使用那些根據(jù)下文描述及本領(lǐng)域中已知技術(shù)改造過的更適合的方法。
(1)抗原的制備在WO94/29340中描述了hEPR抗原的氨基酸序列及編碼該抗原的核酸序列。氨基酸序列與核酸序列分別在SEQ ID NO1與SEQ IDNO2中給出。進(jìn)一步地,EPR在WO94/29340中描述為一種腫瘤細(xì)胞生長抑制因子。
可以按照WO94/29340中所描述的、通過構(gòu)建含有編碼hEPR的DNA片段(SEQ ID NO2)的表達(dá)載體并通過在宿主細(xì)胞,例如,雖不限于但是優(yōu)選的,短芽孢桿菌(Bacillus brevis)導(dǎo)入及表達(dá)該載體的方式來獲得重組人EPR。使用短芽孢桿菌表達(dá)后,用超濾膜(1000kDa)將培養(yǎng)基濃縮20倍,用1M的Tris-HCl(pH8.0)將pH調(diào)節(jié)至7.4并使用陰離子交換柱,例如,Q-瓊脂糖柱進(jìn)行純化。在本例中,洗脫片段的pH值調(diào)節(jié)為5.0并使用陽離子交換柱,例如,S-瓊脂糖柱進(jìn)一步純化。然后,通過反相柱層析(C4柱)進(jìn)行純化以在電泳中獲得單一條帶。
基于SEQ ID NO1中給出的氨基酸序列,hEPR也可以通過固相方法(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,Vol.85,p2185(1963))來進(jìn)行化學(xué)合成。固相方法的化學(xué)合成通常通過使用自動多肽合成儀的標(biāo)準(zhǔn)方法來完成。
(2)多克隆抗體的制備單獨(dú)或者同載體及稀釋劑一起用抗原多肽溶液免疫接種溫血動物4至6次。所用的溫血動物的例子包括,例如,兔子、狗、豚鼠、小鼠、大鼠及其它類似動物。優(yōu)選地,在第三次皮下免疫接種后收集血液樣本測量抗體滴度。血清中抗體滴度的測量是通過將作為抗原的多肽固定在96孔微滴定板上使用ELISA方法來完成的。在確認(rèn)抗體滴度已經(jīng)升至足夠高后,收集全血,通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離并純化抗體。純化方法包括,例如,硫胺沉淀、使用諸如DEAE纖維素與其類似物作為陰離子交換劑的離子交換層析、凝膠過濾、使用諸如蛋白A/G等作為活性吸附劑的親和層析、以及其它純化方法。進(jìn)一步地,通過使用將hEPR固定于固相的柱子可以在純化中提高對hEPR的特異性。
(3)單克隆抗體的制備從免疫的溫血動物中選擇一只抗體滴度升高的動物,在最后一次免疫接種2至5天后收集脾或淋巴結(jié),將這些組織中的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后選擇產(chǎn)MoAb的雜交瘤,從而制備產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞。融合按照諸如Kohler等方法(Nature,256,495(1975))的已知方法進(jìn)行。骨髓瘤細(xì)胞包括但并不局限于,例如,PAI,P3U1(Health Science Research Resources,HSRRB,日本,目錄號為JCRB0113與JCRB0708)等。融合促進(jìn)試劑包括聚乙二醇(PEG)和仙臺病毒(HVJ),不過優(yōu)選的是分子量在1000至6000的PEG。通過添加濃度至約10到80%的促進(jìn)試劑并在20至40℃溫育可以實現(xiàn)有效的細(xì)胞融合。
單克隆抗體的選擇可以根據(jù)已知的方法進(jìn)行。一般地,它是在添加HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的用于動物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行的。用于選擇與培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以包括,例如,含有10至20%胎牛血清等的PRMI1640培養(yǎng)基。細(xì)胞一般在5%CO2氣體的環(huán)境中于20至40℃的溫度下培養(yǎng)5天至3周。
從培養(yǎng)雜交瘤的孔格中收集培養(yǎng)物的上清液,與抗原多肽反應(yīng)的抗體可通過ELISA方法來選擇。首先,抗原多肽被固定在96孔板上并用牛血清封閉。雜交瘤的上清液與小鼠免疫球蛋白/HRP(Amersham-Pharmacia)于37℃反應(yīng)1小時后,使用四甲基聯(lián)苯胺微孔過氧化物酶底物(TMB;Funakoshi)作為底物進(jìn)行顯色。用酸中止反應(yīng)后,測量450/540nm的吸光度。選取吸光度為3左右的抗體,通過有限稀釋法進(jìn)行克隆。
培養(yǎng)所獲得的靶雜交瘤,可以從培養(yǎng)基中獲得單克隆抗體。此外,雜交瘤細(xì)胞可以腹膜內(nèi)接種至,例如,鼠(Balb/c),從腹水中可獲得單克隆抗體。
單克隆抗體的純化可以按照常規(guī)分離及與上文所述的PoAb純化相類似的方式來進(jìn)行。
進(jìn)一步地,本發(fā)明人于2002年9月25日向獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST)的國際專利保藏機(jī)構(gòu)(Chuoh No.6,1-1-1 Higashi,Tsukuba City,Ibaragi-Ken)提交了兩種雜交瘤,保藏號為FERM P-19033及FERM P-19034。更進(jìn)一步地,基于國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約,它們于2004年2月27日轉(zhuǎn)為國際保藏,保藏號為FERM BP-08647及FERM BP-08648。
此外,本發(fā)明的單克隆抗體包括了特異性識別由上文所述的雜交瘤——特別地,保藏號為BP-08647及FERM BP-08648的雜交瘤——所產(chǎn)生的單克隆抗體能夠識別的表位的單克隆抗體,而且也能夠識別hEPR。這些單克隆抗體所識別的表位,含有上文所述的hEPR序列所特有氨基酸殘基。
本發(fā)明提供了一種體外特異性檢測樣品中hEPR的方法,其特征是使用了本發(fā)明上文所述的識別hEPR的多克隆抗體(hEPR-PoAb)與單克隆抗體。樣品包括從受試者收集的血液、體液、組織提取物等。盡管沒有限定,但優(yōu)選的方法是S-ELISA檢驗法,它包括將可能含有hEPR抗原的樣品與本發(fā)明的單克隆抗體相接觸的步驟,以及將在上一個步驟中形成的抗原-抗體復(fù)合物與多克隆抗體接觸的步驟。上面所述的步驟可以是順序完成(逐步法)或者同時完成(同步法)。S-ELISA方法已有詳述,譬如,參見“單克隆抗體、雜交瘤與ELISA”(Iwasaki,Tatsuo等Kodansha Scientific);本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的的描述來實現(xiàn)本發(fā)明的方法。由于本發(fā)明的檢測方法非常靈敏,能夠檢測出10pg/ml或者以上的hEPR,足以檢出在活體中表達(dá)的hEPR的濃度(約20至30pg/ml)。
本發(fā)明還提供了一種體外檢測hEPR表達(dá)細(xì)胞,尤其是人體腫瘤的方法,其特征是使用了上文所述的本發(fā)明的單克隆抗體。由于在細(xì)胞中表達(dá)后,hEPR會從細(xì)胞膜分泌出來,因此可以在細(xì)胞外液中檢測hEPR,樣品不必含有細(xì)胞。
上面所述的方法包括將人源樣品與本發(fā)明的單克隆抗體相接觸的步驟,以及通過將判斷單克隆抗體是否與hEPR結(jié)合作為指示物的檢測hEPR存在的步驟。靶人體腫瘤包括,例如,肺、大腸、膀胱、子宮、結(jié)腸等處的惡性腫瘤,但并不局限于這些。
由于本發(fā)明檢測方法的特點(diǎn)是高靈敏度,因此檢測可以簡單快速地進(jìn)行,而不必經(jīng)過濃縮或類似的樣品處理。在本方法中,含有hEPR的樣品在濃度為10pg/ml或者更高時可以通過S-ELISA方法或類似方法檢出,但為了確保檢出,含有25pg/ml或更高的樣品是優(yōu)選的。
施用本發(fā)明的方法可以檢測特定腫瘤細(xì)胞等是否表達(dá)hEPR,如果表達(dá)則可測定其表達(dá)水平。進(jìn)一步地,這可能用來解釋hEPR表達(dá)與腫瘤發(fā)生機(jī)制之間的關(guān)系。更進(jìn)一步地,基于高水平表達(dá)hEPR的腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中表達(dá)水平的數(shù)據(jù),可以檢測到特定的患者中腫瘤的存在。
本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的單克隆抗體在內(nèi)的用于檢測人類腫瘤的試劑盒。
除了本發(fā)明上文描述中提及的單克隆抗體之外,本發(fā)明的試劑盒可以適當(dāng)包括多克隆抗體、緩沖液、著色劑、標(biāo)記試劑、稀釋劑等。優(yōu)選地,本發(fā)明的試劑盒是用來進(jìn)行S-ELISA的試劑盒。
下文將就本發(fā)明通過下述實施方案給出更為具體的說明,但同上文一樣,本發(fā)明并不局限于這些例子。
實施例1雜交瘤的制備100μl重組hEPR(1mg/ml)(通過WO94/29340中描述的方法制備)鹽溶液與等體積的弗氏完全佐劑混合,乳化后接種至小鼠背部(Balb/c,6周齡)。2周后,使用經(jīng)超聲處理進(jìn)行乳化的50μl抗原多肽鹽溶液與弗氏不完全佐劑的混合物再次免疫接種小鼠之后,每周均進(jìn)行追加的免疫接種。在免疫接種后的第40天,將脾取出,于PRM1640培養(yǎng)基(添加了青霉素與鏈霉素)中收集淋巴細(xì)胞,使用0.17M氯化銨處理除去血紅細(xì)胞。分離的淋巴細(xì)胞與來源于小鼠骨髓腫瘤的骨髓瘤細(xì)胞株P(guān)3U1通過聚乙二醇法(PEG4000)進(jìn)行融合以獲得雜交瘤細(xì)胞。所獲得的雜交瘤細(xì)胞懸浮在含有飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基中,然后加入到96孔板中培養(yǎng)15天。
實施例2單克隆抗體篩選從培養(yǎng)實施例1中所獲得的雜交瘤細(xì)胞的孔格中回收培養(yǎng)基的上清液,選取在ELISA方法中與抗原多肽反應(yīng)的單克隆抗體。
首先,將100μl濃度為10μg/ml的抗原多肽加到96孔板的每個孔格中,于4℃過夜后使其固定于固相,然后用200μl濃度為10%的牛血清于37℃過夜進(jìn)行封閉。將100μl雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液加入到每個孔格中,于37℃反應(yīng)2小時,然后加入稀釋1000倍的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠抗體(Amersham-Pharmacia)于37℃反應(yīng)1小時。使用四甲基聯(lián)苯胺微孔過氧化物酶底物(TMB;Funakoshi)作為底物進(jìn)行顯色。
添加100μl濃度為4N的硫酸終止反應(yīng)后,測量450比540nm的吸光度,選出吸光度大約為3的MoAbs--1C3及3E8,并通過有限稀釋法進(jìn)行克隆。
在用0.5ml降植烷對小鼠(Balb/c)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射7天與3天之前,使用選定的能夠產(chǎn)生MoAb的1C3或者3E8雜交瘤細(xì)胞對其進(jìn)行腹腔內(nèi)接種,并在大約10天后收集腹水。收集的腹水在室溫下放置30分鐘,于4℃過夜,在15000rpm條件下離心10分鐘,然后回收上清液。
所選的兩種MoAb的滴度通過ELISA方法來測定,結(jié)果如圖1所示。水平軸所表示的是固定在微孔板上的重組hEPR的量,加入1C3或者3E8(1μg/ml),在反應(yīng)后,使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠抗體與TMB進(jìn)行顯色。結(jié)果表明兩種MoAbs均以濃度依賴型的方式進(jìn)行反應(yīng)。
進(jìn)一步地,能夠產(chǎn)生MoAb 1C3與3E8的兩種雜交瘤于2002年9月25日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST)的國際專利保藏機(jī)構(gòu)(Center No.6,1-1-1 Higashi,Tsukuba City,Ibaragi-Ken),保藏號為FERM P-19033和FERM P-19034。
實施例3多克隆抗體的制備將1ml重組hEPR鹽溶液(1mg/ml)與1ml弗氏完全佐劑(Difco)進(jìn)行混合并用超聲處理使其乳化,免疫接種兔(日本白兔,重2.7公斤,雄性;Japan Clea)背部10處或者更多部位。一個月之后,將0.5ml重組hEPR鹽溶液(1mg/ml)與0.5ml弗氏不完全佐劑(Sigma)進(jìn)行混合并用超聲處理使其乳化,按照與第一次免疫接種相類似的方式進(jìn)行第二次免疫接種。第二次免疫接種后,每周均使用通過超聲處理而乳化的1ml重組hEPR鹽溶液(1mg/ml)與1ml弗氏不完全佐劑進(jìn)行追加的免疫接種。免疫接種后一周收集血液樣品,用巴斯德管振蕩后置于室溫下1小時,在4℃靜置過夜,然后5000×g離心10分鐘以獲得抗血清。
抗血清使用40%的硫酸銨進(jìn)行沉淀,于50mM Tris-HCl(pH8.0)中透析過夜并通過蛋白-G柱(Amersham-Pharmacia)進(jìn)行純化以獲得IgG片段。為了進(jìn)一步純化抗體,按照基于廠商說明書的常規(guī)方法,通過將1mg重組hEPR與大約1ml NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow(Amersham-Pharmacia)結(jié)合來制備柱子。調(diào)節(jié)通過上文所述而獲得的IgG片段的pH值至8.0,在這個柱子中過柱10小時或者更長時間,結(jié)合到柱子上的抗體使用50mM Glysine-HCl(pH2.5)/0.15M NaCl來洗脫。洗脫下來的抗體立即用1M Tris調(diào)節(jié)pH至中性,并在50mM磷酸緩沖液(pH7.4)/0.15M中透析以獲得hEPR的特異性抗體。
特異性抗體使用生物素化試劑(Amersham-Pharmacia)的常規(guī)方法進(jìn)行生物素化。生物素化hEPR-PoAb的滴度通過下面的方法測定。最高濃度為200ng/ml的hEPR溶液稀釋5倍后,固定在96孔微板上(100μl/孔)。使用25%的Block Ace(Dainippon PharmaceuticalCo.;200μl/孔)封閉后,加入生物素化抗hEPR-PoAb(0.125μg/ml至1μg/ml(使用50%Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.)稀釋100μl/孔)于室溫下反應(yīng)2小時,然后以100μl/孔的量加入稀釋1000倍的親和素-HRP(Amersham-Pharmacia)并于室溫下反應(yīng)30分鐘。添加TMB后,反應(yīng)在室溫下進(jìn)行30分鐘,用4N的硫酸中止反應(yīng)。測量在450比540nm的吸光度,按實施例2中的方式獲得針對固定在固相中的抗原的滴度。結(jié)果表明這些不同濃度抗體都表現(xiàn)出抗原濃度依賴性反應(yīng),從而證實它們均具有有效的滴度(圖2)。
實施例4夾心ELISA系統(tǒng)使用實施例2中的單克隆抗體與實施例3中的多克隆抗體構(gòu)建了一個ELISA系統(tǒng)。
1μg/ml的單克隆抗體1C3以100μl/孔的量加到微孔板上,于4℃溫育24小時固定于固相??赘袷褂煤?.1%Tween 20的pH值為7.5的50mM Tris-HCl(TBST)以200μl/孔的量洗3次。以200μl/孔的量加入25%的Block Ace并于4℃溫育24小時進(jìn)行封閉。
在逐步法中,孔格用TBST以200μl/孔的量洗3次,加入由起始濃度1ng/ml連續(xù)兩倍稀釋的hEPR,于室溫溫育2小時,然后加入生物素化抗hEPR-PoAb(1μg/ml;100μl/孔)并于室溫溫育2小時。
在同步法中,同時加入hEPR抗原與生物素化抗hEPR-PoAb并于室溫反應(yīng)2小時。
使用TBST洗孔格5次后,以100μl/孔的量加入稀釋1000倍的生物素-HPR(Amersham-Pharmacia)并在室溫下溫育30分鐘。加入4N的硫酸來中止反應(yīng)并測量450/540nm的吸光度。結(jié)果表明逐步法與同步法之間在檢測靈敏度方面沒有差異,兩種方法都具備可對活體進(jìn)行定量檢測的足夠的靈敏度(25pg/ml)(圖3)。使用3E8作為一抗也進(jìn)行了相似檢驗,結(jié)果是相同的。
實施例5夾心ELISA系統(tǒng)的特異性本系統(tǒng)的特異性通過實施例4中的方法(同步法)來確認(rèn)。
1C3 MoAb(1μg/ml,100μl/孔)作為一抗固定在微孔板的孔格中,在使用25%的Block Ace(200μl/孔)封閉后,以橫軸所示的量,同生物素化抗hEPR-PoAb(2μg/ml,50μl/孔;最終1μg/ml)一起,加入EPR所屬的EGF家族成員的一組分子(6個因子;表皮生長因子(EGF),轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α),肝素結(jié)合EGF樣生長因子(B-EGF),β細(xì)胞素(BTC),雙調(diào)素(AR),heregulin-α(HRG-a)均購自R&D公司或者Sigma公司)、小鼠EPR(以與人EPR相似的方式制備)或者人EPR。EGF家族的6個成員與小鼠EPR連續(xù)稀釋4次,每次稀釋5倍,起始濃度為200ng/ml,以100ul/孔的量添加。與之類似,人EPR連續(xù)稀釋4次,每次稀釋5倍,起始濃度為200pg/ml。與親和素-HPR反應(yīng)后,使用TMB顯色。
如圖4所示,hEPR的檢測具有高靈敏度,EGF家族分子中的其它分子及小鼠EPR即便濃度高出1000倍也不被檢出,進(jìn)一步證實了本夾心ELISA系統(tǒng)的特異性。在使用3E8作為一抗的類似檢驗中獲得了相似結(jié)果。
實施例6人血清中人EPR的Western blot分析使用pH值為7.4的50mM Tris-HCl緩沖液(Gibco BRL)將人血清(Rockland INC.)稀釋10倍。將重組hEPR加入到稀釋的人血清中,以制備5倍連續(xù)稀釋的試驗樣品,這樣最終濃度分別為泳道10pg/ml,泳道28pg/ml,泳道340pg/ml,泳道4200pg/ml,泳道51000pg/ml。這樣獲得的試驗樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Daiichi Pure Chemical公司)上,然后通過使用諸如抗-hEPR-PoAb、MoAb 1C3和3E8(1μg/ml)這類能識別hEPR的抗體的免疫印記方法(J.Biol.Chem.,270,7459-7500)來進(jìn)行分析。結(jié)果表明每種抗體均能特異性地檢測3.7至8.2kDa區(qū)域的hEPR(圖5)。盡管PoAb及1C3 MoAb檢出了一條約為28kDa的條帶,但由于在抗原(-)的泳道也檢出了相同的條帶,因此它被認(rèn)為是非特異性帶。
實施例7通過ELISA方法檢測人血清中的人EPR濃度為1μg/ml的單克隆抗體1C3或者3E8以100μl/孔的量加到微孔板的孔格中,于4℃溫育24小時固定于固相。板子用含有0.1Tween 20的pH為7.5的50mM Tris-HCl(TBST)以200μl/孔的量洗3次,并以200μl/孔的量加入Block Ace于4℃溫育24小時進(jìn)行封閉。使用TBST以200μl/孔的量清洗孔格3次后,2倍稀釋人血清中的hEPR由起始濃度400pg/ml連續(xù)稀釋兩倍,并以50μl/孔的量加入。同時還以50μl/孔的量加入生物素化抗hEPR-PoAb(2μg/ml),室溫下溫育2小時。使用TBST洗5次后,以100μl/孔的量加入稀釋1000倍的生物素-HRP(Amersham-Pharmacia),于室溫反應(yīng)30分鐘。用濃度為4N的硫酸中止反應(yīng),使用TMB顯色并測量450/540nm的吸光度。圖6所示的結(jié)果表明濃度為25pg/ml的hEPR可被1C3與3E8中的任何一個充分檢出。
實施例8培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的EPR的檢測來源于小鼠的多種培養(yǎng)細(xì)胞(IC38、RAW264.7、NIH3T3 cloneT7、MoAb3)及來源于人的多種培養(yǎng)細(xì)胞(T-24、A-549、HCT116、colo205、colo201、HeLa、NB69、A431、SK-BR-3、MDA-MB-468、KB、TR-13),在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中以起始量106細(xì)胞/10ml/平皿培養(yǎng)3天,通過S-ELISA方法來檢測培養(yǎng)基中的hEPR。
1C3 MoAb(1μg/μl)以100μl/孔的量固定于固相,封閉后,在單個孔格中同時加入50μl的多種細(xì)胞培養(yǎng)基與50μl的生物素化hEPR-PoAb(2μg/ml)并于室溫下溫育2小時。此后的操作同實施例4中的操作類似。作為對照,在含有或不含額外的hEPR(10%FBS、人血清、0.1%BSA(hEPR 1ng/ml)、人血清(EPR 1ng/ml))的血清中進(jìn)行類似操作。
結(jié)果表明諸如能夠產(chǎn)生小鼠EPR的NIH3T3 clone T7細(xì)胞及其它小鼠細(xì)胞的培養(yǎng)基中沒有觀察到A450nm,而在諸如A-549(人肺癌細(xì)胞)、HCT116(人結(jié)腸癌)、colo201(人結(jié)腸癌)、colo205(人結(jié)腸癌)及T-24(人膀胱癌)的人腫瘤細(xì)胞中證實有高產(chǎn)量的hEPR(圖7),確證了培養(yǎng)基中的hEPR可以被特異性地檢出。然而,在諸如HeLa(人子宮癌)、NB69(人神經(jīng)細(xì)胞瘤)、KB(人皮膚癌(口腔))、A431(人皮膚癌(表皮))SK-BR-3(人乳腺癌)、MDA-MB-468(人乳腺癌)及TR-13(人腎癌)的人腫瘤細(xì)胞中沒有檢測到hEPR。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明,可能提供一種能高特異性及高靈敏度地檢測人血液、組織以及其他類似物中hEPR的系統(tǒng),該系統(tǒng)可通過檢測表達(dá)hEPR的腫瘤細(xì)胞而用于癌癥診斷等方面。進(jìn)一步地,可以預(yù)期本發(fā)明方法的應(yīng)用將有助于說明hEPR表達(dá)存在與否并闡釋hEPR表達(dá)與腫瘤形成機(jī)制間的關(guān)系。
本文所涉及的所有出版物、專利及專利申請均引入本文作為參考。
序列表<110>TAISHO PHARMACEUTICAL CO.LTD.
<120>單克隆抗體與產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤<130>PH-2008-PCT<150>JP2003-070864<151>2003-03-14<160>2<210>1<211>46<212>PRT<213>智人<400>1Val Ser Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His1 5 10 15Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys20 25 30Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu35 40 45<210>2<211>138<212>DNA<213>智人<400>2gtgtcaataa caaagtgtag ctctgacatg aatggctatt gtttgcatgg acagtgcatc60tatctggtgg acatgagtca aaactactgc aggtgtgaag tgggttatac tggtgtccga120tgtgaacact tcttttta 138
權(quán)利要求
1.一種能產(chǎn)生特異性識別人表皮調(diào)節(jié)素(hEPR)的單克隆抗體的雜交瘤。
2.權(quán)利要求1所述的雜交瘤,其保藏號為FERM BP-08647。
3.權(quán)利要求1所述的雜交瘤,其保藏號為FERM BP-08648。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1至3所述任一項所述的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體。
5.一種單克隆抗體,它可以識別由權(quán)利要求2或3所述的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體所識別的表位,并特異性地識別hEPR。
6.一種體外特異性檢測樣品中hEPR的方法,其特征在于使用權(quán)利要求4所述的單克隆抗體及能夠識別hEPR的多克隆抗體(hEPR-PoAb)。
7.一種體外檢測表達(dá)hEPR的細(xì)胞的方法,其特征在于使用權(quán)利要求4所述的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求7所述的方法,其中hEPR表達(dá)細(xì)胞是人腫瘤。
9.一種用于檢測人腫瘤的試劑盒,其包含權(quán)利要求4所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明建立了一種簡單且高靈敏度的hEPR檢測方法,并提供了一種檢測表達(dá)hEPR的人腫瘤的新方法。特別地,本發(fā)明提供了一種特異性識別人表皮調(diào)節(jié)素(hEPR)的單克隆抗體,產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤,以及使用該單克隆抗體檢測hEPR的高靈敏度的方法。
文檔編號G01N33/577GK1761682SQ200480006919
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月14日
發(fā)明者小紫俊 申請人:大正制藥株式會社