專利名稱：免疫測(cè)定法及其使用的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫測(cè)定法，該方法通過使用兩種類型的特征抗體使之能夠精確測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)，本發(fā)明還涉及所述方法中使用的試劑盒。更具體地，本發(fā)明涉及一種免疫測(cè)定法，其中使用兩種類型的抗體，即對(duì)靶物質(zhì)比對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)具有更高親和性的第一抗體，和對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)比對(duì)靶物質(zhì)具有更高親和性的第二抗體，用這兩種抗體處理樣品，于是樣品中的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)首先與第二抗體結(jié)合，這樣樣品中靶物質(zhì)與競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的比例擴(kuò)大，使得靶物質(zhì)變得易于與第一抗體結(jié)合，結(jié)果，與僅使用第一抗體的情況相比靶物質(zhì)的反應(yīng)性提高，因此靶物質(zhì)可被精確測(cè)定；本發(fā)明還涉及在這種方法中使用的試劑盒。
背景技術(shù)：
多種類型的物質(zhì)存在于含有待測(cè)定的靶物質(zhì)的樣品中，并且在某些情況下待測(cè)定的靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)同時(shí)存在于特定樣品中。例如，認(rèn)為血清中大部分的酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP)衍生自破骨細(xì)胞的酸性磷酸酶，并且認(rèn)為測(cè)定TRACP可用作評(píng)估成骨細(xì)胞功能的指征。因此，TRACP是作為骨吸收標(biāo)記引起人們興趣的物質(zhì)(Norio Fukunaga，Toshitaka Nakamura和Toshio Matsumoto，“Osseous MetabolismMarker”，Medical Review Co.Ltd.，1995)，并且人們發(fā)現(xiàn)這種酶除具酶促活性外，該酶的降解產(chǎn)物片段也存在于血清中(J Bone MinerRes.151337-1345，2000；和Clin Chem.4774-80.2001)。
此外，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將血清中的酸性磷酸酶分成從起點(diǎn)開始的0-5六個(gè)帶。這其中，對(duì)應(yīng)于第五帶的酸性磷酸酶是酒石酸抗性的，被稱為5帶酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP5酒石酸抗性酸性磷酸酶5)。該酸性磷酸酶進(jìn)一步通過電泳分成具有高含量的與糖鏈結(jié)合的唾液酸的5a，和幾乎不含與糖鏈結(jié)合的唾液酸的5b。另外，5a是衍生自血小板等的酶且其血液水平不變，而只有5b的血液水平隨骨吸收的變化而變化。因此，人們認(rèn)為5b是衍生自破骨細(xì)胞的酒石酸抗性酸性磷酸酶的主要部分。在“臨床化學(xué)”(Clin.Chem.471497.2001)中，還推薦衍生自破骨細(xì)胞的ACP可縮寫為TRACP 5b。因此，在本說明書中，涉及衍生自破骨細(xì)胞并用做骨吸收指征的ACP的磷酸酶表達(dá)為術(shù)語(yǔ)“TRACP 5b”，并認(rèn)為衍生自破骨細(xì)胞的酒石酸抗性酸性磷酸酶和酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)是同義的。因此，它們都以術(shù)語(yǔ)“TRACP 5b”表達(dá)。
除TRACP 5b外，衍生自紅細(xì)胞或衍生自血小板的酸性磷酸酶作為ACP存在于樣品中。即，當(dāng)通過收集樣品引起溶血作用時(shí)，衍生自紅細(xì)胞的酸性磷酸酶包含于樣品中。當(dāng)血清用作樣品時(shí)，在血清制品血液凝固過程中血小板被破壞，致使衍生自血小板的酸性磷酸酶包含于樣品中。因此，測(cè)定TRACP活性的常規(guī)方法不能測(cè)定破骨細(xì)胞特異性TRACP5b。作為這些測(cè)定方法的改進(jìn)，已知一種方法，其中經(jīng)包括5倍稀釋的血清在37℃培育1小時(shí)的預(yù)處理后，在酒石酸存在的情況下通過使用對(duì)硝基苯基磷酸(pNPP)作為底物，測(cè)定剩余的TRACP的活性(“Nichidai-Ishi”，49904-911.1990；和Clin.Chem.33458-462.1987)。該方法使之能夠避免衍生自紅細(xì)胞的酸性磷酸酶的影響，但不能排除衍生自血小板的酸性磷酸酶的影響。此外，作為更加特定的活性測(cè)定方法，有一種利用TRACP 5b和衍生自紅細(xì)胞或血小板的酒石酸抗性酸性磷酸酶之間對(duì)氟的敏感性差異之TRACP 5b測(cè)定方法(JP-A-10-37198)。然而，盡管該方法能夠避免衍生自紅細(xì)胞或血小板的酒石酸抗性酸性磷酸酶的影響，但它不能排除TRACP 5a的影響。此外，該方法需要在精密度上進(jìn)一步改進(jìn)，因?yàn)樵谶@種方法中通過從總的酒石酸抗性酸性磷酸酶活性減去在氟存在的情況下未被抑制的活性測(cè)定TRACP 5b活性。
在免疫測(cè)定方法中，例如使用Marius E、Sari L等人的多克隆抗體的方法(J Clin Endocrinol Metab.71442-451.1990；和Clin Chem.461751-1754.2000)和使用Jussi M.Halleen、Heather Bull等人的單克隆抗體的方法(J Bone Miner Res.13683-687.1998；ImmunolLett.70143-149.1999；J Bone Miner Res.14464-469.1999；Clin Chem.452150-2157.1999；和Clin Chem.461751-1754.2000)，測(cè)定對(duì)應(yīng)于整個(gè)第5帶的活性，因此TRACP 5a的影響不可忽略。此外，Halleen等人的方法(設(shè)計(jì)該方法以專門測(cè)定TRACP 5b)對(duì)衍生自破骨細(xì)胞的TRACP 5b的活性更有特異性，但在健康人樣品與患有惡化的骨吸收疾病的患者樣品之間僅顯示微小的差異。因此，作為骨吸收標(biāo)記的TRACP 5b的敏感性不足。人們認(rèn)為對(duì)以前制備的多克隆抗體和單克隆抗體的TRACP 5b的低專一性是上述缺陷的原因。既然報(bào)道血清中TRACP含有10倍于活性酶量的大量無(wú)酶促活性的片段，還假設(shè)血清中這些片段與完整酶競(jìng)爭(zhēng)，因此由于不利的反應(yīng)系統(tǒng)其專一性很低。
即使在這種情況下，迄今為止通過免疫測(cè)定等方法利用對(duì)酶促活性的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)、完整酶和酶降解產(chǎn)物共有的抗原進(jìn)行定量。然而，結(jié)果，當(dāng)在單克隆抗體的情況下表位有限時(shí)，由于降解作用出現(xiàn)了可測(cè)量片段和不可測(cè)量片段。因此，可推測(cè)具有例如如下問題即使在測(cè)定同一種靶物質(zhì)時(shí)，使用多種試劑盒獲得的測(cè)定結(jié)果中沒有相關(guān)性。此外，還報(bào)道在TRACP的情況下(以前給出的例子)，其片段的量不能在臨床上反應(yīng)骨吸收(J.Bone Miner.Res.，151337-1345，2000；和Clin.Chem.4774-80，2001)。這被視為僅用于測(cè)定酶活形式所必需的適當(dāng)?shù)睦印Ｔ谶@種情況下，僅酶的水平將通過除去片段測(cè)定。通常假設(shè)，通過活性測(cè)定方法測(cè)定TRACP不精確，因?yàn)槭Щ钇闻c酶競(jìng)爭(zhēng)。而且，沒有用于純化分離蛋白質(zhì)片段的片段特異性抗體，因此，實(shí)質(zhì)上沒有給出用于分離的方法。
發(fā)明公開本說明書中闡明的TRACP精確測(cè)定長(zhǎng)期以來都是不可能的，盡管人們認(rèn)為它具有臨床意義。因此，考慮了下面兩種原因。第一種原因是沒有對(duì)指示破骨細(xì)胞活性的TRACP 5b具有高度特異性的抗體。第二種原因是通過TRACP酶降解形成的蛋白片段在血清中以超過活性酶的量存在。
因此，本發(fā)明中，通過開發(fā)對(duì)TRACP活性酶具有高度結(jié)合常數(shù)值的第一抗體以及幾乎不與酶反應(yīng)但與酶的失活降解片段結(jié)合的第二抗體，并將它們用于同一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中，僅酶活水平被精確測(cè)定，而避免降解產(chǎn)物的影響。
考慮到這一問題，本發(fā)明提供了一種免疫測(cè)定方法，其中首先聯(lián)合使用與待測(cè)靶物質(zhì)高度反應(yīng)的第一抗體以及與競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)(例如失活片段)高度反應(yīng)的第二抗體，以排除反應(yīng)系統(tǒng)中競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的影響，籍此，特異并精確地測(cè)定靶物質(zhì)，例如活性酶。
也就是說，本發(fā)明提供了一種免疫測(cè)定方法，其中通過使用兩種類型的抗體測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)，該方法包括使用兩種類型的抗體，即具有如下特性的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對(duì)靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(ii)第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性高于對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(iii)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于對(duì)靶物質(zhì)的親和性，和(iv)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性，使樣品中的靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)與吸附在載體上的第一抗體和第二抗體結(jié)合，然后測(cè)量結(jié)合的靶物質(zhì)的水平以測(cè)定所述樣品中的靶物質(zhì)。
此外，本發(fā)明提供了使用兩種類型的抗體免疫測(cè)定樣品中靶物質(zhì)的試劑盒，其中包括兩種類型的抗體，即具有如下特性的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對(duì)靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(ii)第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性高于對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(iii)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于對(duì)靶物質(zhì)的親和性，和(iv)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示使用Cyphergen Biosystems.Inc.的Protein ChipSystem分析結(jié)果的簡(jiǎn)單圖表。從圖表(1)和(2)發(fā)現(xiàn)就抗體Trk49來說，在嬰兒血清中有4種片段與之特異性反應(yīng)。另一方面，從圖表(3)和(4)發(fā)現(xiàn)就抗體Trk62來說，幾乎沒有片段與之特異性反應(yīng)。
圖2顯示測(cè)定激素治療前、后的骨質(zhì)疏松患者血清的結(jié)果。該治療前觀察到的兩個(gè)峰值于治療后消失。從這一事實(shí)還推測(cè)相應(yīng)于這兩個(gè)峰值的片段對(duì)骨吸收是特異性的。
圖3顯示使用相同濃度的抗體Trk49和Trk62進(jìn)行ELISA的結(jié)果?？贵wTrk49僅顯示低反應(yīng)性。然而，與僅使用抗體Trk62的情況相比，在同時(shí)使用抗體Trk49和Trk62的平板上顯示了提高的反應(yīng)性。
圖4顯示通過吸附抗體Trk62到平板上和吸附抗體Trk62或抗體Trk49到乳膠顆粒上進(jìn)行ELISA的結(jié)果。在獲得的Trk62抗體敏化的乳膠反應(yīng)物可與平板競(jìng)爭(zhēng)的情況下，隨著加入的乳膠反應(yīng)物濃度的提高著色減少。但是，通過對(duì)比，就Trk49敏化的乳膠反應(yīng)物來說，酶的著色值在0.1％～0.15％的實(shí)驗(yàn)組中增加。于是，發(fā)現(xiàn)當(dāng)與吸附在平板上的抗體Trk62聯(lián)合使用時(shí)，Trk49抗體敏化的乳膠反應(yīng)物是有效的。
實(shí)施本發(fā)明的方式本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中，兩種類型的抗體，即第一抗體和第二抗體用于測(cè)定樣品中待測(cè)靶物質(zhì)。所述第一抗體和第二抗體具有如下特性(i)第一抗體具有對(duì)靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(ii)第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性高于對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(iii)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于對(duì)靶物質(zhì)的親和性，和(iv)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性。本文中，術(shù)語(yǔ)“競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)”是指與待測(cè)靶物質(zhì)具有相似的抗原性的物質(zhì)，并且具有這樣的特性，即當(dāng)制備靶物質(zhì)的抗體時(shí)，所述競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)與靶物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)與該抗體結(jié)合。例如，當(dāng)靶物質(zhì)是蛋白質(zhì)或酶時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)包括，例如蛋白質(zhì)或酶的片段、具有在構(gòu)成蛋白質(zhì)或酶的氨基酸序列中通過取代、缺失或添加氨基酸殘基形成的氨基酸序列的變體、和通過向蛋白質(zhì)或酶中添加磷酸酯基或改變蛋白質(zhì)或酶的糖鏈部分獲得的修飾產(chǎn)物。
本發(fā)明中，待測(cè)靶物質(zhì)的典型例子是完整酶。當(dāng)靶物質(zhì)是完整酶時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的典型例子是不具有酶促活性的物質(zhì)，例如通過酶降解獲得的產(chǎn)物，即酶降解產(chǎn)物。
本發(fā)明中各個(gè)第一抗體和第二抗體可以是抗血清、多克隆抗體和單克隆抗體中的任何一種。
可制備用于本發(fā)明的第一抗體和第二抗體，方法是例如通過用待測(cè)靶物質(zhì)免疫動(dòng)物，作為抗原，將動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以制備雜交瘤，然后選擇具有如下性質(zhì)的兩種類型的單克隆抗體，作為兩種類型的抗體，即來自由雜交瘤制備各種單克隆抗體的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對(duì)靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(ii)第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性高于對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(iii)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于對(duì)靶物質(zhì)的親和性，和(iv)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性。本發(fā)明中，第二抗體可以是對(duì)靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)都具有親和性的抗體。為了獲得滿足上述關(guān)于靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的四個(gè)條件的兩種類型的單克隆抗體，例如，下列各項(xiàng)須滿足通過ELISA等測(cè)量各種單克隆抗體之靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的結(jié)合特性，并在測(cè)量結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇滿足上述四個(gè)條件的兩種類型的單克隆抗體。另外，也可根據(jù)公知的方法測(cè)定各種單克隆抗體的靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)(“Protein·Enzyme Fundamental ExperimentalMethods”，Nankohdo Co.，Ltd.)并根據(jù)測(cè)量結(jié)果選擇兩種類型的單克隆抗體。此外，還可通過使用各種不同的單克隆抗體制備親和層析柱并測(cè)定吸附在柱上的靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)，選擇兩種類型的單克隆抗體。
當(dāng)兩種類型的抗體中的每一個(gè)，即第一抗體和第二抗體是抗血清或多克隆抗體時(shí)，例如下列各項(xiàng)是可行的在通過改變佐劑或改變免疫條件建立的各種條件下，用待測(cè)靶物質(zhì)免疫動(dòng)物，這樣獲得的抗血清或多克隆抗體的靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的結(jié)合特性通過與上述單克隆抗體存在的情況下相同的方法測(cè)定，并選擇滿足上述四個(gè)條件的兩種類型的抗體。
本發(fā)明中使用的兩種類型抗體的典型例子是可用于測(cè)定衍生自破骨細(xì)胞的TRACP 5b的兩種類型的單克隆抗體。與TRACP 5b有關(guān)并根據(jù)本發(fā)明獲得的兩種類型的單克隆抗體一個(gè)是第一單克隆抗體，該抗體與TRACP 5b的反應(yīng)性高于此前報(bào)道的單克隆抗體，并幾乎不與TRACP 5b的片段反應(yīng)，另一個(gè)是與失活的酶片段反應(yīng)并幾乎不與活性酶反應(yīng)的第二單克隆抗體。利用這兩種類型的抗體使對(duì)衍生自破骨細(xì)胞的TRACP 5b具有特異性的免疫測(cè)定方法成為可能，該方法幾乎不受TRACP 5b失活片段和血液中其它同工酶(衍生自紅細(xì)胞、血小板、中性白細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)的影響。
通過這些單克隆抗體的例子，下面進(jìn)一步詳細(xì)地闡述用于本發(fā)明的兩種類型的抗體。
上述單克隆抗體可通過使用衍生自人破骨細(xì)胞的純化的TRACP 5b作為免疫原獲得。盡管在下文描述的方法中，使用從正常破骨細(xì)胞中獲得的抗原進(jìn)行免疫，不僅該抗原而且破骨細(xì)胞瘤的TRACP 5b等都可用做抗原。
上述單克隆抗體由雜交瘤生產(chǎn)，所述雜交瘤通過用純化的人TRACP5b作為抗原免疫動(dòng)物，并將其能夠產(chǎn)生抗人TRACP 5b抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得。
上述雜交瘤可通過如下方法獲得。也就是說，以上述方式獲得的人TRACP 5b與公知的佐劑例如弗氏完全或不完全佐劑、氫氧化鋁佐劑、百日咳桿菌佐劑等混合，制備用于敏化的佐劑液體，該液體通過腹腔皮下或尾部靜脈施用于動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)，以數(shù)個(gè)部分每隔1-3周免疫該動(dòng)物。盡管用于敏化的抗原的量通常在1μg-100mg的范圍內(nèi)選擇，約50μg通常是優(yōu)選的。雖然免疫操作的次數(shù)通常為2-7次，各種方法是已知的。隨后，衍生自脾等的抗體產(chǎn)生細(xì)胞在試管中與具有增殖能力的細(xì)胞(例如骨髓瘤細(xì)胞等)融合。該抗體產(chǎn)生細(xì)胞可從小鼠、裸鼠或大鼠獲得。
關(guān)于上述融合方法，可通過已公知的Kohller和Milstein的方法(Nature.256，495.1975)使用聚(乙二醇)(PEG)進(jìn)行融合。融合還可通過使用仙臺(tái)病毒(Sendai virus)或通過電融合方法進(jìn)行。
關(guān)于從融合細(xì)胞中選擇能夠生產(chǎn)可識(shí)別人TRACP 5b的抗體的雜交瘤的方法，可如下進(jìn)行所述選擇。也就是說，在有限稀釋的上述融合細(xì)胞中，從在HAT培養(yǎng)基和HT培養(yǎng)基中存活的細(xì)胞形成的集落中選擇雜交瘤。當(dāng)人TRACP 5b的抗體包含于接種到96-孔平板等中的融合細(xì)胞形成的任何集落之培養(yǎng)液上清時(shí)，可通過ELISA方法選擇能夠生產(chǎn)人TRACP 5b的單克隆抗體的克隆，其中將上清置于具有固定于其上的人TRACP 5b的測(cè)定平板上，反應(yīng)后，次級(jí)標(biāo)記抗體例如抗-小鼠免疫球蛋白-HRP標(biāo)記抗體與上述抗體反應(yīng)。作為標(biāo)記抗體的標(biāo)記物質(zhì)，可使用除HRP外的酶(例如堿性磷酸酶)、熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)等。篩選人TRACP5b的特異性抗體，作為對(duì)照，可通過進(jìn)行僅使用BSA與之結(jié)合的測(cè)定板作為阻斷劑的ELISA，同時(shí)進(jìn)行上述ELISA來完成。即，選擇在具有人TRACP 5b固定于其上的平板上呈陽(yáng)性并在僅使用BSA的ELISA中呈陰性的克隆。
此外，可同時(shí)進(jìn)行如下測(cè)定將抗-小鼠免疫球蛋白抗體接種于微量接種板中，其中加入融合細(xì)胞的培養(yǎng)液上清進(jìn)行反應(yīng)，再加入純化的TRACP 5b與活性酶結(jié)合并形成免疫復(fù)合物，然后通過利用產(chǎn)色底物例如pNPP測(cè)定這樣結(jié)合的酶活。
本發(fā)明中使用的第一單克隆抗體包括能特異性識(shí)別人TRACP 5b的單克隆抗體，具體地，它與完整的人TRACP 5b反應(yīng)，不與衍生自紅細(xì)胞、血小板、中性白細(xì)胞或前列腺和馬鈴薯ACP的酸性磷酸酶交叉反應(yīng)，并對(duì)人TRACP 5b的失活片段具有低的反應(yīng)性。其例子是通過由本發(fā)明人建立的雜交瘤Trk62生產(chǎn)的單克隆抗體。用于本發(fā)明的第二單克隆抗體包括能特異性識(shí)別人TRACP 5b失活片段的單克隆抗體，具體地，它幾乎不與活性人TRACP 5b反應(yīng)，并不與衍生自紅細(xì)胞、血小板、中性白細(xì)胞或前列腺和馬鈴薯ACP的酸性磷酸酶交叉反應(yīng)。其例子是通過由本發(fā)明人建立的雜交瘤Trk49生產(chǎn)的單克隆抗體。
具體地，為了與活性酶特異性結(jié)合，本發(fā)明中使用的第一抗體優(yōu)選地是對(duì)活性人TRACP 5b比對(duì)失活的人TRACP 5b片段具有更高的親和性的抗體。特別優(yōu)選的例子是具有對(duì)活性人TRACP 5b的結(jié)合常數(shù)大于第二抗體的抗體。作為第二抗體，適當(dāng)?shù)氖蔷哂袑?duì)失活的TRACP 5b片段的結(jié)合常數(shù)大于對(duì)第一抗體的人活性TRACP 5b的結(jié)合常數(shù)的抗體。作為第一抗體，舉例說明了由本發(fā)明人建立的雜交瘤Trk62生產(chǎn)的單克隆抗體。作為第二抗體，舉例說明了由本發(fā)明人建立的雜交瘤Trk49生產(chǎn)的單克隆抗體。上述雜交瘤Trk49和Trk62保藏于如下單位，即專利生物保藏中心(Patented Organism Deposition Center)(IPOD)，產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(獨(dú)立行政法人)，Chuo-dairoku，Higashi 1-1-1，Tsukuba City，Ibaraki Prefecture，日本305-8566雜交瘤Trk49于2002年11月27日保藏保藏號(hào)IPOD FERM BP-8249，雜交瘤Trk62于2002年2月14日保藏為保藏號(hào)IPOD FERM BP-7890。
上述各個(gè)雜交瘤在通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，例如α-MEM、RPMI1640、ASF、S-克隆等，且單克隆抗體可從培養(yǎng)基上清回收。如下也是可行的事先用降植烷處理裸鼠，(雜交瘤是從裸鼠衍生的)后，細(xì)胞經(jīng)腹膜內(nèi)注射到動(dòng)物體內(nèi)引起腹水累積，然后從腹水中回收單克隆抗體。
關(guān)于從上述上清液或腹水回收單克隆抗體的方法，可采用常規(guī)方法。這里舉例說明了用硫酸銨、硫酸鈉等鹽析、層析、離子交換層析、和使用蛋白A的親和層析。
通過使用由上述方法純化的本發(fā)明的單克隆抗體，可精確測(cè)定血清樣品中TRACP 5b。下面闡述本發(fā)明的免疫測(cè)定方法。
例如，如下可實(shí)施本發(fā)明的免疫測(cè)定方法。首先，第一抗體和第二抗體吸附在不溶的固體支持物例如平板上，除上述吸附步驟外，該免疫測(cè)定方法可通過與常規(guī)ELISA方法相同的步驟進(jìn)行。用于測(cè)定的樣品首先加入具有吸附于其上的兩種類型抗體的支持物。在這種情況下，由于第一抗體和第二抗體之間結(jié)合常數(shù)的差異，樣品中的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)主要與吸附在支持物上的第二抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，然后樣品中的靶物質(zhì)主要與吸附在支持物上的第一抗體有利地發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)。隨后，必要時(shí)洗滌固體支持物，然后測(cè)定附著在固體支持物上的靶物質(zhì)的水平，如此可測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)。在這種情況下，當(dāng)靶物質(zhì)是完整酶例如TRACP 5b時(shí)，將與之相應(yīng)的底物溶液例如pNPP(對(duì)硝基苯基磷酸)加入固體支持物進(jìn)行酶反應(yīng)，并測(cè)定與固體平板結(jié)合的靶物質(zhì)的水平，如此可精確測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)。
本發(fā)明中，吸附第一抗體的載體可以是不溶的固體支持物，而第二抗體可吸附于在液體中可分散的載體上，例如乳膠或可溶解。在這種情況下，靶物質(zhì)可如下測(cè)定。首先，在液體中可分散的載體，例如乳膠用第二抗體敏化或?qū)⒌诙贵w溶解。另一方面，將第一抗體吸附在固體支持物上。然后，將含有這樣處理的第二抗體的溶液和用于測(cè)定的樣品加入固體支持物，如此樣品中的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)主要與第二抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，而靶物質(zhì)主要與第一抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)。隨后，必要時(shí)洗滌固體支持物，然后測(cè)定附著在固體支持物上的靶物質(zhì)的水平，如此可測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)。在這種情況下，當(dāng)靶物質(zhì)是完整酶如TRACP 5b時(shí)，將與之相應(yīng)的底物溶液例如pNPP(對(duì)硝基苯基磷酸)加入固體支持物以測(cè)定附著在固體支持物上的靶物質(zhì)，這樣可精確測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)。
如上文所闡明的，吸附第一抗體的載體通常是不溶的固體支持物。第二抗體在吸附于不溶的固體支持物上或分散于包含乳膠等的溶液中后使用，或溶解。
不溶的固體支持物沒有限制，只要它是在例如ELISA的固相免疫測(cè)定方法中使用的固體支持物。不溶的固體支持物包括，例如，用聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯等制成的固體支持物。通過物理結(jié)合、化學(xué)鍵合或親和，根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體(抗體)直接或間接地與上述任何公知的固體支持物結(jié)合。用于敏化的抗體的量常常在1ng-100mg/ml的范圍內(nèi)。用于測(cè)定人TRACP 5b的樣品加入通過物理結(jié)合、化學(xué)鍵合或親和結(jié)合在固體支持物上的單克隆抗體(抗體)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)一定時(shí)間后，洗滌固體支持物并加入產(chǎn)色底物進(jìn)行反應(yīng)。關(guān)于底物，可使用已知的底物例如pNPP。
作為可分散于液體中、第二抗體吸附于其上的載體，實(shí)例有乳膠顆粒、磁性顆粒和脂質(zhì)顆粒。還可使用通過將第二抗體與化學(xué)合成聚合物、天然聚合物(例如葡聚糖)等鍵合并將這樣處理的聚合物分散于溶液中獲得的分散體。在這種情況下，測(cè)定固體平板上的靶物質(zhì)可通過將能夠與競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)結(jié)合的第二抗體加入ELISA方法中的緩沖液試劑而方便地進(jìn)行。靶物質(zhì)的測(cè)定可通過第二抗體與固相載體鍵合并使這樣處理的第二抗體與吸附于固體平板上的第一抗體競(jìng)爭(zhēng)而方便地進(jìn)行。此外，靶物質(zhì)的測(cè)定可通過第二抗體與化學(xué)合成聚合物、天然聚合物(例如葡聚糖)等鍵合，并將這樣處理的抗體加入緩沖液試劑而方便地進(jìn)行。
實(shí)施本發(fā)明免疫測(cè)定方法的試劑盒包括兩種類型的抗體，即上述第一抗體和第二抗體。如上所述，如果需要，這些抗體可吸附在不溶的固體支持物或分散于液體中的載體(例如乳膠)上。如果需要，該試劑盒可進(jìn)一步含有用于測(cè)定與抗體結(jié)合的靶物質(zhì)的試劑。
關(guān)于本發(fā)明，如后面實(shí)施例1所詳細(xì)描述的，多種血清中的TRACP 5b片段使用分別由上述雜交瘤Trk49和Trk62產(chǎn)生的單克隆抗體Trk49和Trk62，通過蛋白質(zhì)芯片技術(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果證實(shí)在嬰兒或骨質(zhì)疏松癥患者的血清中發(fā)現(xiàn)分子量約為5580Da、5795Da、6860Da或7075Da的TRACP 5b片段，其中骨吸收活躍地進(jìn)行。因此，發(fā)現(xiàn)這些TRACP 5b片段可用做診斷骨疾病(例如骨吸收活躍進(jìn)行的骨疾病)的標(biāo)志分子。因此，可通過檢測(cè)取自患者的樣品(例如血清、血漿或血液)中的這些標(biāo)志分子，或測(cè)量這些標(biāo)志分子的量診斷骨疾病。
可采用目前已知的所有方法檢測(cè)或定量標(biāo)志分子。所述方法包括，例如，質(zhì)譜分析法、免疫測(cè)定法、電泳法、液相層析法和氣相層析法。對(duì)于質(zhì)譜分析法，舉例說明了使用激光解析/電離時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(LDI-TOF MS)的方法。關(guān)于激光解析/電離時(shí)間飛行質(zhì)譜儀，舉例說明了表面增強(qiáng)的激光解析/電離時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(SELDI-TOF MS法)和基質(zhì)-輔助的激光解析/電離時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS法)。例如，當(dāng)采用SELDI-TOF MS方法時(shí)，可使用由Ciphergen Biosystems，Inc開發(fā)的蛋白質(zhì)·生物·系統(tǒng)·II·質(zhì)譜儀(Ciphergen Biosystems，Inc)。該儀器以包含SELDI(表面增強(qiáng)的激光解析離子化)和飛行時(shí)間質(zhì)譜儀組合的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)為基準(zhǔn)。這種儀器的詳細(xì)資料公開于國(guó)際專利申請(qǐng)WO 01/25791A2、JP-A-2001-281222等。通常，在SELDI-TOFMS方法中，樣品被預(yù)處理，吸附于芯片上，然后裝載在SELDI-TOF MS質(zhì)譜儀上。當(dāng)樣品是血清時(shí)，優(yōu)選地從系統(tǒng)中除去清蛋白，方法是使用清蛋白吸附劑或用緩沖液清洗系統(tǒng)直到芯片由于離子交換導(dǎo)致的清蛋白所帶電荷停止。這種方法中使用的蛋白質(zhì)芯片沒有具體限制，只要它可吸附上述標(biāo)志分子。作為蛋白質(zhì)芯片，舉例的芯片(也稱為化學(xué)芯片)，其中具有蛋白質(zhì)親和性的官能團(tuán)，其經(jīng)修飾產(chǎn)生疏水性、離子交換特性等，并且芯片(生化芯片)具有固定于其上的感興趣的蛋白質(zhì)的抗體。
關(guān)于另一種質(zhì)譜分析法，舉例說明了使用ESI方法(電噴射離子化)的質(zhì)譜分析。在使用ESI方法的情況下，將經(jīng)預(yù)處理(例如蛋白酶處理)的樣品裝載到與分離單元(例如高效液相層析)直接連接的質(zhì)譜儀上常常是優(yōu)選的。作為免疫測(cè)定方法，舉例說明了一種方法，其中通過制備標(biāo)志分子的多克隆或單克隆抗體測(cè)定以前已知的蛋白質(zhì)。這種免疫測(cè)定方法包括酶免疫測(cè)定法(EIA法)、免疫比濁測(cè)定法(TIA法)、乳膠免疫-凝集法(LATEX法)、電化學(xué)發(fā)光法、熒光法等。免疫層析法和使用試紙的方法也是有效的。通常，所有這些方法對(duì)本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員都是已知的，并且這些通常已知的方法可為他們所采用。
除上述方法外，舉例說明了電泳法、液相色譜法(LC)、氣相色譜法(GC)等。這些方法對(duì)本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員通常也是已知的，并可采用這些通常已知的方法進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明參考如下優(yōu)選的實(shí)施例更具體地舉例說明，這并不意味著限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1(1)選擇和制備用于制備單克隆抗體的抗原制備衍生自人破骨細(xì)胞的TRACP 5b用做制備抗-人TRACP單克隆抗體的抗原。下面描述一種純化方法。
得到同意后，通過外科手術(shù)切除的130g人股骨頭冷凍于液氮中，用錘子壓碎，然后懸浮于含有蛋白酶抑制劑的200mL緩沖液中(50mMTris-HCl、0.3M KCl、1mM PMSF、1mM EDTA·2Na，0.1％Triton X-100，0.02％NaN3、1單位/ml抑酶肽，pH7.5)，然后在超聲勻漿機(jī)中勻漿。勻漿4℃攪拌過夜，并在10,000rpm離心20分鐘，上清液對(duì)10mM Tris緩沖液(pH8.2)透析。此后，透析液應(yīng)用于CM-瓊脂糖凝膠柱(Φ40mm×40cm)(SIGMA)，吸附的蛋白質(zhì)用上述含有NaCl的相同的Tris緩沖液洗脫，以線性梯度增加NaCl濃度(0-0.5M NaCl)。用底物對(duì)硝基苯磷酸測(cè)定酒石酸抗性酸性磷酸酶活性，合并含有高水平活性的部分。將這樣獲得的溶液濃縮，然后對(duì)含有0.7M NaCl的20mM Tris緩沖液(pH7.2)透析，透析液應(yīng)用于Superdex 200株(Φ16mm×60cm)(AmershamPharmacia Biotech)。以上述相同的方式，測(cè)定通過洗提獲得的部分中酒石酸抗性酸性磷酸酶活性，合并包含活性的部分。這樣獲得的溶液用20mM Tris緩沖液(pH7.2)稀釋2倍，應(yīng)用于HiTrap Heparin HP柱(5mL)(Amersham Pharmacia Biotech)，吸附的蛋白質(zhì)用上述含有NaCl的相同的20mM Tris緩沖液(pH7.4)洗脫，同時(shí)以線性梯度提高NaCl濃度(0.35-1M NaCl)。合并含有高水平的酒石酸抗性酸性磷酸酶活性的部分，然后濃縮獲得0.4mg衍生自破骨細(xì)胞的純化的酸性磷酸酶。
用A280確定蛋白質(zhì)的量。對(duì)于純化，進(jìn)行SDS-PAGE(TIFCO)，隨后銀染色。結(jié)果，純度通過在約35,000分子量處出現(xiàn)單帶得以確定。對(duì)應(yīng)于單帶的酶被認(rèn)為是純化的TRACP 5b，并被用做免疫抗原。
(2)免疫衍生自破骨細(xì)胞的純化的酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP 5b)用50mM檸檬酸緩沖液(pH5.5)稀釋到濃度250g/ml，25μg(100μl)稀釋液與100μl的弗氏完全佐劑(WAKO)充分混合直到實(shí)現(xiàn)乳化。這樣制備的懸浮液腹膜內(nèi)給予用二乙醚麻醉的6周齡的Balb/c雌性小鼠(Nippon Clear Co.，Ltd.)。兩周后，相同量的上述TRACP 5b(25μg/ml)與弗氏不完全佐劑(WAKO)混合。通過與弗氏完全佐劑的情況完全相同的操作，實(shí)現(xiàn)乳化作用以獲得懸浮液，并用懸浮液敏化小鼠。這樣處置2周后，進(jìn)行與上述相同的步驟。對(duì)于第四次免疫，即最終免疫，制備用50mM檸檬酸緩沖液(pH5.5)稀釋的TRACP 5b(25μg/ml)，然后通過注射尾靜脈給予小鼠。
(3)建立雜交瘤最終免疫后3天，在用二乙醚麻醉的情況下，經(jīng)外科手術(shù)從用TRACP5b敏化的小鼠除去脾，在無(wú)菌條件下將它分散于準(zhǔn)備的脾細(xì)胞中。根據(jù)Kohller和Milstein的方法進(jìn)行融合(Nature，256，495，1975)通過使用聚(乙二醇)(PEG4000)(MERK)將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞P3-X63-Ag8-U1(P3U1)融合。關(guān)于融合比，脾細(xì)胞的數(shù)量為8×107，而骨髓瘤細(xì)胞P3-X63-Ag8-U1(P3U1)的數(shù)量為2×107。也就是，脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合比為4∶1。融合細(xì)胞分散于10％FCS(INVITROGEN)α-MEM(IRVINE)HAT)(Cosmo Bio Co.，Ltd)培養(yǎng)基中，接種于96-孔微量滴定培養(yǎng)板(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)，然后在37℃和5％CO2的條件下培養(yǎng)。
(4)篩選約2周后，證實(shí)并篩選生長(zhǎng)的集落。進(jìn)行篩選的方法描述如下。
為了產(chǎn)生用于篩選的平板，在上述(1)項(xiàng)中純化的TRACP 5b溶解于50mM檸檬酸緩沖液中，并以0.5μg/100μl/孔的量加到96-孔平板(Nunc)中。使平板4℃靜置兩夜，然后用含有0.05％Tween20的Tris緩沖液洗滌三次。各個(gè)孔中加入200μl 1.5％BSA溶液以抑制非特異性反應(yīng)，使平板4℃靜置過夜。這樣制得的平板用含0.05％Tween20的Tris緩沖液洗滌3次后，100μl培養(yǎng)上清在各個(gè)孔中反應(yīng)，并進(jìn)一步洗滌平板。然后，加入一種第二抗體(HRP-標(biāo)記的抗-小鼠免疫球蛋白抗體(Zymed))進(jìn)行反應(yīng)。洗滌后，檸檬酸中100μl 3mg/ml的鄰苯二胺產(chǎn)色溶液(OPD)(Nakalai)，HRP的產(chǎn)色底物，加入各個(gè)孔在一定時(shí)間內(nèi)引起著色。然后，100μl 1N的硫酸作為終止溶液加入各個(gè)孔，并在492nm測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。通過上述步驟發(fā)現(xiàn)呈陽(yáng)性的克隆通過有限稀釋法再克隆，這樣獲得的上清再檢驗(yàn)。
(5)抗體的確定具有純化TRACP 5b的克隆Trk49和Trk62的反應(yīng)性通過ELISA確定，以發(fā)現(xiàn)盡管它們親和力不同，克隆Trk49和Trk62與具有高度敏感性的平板反應(yīng)。結(jié)果，選擇克隆Trk49和Trk62作為識(shí)別TRACP 5b的克隆。由這些克隆產(chǎn)生的抗體使用單克隆抗體分類試劑盒(AmershamPharmacia Biotech)測(cè)定，獲得的結(jié)果顯示于下表1中。
表1克隆的特征類別 輕鏈克隆Trk49 IgG1 K克隆Trk62 IgG1 K(6)制備和純化單克隆抗體10周齡的Balb/c雌性小鼠(Nippon Clear Co.，Ltd.)給予0.5ml降植烷(Aldrich)兩周后，腹膜內(nèi)給予1×107個(gè)上述第(5)項(xiàng)中獲得的各個(gè)雜交瘤Trk49和Trk62的細(xì)胞。約兩周后，小鼠腹腔內(nèi)累積的腹水在二乙醚麻醉的情況下手術(shù)收集。通過使用逐步稀釋為樣品的腹水并通過上述第(4)項(xiàng)中為了篩選采用的ELISA法證實(shí)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)腹水含有高濃度單克隆抗體。該腹水用40％的硫酸銨處理并對(duì)PBS透析，然后單克隆抗體使用蛋白質(zhì)G柱(Amersham Pharmacia Biotech)純化并通過SDS-PAGE證實(shí)。結(jié)果，在兩種單克隆抗體Trk49和Trk62的情況下，當(dāng)抗體處于非還原狀態(tài)時(shí)，在約150,000分子量處證實(shí)具有單帶，當(dāng)抗體用巰基乙醇還原時(shí)，在約50,000和25,000分子量處證實(shí)具有兩個(gè)帶。每只小鼠中各個(gè)純化的抗體Trk49和Trk62的量約為15mg或更多，也就是說，它對(duì)于工業(yè)利用是足夠的。
(7)特異性分析為了研究單克隆抗體Trk49和Trk62的特異性，使用各種同工型(TRACP 5b、紅細(xì)胞、血小板、PAP(SIGMA)，和馬鈴薯ACP(SIGMA))進(jìn)行下列試驗(yàn)。測(cè)定方法簡(jiǎn)要描述如下。
使用蛋白質(zhì)G純化的各個(gè)單克隆抗體以2μg/孔的量加入固體平板中(Nunc)，使該平板4℃靜置兩天。該平板用20mM Tris(pH7.0)洗滌3次，洗滌液含有0.05％Tween20，然后將200μL 1.5％BSA Tris(pH7.0)加入各個(gè)孔中，隨后4℃下過夜封閉。這樣產(chǎn)生的平板用與上述相同的洗滌液洗滌一次，將各種同工型的酶活都調(diào)整到10IU/L，并將100μl這樣獲得的各個(gè)溶液加入抗體-附著平板的各個(gè)孔中。室溫下反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)。反應(yīng)完成后，平板用與上述相同的洗滌液洗滌3次，加入100μl酸性磷酸酶的底物，反應(yīng)在37℃進(jìn)行1小時(shí)。各個(gè)樣品中酶的水平從由抗體捕獲的酶引起的底物著色確定。加入50μl反應(yīng)-終止溶液后，在405nm光學(xué)波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體Trk49和Trk62具有極高的特異性，因?yàn)樗鼈儍H與TRACP 5b反應(yīng)，不具有與其它同工型的交叉反應(yīng)性。
(8)利用SELDI法證實(shí)片段最近幾年，包括表面增強(qiáng)激光解析離子化(SELDI)和飛行時(shí)間質(zhì)譜儀組合的蛋白質(zhì)碎片技術(shù)已由Ciphergen Biosystems Inc.，USA開發(fā)，并已開始臨床應(yīng)用，例如，用于檢測(cè)新的腫瘤標(biāo)記物。本發(fā)明人試圖通過使用所述技術(shù)和利用由建立的雜交瘤Trk49和Trk62產(chǎn)生的單克隆抗體在實(shí)踐中捕獲血清中的TRACP 5b片段。
1)使用PS20芯片的試驗(yàn)首先，本發(fā)明人通過使用PS20蛋白質(zhì)芯片陣列(Protein ChipArrays)(Ciphergen Biosystems，Inc)，在血清中搜索與抗體Trk49和Trk62反應(yīng)的TRACP 5b或其片段。該P(yáng)S20芯片指抗體-結(jié)合芯片并具有下列特征樣品中的反應(yīng)物質(zhì)首先與結(jié)合在金屬表面上的抗體結(jié)合，并且與抗體反應(yīng)的物質(zhì)用激光從抗體上解離并于真空中飛行，由此測(cè)定該物質(zhì)的分子量。蛋白質(zhì)芯片陣列的試驗(yàn)操作方法簡(jiǎn)要描述如下。首先，培養(yǎng)適應(yīng)于合成培養(yǎng)基S-克隆的雜交瘤Trk49和Trk62(SankoJunyaku Co.，Ltd.)，由它們產(chǎn)生的各個(gè)抗體使用蛋白質(zhì)G柱純化(Amersham Pharmacia)。各個(gè)抗體的濃度調(diào)整到500μg/mL，2μl這樣獲得的溶液加入PS20芯片。室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，加入5μl的阻斷緩沖液(1M乙醇胺PBS pH8.0)(WAKO)，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行10分鐘。阻斷后，芯片用8mL的洗滌緩沖液(0.5％Triton 100 PBS)室溫洗滌5分鐘。這樣重復(fù)洗滌兩次，然后該芯片用PBS輕柔漂洗。輕輕擦去反應(yīng)斑點(diǎn)附近的區(qū)域，并將4個(gè)樣品中的每一個(gè)取3μl加入芯片，這4個(gè)樣品即健康志愿者的血清、12歲或以下幼兒的血清、激素替代治療前骨質(zhì)疏松患者的血清和激素替代治療后骨質(zhì)疏松患者的血清。反應(yīng)完成后，樣品用Kimwipe(Jujo Kimberley)吸收，芯片用8mL洗滌緩沖液(0.5％Triton 100 PBS)室溫洗滌5分鐘。這樣重復(fù)洗滌兩次，然后該芯片用PBS輕柔漂洗。用Kimwipe(Jujo Kimberley)從芯片上擦去水滴，且0.5μl的飽和芥子酸(Ciphergen Biosystems Inc)/50％乙腈(Wako)/0.5％TFA(Wako)溶液加入兩次。這樣產(chǎn)生的蛋白質(zhì)芯片陣列用Protein·Biology·System II質(zhì)譜儀解讀(Ciphergen Biosystems，Inc)。
2)使用PS20芯片進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果測(cè)定數(shù)據(jù)顯示于圖1和圖2中。在此數(shù)據(jù)格式中，橫坐標(biāo)軸指從PS20蛋白質(zhì)芯片分離的各個(gè)樣品中蛋白質(zhì)的分子量，縱坐標(biāo)軸指反應(yīng)在上述分子量處達(dá)到檢波器的被分析物量的峰高。在這種情況下，縱坐標(biāo)軸的單位為主觀單位(AU)。在上述試驗(yàn)中，幼兒血清以及激素替代治療前骨質(zhì)疏松患者的血清是在進(jìn)程中骨吸收活躍的血清。作為試驗(yàn)結(jié)果，僅當(dāng)使用抗體Trk49進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在上述兩個(gè)試驗(yàn)組的情況下觀察到5795Da附近的峰和6860Da附近的峰(圖1，(2)和圖2，(5))。在進(jìn)程中骨吸收溫和的成人血清的情況下沒有觀察到這些峰(圖1，(1)和(3))。在顯示高峰值的幼兒血清的情況下，除所述高峰外還可證實(shí)近5580Da的峰和近7075Da的峰(圖1，(2))。經(jīng)激素替代療法治療后，骨質(zhì)疏松患者近5795Da和近6860Da的峰消失(圖2，(6))。詞語(yǔ)“近”用于表達(dá)對(duì)應(yīng)于各個(gè)峰的分子量的原因是通常具有20或以下的測(cè)定誤差。此外，當(dāng)使用抗體Trk62進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，進(jìn)程中骨吸收活躍的血清中沒有發(fā)現(xiàn)特異性片段(圖1，(3)和(4))。作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人成功地發(fā)現(xiàn)幾種類型的相當(dāng)新的TRACP 5b片段，它們以前是未知的。實(shí)際上，該片段是在約5795Da、約5580Da、約6860Da和約7075Da檢測(cè)到的蛋白質(zhì)或其降解產(chǎn)物。這些片段是完全新的物質(zhì)并是能反應(yīng)骨吸收或發(fā)病的標(biāo)記物。結(jié)合片段的量與各個(gè)抗體的結(jié)合常數(shù)緊密相關(guān)。應(yīng)對(duì)抗體Trk62的反應(yīng)性特別重視?？贵wTrk62幾乎不與結(jié)合抗體Trk49的片段反應(yīng)，已證明抗體Trk62對(duì)活性酶具有高度的特異性。相反，抗體Trk49與片段反應(yīng)得很好。從這些事實(shí)推測(cè)用于本發(fā)明的兩種類型的單克隆抗體，即抗體Trk49和Trk62，分別對(duì)片段和酶具有高度的特異性，因此本發(fā)明中，TRACP 5b可使用兩種抗體通過酶免疫測(cè)定法高度敏感地特異性測(cè)定。
(9)測(cè)量單克隆抗體的結(jié)合常數(shù)進(jìn)行下列試驗(yàn)用于確定各個(gè)抗原的結(jié)合常數(shù)。關(guān)于確定方法，根據(jù)“蛋白質(zhì)·酶基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法(Protein·Enzyme FundamentalExperimental Methods)”，Nankohdo Co.，Ltd.進(jìn)行測(cè)定。制備兩種類型抗原溶液，即(A)純化的TRACP 5b和(B)通過使用Trk49親和柱純化的TRACP 5b片段(TRACP 5b片段的混合物，它至少含有分別具有約5580Da、5795Da、6860Da和7075Da分子量的TRACP 5b片段)，以獲得濃度為5μg/mL 20mM的檸檬酸緩沖液。96-孔平板(Nunc)的各個(gè)孔用50μL的各個(gè)抗原溶液敏化。4℃靜置過夜后，平板的各孔用200μL含有0.05％Tween20的20mM Tris緩沖液洗滌3次，并將100μL封閉劑(20mM Tris緩沖液含有1.5％BSA和10％蔗糖)加入各孔，隨后4℃靜置過夜。平板的各孔再次用200μL含有0.05％Tween20的20mMTris緩沖液洗滌3次，通過分步稀釋各個(gè)抗體為12個(gè)濃度(0、0.1、0.15、0.20、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.75、1.0μg/mL)獲得的20μL的各個(gè)抗體溶液加入各個(gè)孔中。反應(yīng)在各個(gè)條件下進(jìn)行2小時(shí)(i)37℃和(ii)4℃。經(jīng)這樣初次反應(yīng)后，平板的各孔用200μL含有0.05％Tween20的20mM Tris緩沖液洗滌3次，并將50μL 1000倍稀釋的第二抗體(抗-小鼠IgG-HRP標(biāo)記抗體Zymed)加入各孔。反應(yīng)在37℃進(jìn)行2小時(shí)，平板的各孔用200μL含有0.05％Tween20的20mM Tris緩沖液洗滌3次。然后，100μL 3mg/mL的OPD溶液加入各孔以引起著色。用100μL 0.1N的硫酸溶液終止著色，隨后在492nm處比色。
從這樣獲得的結(jié)果，通過條件(i)下每1M濃度的A492，首先確定結(jié)合的單克隆抗體的量。例如，由于當(dāng)TRACP 5b平板上抗體的量是0.05μg時(shí)A492為0.250，當(dāng)抗體的分子量取做146,000時(shí)，結(jié)合的抗體的量可如下確定0.25/{0.05/(0.146×10-9)}＝0.731×10-9(1)接著，條件(ii)下各個(gè)抗體濃度結(jié)合的抗體的濃度(PL)從在條件(i)下獲得的值確定。
＝條件(ii)下的A492/每1M濃度的A490(2)然后，從加入的抗體濃度確定游離抗體的濃度[PF]。
＝加入的抗體濃度-[PL] (3)[PL]/[PF]對(duì)結(jié)合抗體的濃度做曲線圖，通過曲線的斜率(-nK)確定結(jié)合常數(shù)。
Ka＝-斜率/n作為通過上述方法測(cè)定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)的兩種單克隆抗體Trk49和Trk62的結(jié)合常數(shù)(ka)值顯示于下表2中。
表2單克隆抗體的結(jié)合常數(shù)單克隆抗體結(jié)合常數(shù)Trk49 (TRACP 5b) Ka＝0.94×109(TRACP 5b片段) Ka＝5.25×109Trk62 (TRACP 5b) Ka＝3.73×109(TRACP 5b片段) Ka＝0.69×109當(dāng)領(lǐng)會(huì)了上述反應(yīng)系統(tǒng)中結(jié)果的含義時(shí)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)活性，即親和性如下Trk49與片段的反應(yīng)性>Trk62與酶的反應(yīng)性>Trk492與酶的反應(yīng)性>Trk62與片段的反應(yīng)性因此，發(fā)現(xiàn)如下事實(shí)由于單克隆抗體Trk49與TRACP 5b片段的反應(yīng)性高于與TRACP 5b本身的反應(yīng)性，而且，當(dāng)與單克隆抗體Trk62對(duì)TRACP 5b的結(jié)合常數(shù)相比時(shí)該反應(yīng)性更高，因此反應(yīng)系統(tǒng)中單克隆抗體Trk49首先選擇性地與TRACP 5b片段結(jié)合，單克隆抗體Trk62可在競(jìng)爭(zhēng)片段的量減少的反應(yīng)系統(tǒng)中與TRACP 5b更有利地結(jié)合。該結(jié)果支持了使用蛋白質(zhì)芯片的試驗(yàn)的結(jié)果。
(10)通過ELISA進(jìn)行測(cè)定的試驗(yàn)因此，生產(chǎn)下列5中類型的平板Trk49 1μg/孔/100μL、Trk49 2μg/孔/100μL、Trk62 1μg/孔/100μL、Trk62 2μg/孔/100μL、和Trk49 1μg+Trk62 1μg)/孔/100μL。除如下改變外敏化抗體溶液的體積100μL，封閉液的體積100μL、樣品的體積100μL，生產(chǎn)平板的方法與上述第(7)項(xiàng)中測(cè)定單克隆抗體的特異性的生產(chǎn)方法相同。關(guān)于初次反應(yīng)，具有高的TRACP 5b水平的合并血清(包含至少分別具有約5580Da、5795Da、6860Da或7075Da的分子量的TRACP 5b片段)作為樣品加入吸附在平板上的抗體，抗原-抗體反應(yīng)在室溫下震蕩進(jìn)行。然后，進(jìn)行洗滌步驟，將100μL合成底物溶液加入各個(gè)孔中，37℃下進(jìn)行1小時(shí)酶促反應(yīng)。反應(yīng)經(jīng)加入0.2N NaOH溶液而終止，隨后比色，借此測(cè)定酶活。獲得的結(jié)果顯示于圖3中。
基于它的結(jié)合常數(shù)，假定與酶具有低反應(yīng)性，而與片段具有高反應(yīng)性的抗體Trk49對(duì)酶具有低的親和力，因此對(duì)測(cè)定不具有必要的敏感性。另一方面，基于根據(jù)抗體Trk62的結(jié)合常數(shù)，推測(cè)與酶具有高反應(yīng)性的抗體Trk62顯示良好的線性關(guān)系。此外，在平板具有抗體Trk49和抗體Trk62混合物的情況下，獲得更長(zhǎng)的線性和改進(jìn)的敏感性。由于即使當(dāng)各個(gè)抗體的量從1μg增加到2μg時(shí)，線性和敏感性幾乎沒有改善，推測(cè)作為反應(yīng)中涉及的各個(gè)抗體的量，1μg/孔基本上足夠了。即，推測(cè)因?yàn)楦鶕?jù)基于結(jié)合常數(shù)試驗(yàn)的理論線性和敏感性得以提高，反應(yīng)系統(tǒng)中抗體Trk49實(shí)質(zhì)上優(yōu)勢(shì)性地與片段結(jié)合，然后抗體Trk62與完整酶結(jié)合。
(11)使用乳膠試劑的片段吸收方法使用已發(fā)現(xiàn)能夠?qū)嵸|(zhì)上特異性吸收片段的單克隆抗體Trk49和單克隆Trk62作為對(duì)照，用這兩種單克隆抗體中的每一個(gè)敏化乳膠以制備乳膠試劑。乳膠試劑的制備如下進(jìn)行。
將2mL 1％的乳膠懸浮液與2mL 0.1mg/mL的抗體Trk49和Trk62的各個(gè)溶液混合，獲得的混合物攪拌約1小時(shí)。離心后，沉淀懸浮于1％的BSA溶液中，并將懸浮液再攪拌約1小時(shí)。重新離心后，沉淀懸浮于PBS溶液中以獲得乳膠試劑。該乳膠試劑稀釋為8個(gè)濃度，即0.15％和從0.1％通過2倍稀釋(0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.00313和0.00156％)獲得7個(gè)濃度，共制備8種乳膠試劑。ELISA法中的操作闡述如下。
首先，取這些乳膠試劑中的每一個(gè)各50μL加入接種了抗體Trk62的平板的各個(gè)孔中(2μg/孔)。然后，將從得到其同意的患者獲得的具有高水平TRACP 5b(8U/ml)的100μL合并血清加入各孔，室溫下振動(dòng)反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，該平板用含0.05％Tween20的20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗滌3次，并向其中加入合成底物溶液。37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，50μL的反應(yīng)終止溶液(0.2N NaOH溶液)加入各孔，隨后在405/490nm處測(cè)定。獲得的結(jié)果顯示于圖4中。在Trk62-敏化乳膠試劑添加實(shí)驗(yàn)中，引起與平板上單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)，以致隨乳膠試劑濃度的增加酶著色下降。然而，在抗體Trk49的情況下，在添加0.1～0.15％乳膠試劑的試驗(yàn)中獲得顯著提高的酶著色值。這一事實(shí)，例如，表明不僅用抗體同時(shí)敏化的平板，而且使用用于吸附的載體例如乳膠等的吸收方法對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)片段的吸收是有效的。此外，使用通過將抗體Trk49溶解于溶液中獲得的溶液代替用抗體Trk49敏化的乳膠也是有效的。
工業(yè)適用性如上文詳細(xì)闡述的，本發(fā)明的免疫測(cè)定法通過使用與靶物質(zhì)具有高度反應(yīng)性的第一抗體和與競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)例如靶物質(zhì)的失活片段具有高度反應(yīng)性的第二抗體的組合，使特異和精確測(cè)定待測(cè)靶物質(zhì)例如活性酶成為可能，以避免反應(yīng)系統(tǒng)中競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的影響。
權(quán)利要求
1.一種通過使用兩種類型的抗體測(cè)定樣品中靶物質(zhì)的免疫測(cè)定法，所述方法包括使用兩種類型的抗體，即具有如下特性的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對(duì)靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(ii)第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性高于對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(iii)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于對(duì)靶物質(zhì)的親和性，和(iv)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性，使樣品中的靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)與吸附在載體上的第一抗體和第二抗體結(jié)合，然后測(cè)量結(jié)合的靶物質(zhì)的水平以測(cè)定所述樣品中的靶物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫測(cè)定法，其中更進(jìn)一步，第二抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性高于第一抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫測(cè)定法，其中所述靶物質(zhì)是完整酶并且測(cè)量結(jié)合的靶物質(zhì)水平是測(cè)量所述完整酶的酶活。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫測(cè)定法，其中所述競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)是不具有所述酶活的物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的免疫測(cè)定法，其中所述競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)是酶降解產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任何一項(xiàng)所述的免疫測(cè)定法，其中所述完整酶是酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述的免疫測(cè)定法，其中所述載體是不溶性固體支持物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)所述的免疫測(cè)定法，其中吸附第一抗體的載體是固體支持物，而第二抗體吸附在分散于溶液中的載體上或被溶解。
9.一種通過使用兩種類型的抗體免疫測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)的試劑盒，其包括兩種類型的抗體，即具有如下特性的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對(duì)靶物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(ii)第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性高于對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性，(iii)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于對(duì)靶物質(zhì)的親和性，和(iv)第二抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于第一抗體對(duì)靶物質(zhì)的親和性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述第一抗體和第二抗體吸附在載體上。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的試劑盒，其中所述第一抗體吸附在固體支持物上，第二抗體吸附在分散于溶液中的載體上或被溶解。
12.一種診斷骨疾病的標(biāo)志分子，包括分子量約為5580Da、5795Da、6860Da或7075Da的酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)的片段。
全文摘要
使用兩種類型的抗體，即對(duì)靶物質(zhì)的親和性高于對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性的第一抗體和對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的親和性高于對(duì)靶物質(zhì)的親和性的第二抗體，樣品用這兩種抗體處理。然后，樣品中的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)首先與第二抗體結(jié)合，這樣樣品中靶物質(zhì)對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的比率擴(kuò)大。結(jié)果，靶物質(zhì)變得易于與第一抗體結(jié)合，依次地，與僅使用第一抗體的情況相比靶物質(zhì)的反應(yīng)性增加。因此，可精確測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)，同時(shí)避免包含于樣品中的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的影響。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1732385SQ20038010755
公開日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2003年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者大橋建也, 三浦俊英, 五十嵐吉彥, 野村文夫, 朝長(zhǎng)毅, 片山勝博 申請(qǐng)人:日本紡績(jī)株式會(huì)社