專利名稱：大腸癌標記物的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包括從生物學樣品中提取RNA的工序的用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法，其特征在于，不含從生物學樣品中分離細胞成分的工序。
背景技術(shù)：
大腸癌導致的死亡者正在增加。大腸癌導致的死亡者是在所有的癌癥導致的死亡者中數(shù)量眾多的癌癥，在男性為第4位、在女性為第2位(1999年度癌死亡統(tǒng)計)。另外，推算在2015年的癌患者中，男女中都成為第1位，所以需要包括二次預(yù)防在內(nèi)的綜合性大腸癌對策，癌的群體篩查是最有效的方法之一。
將簡便而且非侵襲性的檢測方法用于癌的群體篩查(mass screening)是很重要的。目前可以利用的唯一的非侵襲性方法是，檢查有無潛血的糞便檢查即便潛血檢查，作為大腸癌的群體篩查的標準方法被廣泛使用。
但是，由于在糞便中出現(xiàn)血紅蛋白并不是腫瘤特異性標記，所以便潛血檢查的敏感度和特異度低(敏感度30～90％、特異度70～98％)，為此其缺點是存在很多假陰性或假陽性。
另外，為了診斷大腸癌，在通過免疫學便潛血法進行篩查之后，或者同時將全大腸內(nèi)窺鏡檢查或灌腸檢查和乙狀結(jié)腸內(nèi)窺鏡檢查組合使用，其缺點是需要花費很多時間和勞力。
作為便潛血檢查的替代法，已報道的有檢測糞便中的K-ras、p-53、APC基因變異或微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等使用DNA的方法(Sidransky等著(D.Sidransky，et al.)、Science、第256卷、1992年4月3日、第102頁～第105頁；Dong等著(S.M.Dong，et al.)、Journal of the National CancerInstitute、第93卷、第11號、2001年6月11日、第858頁～第865頁；Traverso等著(G.Traverso，et al.)、The New England Journal of Medicine、第346卷、第5號、2002年1月31號、第311頁～第320頁；Traverso等著(G.Traverso，et al.)、The Lncet、第359卷、2002年2月2日、第403頁～第404頁)。
這些使用DNA的方法是可以非侵襲地捕捉癌細胞的直接變化的方法，具有特異度高的特征，是很有前途的方法，但與作為以往技術(shù)的便潛血檢查相比，敏感度低，而且，也需要花費相當?shù)臅r間和勞力。
另外，作為便潛血檢查的進一步替代方法，為了更直接地檢測出基因表達，還開發(fā)了檢測糞便中的蛋白質(zhì)激酶C(PKC)等的mRNA的方法(Davidson等著(L.A.Davidson，et al.)、Carcinogenesis、第19卷、第2號、1998年、第253頁～第257頁；Alexander和Raicht等著(R.J.Alexanderand R.F.Raicht)、Digestive Diseases and Sciences、第43卷、第12號、1998年、第2652頁～第2658頁；Yamao等著(T.Yamao et al.)、Gastroenterology、第114卷、第6號、1998年、第1198頁～第1205頁)。
但是，即使通過上述使用RNA的方法，也不能從少量的糞便簡單而有效地提取RNA，不能得到比便潛血法更高的敏感度。
已知有通過組合PCR法與逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)(RT)來定性地且定量地檢測RNA的方法。該RT-PCR法在檢測微量分子的敏感度方面比Northern印跡法更好，另外，在操作速度或容易程度方面比原位雜交法更出色。
但是，RNA沒有DNA穩(wěn)定，而且經(jīng)常暴露在有可能被所有生物學樣品中普遍存在且極為穩(wěn)定的RNA分解酶(RNase)分解的危險性中，所以即便在RT-PCR法中或在RNA的純化過程和純化后，都要求嚴密保存以免RNase混入。
因而，在從糞便這樣的生物學上極為粗糙的樣品中提取RNA時，為了排除RNase的影響，需要進行預(yù)先分離細胞區(qū)域(fraction)的工序。
因而，從存在來源于極多量的微生物的龐大數(shù)量的RNase的糞便中直接檢測RNA是不可能的，為了至少除去來源于微生物等的外因性RNase，必須進行細胞區(qū)域的分離。

發(fā)明內(nèi)容
但是，本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)了通過在RNA分解酶抑制劑的存在下使根據(jù)情況凍結(jié)的生物學樣品均質(zhì)化，可以解決上述課題，從而完成了本發(fā)明。
因而，本發(fā)明的目的在于，提供一種具有超過以往的便潛血檢查的敏感度和特異度的非侵襲性的而且簡單的用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法。
本發(fā)明提供一種方法，是包括下述工序的用于提取在用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法中使用的RNA的樣品的調(diào)制方法，所述的工序是a)在RNA分解酶抑制劑的存在下使采集的生物學樣品均質(zhì)化來調(diào)制懸濁物的工序，其特征在于，不包括從生物學樣品中分離細胞成分的工序。
在這里，該采集的生物學樣品優(yōu)選被凍結(jié)。
另外，本發(fā)明是RNA分解酶抑制劑為硫代氰酸胍的上述方法。
另外，本發(fā)明是生物學樣品為糞便的上述方法。
另外，本發(fā)明的用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法，除了包括上述方法的工序以外，還包括下述工序b)從用于提取得到的RNA的樣品中提取RNA的工序、c)使提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄而得到cDNA的工序、d)擴增得到的cDNA的工序，和e)檢測擴增的cDNA的工序。
本發(fā)明是腫瘤標記物為COX-2的用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法。
另外，本發(fā)明提供一種試劑盒，是包括下述組分的、用于調(diào)制用于提取在用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法中使用的RNA的樣品的試劑盒，其中，所述的組分是a)在RNA分解酶抑制劑的存在下使采集的生物學樣品均質(zhì)化來調(diào)制懸濁物的組分，其特征在于，不包括從生物學樣品中分離細胞成分的組分。
另外，本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選包括使該采集的生物學樣品凍結(jié)的組分。
另外，本發(fā)明是RNA分解酶抑制劑為硫代氰酸胍的上述試劑盒。
另外，本發(fā)明是生物學樣品為糞便的上述試劑盒。
另外，本發(fā)明是用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測試劑盒，進一步包括下述組分b)從用于提取得到的RNA的樣品中提取RNA的組分、c)使提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA的組分、d)擴增得到的cDNA的組分，和e)檢測擴增的cDNA的組分。
另外，本發(fā)明是腫瘤標記物為COX-2的上述試劑盒。


圖1表示實施例2的電泳結(jié)果。道1是表示用Alexander等的方法從人糞便中提取的全RNA。道2是表示用本發(fā)明的方法從人糞便中提取的全RNA。道3是表示從人大腸癌組織中提取的全RNA。道M是表示分子量標記。
具體實施例方式
作為本發(fā)明的RNA分解酶抑制劑，可以舉出硫代氰酸胍、等基因(Isogene)、ウルトラスペツクII(注冊商標)(UltraspecII)等。
作為本發(fā)明的生物學樣品，可以舉出動植物組織、體液、排泄物等，優(yōu)選糞便，更優(yōu)選人的糞便。
本發(fā)明的生物學樣品可以直接或者根據(jù)情況凍結(jié)后使用。
凍結(jié)方法可以使用以往的任何技術(shù)，優(yōu)選使用液氮的方法。關(guān)于凍結(jié)溫度，保存溫度為-1～-196℃，優(yōu)選為-20～-196℃，更優(yōu)選為-75～-196℃，進一步優(yōu)選為-110～-196℃，最優(yōu)選為-196℃。
凍結(jié)的樣品可以冷凍保存。保存溫度為-75～-196℃，優(yōu)選為-110～-196℃，更優(yōu)選為-196℃。保存時間為1天～10年，優(yōu)選為1天～3年，更優(yōu)選為1天～1年。
作為在本發(fā)明中使用的腫瘤標記物，可以舉出COX-2、MatrixmetalloProtease(MMP)、c-met、CD44變異體(variants)、EGF-R、EF-1、Wnt-2、Bradeion、SKP2、KPC-1、KPC-2、PRL-3、血管生成素(Angiogenin)、整合素(Integrin)、Snail、Dysadherin等，優(yōu)選COX-2。
上述工序c)～e)被稱為RT-PCR法，例如可以按照關(guān)谷剛男等編、PCR法最前線、1997年、共立出版、第187頁～第196頁所記載的內(nèi)容進行。
從懸濁物提取RNA可以使用以往公知的方法，例如可以使用RNeasyMini(QIAGEN)或RNA Extraction Kit(Pharmacia Biotech)之類的市售的試劑盒。
在本發(fā)明中，逆轉(zhuǎn)錄是指使用逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)、將RNA轉(zhuǎn)換為互補的DNA(cDNA)的過程。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通常是使用含有緩沖液、MgCl2或KCl等鹽類、二硫蘇糖醇(dithiothreitol)(DTT)、引物、脫氧核苷酸類、RNase抑制劑以及逆轉(zhuǎn)錄酶的溶液進行的。可以將上述鹽類適當變更為其它鹽類試用。另外，也可以添加明膠、白蛋白等蛋白質(zhì)或表面活性劑等。
在逆轉(zhuǎn)錄之后進行的cDNA的擴增通常使用PCR。PCR反應(yīng)液通常含有緩沖液、MgCl2或KCl等鹽類、引物、脫氧核苷酸類以及耐熱性聚合酶。可以將上述鹽類適當變更為其它鹽類試用。另外，還可以適宜添加明膠、白蛋白等蛋白質(zhì)，二甲基亞砜或表面活性劑等。
cDNA的擴增還可以使用LAMP法(專利第3313358號公報)或ICAN法(特開2001-136965)。
在本發(fā)明中，引物是指在cDNA合成或核酸擴增時發(fā)揮合成起始點作用的寡聚核苷酸。引物優(yōu)選為1條鏈，也可以使用2條鏈。在引物為2條鏈時，在擴增反應(yīng)之前，需要成為1條鏈。引物可以按照公知的方法合成，另外，還可以從生物中分離出。
用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶是指可以將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的酶。作為逆轉(zhuǎn)錄酶，包括RAV(Rous associated virus)或AMV(Avianmyeloblastosis virus)等來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶、MMLV(Moloneymurine leukemia virus)等來源于鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，但不限定于這些。
作為用于PCR的耐熱性聚合酶，可以舉出Taq聚合酶，但不限定于此。
作為擴增的DNA的檢測方法，可以利用使用瓊脂糖凝膠的電泳，但不限定于此。
另外，本發(fā)明的試劑盒還包括記載了本發(fā)明的方法的說明書。
實施例1下面的實施例是說明本發(fā)明的例子，但本發(fā)明不限定于此。
以為了精確檢查、進行治療而到濱松醫(yī)科大學第1內(nèi)科住院并通過全大腸內(nèi)窺鏡已經(jīng)確認了存在大腸癌的患者30例、以及在大腸部位沒有腫瘤或炎癥變化(非大腸疾病)的患者22例作為對象。另外，從所有的患者取得了知情同意。
在采便后盡可能快速地將每1g糞便分裝到5ml管中，使用液氮凍結(jié)，在-80℃下保存。另外，為了比較對照，通過免疫學便潛血檢查法對各樣品測量便中的人血紅蛋白(Hb)。在治療前接受內(nèi)窺鏡檢查時將癌部位和正常部位的活檢材料用液氮進行凍結(jié)，然后將組織保存于-80℃下。然后，使用勻漿器、胍鹽和苯酚使其均質(zhì)化，用氯仿和乙醇提取全RNA。
使用ReverseScript II(注冊商標)(反應(yīng)液量20μl，和光純藥)，將1μg得到的RNA逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，使用Gene Taq(和光純藥)，通過巢式PCR擴增其中的一部分。使用4％瓊脂糖凝膠對得到的PCR產(chǎn)物進行電泳，用溴化乙錠(EB)染色。
另外，使用的引物在逆轉(zhuǎn)錄中為隨機引物，在PCR中，CEA為Gerhard(JJCO，1994)所報道的標記物，對于COX-2，使用的是獨自設(shè)計的。PCR以第1輪為20個循環(huán)，第2輪為25個循環(huán)進行。
將使用的引物顯示于下述中。
<CEA>
Forward 15′-TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG-3′Forward 25′-GGGCCACTGCTGGCATCATGATTG-3′Reverse5′-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3′<COX-2>
Forward 15′-CTGAAAACTCCAAACACAG-3′
Forward 25′-GCACTACATACTTACCCACTTCAA-3′Reverse5′-ATAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT-3′結(jié)果嘗試通過RT-PCR從大腸癌30例(早期癌3例、進展癌27癌)和對照組22例的糞便中檢測CEA、COX-2，得出以下結(jié)果。
在大腸癌30例中的全部例子和對照組22例中的21例中檢測出CEA。另外還發(fā)現(xiàn)，可以從兩者中提取能夠利用RT-PCR擴增的RNA。
在大腸癌30例中有27例(盲腸2/2、升結(jié)腸3/5、降結(jié)腸1/1、乙狀結(jié)腸7/7、直腸12/13、早期癌2/3、進展癌25/27)檢測出COX-2，而在對照組22例中，沒有檢測出1例(敏感度90％、特異度100％)。
在免疫學便潛血檢查法中，28例大腸癌中的23例22例和對照組中的3例為陽性(敏感度82.1％、特異度86.3％)。
在3例COX-2陰性大腸癌中，有1例免疫學便潛血檢查為陽性，2例為陰性。
免疫學便潛血檢查為陰性的5例大腸癌中有3例檢測出COX-2。
實施例2就從人糞便中得到的全RNA的量和分子量的分布對本發(fā)明的方法與Alexander的方法(非專利文獻6)進行了比較。作為對象，使用市售的RNA提取劑(アイソジエン，和光純藥)，從人的大腸癌組織中提取出全RNA。
將從各個樣品中提取出的全RNA的相同量加在瓊脂糖凝膠上跑電泳。
在道3(來源于人大腸癌組織的RNA)中可見的2條主要帶，表示28S和18SrRNA。另外，彌散狀的部分表示在得到的全RNA中含有各種高分子RNA。
在道2(通過本發(fā)明的方法的來源于糞便的RNA)中可見的2條主要帶，表示來源于腸內(nèi)細菌的23S和16SrRNA。另外，與道3相同，由于可見彌散狀的部分，所以在通過本發(fā)明的方法從糞便中得到的全RNA中，含有各種高分子RNA。
與此相對，道1的任何帶都沒有彌散，表示在樣品提取物中沒有含高分子RNA。
實際上，可以通過RT-PCR從道2的樣品中得到目的產(chǎn)物，而不能從道1的樣品得到PCR產(chǎn)物。
從本研究結(jié)果可知，利用本發(fā)明的方法從人糞便中提取的RNA可以通過RT-PCR進行擴增。另外通過RT-PCR從糞便檢測COX-2由于具有90％的敏感度和100％的特異性，所以可以證明與作為以往技術(shù)的免疫學便潛血法相比更出色。
另外，本發(fā)明的方法與報道的APC、K-ras或p53基因變異的檢測相比，檢測中需要的糞便的量少而且檢測敏感度高，所以可以大幅度節(jié)約檢測所需要的時間和勞力。
與以往技術(shù)的便潛血法是以從病變的所謂“出血”這種通常而間接的現(xiàn)象作為對象相比，本發(fā)明的方法由于是以作為致癌標記物的所謂COX-2表達這種特異而且直接的現(xiàn)象作為對象，所以通過本發(fā)明得到的數(shù)據(jù)，可以提供更高品質(zhì)的診斷。
因而，本發(fā)明的方法作為特異度和敏感度高的新式大腸癌的非侵襲性篩查方法，在臨床上極為有用。
序列表<110>靜岡技術(shù)特許組織(Shizuoka Technology Licensing Organization)<120>大腸癌標記物的檢測方法<130>KP-10665<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>設(shè)計引物<400>1tctggaactt ctcctggtct ctcagctgg29<210>2<211>24<212>DNA<213>人工
<220>
<223>設(shè)計引物<400>2gggccactgc tggcatcatg attg 24<210>3<211>32<212>DNA<213>人工<220>
<223>設(shè)計引物<400>3tgtagctgtt gcaaatgctt taaggaagaa gc32<210>4<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>設(shè)計引物<400>4ctgaaaactc caaacacag 19
<210>5<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>設(shè)計引物<400>5gcactacata cttacccact tcaa 24<210>6<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>設(shè)計引物<400>6ataggagagg ttagagaagg ct 2權(quán)利要求
1.一種方法，是包括下述工序的用于提取在用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法中使用的RNA的樣品的調(diào)制方法，所述的工序是a)在RNA分解酶抑制劑的存在下使采集的生物學樣品均質(zhì)化來調(diào)制懸濁物的工序，其特征在于，不包括從生物學樣品中分離細胞成分的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，凍結(jié)所采集的生物學樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的方法，其特征在于，RNA分解酶抑制劑是硫代氰酸胍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任意1項所述的方法，其特征在于，生物學樣品為糞便。
5.一種用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法，其特征在于，除了包括權(quán)利要求1～4中任意1項所述的方法以外，還包括下述工序b)從用于提取得到的RNA的樣品中提取RNA的工序、c)使提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄而得到cDNA的工序、d)擴增得到的cDNA的工序，和e)檢測擴增的cDNA的工序。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任意一項所述的方法，其特征在于，腫瘤標記物是COX-2。
7.一種試劑盒，是包括下述組分的、用于調(diào)制用于提取在用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法中使用的RNA的樣品的試劑盒，其中，所述的組分是a)在RNA分解酶抑制劑的存在下使采集的生物學樣品均質(zhì)化來調(diào)制懸濁物的組分，其特征在于，不包括從生物學樣品中分離細胞成分的組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，進一步包括凍結(jié)所提取的生物學樣品的組分。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或者8所述的試劑盒，其特征在于，RNA分解酶抑制劑是硫代氰酸胍。
10.根據(jù)權(quán)利要求7～9中任意一項所述的試劑盒，其特征在于，生物學樣品為糞便。
11.一種用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測試劑盒，其特征在于，進一步包括下述組分b)從用于提取得到的RNA的樣品中提取RNA的組分、c)使提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄而得到cDNA的組分、d)擴增得到的cDNA的組分，和e)檢測擴增的cDNA的組分。
12.根據(jù)權(quán)利要求7～11中任意一項所述的試劑盒，其特征在于，腫瘤標記物是COX-2。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法，是在RNA分解酶抑制劑的存在下使在采集后根據(jù)情況使用液氮立即凍結(jié)的生物學樣品均質(zhì)化，調(diào)制懸濁物，從得到的懸濁物中提取RNA，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，擴增得到的cDNA，檢測擴增的cDNA，其特征在于，不包括從生物學樣品中分離細胞成分的組分。由此，本發(fā)明提供一種具有超過以往的便潛血檢查的敏感度和特異度的非侵襲性且簡單的用于大腸癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法。
文檔編號G01N33/48GK1759317SQ0382617
公開日2006年4月12日 申請日期2003年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月19日
發(fā)明者金岡繁 申請人:財團法人浜松科學技術(shù)研究振興會