專利名稱：一種檢測玻璃酸鈉原料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢驗領(lǐng)域，涉及一種藥物原料玻璃酸鈉(又稱透明質(zhì)酸鈉，簡稱HA)細(xì)菌內(nèi)菌素檢測方法，也就是檢測玻璃酸鈉原料中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法。
背景技術(shù)：
玻璃酸鈉為一種高分子物質(zhì)，具有保濕、潤滑、優(yōu)良載體等功用，而細(xì)菌內(nèi)毒素是一種能引起人體發(fā)熱、白細(xì)胞減少等一系列生理反應(yīng)的物質(zhì)。玻璃酸鈉作為注射劑藥物的原料時，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢查控制。目前國內(nèi)只有我們對玻璃酸鈉原料進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素控制，也沒有文獻(xiàn)報道關(guān)于玻璃酸鈉原料細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏可靠方法，可快速地檢查出玻璃酸鈉原料中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。
本發(fā)明的玻璃酸鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法是精密定量稱取玻璃酸鈉原料，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2mg/ml.再稀釋至不超過最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的各稀釋級的稀釋液，備用。參照《中國藥典》2000版附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，先檢查各稀釋級的細(xì)菌內(nèi)毒素，再從反應(yīng)結(jié)果為陰性的最低稀釋級開始做干擾實驗，直至某稀級劑不存在干擾，可用該濃度計算內(nèi)毒素值。
本發(fā)明有如下的優(yōu)點和積極效果(1)、可以快速可靠地檢測出玻璃酸鈉原料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。
(2)、通過先摸出反應(yīng)結(jié)果為陰性的最低稀釋劑再從此稀釋級開始做干擾實驗，可以省卻大量的先期摸索工作，降低檢驗成本。
(3)、玻璃酸鈉是高分子物質(zhì)，粘度大，所以原始濃度的確定也減少了摸索初濃度的工作。
(4)、玻璃酸鈉溶解和溶脹的時間和條件確定大大減少了由于溶解不充分以及溶解條件不好而引起檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。
本發(fā)明的
具體實施例方式
一、實驗準(zhǔn)備1、實驗用具本實驗所用的玻璃器皿，均需超聲清洗后再用蒸餾水沖洗三次，于180℃-200℃干烤至少2小時或250℃干烤1小時備用。
2、實驗試劑75％的酒精棉球細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品鱟試劑 規(guī)格0.1ml/支，應(yīng)具有國家主管部門批準(zhǔn)文號，且經(jīng)過靈敏度復(fù)核符合規(guī)定的。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指與靈敏度為0.03EU/ml或更高靈敏度鱟試劑在37+1℃條件下24小時不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。
二、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用砂輪片輕輕劃痕，用75％棉球擦拭啟開，防止玻璃屑落入瓶中。
按規(guī)定加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，在旋渦混合器上混合15分鐘，然后制備所需濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ)，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘，備用。
三、供試品溶液的制備供試品溶液的稀釋精密定量稱取玻璃酸鈉原料10-20mg，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2mg/ml(經(jīng)多次實驗得出的適宜濃度，因玻璃酸鈉粘度比較大，如濃度高，則操作不易準(zhǔn)確；濃度太低，則細(xì)菌內(nèi)毒素不能準(zhǔn)確檢測到)作為原液，冰箱放置12-15小時，使其充分溶解振搖，再對倍稀釋至各稀釋級。
四、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測取鱟試劑，每支加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，復(fù)溶后，從中取1支加入0.1ml 2.0λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽性對照，1支加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照，其余每2支作平行加入各稀釋級的稀釋液0.1ml，將試管中溶液輕輕搖勻后，于37±1℃恒溫水浴箱中保溫60±2分鐘，記錄反應(yīng)結(jié)果。如果供試品稀釋液反應(yīng)結(jié)果全部為陽性，則應(yīng)加大稀釋倍數(shù)，進(jìn)行試驗。
五、干擾實驗1、含供試品的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備用反應(yīng)結(jié)果為陰性的最低稀釋級的供試品稀釋液在制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的同時將細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品以相同的方法制備成所需濃度的內(nèi)毒素溶液(2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ)。
2、取準(zhǔn)備好的鱟試劑36支，分成兩組，放在試管架上，每組排成4列，每列4支。一組加入(2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ)四種濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度平行做4管；另一組加入(2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ)四種濃度的含供試品的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度平等做4管。另取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和供試品稀釋液各做兩管陰性對照。
3、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、含供試品的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品稀釋液的加樣量為0.1ml。
4、將試管中溶液輕輕搖勻后，于37±1℃恒溫水浴箱中保溫60±2分鐘，觀察并記錄結(jié)果。
5、結(jié)果觀察與判斷如最大濃度2.0λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管均為陰性時，按下式計算用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Es)和用供試品稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Et)。
Es＝1g(∑Xs/4)式中Xs為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值；Et＝1g(∑Xt/4)式中Xt為供試品稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值。
當(dāng)Es在0.5λ-2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)時，且當(dāng)Et在0.5Es-2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)時則認(rèn)為使用該鱟試劑，供試品在該稀釋級不存在干擾，只有三個批次的鱟試劑在同一稀釋級都不存在干擾現(xiàn)象時，才能證明這一稀釋級確無干擾。否則應(yīng)再對供試品的高一稀釋級作干擾實驗。
6、結(jié)果判定細(xì)菌內(nèi)毒素含量＝稀釋倍數(shù)×鱟試劑靈敏度
權(quán)利要求
1.一種檢測玻璃酸鈉原料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于精密定量稱取玻璃酸酸原料10-20mg，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2mg/ml，作為原液，冰箱放置12至15小時，再稀釋至不超過最大有效稀釋倍數(shù)的各稀釋級，先檢查各稀釋級的細(xì)茵內(nèi)毒素，再從反應(yīng)結(jié)果為陰性的最低稀釋級開始做干擾實驗，直至某高稀釋級不存在干擾，可用該稀釋級計算細(xì)菌內(nèi)毒素值。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于精密定量稱取的玻璃酸鈉重量為10-20mg.
3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于用原液的稀釋濃度為2mg/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于為充分溶解玻璃酸鈉原料，冰箱放置12-15小時。
5.如權(quán)利要求1所述的檢查方法，其特征在于做干擾實驗的具體操作程序上是先摸出反應(yīng)結(jié)果為陰性的最低稀釋級，再從此稀釋級開始做干擾實驗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玻璃酸鈉(HA)原料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法。精密定量稱取玻璃酸鈉原料，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2mg/ml。再稀釋至不超過最大有效稀釋倍數(shù)的各稀釋級，先檢查各稀釋級的細(xì)菌內(nèi)毒素；再從反應(yīng)結(jié)果為陰性的最低稀釋級開始做干擾實驗，直至某高稀釋級不存在干擾，可用該稀釋級計算細(xì)菌內(nèi)毒素值。本方法為玻璃酸鈉原料的生產(chǎn)和科研提供了控制和測定細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。
文檔編號G01N1/38GK1547026SQ200310105550
公開日2004年11月17日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者凌沛學(xué), 龐曉陽, 張興斌, 錢雪, 蘇淮, 宋燕, 莊會軍, 李洪磊, 欒志霞 申請人:凌沛學(xué)