專利名稱：納米級光學熒光標記及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于金屬簇熒光的新型熒光/發(fā)光探針的開發(fā)，其制備方法，及其使用方法。
背景技術(shù)：
單分子熒光顯微技術(shù)研究會帶來一個極限，其中微弱信號必須在實質(zhì)上為O的本底上觀察。這種依靠高強度激光激發(fā)強發(fā)射和強力熒光團的光學方法需要非常有效的本底排斥。依靠引入人工標記來鑒定特定目的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)，基于熒光的方法有兩個另外的問題—光漂白(由于探針失效而丟失信號)和自發(fā)熒光(來自生物介質(zhì)中天然物質(zhì)自然存在的本底熒光)。盡管有這些問題，當使生物介質(zhì)成像的時候，熒光顯微技術(shù)仍然是一種具有單分子和化學靈敏度潛力的主要光學方法。
大多數(shù)體外熒光標記是經(jīng)由標準的化學偶聯(lián)法來做的或使N-琥珀酰亞氨酸酯綴合的染料同游離的、溶劑-暴露的胺(常在賴氨酸殘基上)偶聯(lián)，或者使馬來酰亞胺綴合的染料同硫醇(在天然存在或基因引入的溶劑-暴露的半胱氨酸上)偶聯(lián)。這兩種化學偶聯(lián)法在使小的強熒光染料附著在目的蛋白質(zhì)上仍然是非常有用的。這種熒光生物材料因而足以適用于體外單分子研究，或者經(jīng)由微量注射或其它膜轉(zhuǎn)運法高濃度地再引入細胞里來做全細胞內(nèi)目的蛋白質(zhì)的整體熒光研究。不僅蛋白質(zhì)功能可能被熒光標記的粒徑和附著點兩者所改變，而且往往由于所用的化學偶聯(lián)法使熒光標記的位點不能確切知道。因此，一種盡可能小的基因編程標記(smallest possible genetically programmed lable)就會是非常有用的。
而且，在生物系統(tǒng)中，來自黃素、卟啉、和其它有微弱熒光的天然物質(zhì)的自發(fā)熒光本底會產(chǎn)生一個干擾激光-誘導(dǎo)的熒光信號的大本底。由于這些問題，生物系統(tǒng)里少量拷貝的蛋白質(zhì)的動態(tài)特性研究要求開發(fā)新的熒光探針，該探針強烈吸收和發(fā)射且無明顯的光漂白，以致用極微弱的斷續(xù)照明就能輕易地長久看到熒光。這種照明，較之激發(fā)微弱的本底信號，將能優(yōu)先激發(fā)目的熒光團。而且，該微弱照明會將光毒性效應(yīng)減至最小來保護生物生存力。遺憾的是，單分子的靈敏度尚難達到像這樣高的體內(nèi)研究本底，且即使在較低的體外研究本底上也往往難以看到熒光。
由于信噪限制因素，伴有其各種麻煩的單分子研究就被限制在熒光法測定方面。當單分子方法在使總體均值“脫殼(peeling back)”以檢查環(huán)境、機制異質(zhì)性方面有效的同時，現(xiàn)有的技術(shù)仍需要昂貴的基于激光的裝置，專門的合成方法，且基本上仍被現(xiàn)有熒光標記的不良光學性能或生物不相容性所限制。
若干主要的實驗已明確證明單分子顯微技術(shù)有能力探索導(dǎo)致生物活性的關(guān)鍵步聚(Lu等人，Science 1998，2821877-1882；Dickson等人，Nature 1997，388；355-358；Funatsm等人，Nature 1995，374555-59；Ha等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA 1996，93，6264-6268；Vale等人，Nature 1996，380451-453；Deniz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA2000，975179-5184；Ha等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96893-898；Harada等人，Biophys.J.1999，76709-715；Kinosita，Biophys.J.2000，78149Wkshp)。在個體運動蛋白的移動的研究種，對生物力學循環(huán)里蛋白功能和子步的機械認識都能直接可視化，而無需進行麻煩的外部同步化(Funatsu等人，Nature 1995，374555-59；Vale等人，Nature 1996，380451-453；Kinosita，BiopHys.J.2000，78149Wkshp；Yanagida等人，Curr.Opin.Cell Biol.2000，1220-25)。甚至已經(jīng)探測了生物分子折疊以揭示導(dǎo)向錯誤折疊和折疊狀態(tài)的途徑(Deniz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA2000，975179-5184；Ha等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96；893-898)。因為已經(jīng)在單分子水平上開發(fā)了定向法(Bartko，& Dickson，J.Phys.Chem.B 1999，1033053-3056；Bartko &Dickson，J Phys.Chem.B 1999，10311237-11241；Bartko等人，Chem.Phys.Lett.2002，358459-465；Hollars & Dunn，J.Chem.Phys.2000，1227822-7830)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)(Weiss，Science1999，2831676-1683)，更多的實驗?zāi)壳岸际强赡茏龅降摹＿z憾的是，在所有的單分子研究中，研究人員都只限于去做目的蛋白的人工熒光標記，且限于體外觀察。由于有機體熒光團的大熒光本底和不良的光穩(wěn)定性，標記蛋白質(zhì)向細胞內(nèi)的再引入仍不能產(chǎn)生可行的體內(nèi)單分子信號。
單個分子也有許多固有的不良性能限制了實驗的時間長度。激發(fā)速率必須很高從而以合理的時間分辨率(毫秒～秒)和良好信噪比產(chǎn)生生物學相關(guān)的信息。因為最好的有機熒光團的吸收截面(即消光系數(shù)ε)在室溫下只有～10-16cm2(即ε～105M-1cm-1)(Macklin等人，Science1996，272255-258)，須使用高強度激光激發(fā)以供單分子熒光研究。而且，有機體分子在光化學分解前只能耐得住～107激發(fā)周期(Dickson等人，Nature 1997，388355-358；Lu & Xie，Nature1997，385143-146；Macklin等人，Science 1996，272255-258)。在106激發(fā)/秒(使用～5kW/cm2激發(fā)強度和常用的5％的采集/檢測效率)，這把時間分辨率限制在～1ms(帶有理想化的信噪比～7)，并且在光漂白前跟蹤個體分子的平均總時間為～10秒鐘。盡管對于真正生物相關(guān)時間長度來說這可能是大量的數(shù)據(jù)，但是許多激發(fā)周期在采集數(shù)據(jù)之前被尋找目的分子所耗費。顯然，減少氧氣往往能增加光漂白前的時間，而有機染料的光穩(wěn)定性和總亮度限制了全部生物單分子實驗。因而熒光團性能的提高將是生物系統(tǒng)中的全部單分子光學研究持續(xù)成功的關(guān)鍵。
最近已提出并證明水溶性II-VI量子點(quantum dot)可以作為生物標記(需要使用與有機熒光團類似的化學偶聯(lián))(Brucher等人，Science1998，2812013-2016；Chan & Nie，Science 1998，2812016-2018；Zhang等人，Analyst 2000，1251029-1031)一些材料，諸如有ZnS外敷層(起保護和穩(wěn)定作用)的CdSe，具有粒徑依賴型的光學性能并能以很窄的粒徑分布合成(Murray等人，Z，Phys，D-Atoms Mol.Clusters1993，26S231-S233；Murray等人，J.Am.Chem.Soc.1993，1158706-8715；Peng等人，Nature 2000，40459-61)。這些納米材料的強吸收，光譜穩(wěn)定性、和可由尺寸調(diào)節(jié)的窄發(fā)射，意味著它們很可能用于生物標記，只要對ZnS外層再做化學處理使這些材料成為水溶性的(Rodriguez-Viejo等人，J.Appl.Phys.2000，878526-8534；Dabbousi等人，J.Phys.chem.B1997，1019463-9475)。因為表面鈍化在總量子點光學性能里是非常重要的，因此要把很多的注意力用在量子點的表面鈍化和衍生化上，以使之以可預(yù)知的光學響應(yīng)能再現(xiàn)地結(jié)合到蛋白質(zhì)上(Bruchez等人，Science1998，2812013-2016；Chan & Nie，Science 1998，2812016-2018；Rodriguez-Viejo等人，J.Appl.pHys.2000，878526-8534；Dabbousi等人，J.Phys.Chem.B 1997，1019463-9475；Nirmal & Brus，Acc.Chem.Res.1999，32407-414；Nirmal等人，Nature 1996，383802-804)。事實上，水溶解和表面鈍化現(xiàn)在才開始取得成功(Dubertret等人，Science2002，2981759-1762；Jaiswal等人，Nat.Biotechnol.2003，2147-51；Wu等人，Nat.Biotechnol.2003，2141-46；Sutherland，Curr.Opin.SolidState Mat.Sci.2002，6365-370；Gao等人，J.Biomed.Opt.2002，7532-537；Mattoussi等人，J.Am.Chem.Soc.2000，12212142-12150)。
盡管因其明亮和很窄的粒徑依賴型發(fā)射而大有前途，可是用CdSe作生物標記依然存在許多問題。它們的合成方法需要用高毒性前體和高溫，它們的大小與它們所要標記的蛋白質(zhì)的大小相當(直徑2-6nm)，它們同樣需要目的蛋白的外部標記，以及可能要把標記的蛋白再引入細胞。因此，盡管強烈的振蕩強度使量子點借助弱汞燈的激發(fā)就能很容易觀察到，從而避免大量額外的更弱的吸收性自發(fā)熒光本底，可是，對體內(nèi)或體外單分子研究來說，它們?nèi)匀徊皇且粋€理想的解決辦法。
理想地，人們需要一種表達在目的蛋白上或其附近的盡可能小的基因編程標記。這一理想的標記必須有足夠強的吸收和發(fā)射，以及顯著的光穩(wěn)定性，從而即使在高本底熒光存在下也能以高時間分辨率持久地觀察單個分子。這樣的熒光探針現(xiàn)在還沒有。目前，可用的最好選擇由于僅由氨基酸，綠色熒光蛋白(GFP；Dickson等人，Nature1997，388355-358；Heim，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 1994，9112501-04；Ormo等人，Science 1996，2731392-5；Chattoraj等人，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 1996，93362-67；Brejc等人，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 1997，942306-11；Cubitt等人，Trends in Biochem.Sci.1995，20448-55；Kain& Kitts，Methods Mol.Biol.1997，63305-24)以及DsRed組成(Gross等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA2000，9711990-11995；Jakobs等人，F(xiàn)EBSLett.2000，479131-135；Wall等人，Nat.Struct，Biol，2000，71133-1138；Yarbrough等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA2001，98462-467)，是極好的體內(nèi)標記，已由許多作者在體外研究中于單分子水平上觀察到(Dickson等人，Nature 1997，388355-358；Malvezzi-Campeggi等人，BiopHys.J.2001，811776-1785；Garcia-Parajo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA2000，977237-7242；Cotlet等人，Chem.Phys.Lett.2001，336，415-423；Lounis等人，J.Phys.Chem.B 2001，1055048-5054；Garcia-Parajo等人，Pure Appl.Chem.2001，73431-434；Garcia-Parajo等人，Chem Phys Chem 2001，2347-360；Garcia-Parajo等人，Proc，Natl.Acad.Sci.，USA 2001，9814392-14397；Blum等人，Chem.Phys.Lett.2002，362355-361)。
在最早的這批研究之一中，當用光子使GFP生色團在兩種不同光可達狀態(tài)間轉(zhuǎn)換時，研究了GFP的閃爍和光學轉(zhuǎn)換能力(Dickson等人，Nature 1997，388355-358)。遺憾的是，盡管GFP能特異性地附著于任何蛋白質(zhì)的N或C末端并體內(nèi)表達為強熒光標記，但是仍然存在問題，特別是在單分子水平上。GFP為27kD或直徑為～4nm(Ormo等人；Science1996，2731392-5；Cubitt等人，Trends in Biochem.Sci.1995，20448-55)，因而對其所附著的蛋白質(zhì)是一大干擾。而且，只有當GFP折疊成其最終構(gòu)象才出現(xiàn)發(fā)射，該過程時間可達約1小時，盡管GFP標記的例子已在不同細胞的所有區(qū)域里報道過，但是有時候在一組給定的條件之下GFP并不能正確折疊(Heim，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1994，9112501-04；Cubitt等人，Trends in Biochem.Sci.1995，20448-55)。而且，當考慮到單分子研究時，其發(fā)射與自發(fā)熒光本底明顯重疊，而其發(fā)射強度只和標準外源性有機染料相當，從而使體內(nèi)單分子研究面臨真正挑戰(zhàn)。盡管基本上對氧非常不敏感，其一般也在～107激發(fā)周期后漂白，與標準有機染料類似(Dickson等人，Nature 1997，388355-358)。DsRed部分克服了與自發(fā)熒光本底重疊的問題，但是盡管DsRed相對于GFP的紅移發(fā)射是一個優(yōu)點，其相當?shù)臒晒鈴姸纫约凹词乖跇O低濃度下四重化的趨勢可能進一步限制作為一種理想的生物標記的應(yīng)用(Lounis等人，J.Phys.Chem.B 2001，1055048-5054；Garcia-Parajo等人，Chem PhysChem 2001，2347-360；Verkhusha等人，J.Biol.Chem.2001，27629621-29624；Sacchetti等人，F(xiàn)EBS Lett.2002，52513-19)。所以，理想的標記應(yīng)該同時具有無機量子點的強吸收、發(fā)射和光穩(wěn)定性以及有機染料的小尺寸和簡單附著的化學性質(zhì)，或優(yōu)選的是象GFP和DsRed那樣，能在體內(nèi)表達為附著在任何目的蛋白質(zhì)的單分子生物標記，而無需首先純化、標記和再注入蛋白質(zhì)。
總之，盡管現(xiàn)有的標記方法和材料已使數(shù)不清的整體研究和許多體外單分子實驗成為可能，但是單分子實驗仍然受到即使是最好的熒光探針的不利條件的限制。本領(lǐng)域中需要新的單分子探針，其具有大大提高的光穩(wěn)定性，在弱照射下更強的吸收和發(fā)射，易于合成和易于與蛋白質(zhì)綴合，以及可調(diào)的發(fā)射顏色。理想地，這種熒光標記也應(yīng)該是基因編程的，以便待研究的蛋白質(zhì)能夠直接在細胞內(nèi)進行標記，而無需首先進行過度表達、純化、標記、然后再重新引入細胞。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的在于克服、或至少減輕一種或多種與現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)的困難或缺點。本發(fā)明部分滿足那種鑒定新的、獨特的強熒光標記的需求，該熒光標記可在單分子或大濃度場合下分子的簡易研究之用。本發(fā)明的組合物包含水溶性熒光標記，該熒光標記包含包囊化的貴金屬納米簇。在一個實施方式中，貴金屬納米簇包含2～8個貴金屬原子。在優(yōu)選的實施方式中，貴金屬選自金、銀、和銅。在某一實施方式中，該貴金屬納米簇具有可變的電荷。
優(yōu)選的是，該熒光標記顯示偏振發(fā)射光譜并顯示偶極發(fā)射模式。熒光標記的光譜發(fā)射提供有關(guān)生物狀態(tài)的信息，其中該生物狀態(tài)選自生物部分的定量和定性存在；生物部分的結(jié)構(gòu)、組成和構(gòu)象；生物部分在周圍環(huán)境中的定位；生物部分間的相互作用，生物化合物結(jié)構(gòu)方面的變化和在細胞過程中的變化。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的熒光標記能在約3到約8的pH范圍內(nèi)發(fā)射熒光，該貴金屬納米簇在光漂白前發(fā)射＞約106、＞107、＞108、或＞109個光子。在一個實施方式中，在納米簇光譜激發(fā)最大值處，包囊化的貴金屬納米簇的熒光量子產(chǎn)量大于約1％，飽和強度在約1-1000W/CM2范圍。
在某些優(yōu)選的實施方式中，用樹枝狀分子包囊貴金屬納米簇。在一個實施方式中，樹枝狀分子包括聚(酰胺胺)，其中，該聚(酰胺胺)樹枝狀分子選自0級、1級、2級、3級、4級、和更高級聚(酰胺胺)樹枝狀分子。在另一實施方式中，該聚(酰胺胺)樹枝狀分子是一種2級、或4級羥基封端的聚(酰胺胺)樹枝狀分子。
在某些其它的優(yōu)選實施方式中，貴金屬納米簇包囊在肽中。優(yōu)選的是，該肽的長度為約5～500個氨基酸。在另外的實施方式中，肽的長度為約5-20個氨基酸。在進一步的實施方式中，該肽包括SEQ ID No.1所定義的多肽序列。
本發(fā)明提供一種此處所述能發(fā)熒光的樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇之制備方法，它包括下列步驟(a)把樹枝狀分子、含貴金屬的水溶液、和水性溶劑混合以產(chǎn)生混合溶液；(b)添加還原劑；(c)接著添加足量酸性化合物把混合溶液調(diào)至中性范圍或生理pH值；和(d)混合調(diào)好pH值的混合溶液使樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇得以形成。本發(fā)明還提供一種此處所述能發(fā)熒光的肽包囊化的的貴金屬納米簇的制備方法，它包括下列步驟；(a)把肽、含貴金屬的水溶液和水性溶液混合以產(chǎn)生混合溶液；(b)添加還原劑；(c)添加足量酸性化合物把混合溶液調(diào)至中性范圍的pH值；和(d)混合調(diào)好pH值的混合溶液使肽包囊化的貴金屬納米簇得以形成。
本發(fā)明還包括為研究生物狀態(tài)而使用此處所述熒光標記的方法。本發(fā)明提供一種監(jiān)測目的分子的方法，它包括(a)把含包囊化的貴金屬納米簇的水溶性熒光標記附著在目的分子上，其中熒光標記在某一可見光或近紅外波長范圍內(nèi)發(fā)出發(fā)射光譜；和(b)檢測熒光標記的發(fā)射光譜。在某些實施方式中，該方法還包括把連接體分子附著在包囊化的貴金屬納米簇上的起始步驟，其中連接體分子能使熒光標記附著在目的分子上。在一個優(yōu)選的實施方案中，目的分子存在于生物樣品中。在一個優(yōu)選的實施方式中，貴金屬納米簇包囊在肽中。優(yōu)選的是，該肽在細胞里表達。在一個實施方式中，該肽包含融合多肽。
附圖簡述

圖1A提供了銀/樹枝狀分子水溶液的UV-可見光吸收光譜。(1)顯示了大的非熒光樹枝狀分子包囊化的銀納米顆粒的強等離子吸收(398nm)特性，該納米顆粒由樹枝狀分子主體里的銀離子經(jīng)NaBH4還原制成(1∶12樹枝狀分子∶Ag)。(2)顯示了未還原的非熒光1∶3(樹枝狀分子∶Ag)溶液在光活化前的吸收光譜。(3)顯示了同一溶液在光活化/光還原后產(chǎn)生強熒光銀納米點(nanodot)。圖1B提供了光活化G2-OH PAMAM(MW3272amu)-AgNO3溶液的電霧化電離質(zhì)譜。Agn納米點峰被Ag原子質(zhì)量(107.8amu)隔開，僅顯現(xiàn)在有熒光的光活化納米點溶液里。
圖2A-D顯示了汞燈激發(fā)(450～480nm，30W/cm2，標尺＝15μm)落射熒光顯微技術(shù)圖象，證明水性樹枝狀分子包囊化的銀納米點的時間依賴型光活化。各300msCCD幀顯示隨照明時間增加(0秒、0.3秒、1.5秒、和6秒)熒光也增強。圖2E顯示了水溶液中表面結(jié)合的銀納米點的發(fā)射模式。在弱汞燈激發(fā)下可輕易觀察到指示單個分子的各向異性發(fā)射模式和熒光閃爍。
圖3顯示了室溫單個納米點共聚焦熒光光譜(476-nm Ar+激光激發(fā)，496-nm長通濾波器，帶有300-mm單色儀)。5個典型納米點的最大發(fā)射波長為533nm、553nm、589nm、611nm和648nm。整體銀納米點溶液的總體熒光光譜(頂部)基本上由這5個光譜型組成，它們與在AgO表面上的那些難以區(qū)分。
圖4A顯示了單個納米點的熒光壽命，圖5B顯示了典型的樹枝狀分子-包囊化的納米點的飽和強度測定。圖5A中，400-nm激發(fā)的壽命受300ps儀器響應(yīng)的限制，而在去褶合后顯示亞-100ps組分(92％)和1.6納秒組分(8％)。圖4B中，飽和發(fā)生在～400W/cm2(使用偏共振、514.5-nm激發(fā))，帶有各種納米點間量子產(chǎn)量變化而產(chǎn)生的總強度差異。作為比較，有機染料DiIC18的飽和強度為10kW/cm2。與DiI相比，得到一個熒光量子產(chǎn)率為～30％的較低估算量。
圖5A顯示了水性金納米點和純樹枝狀分子溶液的UV-可見光吸收光譜。圖5B表明扣除A中的吸收光譜，顯出PAMAM包囊化的Au納米點的384-nm吸收。
圖6顯示了G4-OH PAMAM包囊化的金納米簇在室溫下的激發(fā)和發(fā)射光譜。“1”表示激發(fā)光譜，“2”表示發(fā)射光譜。
圖7A顯示了水溶液里金納米點的壽命測定。經(jīng)過擬合的儀器響應(yīng)和納米點數(shù)據(jù)顯示7.5ns(93％)和2.8μs(7％)的壽命。圖7B顯示了G2-OHPAMAM包囊化的金納米點的ESI質(zhì)譜，G2-OH+Au8+5H2O+H+的預(yù)期m/z為4940。
圖8顯示了PAMAM樹枝狀分子包囊化的銅納米簇在室溫下的激發(fā)和發(fā)射光譜?！?”表示激發(fā)譜，“2”表示發(fā)射譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供包括熒光標記的組合物、該組合物的制備方法及其使用方法。本發(fā)明的組合物包含能發(fā)熒光的包囊化的貴金屬納米簇。上述熒光標記提供超過已知熒光標記的某些優(yōu)越性，包括尺寸小、在弱光照下更強的吸收和發(fā)射、易于合成和綴合于蛋白質(zhì)、可調(diào)的發(fā)射顏色、和可以選擇給標記做基因編程以便能在細胞內(nèi)直接標記蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供的組合物包含水溶性熒光標記，該熒光標記包含包囊化的貴金屬納米簇。在一個實施方式中，貴金屬納米簇包含2～8個貴金屬原子。在優(yōu)選的實施方式中，貴金屬選自金、銀、和銅。
在一個實施方式中，該熒光標記顯示偏振發(fā)射光譜和/或偶極發(fā)射模式。熒光標記的發(fā)射光譜提供有關(guān)生物狀態(tài)的信息，其中該生物狀態(tài)選自生物部分的定量和定性存在；生物部分的位置、結(jié)構(gòu)、組成、和構(gòu)象；生物部分在周圍環(huán)境中的定位；生物部分間的相互作用，生物化合物的結(jié)構(gòu)改變和細胞過程的改變。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的熒光標記能在約3到約8的pH范圍內(nèi)發(fā)熒光，該貴金屬納米簇在光漂白前發(fā)射大于約106個光子。在另一實施例方式中，該貴金屬納米簇在光漂白前發(fā)射大于約107、108、或大于109個光子。
在某些優(yōu)選的實施方式中，用樹枝狀分子包囊化貴金屬納米簇。在一個實施方式中，樹枝狀分子包括聚(酰胺胺)，其中聚(酰胺胺)樹枝狀分子選自0級、1級、2級、3級、4級、和更高級聚(酰胺胺)樹枝狀分子。在另一實施方式中，該聚(酰胺胺)樹枝狀分子是一種2級、或4級羥基封端的聚(酰胺胺)樹枝狀分子。
在某些其它優(yōu)選實施方式中，貴金屬納米簇包囊在肽中。優(yōu)選的是，該肽的長度為約5～500個氨基酸。在其它的實施方式中，該肽的長度為約5～20個氨基酸。在另外的實施方式中，該肽包括如SEQ ID NO1所定義的多肽序列。
本發(fā)明提供一種用樹枝狀分子包囊的貴金屬納米簇的制備方法，它包括下列步驟(a)把樹枝狀分子、含貴金屬的水溶液和水性溶劑混合以產(chǎn)生混合溶液；(b)添加還原劑；(c)添加足量酸性化合物把混合溶液調(diào)至中性范圍pH或生理pH；和(d)混合調(diào)好pH的混合溶液以使樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇得以形成。本發(fā)明還提供一種能發(fā)熒光的肽包囊化的貴金屬納米簇的制備方法，它包括下列步驟(a)把肽、含貴金屬的水溶液和水性溶液混合以產(chǎn)生混合溶液；(b)添加還原劑；(c)添加足量酸性化合物把混合溶液調(diào)至中性范圍或生理pH；和(d)混合調(diào)好pH的混合溶液使肽包囊化的貴金屬納米簇得以形成。
本發(fā)明還包括為研究生物狀態(tài)而使用該熒光標記的方法。本發(fā)明提供一種監(jiān)測目的分子的方法，它包括；(a)把含包囊化的貴金屬納米簇的水溶性熒光標記附著在目的分子上，其中該熒光標記在某一可見光和近紅外波長范圍內(nèi)發(fā)出發(fā)射光譜；和(b)檢測該熒光標記的發(fā)射光譜。在某一實施方式中，該方法還包括把連接體分子附著在包囊化的貴金屬納米簇上的起始步驟，其中該連接體分子能使熒光標記附著在目的分子上。在一個優(yōu)選的實施方式中，目的分子存在于生物樣品中。在一個優(yōu)選的實施方式中，貴金屬納米簇包囊在肽中。優(yōu)選的是，該肽在細胞里表達。在一個實施方式中，該肽包含融合多肽。
此處所述的強熒光水溶性貴金屬納米簇(納米點)能借助弱汞燈的激發(fā)以單個納米點的形式輕易地觀察到，這是因其具有極強的吸收和發(fā)射能力(Peyser等人；Science 2001，291103；Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，1067725)。借助可與更大的量子點相比的吸收強度，這些強熒光和非常光穩(wěn)定的納米點，在一個實施方式中，可用作單分子和多分子熒光生物標記。這種穩(wěn)定、生物相容性的單個貴金屬納米簇的開發(fā)，大大促進了這些光活化納米材料作為極小的明亮的熒光團的應(yīng)用。本發(fā)明如此明亮的、容易合成的、強有力的納米材料將會擴大單分子方法的可利用性，因為它大大降低了實驗的費用和復(fù)雜性，提供了光激活的熒光團，該受激熒光團能從單個分子產(chǎn)生比現(xiàn)有技術(shù)多幾個數(shù)量級的光子。
此處所述的本發(fā)明的一個方面提供一種光活化生物標記的制造和表征，該生物標記極為強力，非常明亮，同時很小又生物相容，適用于體外和體內(nèi)特異性標記，并只借助弱汞燈的激發(fā)就容易在單分子水平上觀察到。比最好的有機染料至少明亮20倍，這種亮度和合成的簡易性使研究人員能以廉價的標準燈型熒光顯微鏡輕易地做單分子實驗。如此處所述，產(chǎn)生非常明亮的、容易在單分子水平觀察到的化合物只需幾個到幾十個貴金屬原子。因此，包囊貴金屬納米簇的合適的生物相容性支架(通常是樹枝狀分子、基因優(yōu)化的肽，或任何其它合適的包囊材料)使它們很有用，并使它們成為潛在的盡可能小的體內(nèi)和體外標記。
除非另行指出，此處所用的術(shù)語應(yīng)按相關(guān)領(lǐng)域里普通技術(shù)人員的傳統(tǒng)使用來理解。除一些術(shù)語的定義提供于下以外，分子生物學的常用術(shù)語的定義也可在下列參改文獻中找到Rieger等人，1991 Glossary ofgeneticsClassical and molecular，5th Ed.BerlinSpringer-Verlag；Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel等人，Eds，Current Protocots，a joint venture between Greene PublishingAssociates，Inc.and John Wiley Sons，Inc.(1998 Supplement)。應(yīng)理解的是，說明書和權(quán)利要求書中所用的“a”或“an”可以表示單數(shù)或復(fù)數(shù)，取決于它所處的上下文。例如“細胞”意思可以是“至少一個或至少一種細胞”。
通過參看本發(fā)明優(yōu)選實施方式的下列詳細描述和此處的各實施例，可更容易地理解本發(fā)明。但是，在公開和描述本發(fā)明的化合物、組合物、和方法之前，應(yīng)理解的是，本發(fā)明不局限于特定的貴金屬、特定的多肽，特定的樹枝狀分子，特定的條件，或特定的方法等等，因為它們顯然可以變化，并且對其的大量修改和變動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。同樣應(yīng)理解的是，此處所用的術(shù)語只是為了描述特定的實施方式而不是用來進行限制本發(fā)明的。
正如此處所用，“包囊材料”是指一種基質(zhì)(substrate)，它能附著于或物理性結(jié)合于一個或多個貴金屬納米簇分子上。包囊材料能提供一種把貴金屬納米簇間接附著于目的分子上的手段，并能保護貴金屬納米簇免于環(huán)境影響。所述附著或連接是借助于共價鍵、氫鍵、吸附、吸收、金屬鍵、范德華力或離子鍵，或者其任何組合。正如此處所用，“包囊化的”是指一個或多個貴金屬納米簇分子能物理性結(jié)合于或包含在包囊材料里，部分或完全分散到整個包囊材料中，或附著或連接于包囊材料上，或其任一組合，其中所述附著或連接是借助于共價鍵、氫鍵、吸附、吸收、金屬鍵、范德華力或離子鍵、或其任何組合。
本發(fā)明包括的貴金屬納米簇可用任何合適的包囊材料來包囊，包囊材料包括，但不局限于樹枝狀分子、多肽，表面活性劑、和非樹枝狀分子聚合物。在一個實施方式中，樹枝狀分子是PAMAM樹枝狀分子。在另一實施方式中，多肽包含長度為5～500個氨基酸的序列。在又一實施方式中，多肽包含抗體。
正如此處所用，涉及樹枝狀分子時，例如“包囊化的”是指一個或多個貴金屬納米簇分子能物理性結(jié)合于或包含在樹枝狀分子的核心里，部分或完全分散到整個樹枝狀分子中，或者附著于或連接于樹枝狀分子，或其任一組合，其中該附著或連接是借助于共價鍵、氫鍵、吸附、吸收、金屬鍵、范德華力或離子鍵，或其任一組合。由于樹枝狀分子的大小、形狀和官能團密度可以借助熟知的方法加以精確控制，因此有許多方法可以將被運載物質(zhì)(即貴金屬納米簇)結(jié)合在樹枝狀分子上。例如，(a)在被運載物質(zhì)和實體(通常為位于樹枝狀分子表面或其附近的官能團)之間可有共價、庫倫、疏水、或螯合等類型的結(jié)合；(b)在被運載物質(zhì)和位于樹枝狀分子內(nèi)部的部分之間可有共價、庫倫、疏水、或螯合等類型的結(jié)合；(c)樹枝狀分子可制成其內(nèi)部主要為空腔的形式，可供在該內(nèi)部(空腔)中包含(例如，物理性包含于或者結(jié)合在致密的星形樹枝狀分子的內(nèi)部部分)被運載物質(zhì)之用，(例如，在樹枝狀分子里由金屬離子的螯合以及完全或不完全還原成零價態(tài)或非零價態(tài)所產(chǎn)生的磁性或順磁性核心或結(jié)構(gòu)域)，這些含有磁性內(nèi)部的樹枝狀分子可用于獲得各種生物活性實體，該實體借助磁體等能與各種樹枝狀分子表面復(fù)合，其中被運載物質(zhì)的釋放可以可選擇地用擴散控制部分擠壓樹枝狀分子表面來控制；或(d)可利用上述現(xiàn)象的各種組合。
此處所用的術(shù)語“貴金屬”是指選自金、銀、銅，以及鉑族金屬(PGM)鉑、鈀、鋨、銥、釕、和銠的元素組。在某些優(yōu)選的實施方式中，貴金屬選自金、銀、和銅。在其它優(yōu)選的實施方式中，貴金屬是銀。在其它優(yōu)選的實施方式中，貴金屬是金。在其它優(yōu)選的實施方式中，貴金屬是銅。
正如此處所用，“納米簇”是指一種2～27個金屬原子的締合體(association)。制造的納米簇是已知的，并且在催化劑、陶瓷、半導(dǎo)體和材料科學以及其它領(lǐng)域中變得越來越重要。它們的重要性歸因于納米簇中表面原子相對于內(nèi)部原子的高比例。這產(chǎn)生了一些特性，如高的表面反應(yīng)性、增加的硬度、產(chǎn)率和強度、降低的延展性、低溫下的液體狀性能、和與尺寸相關(guān)的化學、物理、和/或量子效應(yīng)(這些效應(yīng)都與其宏觀對應(yīng)物的性能不同)。在其最小的組成單元，元素由單個原子組成。分子由幾個原子的簡單聚集體組成，而金屬和其它粗晶固體包括向外連續(xù)延伸的三維原子陣列，即單晶或多晶晶格。原子和分子的尺度用埃來度量，1埃為10-10m或0.1nm。微晶固體諸如金屬中的晶疇一般用微米來度量。納米簇處于簡單原子態(tài)到納米晶態(tài)的過渡段，其直徑在約0.1到約3nm范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，此處所述的納米簇包括大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、或27個原子。在其它優(yōu)選的實施方式中，納米簇包括約2～27個原子，約2～25個原子，約2～20個原子，約2～15個原子，約2～10個原子，或者約2～8個原子。優(yōu)選包囊于包囊材料諸如樹枝狀分子或肽里的納米簇的大小可取決于所用金屬的種類、想要的發(fā)射顏色、和特定的用途。
正如此處所用，“納米顆粒”定義為一種直徑為約3到約100納米的粒子，具有任意大小、形狀或形態(tài)，并包含此處定義的貴金屬。
正如此處所用，“納米點”是一種貴金屬納米簇，它包囊在諸如樹枝狀分子或肽之類的包囊材料里，其中包囊化的貴金屬納米簇能在低激發(fā)強度下發(fā)熒光。優(yōu)選的是，在納米簇最大激發(fā)下，包囊化的貴金屬納米簇的熒光量子產(chǎn)率大于約1％，其飽和強度在約1～1000W/cm2范圍內(nèi)。在某些實施方式中，熒光量子產(chǎn)率大于約2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、或更高。在某些實施方式中，飽和強度為約1～1000W/cm2、約10～800W/cm2、或約10～500W/cm2。最大激發(fā)因納米簇而異，并至少取決于納米簇中金屬原子的種類和數(shù)目。最大激發(fā)可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用本領(lǐng)域熟知的方法不費力地測定。
正如此處所用，術(shù)語“飽和強度”是指使分子的吸收飽和且與激發(fā)強度不再成線性關(guān)系時的強度。在分子非線性吸收的飽和強度時，多光子吸收不再取決于那種由非線性相互作用的能量產(chǎn)生的強度。量子產(chǎn)率定義為發(fā)射光子數(shù)與吸收光子數(shù)之比。
正如此處所用，術(shù)語“水溶性”是指在水溶液中溶解和/或形成懸浮體的能力。盡管熒光標記可以明顯溶于水溶液，但它在水溶液中至少是暫時可分散的或能形成懸浮體。
正如此處所用，“熒光”或“發(fā)熒光的”是指一種基于某些分子在不同波長吸收和發(fā)射光線的能力的物理現(xiàn)象。在第一波長光(光子)的吸收后為第二波長和不同能量光子的發(fā)射。正如此處所用，“熒光標記”就是這樣的分子，它在第一波長吸收光，在第二波長發(fā)射不同能量的光子。正如此處所用，“熒光標記”與“發(fā)光標記”可互換地使用，而“發(fā)熒光的”和“熒光”分別與“發(fā)光的”和“發(fā)光”可互換地使用。照這樣，熒光包括磷光和拉曼發(fā)射，并且所有發(fā)射都由術(shù)語“發(fā)光”表示。正如此處所用，“飽和熒光”是指在所有入射強度下分子發(fā)熒光的能力。優(yōu)選的是，熒光標記包括包囊化的貴金屬納米簇。優(yōu)選的是，本發(fā)明的熒光標記是在低激發(fā)強度(諸如由汞燈提供)激發(fā)時發(fā)熒光的。優(yōu)選的是，低激發(fā)強度為約30W/cm2(～460nm)。在其它實施方式中，激發(fā)強度可為＜1W/cm2到最高10kW/cm2(激發(fā)波長約330nm～900nm)。激發(fā)強度的變化至少取決于納米簇的大小和構(gòu)成納米簇的金屬，并可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用本領(lǐng)域熟知的方法不費力地測定。盡管此處所述的熒光標記能在諸如用弱汞燈之類的低激發(fā)能量激發(fā)時發(fā)出熒光，但在一個實施方式中，當熒光標記用激光活化時也能發(fā)熒光。
可測定本發(fā)明熒光標記的發(fā)射光譜。原子和原子(或分子)的集合能夠借助吸收或發(fā)射能級間的能量差，依據(jù)量子力學在電子能級之間躍遷。發(fā)射或吸收光的波長使光子帶有兩個軌道之間的能量差。該能量可由普朗克常數(shù)與光速之積(hc)除以光的波長來算出。這樣，某個原子或原子集合只能吸收或發(fā)射那些取決于原子精細結(jié)構(gòu)的特定波長(或相應(yīng)的頻率或能量)。當相應(yīng)的光通過棱鏡或攝譜儀時，它按照波長在空間分散。相應(yīng)的光譜即顯出連續(xù)光譜，或者疊加在連續(xù)明線上(發(fā)射光譜)。這樣，當原子受到的碰撞不多(由于低密度)時就產(chǎn)生發(fā)射光譜。發(fā)射譜線對應(yīng)于發(fā)射的光子，所述光子是當分子或原子的集合的激發(fā)態(tài)允許返回低能級時發(fā)射出來的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，熒光標記的發(fā)射光譜是偏振化的。在其它實施方式中，取決于納米簇的性能，發(fā)射可顯示不同的偏振。在某些實施方式中，包囊化的貴金屬納米簇顯示偶極發(fā)射模式。優(yōu)選的是，熒光標記的光譜發(fā)射特性至少部分取決于一種或多種選自下列的特性所用的包囊材料、樹枝狀分子的級別、測試環(huán)境的pH、形成納米點的環(huán)境的pH、由肽序列決定的肽對貴金屬納米簇的親合力、納米簇的大小，和形成包囊化的貴金屬納米簇所用的特定貴金屬。
優(yōu)選的是貴金屬納米簇有不定的電荷。正如此處所用，“不定的電荷”是指貴金屬納米簇可完全或不完全還原，或者可帶負電。在某些應(yīng)用中，帶有一定電荷的貴金屬納米簇可能是優(yōu)選的。貴金屬納米簇的電荷可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用本領(lǐng)域熟知的方法不費力地測定。
本發(fā)明貴金屬納米簇的直徑優(yōu)選應(yīng)低于3nm，并可小于2nm或1nm。包囊化之后，包囊化的貴金屬納米簇的直徑可在小于1nm至約為或大于15nm范圍之內(nèi)。包囊化的貴金屬納米簇的大小主要取決于所用的包囊材料。例如，在一個實施方案中，用一種抗體諸如IgG來包囊貴金屬納米簇。此抗體的直徑為約10nm。在體內(nèi)成象應(yīng)用上，10～50nm大包囊化的貴金屬納米簇可由淋巴系統(tǒng)過濾。
正如此處所用，“樹枝狀聚合物”是一種顯示出規(guī)則樹枝狀分枝的聚合物，是通過向核心或自核心順次或分級添加分枝層而形成的。術(shù)語樹枝狀聚合物包括“樹枝狀分子”，其特征在于有核心，至少一個內(nèi)部分枝的層，和表面分枝的層(Dvornic & Tomalia in Chem.inBritain，641-645，August 1994)?！把诱剐蛢尚苑肿?dendron)”是樹枝狀分子的一種，其帶有從焦點發(fā)散的分枝，該焦點直接或經(jīng)由連接部分連接或能連接于核心以形成樹枝狀分子。許多樹枝狀分子包含2個或多個連接到共同核心上的延展型兩性分子。但是，術(shù)語樹枝狀分子的含義不僅包括單個延展型兩性分子。在本發(fā)明中，優(yōu)選的樹枝狀分子是聚(酰胺胺)或PAMAM樹枝狀分子，但是，也預(yù)期使用其它樹枝狀分子。優(yōu)選的是，樹枝狀分子選自0級、1級、2級、3級、4級或更高級的樹枝狀分子。樹枝狀分子可有各種末端，包括但不限于OH末端、COOH末端和NH2末端。所選樹枝狀分子的級別因包囊化的貴金屬納米簇的特定應(yīng)用而異。
樹枝狀聚合物包括，但不限于，對稱和不對稱的分枝型樹枝狀分子、級聯(lián)分子(cascade molecule)、arborol等等，不過最優(yōu)選的樹枝狀聚合物是致密的星型聚合物。此處公開的PAMAM樹枝狀分子是對稱的，其中分枝臂的長度相等。在前一級分枝氨基末端的氫原子上出現(xiàn)分枝。
即使不是通過由有規(guī)律地逐次添加分枝層而形成，過度分枝的聚合物(例如過度支化的多元醇)可相當于樹枝狀分子聚合物，其分枝模式顯示類似于樹枝狀分子的規(guī)律性程度。
帶有大小和形狀受控地結(jié)構(gòu)域的拓撲聚合物是一種經(jīng)由其活性末端基團彼此連接(例如共價橋接或如下文限定的其它連接)的樹枝狀分子，它們叫做“橋接樹枝狀分子”。當多于兩個致密的星形樹枝狀分子聚集在一起時，它們叫做“聚集體”或“致密星形聚集體”。
因此，樹枝狀聚合物包括橋接樹枝狀分子和樹枝狀分子聚集體。樹枝狀聚合物包括樹枝狀分子的級別單分散和級別多分散溶液。在單分散性溶液中，樹枝狀分子基本上全部是同一級別，因此大小和形狀一致。在多分散性溶液中，樹枝狀分子包括不同級別樹枝狀分子的分布。
樹枝狀聚合物也包括表面改性的樹枝狀分子。例如PAMAM樹枝狀分子的表面可借助添加氨基酸(如賴氨酸或精氨酸)來改性。
正如此處所用，當涉及樹枝狀分子時，術(shù)語“級別”意指添加到樹枝狀分子的起始核心上的重復(fù)單元的層數(shù)。例如，1級樹枝狀分子包含起始核心和1層重復(fù)單元，2級樹枝狀分子包含起始核心和2層重復(fù)單元，依此類推。級別(即級數(shù)和重復(fù)單元的大小和性質(zhì))的逐次建立決定了樹枝狀分子的大小及其內(nèi)部。
把樹枝狀分子連接在生物底物上的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并包括連接體分子的使用。例如，硫醇-反應(yīng)性物質(zhì)的制法是使樹枝狀分子的羥基同雙官能交聯(lián)劑(N-(對馬來酰亞氨基苯基)異氰酸)的異氰酸末端偶聯(lián)，留下硫醇-反應(yīng)性馬來酰亞胺義與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
正如此處所用，“光漂白”包括導(dǎo)致在激發(fā)波長產(chǎn)生的熒光強度降低的所有過程。在本發(fā)明的各實施方式中，貴金屬納米簇在光漂白前發(fā)射出大于約106、107、或108個光子。在一個更優(yōu)選的實施方案中，貴金屬納米簇在光漂白前發(fā)射出大于約109個光子。光漂白可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不費力地加以確定。
在本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方式中，當激發(fā)包囊化的貴金屬納米簇時，大于約80％的貴金屬納米簇發(fā)出熒光長達約30分鐘以上。優(yōu)選的是，貴金屬納米簇在連續(xù)激發(fā)能(約300W/cm2，在514.5nm或476nm)下發(fā)出熒光。在另一個實施方式中，優(yōu)選的是大于約90％的貴金屬納米簇發(fā)出熒光長達約30分鐘以上。在其它實施方式中，大于80％或大于90％的納米簇的熒光量子產(chǎn)率大于約1％，飽和強度為1～1000W/cm2，發(fā)射延續(xù)長達30分鐘以上。
在一個實施方式中，樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇用于把貴金屬納米簇穿過細胞膜運送給能與該貴金屬納米簇強力結(jié)合的肽。與貴金屬納米簇的結(jié)合強度可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不費力地測定，并包括熒光強度的目測。在一個優(yōu)選的實施方式中，樹枝狀分子是低級別的樹枝狀分子，諸如0級、1級或2級。在其它實施方式中，樹枝狀分子是高級別的樹枝狀分子，諸如3級、4級或更高級。在某些實施方式中，該肽在某一pH范圍內(nèi)與貴金屬納米簇結(jié)合。優(yōu)選的是，肽在pH10～1、更優(yōu)選在9～2，最優(yōu)選在8～3范圍內(nèi)與貴金屬簇穩(wěn)定地結(jié)合。在其它實施方式中，肽在pH9、8、7、6、5、4或3下與貴金屬穩(wěn)定結(jié)合。這一實施方式允許在體外和體內(nèi)容易地標記蛋白質(zhì)。
“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此處包括核苷酸的任意長度的多聚形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。此術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)；因此此術(shù)語包括三鏈、雙鏈和單鏈DNA，以及三鏈、雙鏈和單鏈RNA。此術(shù)語也包括修飾型式，諸如甲基化和/或加帽，和多核苷酸的未修飾形式。更具體而言，術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多聚脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其它形式的多核苷酸(嘌呤或嘧啶堿基的N-或C-糖苷)，和含非核苷酸主鏈的其它聚合物，例如，聚酰胺(如肽核酸(PNA))和聚嗎啉代(商品名Neugene，可從Anti-Virals Inc.Coruallis，Ore.購得)聚合物，和其它合成得序列特異性的核酸聚合物，只要該聚合物所含核堿基的構(gòu)象允許堿基配對和堿基堆疊，如同在DNA和RNA中的那樣。沒有打算區(qū)別“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之間的長度，這些術(shù)語可互換使用。這些術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因此這些術(shù)語包括，例如3’-脫氧-2’，5’-DNA，寡聚脫氧核糖核苷酸N3’P5’氨基磷酸，2’-O-烷基取代的RNA，雙和單鏈DNA，以及雙和單鏈RNA，DNARNA雜合體，和PNA和DNA或RNA間的雜合體，而且也包括已知類型的修飾，例如，本領(lǐng)域已知的標記、甲基化、“加帽”、用類似物取代1種或多種天然核苷酸，核苷酸間的修飾，例如，用不帶電的連接物(如磷酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶負電的連接物(如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)和帶正電的連接物(如氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)進行的修飾，用含有側(cè)鏈部分的那些例如蛋白質(zhì)(包括核酸酶，毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)進行的修飾，用嵌入劑(如吖啶、補骨脂素等)進行的修飾，用含有螯合物的那些(如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)進行的修飾，含有烷化劑的那些進行的修飾，用改性的連接物(如α異頭核酸等)進行的修飾，以及多核苷酸或寡核苷酸的未修飾形式。尤其是，DNA是脫氧核糖核酸。
這些術(shù)語還包括位于基因編碼區(qū)3’和5’兩端的非翻譯序列基因編碼區(qū)5’端上游至少約1000核苷酸及其3’端下游至少約200核甘酸。不太常見的堿基，諸如肌苷，5-甲基胞嘧啶，6-甲基腺嘌呤，次黃嘌呤及其它也可用于反義、dsRNA和核酶配對。例如，含有尿嘧啶和胞苷的C-5丙炔類似物的多核苷酸已被證明以強親合力結(jié)合RNA并且是基因表達有效的反義抑制劑。也可以進行其它修飾型式，諸如磷酸二酯主鏈的修飾、或者RNA核糖基團的2’-羥基的修飾。反義多核苷酸和核酶可完全由核糖核苷酸組成，或可混合含有核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可用各種方法制造，包括基因組制備，cDNA制備，體外合成，RT-PCR和體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。
“分離的”核酸分子是一種基本上與該核酸的天然來源中的其它核酸分子(如編碼其它多肽的序列)分開的核酸。優(yōu)選的是，分離的核酸不含其天然復(fù)制子里天然位于該核酸側(cè)翼的某些序列(如位于該核酸5’和3’端的序列)。例如，克隆的核酸被認為是分離的。如果核酸已由人為干預(yù)而經(jīng)過改變、或者放在不是其天然位點的基因座或位置中、或者已經(jīng)通過轉(zhuǎn)染而引入細胞中，則該核酸也被認為是分離的。并且，“分離的”核酸可以不含其天然伴隨的某些細胞材料，或者當用重組技術(shù)生產(chǎn)時，不含培養(yǎng)基，或者當化學合成時不含化學前體或其它化學品。
從“分離的核酸”定義中明確排除的是天然染色體(諸如染色體片段(spread))、人工染色體文庫、基因組文庫、和cDNA文庫，它們以體外核酸制劑或轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化宿主細胞制劑的形式存在，其中該宿主細胞是體外異質(zhì)制劑或者是作為單集落的異質(zhì)群體而平板培養(yǎng)的。同樣明確排除的是其中特定的核酸在載體分子中占核酸插入片段數(shù)目不到5％的上面各文庫。進一步明確排除的是全細胞基因組DNA或全細胞RNA制劑(包括機械切割或酶促消化的全細胞制劑)。更加進一步明確排除的是作為體外制劑或者作為一種用電泳法分離出來的異質(zhì)混合物的全細胞制劑，其中本發(fā)明的核酸未曾進一步從電泳介質(zhì)里異源核酸中分離出來(如從瓊脂糖凝膠或尼龍印跡里的異質(zhì)條帶群體中分割單一條帶來進一步分離)。
在一個優(yōu)選的實施方式中，將編碼結(jié)合貴金屬納米簇的肽的分離核酸引入細胞，該肽被表達并結(jié)合貴金屬納米簇。在某些實施方式中，編碼結(jié)合該貴金屬納米簇的肽的分離核酸也可以是嵌合或融合多核苷酸。正如此處所用，“嵌合多核苷酸”或“融合多核苷酸”包括編碼結(jié)合貴金屬納米簇的肽的核酸，該核酸可操作地連接在第二核酸序列上。優(yōu)選的是，第二核酸序列不結(jié)合或不強力結(jié)合貴金屬納米簇，并且與編碼結(jié)合貴金屬納米簇的肽的核酸相比，既具有不同的多核苷酸序列，也編碼具有不同功能的蛋白質(zhì)。在融合多核苷酸里，“可操作地連接”表示編碼結(jié)合貴金屬納米簇的肽的所述核酸和第二核酸序列彼此相互融合，從而使得該兩個序列實現(xiàn)使用它們所要達到的目的。第二核酸序列可以融合到結(jié)合貴金屬納米簇的肽的編碼核酸之N端或C端上。
核酸引入細胞的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，它包括，但不限于，轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)，電穿孔，粒子轟擊，農(nóng)桿菌感染等等。在某些實施方式中，核酸整合入載體或表達盒中，然后引入細胞。核酸引入宿主細胞的其它合適的方法可在下列文獻里找到Sambrook，等人，Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989，及其它實驗手冊如Methods in MolecularBiology，1995，Vol.44，Agrobacterium protocols，EdGartland andDavey，Humana Press，Totowa，New Jersey。
正如此處所用，“多肽”是指由肽鍵連接的至少4個氨基酸的鏈。該鏈可以是線性的，分支的，環(huán)狀的或其組合。術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”在此處可互換使用。此術(shù)語不是指產(chǎn)物的特定長度。所以，“肽”、“寡肽”和“蛋白質(zhì)”都包括在多肽定義之內(nèi)。此術(shù)語包括多肽的翻譯后修飾，例如，糖基化，乙酰化、磷酸化等等。而且，蛋白質(zhì)片段、類似物、突變或變體蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)等等也包括在多肽的含義之內(nèi)。
本發(fā)明還提供嵌合或融合多肽。正如此處所用，“嵌合多肽”或“融合多肽”包括結(jié)合貴金屬納米簇的多肽，該多肽可操作地與第二多肽相連。優(yōu)選的是，第二多肽的氨基酸序列實質(zhì)上和貴金屬納米簇最佳結(jié)合多肽不一樣，例如，如此處所述不穩(wěn)定地結(jié)合貴金屬納米簇的多肽。如此處所用，涉及融合多肽時，術(shù)語“可操作地連接”是用來表明兩個多肽相互融合從而使得這兩個序列都能實現(xiàn)其所使用的目的功能。第二多肽可以融合到結(jié)合貴金屬納米簇的肽的N端或C端上。這種多肽能促進單分子或整體研究，并允許體內(nèi)或體外肽的直接標記。
在本發(fā)明的某些實施方式中，結(jié)合貴金屬納米簇的肽之長度為約5～1000個氨基酸，1～800個氨基酸或5～500個氨基酸。在某些實施方式中，肽的長度為約5～10個氨基酸。在其它實施方式中，肽的長度為約10～20個氨基酸或20～40個氨基酸。在一個實施方式中，肽包含如SEQID NO.1中定義的多肽序列。
本發(fā)明還包括具有上述特性的包囊化的貴金屬納米簇的制備方法。在一個實施方式中，樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇的制備方法包括下列步驟(a)把樹枝狀分子、含貴金屬的水溶液和水性溶劑混合以產(chǎn)生混合溶液；(b)添加還原劑；(c)接著添加足量酸性化合物把混合溶液調(diào)至中性范圍pH；和(d)混合調(diào)好pH的混合溶液使樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇得以形成。在第二個實施方式中，能發(fā)熒光的肽包囊化的貴金屬納米簇的制備方法包括下列步驟(a)把肽、含貴金屬的水溶液和蒸餾水混合以產(chǎn)生混合溶液；(b)添加還原劑；(c)接著添加足量酸性化合物把混合溶液調(diào)至中性范圍pH；和(d)混合調(diào)好pH的混合溶液使肽包囊化的貴金屬納米簇得以形成。
在這些方法中，把還原劑添加到混合溶液里以使貴金屬納米簇光活化。優(yōu)選的是，還原劑選自化學還原劑、光或其組合。在這些方法的某些實施方式中，光可用作還原劑以使貴金屬納米簇光活化。在這些方法的某些其它實施方式中，化學還原劑可用作還原劑。在一個實施方式中，光與還原劑組合使用以使貴金屬納米簇光活化。優(yōu)選的是包囊化的貴金屬納米簇的制備方法是在約65°F～100°F的溫度下實施的。更優(yōu)選的是，從步驟a)到步驟c)，混合溶液的溫度是約68°F到約80°F，更優(yōu)選的是約68°F到約74°F。
優(yōu)選的是，用于制備該化合物的含貴金屬的水溶液選自AgNO3、HAuCl4·nH2O和CuSO4·nH2O。在一個實施方式中，含貴金屬的水溶液是AgNO3溶液。在另一實施方式中，含貴金屬的水溶液是HAuCl4·nH2O溶液。在另外的實施方式中，含貴金屬的水溶液是CuSO4·nH2O溶液。
在一個實施方式中，含貴金屬的水溶液是HAuCl4·nH2O，還原劑添加到混合溶液里，攪拌調(diào)好pH的混合液至少1小時，形成樹枝狀分子包囊化的金納米簇。在另一實施方式中，攪拌調(diào)好pH的混合液至少48小時，使其形成樹枝狀分子包囊化的金納米簇。在另一實施方式中，包囊化的貴金屬納米簇是經(jīng)由光還原(經(jīng)由可見光或紫外光照射)，從而形成樹枝狀分子包囊化的金、銀或銅納米簇。
在另一個實施方式中，當包囊材料是肽時，優(yōu)選的是，步驟(a)中貴金屬與肽之摩爾比為約0.1∶1。在另一個實施方式中，步驟(a)中貴金屬與肽之摩爾比小于約0.1∶1，在其它實施方式中大于0.1∶1，并可為1∶1或更大。
在某些實施方式中，包囊化的貴金屬納米簇熒光標記存在于生物樣品中。在某些優(yōu)選的實施方式中，包囊貴金屬納米簇的肽在細胞里面表達，也叫做“基因編程”。如此處所用，術(shù)語“表達”包含肽的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。在另外的實施方式中，把包囊貴金屬納米簇的肽引入生物樣品。如此處所用，“生物樣品”是指分離的細胞、組織或流體的樣品，包括但不限于，例如血漿、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道、和生殖泌尿道的外面部分、眼淚、唾液、乳汁、血細胞、腫瘤、器官、還有體外細胞培養(yǎng)組分的樣品(包括但不限于，細胞在培養(yǎng)基中生長所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基、推定的病毒感染細胞、重組細胞、和細胞組分)。熒光標記可用于來自任何種類生物的細胞，其中該生物為原核生物或真核生物。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，該生物是真核生物。本發(fā)明真核細胞的非限制性例子包括那些來自動物、植物、真菌、原生生物、和其它微生物的細胞。在某些實施方式中，該細胞是多細胞生物(如植物或動物)的一部分。
如此處所述，包囊化的納米簇組合物以及樹枝狀分子大小或肽序列的選擇都會影響半導(dǎo)體納米晶的特征發(fā)射光譜波長。所以，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會意識到，此處所述納米點的特定組成要根據(jù)待監(jiān)測的光譜區(qū)來選擇。例如，可以設(shè)計在可見光區(qū)、或者在紅光、藍光或近紅外區(qū)發(fā)射能量的納米點。在一個實施方式中，隨著納米簇尺寸的減小，包囊化的貴金屬納米簇顯示能量發(fā)射越來越強。
本發(fā)明的水溶性包囊化的貴金屬納米簇在經(jīng)常使用其它不太可靠的標記方法的各種測定方法中獲得應(yīng)用，這些測定方法包括但不限于，熒光顯微術(shù)、組織學、細胞學、病理學、流式細胞術(shù)、FISH和其它核酸雜交測定法、信號放大測定法、DNA和蛋白質(zhì)序列測定、免疫測定法諸如競爭性結(jié)合測定法和ELISAs、免疫組織化學分析、蛋白質(zhì)和核酸分離、同質(zhì)性測定、多聚化(multiplexing)、高流通量篩選、染色體核型分析等等。上述包囊化的貴金屬納米簇熒光標記在可接受環(huán)境中可用于各種基于報道分子的測定法。
在某些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的包囊化的貴金屬納米簇熒光標記用于單分子或多分子研究。本發(fā)明包含一種監(jiān)測目的分子的方法，該方法包括(a)把包含包囊化的貴金屬納米簇的水溶性熒光標記附著在目的分子上，其中所述熒光標記發(fā)出發(fā)射光譜；和(b)檢測所述熒光標記的發(fā)射光譜。如此處所用，檢測發(fā)射光譜包括測定熒光標記的光發(fā)射性能。單分子研究能允許測定局部環(huán)境的各個層面，從信號強度、定向和壽命，一直到分子的發(fā)射光譜和與鄰近分子的能量傳遞程度。單分子研究已經(jīng)用于操作個體分子并測量由分子馬達或共價鍵產(chǎn)生的力。新探針技術(shù)的開發(fā)為實時觀測活細胞里分子的相互作用和交換創(chuàng)造條件。這些工具使群體的個體成員在細胞亞群和亞結(jié)構(gòu)里得到觀察、鑒定和定量比較。單分子研究具有提供空間和時間信息的潛力，這些信息是使用其它更加靜態(tài)的技術(shù)不可能獲得的。單分子研究能夠測量單個分子在細胞內(nèi)空間的體內(nèi)動態(tài)移動，或者在一個延長的時段內(nèi)觀察單個分子的行為。通過使用單分子方法，應(yīng)該能夠研究細胞集群里個體成員的時間軌跡和反應(yīng)途徑而不用算出在群體的平均值。細胞過程，諸如胞吐、經(jīng)通道的流出、或轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的裝配都能目視觀察。由等位基因多態(tài)性產(chǎn)生的在結(jié)構(gòu)或功能方面的個體差異，理應(yīng)能在單分子層次探測出來。而且，使用這些技術(shù)能夠?qū)μ囟ńM織里或者在某些發(fā)育階段的基因或基因組的協(xié)調(diào)表達實施監(jiān)測。照此，包囊化的貴金屬納米簇熒光探針的使用，就為提供生物狀態(tài)信息的光譜發(fā)射之測定創(chuàng)造條件。如此處所用，“生物狀態(tài)”是指進行條件測定，諸如生物部分的定量和定性存在；生物部分的結(jié)構(gòu)、組成和構(gòu)象；生物部分在環(huán)境里的定位；生物部分之間的相互作用，生物化合物結(jié)構(gòu)的改變和細胞過程的改變。
本發(fā)明的方法和組合物還包括連接體分子的使用，其中連接體分子能使含有包囊化的貴金屬納米簇的熒光標記附著在目的分子上。
克隆、DNA分離、擴增和純化的標準技術(shù)，涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切核酸酶等等酶促反應(yīng)的標準技術(shù)，和各種分離技術(shù)都是已知的，而且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍使用的。大量的標準技術(shù)在下列文獻中有描述Sambrook等人，1989 Molecular Cloning，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NewYork；Maniatis等人，1982 Molecular CLoning，Cold Spring HarborLaboratory，Plainview，New York；Wu(ed.)1993 Meth.Enzymol.218，PartI；Wu(ed.)1979 Meth Enzymol.68；Wu等人，(Eds.)1983 Meth.Enzymol.100 and 101；Grossman & Moldave(Eds.)1980Meth.Enzymol.65；Miller(ed.)1972 Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring，Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork；Old and Primrose，1981 Princeples of GeneManipulation，University of California Press，Berkeley；Schleif &Wensink，1982 Practical Methods in Molecular Biology；Glover(ed.)1985 DNA Cloning Vol.I and II，IRL Press，Oxford，UK；Hames &Higgins(eds.)1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press Oxford，UK；和Setlow & Hollaender 1979 Genetic EngineeringPrinciples andMethods，Vols.1-4，Plenum Press，New York.所用的縮寫詞及術(shù)語在本領(lǐng)域中被認為是標準的，并且普遍用于此處所引用的專業(yè)雜志中。
在整個申請文件中，參考了多種出版物。所有這些出版物及其中的引用文獻的公開內(nèi)容都以其整體引用作為參考，以便更充分地描述本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的狀態(tài)。下列各實施例不是用來限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍，相反是為給某些實施方式作例證的。熟練技術(shù)人員想到的對所實施的方法之任何改變都被屬于本發(fā)明范圍以內(nèi)。
實施例實施例1樹枝狀分子包囊化的銀納米簇的產(chǎn)生方法PAMAM從溶液中螯合金屬離子的作用是已知的(Crooks等人，Accounts Chem.Res.2001，34181；Ottaviani等人，Macromolecules2002，355105；Zheng等人，J.Phys.Chem.B 2002，1061252；Varnavski等人，J.Chem.Phys.2001，1141962)。PAMAM G4-OH和G2-OH樹枝狀分子(分別為4級和2級羥基封端的聚(酰胺胺)，Aldrich)因而被用來濃縮、穩(wěn)定和溶解Ag納米簇于充氣和脫氣兩水溶液中。通過把0.5μmolG4-OH和1.5μmol AgNO3溶于1ml蒸餾水(18MΩ)并用160μmol乙酸把溶液調(diào)到中性，銀離子就很容易地與樹枝狀分子相互作用。通常當生成小納米顆粒(直徑＞3nm)時，文獻記載的制備方法通常添加少量還原劑諸如NaBH4(Crook等人，Accounts Chem.Res.201，34181；Ottaviani等人，Macromolecules 2002，355105；Zheng等人，J.Phys.Chem.B 2002，1061252；Varnavski等人，J.Chem.Phys.2001，1141962)。為產(chǎn)生樹枝狀分子包囊化的納米簇(“納米點”)而不是納米顆粒，反應(yīng)中是不加還原劑的。探測這類溶液熒光的方法是，在環(huán)境空氣、氮氣、和/或真空(10～5乇)條件下把10ml溶液滴加在清潔的蓋玻片上，用帶通濾過的汞燈之藍光(450～480nm)照射，通過標準的落射熒光顯微鏡來探測。其結(jié)果不受氧化程度或樹枝狀分子產(chǎn)生的影響。
結(jié)果起初，看不到這類溶液的可見吸收或熒光，但在暴露于白光前后由溶液吸收光譜清楚地闡明了光活化(Fig。1A)。起初，光譜上只有樹枝狀分子的單一吸收(284nm)。光活化后，由于光還原的小的銀納米點(Ag2～Ag8)的吸收，溶液顯示出兩個新峰(345nm和430nm)(Rabin等人，G.Chem.Phys.Lett.1999，312394；Bonacic’-Koutecky等人，J.Chem.Phys.2001，11510450)。光活化中同時生成的小的銀納米點的大小和幾何形狀差別產(chǎn)生了整個可見光區(qū)的多種顏色熒光。這種大小的銀納米簇是唯一已知的強可見光吸收和發(fā)射之物(Rabin等人，G.Chem.Phys.Lett.1999，312394；Bonacic’Koutecky等人，J.Chem.Phys.2001，11510450；Linnert等人，J.AM.Chem.Soc.1990，1124657；Mostafavi等人，Chem.Phys.Lett.1990，167193)。光活化的熒光納米點溶液的質(zhì)譜分析確認了這樣小的尺寸(Fig.1B)。氫硼化物-還原的溶液產(chǎn)生了較大的銀納米顆粒(3～7nm)，它有特征性的表面等離子的強吸收(398nm)，但基本上沒有熒光(Fig.1A)。所以，因為只出現(xiàn)不帶等離子吸收的熒光銀納米點，故它們應(yīng)該遠小于3nm，并且可能小于2nm。
與吸收的變化相關(guān)，當銀離子在樹枝狀分子主體內(nèi)光還原時，熒光隨照射時間的增加而增強。在約6秒鐘之內(nèi)，經(jīng)少量連續(xù)的光活化，視野就被閃爍的單個熒光粒子填滿(Figs 2A～D)。這種很亮、很穩(wěn)定的熒光特性是被高度偏振的并顯示出清晰的偶極發(fā)射模式(Fig.2E；Bartko& Dickson，J.Phys.Chem.B 1999，10311237)和單個發(fā)射物的閃爍動態(tài)特性(Lu等人，Science 1998，2821877；Dickson等人，Nature1997，388355；Hu等人.J.Am.Chem.Soc.1999，1216936)。在此銀-限定的環(huán)境中完成光活化后，熒光銀-樹枝狀分子納米點在平均發(fā)射強度和光譜特性兩方面都保持非常穩(wěn)定。因此與在AgO膜上相比，樹枝狀分子穩(wěn)定了納米簇并提高了其光學性能(Peyser等人，Science 2001，291103；Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，1067725)。因為小Ag納米簇的結(jié)合能小于激發(fā)能，樹枝狀分子的籠效應(yīng)可能類似于稀有氣體基質(zhì)的籠效應(yīng)(Rabin等人，Chem.Phys.Lett.1999，312394)，通過防止光解離以穩(wěn)定并提高納米簇熒光。盡管已知AgO膜上的Ag納米簇熒光能被水焠滅(Mihalcea等人，J.Am.Chem.Soc.2001，1237172)，但是樹枝狀分子-包囊化的銀納米點在水溶液中卻是強熒光性的且相當穩(wěn)定。所以，光化學法制成的Ag納米簇在樹枝狀分子內(nèi)同樣已被保護，從而避免與溶液中的焠滅劑起反應(yīng)。
上述光活化的納米點溶液的電霧化電離質(zhì)譜(ESI-MS)顯示出樹枝狀分子+Agn(n＝2～4)的強力富集化，其富集程度勝過末光活化的因此是非熒光性的納米點溶液(Fig 1B)。在未光活化的納米點溶液中，樹枝狀分子+Ag2和較大的納米簇峰沒能觀察到，這清楚地表明，只要溶液受到光活化，就有來自樹枝狀分子-包囊化的Ag納米簇(大小為2～8個原子)的發(fā)射(Zheng & Dickson，J.Am.Chem.Soc.，2002，12413982-13983)。
與研究AgO膜上的納米簇(Peyser等人.Seience 2001，291103；Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，1067725)相反，單個納米簇的光譜測定很容易在這些可溶性樹枝狀分子-包囊化的銀納米點上進行。盡管AgO上的Agn在整體光譜方面與納米點水溶液難區(qū)分(Fig.3)，但是同整體納米點試樣或AgO膜上的單個納米簇相比，單個Ag納米點具有更窄、更穩(wěn)定的發(fā)射光譜(Fig.3)。由于AgO膜上的納米簇大小因激發(fā)而頻頻改變，所以單個納米簇顯示出較大的譜移(Peyser等人，Science 2001，291103；Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，1067725)。相反，從這些高度分散的樹枝狀分子-包囊化的的銀納米點得到了5條穩(wěn)定且易于區(qū)分的熒光光譜(Fig.3)，這表明整體光譜是由少至5種尺寸的納米簇決定的。室溫下單個納米點熒光光譜比整體納米點膜或溶液的光譜顯著狹窄，并且沒有出現(xiàn)明顯的光譜擴散。由于沒有另外的銀能整合到納米點里及樹枝狀分子穩(wěn)定了納米點熒光，所以單個納米點的發(fā)射是相當穩(wěn)定、強勁的，最大值在533nm、553nm、589nm、611nm、和648nm，不過易于見到熒光間歇現(xiàn)象。與II-VI納米顆粒相比，這些納米點頗為光穩(wěn)定，有約80％的個體特點在300W/cm2(514.5nm或476nm)的連續(xù)激發(fā)下保持熒光＞30分鐘。只是在小尺寸的納米點上觀察到了納米點光活化、閃爍、偶極發(fā)射模式、光譜穩(wěn)定性、質(zhì)譜測定法和熒光，這進一步證實，尺寸小于8個原子的單個樹枝狀分子-包囊化的Agn納米簇導(dǎo)致了所觀察到的發(fā)射。類似方法制備的無樹枝狀分子的溶液或者無銀的溶液中就看不到熒光。對溶解度和穩(wěn)定化至關(guān)重要的是，樹枝狀分子包囊和保護納米簇，產(chǎn)生強發(fā)射并提供防止進一步光還原/納米簇生長的銀-限定環(huán)境(silver-limited environment)。
通過這些方法，以及通過環(huán)境條件下的直接光還原，一種十分光穩(wěn)定的水溶性銀納米點業(yè)已在樹枝狀分子里成功地產(chǎn)生。這種銀納米點在水溶液和膜中都相當穩(wěn)定和具有強熒光性，而且借助弱汞燈激發(fā)(30W/cm2)容易在單分子水平觀察到。借助樹枝狀分子附著的合成控制(例如，可把樹枝狀分子羥基偶聯(lián)到雙功能交聯(lián)劑N-(對馬來酰亞氨苯基)異氰酸的異氰酸末端，保留硫醇-反應(yīng)性馬來酰亞胺用于與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，從而制備硫醇-反應(yīng)性物質(zhì))，這種簡單的納米材料可能用作生物標記，從而能更廣泛地進行單分子研究，而無需昂貴的激光源。光漂白前強烈的光活化發(fā)射和非常長的壽命，使它們成為用于研究化學和生物系統(tǒng)的有吸引力的新型納米材料。
實施例2單個Ag納米點的表征一系列PAMAM樹枝狀分子級別[GO-OH到G4-OH，直徑(MW)從1.5nm(517g/mol)到4.5nm(14，215g/mol)]用來產(chǎn)生有強熒光性的Agn納米點。極亮的熒光在pH8.0～3.0范圍內(nèi)看到。這些不同級別的PAMAM能成為控制納米簇分布的一種手段用小級別樹枝狀分子產(chǎn)生的納米點與用大級別樹枝狀分子產(chǎn)生的納米點顯出不同的發(fā)射光譜。納米點發(fā)射不僅在光譜和強度方面非常穩(wěn)定，而且顯出帶有十分清晰和穩(wěn)定的偶極發(fā)射模式的高度偏振發(fā)射(Fig2E)。發(fā)射模式的觀測使得使用三維取向法成為可能，該方法的開發(fā)是來跟蹤溶液或固定特征方面的取向動態(tài)特性，如下列文獻所述Bartko & Dickson，J，Phys.Chem，B1999，1033053-3056；Bartko & Dickson，J.Phys.Chem，B1999，10311237-11241；及Bartko等人，Chem，Phys，Lett.2002，358459-465.
這些單個Ag納米點的許多光物理參數(shù)也已被表征鑒定(Fig，4A)。雖然遠小于量子點，在低激發(fā)強度(30W/cm2460nm，緊鄰450nm激發(fā)高峰)下由極短熒光壽命產(chǎn)生極亮的納米點熒光。在儀器響應(yīng)去褶后，用來自雙重Ti藍寶石的400nm激發(fā)，時間相關(guān)單光子計數(shù)測定個體納米點壽命，顯示出一個主要的亞100ps部分(92％)。納米點也有一個較慢(1.6納秒)衰變部分。極快的松馳表明基態(tài)與激發(fā)態(tài)間有極強的聯(lián)系，因而產(chǎn)生一個來自在極小(幾個原子)納米簇的極強的躍遷動量。
單個納米點的吸收截面是通過飽和強度測定法測定的(Fig，4B)。這些納米點與明確表征的單個DiIC18分子相比較，該分子有熟知的飽和強度，壽命、及熒光量子產(chǎn)率(Macklin et al，Science 1996，272255-258)。這些實驗指出Ag納米點的吸收截面比最佳有機染料強約20倍，幾乎和最佳CdSe量子點相等。加之，通過單個DiI分子和單個納米點兩者的吸收光子總數(shù)的比較，其納米點熒光量子產(chǎn)率計算的低估計值至少為約30％。另外，這些Ag納米點顯示出至少可與更大的II-VI量子點相當?shù)墓夥€(wěn)定性，帶有＞90％的個體特征，在300W/cm2連續(xù)514.5-nm激發(fā)保持發(fā)熒光＞＞30分鐘。當發(fā)射＞106個光子/秒接近飽和時，通常持續(xù)大于1小時的連續(xù)光激發(fā)，典型的單個納米點在光漂白前發(fā)射的光子大大超過109。這比最佳有效染料發(fā)射的總光子數(shù)大兩個數(shù)量級。因此，這些納米點有機會探測廣泛范圍內(nèi)生物系統(tǒng)短期和長期單個分子的動態(tài)特性。
于是，通過環(huán)境條件下直接光還原，一種樹枝狀分子-包囊化的水溶性銀納米簇(Ag納米點)業(yè)已產(chǎn)生。這種銀納米點在溶液和膜中都相當穩(wěn)定，且當激發(fā)緊鄰吸收峰450nm時，通過弱汞燈激發(fā)(30W/cm2)，可在單分子水平上進行觀察。通過樹枝狀分子附著的合成控制，這種簡單的納米材料作為生物標記是很有用的，從而使單個分子研究，不用昂貴的激光源，得以極廣泛地應(yīng)用。光漂白前強烈的光活化發(fā)射和極長的壽命，使這些有吸引力的新納米材料用于研究生物系統(tǒng)。
實施例3樹枝狀分子包囊化的金納米簇的產(chǎn)生以前的研究已產(chǎn)生了有熒光性的，表面鈍化的金納米簇，其大小從28個原子到更小粒子(＜1.2nm)，并具有近紅外(Link等人，J，Phys，Chem.B2002，1063410-3415)，紅的(Huang & Murray，J.Phys.Chem.B2001，10512498-12502)和藍的發(fā)射(Wilcoxon等人，J.Chern，Phys.1998，1089137-9143)，隨著納米簇粒徑的減小有越來越高的能量發(fā)射。盡管與整體金膜相比有百萬倍增強的熒光量子產(chǎn)率φF的Au納米簇業(yè)已產(chǎn)生，(Mooradian，A.Phys.Reu.Lett.1969，22185-187)10-3～10-4量子產(chǎn)率和多分散的納米顆粒粒徑分布已使它們不能當做有效的熒光團(Link等人，J.Phys.Chem.B 2002，1063410-3415；Huang& Murray，J.Phys.Chem.B 2001，10512498-12502)。本發(fā)明公開了一種水溶性單分散的藍-發(fā)射Au8納米點，當其由生物相容性PAMAM樹枝狀分子(Tomalia，Sci，Am.1995，27262-66)包囊化和穩(wěn)定時，顯示出41±5％的熒光量子產(chǎn)率，比其它已報道的金納米簇(Link等人，J.Phys.Chem，B 2002，1063410-3415；Huang & Murray，J.Phys.CHemB2001，10512498-12502)提高不止100倍。較大的Aun納米點，帶有全可見區(qū)強發(fā)光，也已產(chǎn)生。
2級和4級的OH-封端PAMAM(G2-OH和G4-OH，Aldrich)適用于穩(wěn)定和加溶處于水和甲醇兩溶液中的金納米簇。通過把0.5μmol G4-OH或G2-OH和1.5μmol HAuCl4·nH2O(Aldrich)溶于2ml蒸餾水(18MΩ)，通過向溶液中慢慢加入等量NaBH4，金離子就螯合到樹枝狀分子里并被還原。還原了的金原子聚集在樹枝狀分子里形成小納米點(樹枝狀分子-包囊化的納米簇)和大納米顆粒。溶液攪拌兩天直到反應(yīng)和聚集過程完結(jié)。接著，溶液經(jīng)由離心作用(13,000g)純化以除去大金納米顆粒(Crooks等人，Accounts Chem.Res.2001，34181-190；Esum等人.Langmuir1998，143157-3159)，留下一種無色透明的金納米點溶液。盡管比純樹枝狀分子峰(285nm)弱(見Fig，5A)，但減去純樹枝狀分子吸收后仍得到一清晰的樹枝狀分子包囊化的金納米簇吸收光譜。由Fig.5B可見，一條新吸收譜帶384nm(帶寬～60nm，F(xiàn)WHM)出現(xiàn)在最后的熒光金納米點溶液中。與大金納米顆粒的吸收光譜相反，沒有看到此溶液的表面等離振子吸收(520nm)，表明該納米點小于～2nm(Crooks等人，Accounts Chem，Res，2001，34181-190；Esumi等人，Langmuir 1998，143157-3159)。
清楚地看到了這些樹枝狀分子包囊化的金納米點溶液的強藍色熒光(激發(fā)峰384nm，發(fā)射峰450nm)(Fig6)。熒光激發(fā)峰和帶寬與納米點吸收譜帶(Fig 5B)完全一樣。在相同的合成條件下，G2-OH和G4-OH樹枝狀分子產(chǎn)生無法區(qū)別的熒光溶液，可是G0樹枝狀分子卻只產(chǎn)生一種帶有黑色金粒的非熒光溶液。這種多相溶液使人們認為，不象較大的2級和4級產(chǎn)物，小的0級樹枝狀分子產(chǎn)物不足以保護和穩(wěn)定金納米簇。惹人注目的是，對于384-nm激發(fā)，G4-OH和G2-OH包囊化的金納米點的累積熒光量子產(chǎn)率為41％±5％，用同樣發(fā)射硫酸奎寧為參照。該量子產(chǎn)率在甲醇中進一步增加到52％±5％。發(fā)射的時間相關(guān)性顯示，有兩個壽命部分(Fig，7A)是金納米點發(fā)射的特征(Link等人，J.Phys.Chem.B2002，1063410-3415)。短壽命部分為7.5ns，在發(fā)射中占優(yōu)勢(93％)，可能起因于金納米點的低位d軌道和激發(fā)sp能帶間的單態(tài)躍遷。長壽命部分(2.8μs，7％)可能是由于三態(tài)單態(tài)能帶內(nèi)躍遷(Link等人，J.Phys.Chem，B 2002，1063410-3415；Huang & Murray，J.Phys.Chem.B2001，10512498-12502)。
清楚的樹枝狀分子結(jié)構(gòu)使通過電霧化電離(ESI)質(zhì)譜法分析包囊化的納米簇的粒徑成為可能。如Fig，7B所示，Au8是熒光溶液中的主要含金組分而其豐度直接與熒光強度有關(guān)，與試樣制備無關(guān)。取決于還原條件，在質(zhì)譜中能出現(xiàn)Au濃度、樹枝狀分子級別，及不同的含金峰。在所有情況(＞20個各種制備試樣)下，藍熒光強度僅僅與質(zhì)譜中看到的含Au8粒子之豐度有關(guān).與穩(wěn)定的有8個價電子的納米簇一致(每個Au原子有1個；Lin等人，Inorg.Chem.1991，3091-95)，此主要納米簇被證實是處于總體中性氧化態(tài)，因為即使100倍過量強還原性BH4-也沒改變該納米點的熒光。當溶于D2O而不是H2O時，通過相對于樹枝狀分子母體峰的預(yù)期譜移證實，還發(fā)現(xiàn)有5個水分子與親水性PAMAM樹枝狀分子-Au絡(luò)合物締合著。5個水分子可認為是有利數(shù)值，同時在其它同樣制備的試樣的質(zhì)譜中也看到對應(yīng)于有1～6個水分子的Au8的較小的峰。這些含Au8的峰僅在有熒光性的Au納米點溶液中看到，而且不同方法制備的溶液之熒光強度僅僅與該Au8納米點峰的相對豐度成正比。加之，使用HAuCl4和AuBr3兩者的Au納米點制劑產(chǎn)生帶有完全一樣質(zhì)譜的無法區(qū)別的熒光性溶液。這就表明，該高效藍發(fā)射起因于Au8納米點。各種顏色的發(fā)射可以通過調(diào)整Au樹枝狀分子的相對濃度以產(chǎn)生較大的Au納米點而發(fā)生。
如上所述，來自金納米點的發(fā)光，被認為是由d滿帶與sp導(dǎo)帶間的躍遷引起的(Link等人.J.Phys.Chem.B 2002，1063410-3415；Huang &Murray，J.Phys.Chem，B 2001，10512498-12502；Mohamed等人，Chem.Phys.Lett.2000，317517-523)。隨納米簇粒徑減小，各譜帶中分立態(tài)間的間隔加大，導(dǎo)致相對于更大納米點的熒光的藍移。比不同方法制備的較大納米簇大不止100倍的熒光量子產(chǎn)率的提高可能起因于兩個因素。存在于極小Au8納米簇的態(tài)的低密度使內(nèi)部無輻射松弛路徑最少化。加之，更大樹枝狀分子籠更好地保護這些納米簇/納米點免于在溶液中猝滅。這后一解釋是來自于0級樹枝狀分子產(chǎn)物不能穩(wěn)定有熒光性的Au納米點。另外，純化了的溶液中，沒有大的金納米顆粒以猝滅納米點熒光(Dulkeith等人，Phys.Rev.Lett.2002，89，art，No-203002；Haang &Murray，Langmuir 2002，187077-7081)。
總之，單分散性Au8納米點是在樹枝狀分子PAMAM水溶液中合成并穩(wěn)定化的。Au8納米點顯示出強的粒徑特性發(fā)射，其水溶液中的量子產(chǎn)率實測為～41％。金納米點作為一種新熒光團的實際應(yīng)用，由于量子產(chǎn)率不止100倍的提高而變得可能。
實施例4樹枝狀分子-包囊化的銅納米簇的產(chǎn)生OH封端PAMAM的2級和4級產(chǎn)物(G2-OH和G4-OH，Aldrich)用于穩(wěn)定和加溶處于水和甲醇兩溶液中的銅納米簇。通過把0.5μmol G4-OH或G2-OH和1.5μmol硫酸銅溶于2mL蒸餾水(18MΩ)，通過向溶液中慢慢加入等量NaBH4，銅離子就螯合到樹枝狀分子里并被還原。被還原的銅原子聚集在樹枝狀分子內(nèi)部并形成小納米點(樹枝狀分子-包囊化的納米簇)和大納米顆粒，留下一種黃色透明的銅納米點溶液。
清楚地看到了這些樹枝狀分子包囊化的銅納米點溶液強的藍色熒光(激發(fā)峰392nm，發(fā)射峰470nm)(Fig，8)。用不同級別的PAMAM樹枝狀分子產(chǎn)物重做這種實驗并測定其發(fā)射和激發(fā)光譜。測定各級樹枝狀分子包囊化的銅納米簇的量子產(chǎn)率。用電霧化電離(ESI)質(zhì)譜法分析包囊化的納米簇的粒徑。取決于還原條件、銅的濃度，和樹枝狀分子級別，各種含銅峰出現(xiàn)在質(zhì)譜中。樹枝狀分子包囊化的銅納米簇的進一步表征的實施，如實施例5-6對樹枝狀分子包囊化的銀納米點所述的。
實施例5水溶性光活化的熒光Ag納米點產(chǎn)生的最優(yōu)化和控制樹枝狀分子和化學還原劑通常用于合成大的金屬和半導(dǎo)體納米顆粒，而更小的Ag納米點卻能不費力地合成，就是把0.5mM AgNO3水溶液添加到所需的PAMAM樹枝狀分子溶液(適當摩爾比，pH調(diào)至中性)中。通常，不加化學還原劑，靠慢慢加入少量NaBH4來防止光活化也可得到類似的結(jié)果。在沒加任何化學還原劑的溶液中，該混合物只要保存在暗處，就看不到可見吸收且沒有熒光。但是，經(jīng)用一未濾光的100W汞燈光活化整個溶液5分鐘后，可見吸收(～450nm)和強熒光二者都出現(xiàn)。當該溶液通過顯微鏡高強度照射時在小體積內(nèi)發(fā)生更快的光活化。
雖然此納米點合成方法做得很好，可是此法產(chǎn)生一種分布很寬的帶有全可見區(qū)熒光的納米點。為使合成納米點的分布變窄，必須使光譜性能與產(chǎn)生條件發(fā)生連系。某些納米簇粒徑可能在特定的激發(fā)和濃度條件下優(yōu)先產(chǎn)生。例如，有人指出總熒光強度和總體發(fā)射顏色是和所用樹枝狀分子級別非常相關(guān)的0級樹枝狀分子產(chǎn)物在低Ag∶樹枝狀分子比(0.3∶1)時主要產(chǎn)生黃和綠色強熒光納米點，而4級PAMAM則需要更高的Ag樹枝狀分子比(3∶1)以產(chǎn)生全色納米點。在與0級～4級或高級樹枝狀分子起反應(yīng)中，通過調(diào)節(jié)Ag∶樹枝狀分子比和總濃度兩者來使反應(yīng)條件最佳化。工作在各樹枝狀分子級別只是剛開始產(chǎn)生熒光的比例下，最小的發(fā)射納米簇之濃度會優(yōu)選提高。用不同波長范圍對等分量的各溶液照射不同時間。把這些溶液與那些經(jīng)由亞化學計量添加NaBH4溶液制得的溶液相比，以對照化學和光還原方法。用電霧化電離質(zhì)譜法測定等分量的各試樣溶液并與來自未光活化的溶液之信號對照。用熒光顯微術(shù)和ESI-MS的平行分析來鑒定最小納米簇的光譜特征。
此組實驗會幫助闡明Ag納米簇在納米點試樣中的分布。因為納米點只含幾個原子，納米點粒徑可能至少會粗略地遵守泊松統(tǒng)計規(guī)律(小數(shù)統(tǒng)計)，給出每個樹枝狀分子可預(yù)測的銀原子數(shù)。但是泊松統(tǒng)計是假設(shè)不存在其它干擾以偏離計數(shù)統(tǒng)計。因為不同納米簇在不同情況下大體上穩(wěn)定，調(diào)整納米點產(chǎn)生條件會得出修正的泊松分布，對鑒定各粒徑納米點的性能，有關(guān)總數(shù)作出實驗驗證是重要的。在給定濃度下，調(diào)節(jié)濃度應(yīng)改變這個由反應(yīng)進度調(diào)節(jié)的有關(guān)總數(shù)。偏離泊松統(tǒng)計規(guī)律將是相對平衡濃度和特定納米簇粒徑優(yōu)選穩(wěn)定的一個直接量度。所以，對于給定量的樹枝狀分子改變Ag的濃度用質(zhì)譜法和熒光顯微術(shù)測定在光活化前后各該混合物將會提供關(guān)于控制納米點形成的平衡常數(shù)之詳細信息。這些實驗將會決定所需的Ag濃度來優(yōu)選產(chǎn)生一種在該納米點范圍內(nèi)想要的銀納米簇和各級PAMAM的平衡常數(shù)。
加之，利用彩色CCD攝象機和熒光分光計，在熒光顯微鏡視野中對某一給定顏色的納米點進行計數(shù)。圖象的模擬、擬合、和處理軟件已記載于IDL(Interactue Data Language Research Systems Inc.)。一個開放的程序設(shè)計環(huán)境對圖象和數(shù)學處理來說是理想的。測量單個分子熒光光譜可能是一種冗長乏味的工作方法，單個納米點的一個代表性試樣用分光計來探測以決定給定試樣中不同的發(fā)射納米點的數(shù)目。只要光譜純度和單個納米點發(fā)射窄度確定，便用彩色CCD攝象機來對單個的特征計數(shù)。一種帶標準鑲嵌濾光器產(chǎn)生彩色圖像的單片式CCD，用4個像素(1紅，1藍，2綠)生成一個復(fù)合彩色像素。在單片彩色CCD上受衍射限制的小部件不能覆蓋足夠的像素以產(chǎn)生準確顏色。當用此攝象機檢測時，由于通過不同數(shù)目的紅、藍和綠像素檢測，任何試樣位置的小變化實際上會記錄成發(fā)射的顏色變化。由于各特征尺寸小，三片式CCD將會提供準確的顏色信息。采用三片式CCD，每個粒子的發(fā)射顏色將被鑒別，而用戶編制的粒子計數(shù)軟件將被用來自動檢點各色納米點的數(shù)目。來自單個納米點的熒光顏色分布將與各光活化或化學還原的溶液的質(zhì)譜發(fā)生連系，以在各類納米點溶液內(nèi)的特定納米簇粒徑指定顏色。分光計將會表征鑒定納米點發(fā)射的譜寬，而CCD只提供綜合顏色，但帶有高靈敏度和時間分辨率。因此，為了準確表征鑒定單個納米點，及起因于某組產(chǎn)生條件的納米點分布，它們的組合是重要的。
實施例6特定Ag納米點尺寸合成的最優(yōu)化已知的PAMAM樹枝狀分子和Ag離子及原子的pH敏感性，可用來控制Ag納米簇尺寸、因而控制光譜性能。已知PAMAM的尺寸隨pH的降低而增大(Kleinman等人，J.Phys.Chem.B 2000，10411472-11479；Lee等人，Macromolecules 2002 354510-4520；及Bosman等人，Chem.Rev.1999，991665-1688)。此粒徑變化使樹枝狀分子外部顯然更加可滲透，且在其表面產(chǎn)生較大空腔來容納納米簇甚至納米顆粒。在高pH下，樹枝狀分子相當緊密，從而使離子不能到達樹枝狀分子核心。此尺寸行為很好地配合了銀對堿性環(huán)境的偏愛。因此，Ag離子和金屬納米簇在樹枝狀分子內(nèi)部與堿性的胺強相互作用。隨著pH降低，Ag向樹枝狀分子內(nèi)部的分配會明顯增多。在酸性pH下提高了的樹枝狀分子滲透性和銀易與樹枝狀分子內(nèi)部相互作用兩者都使人認為較大的納米簇理應(yīng)在低pH下更易形成。由于pH對高級樹枝狀分子具有更明顯的作用，對4級產(chǎn)物G4-OH和G4-NH2PAMAM樹枝狀分子的pH研究將會實施。此方案用來把納米點的尺寸分布優(yōu)先轉(zhuǎn)移到較大和較小的尺寸。作為pH的一個函數(shù)，測量整體吸收和發(fā)射光譜，如上所述對給定顏色的單個納米點計數(shù)。作為樹枝狀分子級別和pH兩者的函數(shù)，測定納米點分布以便獲得控制納米點的光譜性能。只要納米點產(chǎn)生，就使pH返回到7，以測定形成的納米點在PAMAM主體中的穩(wěn)定性。對全部上述溶液做ESI-MS，使納米點試樣的光學性能的變化與Ag納米簇粒徑的變化直接發(fā)生連系。同時，這些方法將能測定那些涉及PAMAM樹枝狀分子內(nèi)特定Ag納米簇粒徑的光譜性能。
樹枝狀分子-包囊化的納米點的光物理表征對時間范疇內(nèi)的納米點做整體壽命測定，使用倍頻鈦藍寶石激光器作為激發(fā)(400nm、82MHz重復(fù)率、200fs脈沖寬度)、10GHz Si光電二極管、和20GSample/sec數(shù)字示波器，在每個方式中，此組合能以50ps時間分辨率采取樣點。此快速檢測系統(tǒng)足夠靈敏地通過光學顯微鏡為整體試樣工作。但是，對于單個納米點，使用一種時間相關(guān)單光子計數(shù)板(Picoquant)和較慢但很敏感的雪崩光電二極管，兩者都受APD抖動的限制到～300ps的壽命。通過儀表響應(yīng)的去褶，Ag納米點的主要熒光壽命部分測定為～100ps。所以，對來自Ag納米點組較亮的發(fā)射，亞100ps壽命的快速測定就使用這一更快的檢測系統(tǒng)。如有多壽命存在，則有時間范疇法來使各種時間組分去褶是相當直接的。
吸收截面測定的方法是，通過與單個DiIC18分子相比，一種帶有非常明確表征的吸收截面的染料和一種在單分子態(tài)以其為工作對象的染料(Bartko & Dickson，J.Phys.Chem.B1999，103；3053-3056；Bartko& Dickson，J.Phys.Chem.B1999，10311237-11241；和Bartko等人，Chem.Phys.Lett.2002，358459-456)。通過鑒定閃爍物種和那些同時顯示的偶極發(fā)射模式來確認單分子性能，便于避免給定試樣中不知其準確濃度，和簡單測定已知吸收截面的單分子之吸收強度，并比較飽和強度。在給定的試樣中，利用個體納米點光譜，在給定納米點溶液范圍內(nèi)的分布、及其相應(yīng)的吸收截面的組合，測定各納米點品種的濃度。這將用于測定在給定溶液中給定顏色納米點的光密度，并通過利用樹枝狀分子和銀的初始濃度來測定納米點形成的平衡常數(shù)。
利用各粒徑納米點的測得的濃度及其對總?cè)芤何盏呢暙I，來測定給定納米點類型的光密度。通過與羅丹明6G甲醇溶液的比較，制備相同光密度的納米點溶液。通過在和標準羅丹明溶液等同的納米點光密度之波長激發(fā)下測定熒光量子產(chǎn)率。羅丹明熒光強度與所需納米簇熒光強度(當在其特征光譜窗范圍內(nèi)查看時，在考慮到來自溶液中其它納米簇的更小而已測到的貢獻之后)之比，將直接產(chǎn)生各納米點的量子產(chǎn)率。這種比例測量方法不需要知道納米點的絕對濃度就能夠準確測定量子產(chǎn)率，因為羅丹明6G參考標準和被探測的納米點兩都吸收的光子數(shù)目是一樣的。加之，整體和單分子試樣兩者的質(zhì)譜和光物理的表征法將明確地決定各色納米點的粒徑和光物理特征。此信息也將引出一套用于相對于其它粒徑優(yōu)選富集一種納米點粒徑的合成方法。
熒光穩(wěn)定性基本上不受環(huán)境相互作用的影響，正在進一步仔細研究樹枝狀分子-穩(wěn)定的發(fā)射，以求產(chǎn)生在多種不同環(huán)境里一種給定納米點的在數(shù)量上相似的發(fā)射。這種環(huán)境不敏感性與II-VI(如CdSe)量子點的環(huán)境不靈敏性完全相反，其中表面鈍化由于表面存在阱態(tài)而對綜合光物理性能非常關(guān)鍵(Bracheg等人，Science 1998，2812013-2016；Chan & Nie，Science 1998，2812016-2018；Nirmal等人，Nature 1996 383802-804；Huynh等人，Adv.Mater.1999，11923；Alaisatos，Endeauomr 1997，2156-60；Klimou等人，Phys，Rev.B 2000，61R 13349-R13352)。樹枝狀分子-包囊化的納米點看來象是通過一種隱藏在水溶性樹枝狀分子核心里的生色團來避免這樣一些困難。閃爍(熒光間歇現(xiàn)象)是作為離子強度和pH的函數(shù)來探測的。通常使用的緩沖劑諸如磷酸鹽緩沖劑和乙酸鈉/乙酸等用來同時控制pH并調(diào)節(jié)離子強度。把帶有不同吸收的從丙烯酰胺到染料的猝滅劑添加到各納米點溶液中來測定Ag納米點的能量傳遞。為測定猝滅度，和樹枝狀分子對納米簇的穩(wěn)定性及與環(huán)境的隔離性而做Stern-Valmer猝滅研究。但是，快的壽命就意味著這些納米點基本上對猝滅不敏感。除閃爍和總發(fā)射強度以外，還有熒光壽命和光譜也將被測，以判定是否發(fā)生由于環(huán)境相互作用的任何變化。但是，因其極強躍遷和短壽命，它們可能在FRET供體-受體對中形成極好的受體。整體和單個實驗譯解那些可能發(fā)生的光物理動態(tài)特性的變化，該變化起因于異常閃爍動態(tài)特征或熒光效率中的平均總減少。主體密度和樹枝狀分子粒徑也得到調(diào)節(jié)。為直接測定由連續(xù)的較大、和較高密度的樹枝狀分子主體提供的保護，探測了Ag納米點的閃爍動態(tài)特性和0級到4級PAMAM樹枝狀分子的光物理參數(shù)。這些研究將直接測定溶劑和猝滅劑向樹枝狀分子核心里的滲入程度。
取向動態(tài)特性以線性偏振個體表面為界(bound)的納米點之取向動態(tài)特性研究有兩個目的認為小Ag納米簇的幾何結(jié)構(gòu)變化結(jié)果形成極不相同的吸收和發(fā)射波長(Harbich等人，J.Chem.Phys.1990，938535-8543；Fedrigo等人c，J.Chem.Phys.1993，995712-5717；Rabin等人，Chem.Phys.Lett.2000，32059-64)，以及取向信息可能對生物標記實驗非常有用，無論是用于能量傳遞測量或是用于跟蹤個體蛋白質(zhì)的取向運動。這與更大的不是線式偏振的CdSe量子點相反，其是各方向發(fā)射，其特征在于一個單獨的“暗”軸(Empedocles等人，Nature 1999，399126-130)。因此，使納米簇的取向動態(tài)特性與任何觀測的光譜變化發(fā)生連系，對了解幾何結(jié)構(gòu)的變化是否也產(chǎn)生不同著色的Ag納米點這一問題是極其重要的。這些實驗也將用三片彩色CCD來進行以獲得彩色發(fā)射模式。為確認光譜足夠窄，利用150l/mm衍射光柵通過顯微鏡聯(lián)合攝譜儀獲得單個納米點熒光光譜。將取向跡線擬合到偶極界面處的發(fā)射模型.(Bartko等人，J.Phys.Chem，B1999，1033053-3056；Bartko & Dickson，J.Phys，Chem.B1999，10311237-11241；Hollars & Dunm，J.Chem.Phys.2000，1127822-7830；Helle & Axelrod，J.Opt.Soc.Am，B-Opt.Phys.1987，4337-350)，當通過光學顯微鏡觀察來跟蹤起因于樹枝狀分子主體中納米簇遷移的真實3-D納米簇取向動態(tài)特性。
實施例7銀納米點的肽包囊化的著手利用生物系統(tǒng)固有的巨大多樣性(Whaley等人，Nature 2000，405665-668；Lee等人，Science 2002，296，892-5；和Seeman & Belcher，2002.Proc.Nat.Acad.Sci USA，99Supp126451-5)，已經(jīng)證明，一個短的九氨基酸肽能使Agn納米簇熒光穩(wěn)定。最近報道，序列為AHHAHHAAD(SEQ ID NO1)的短肽在NaBH4還原時與大的金屬和半導(dǎo)體納米顆粒相互作用(Djalali等人，J.Am.Chem.Soc.2002，12413660-13661；Slocik等人.Nano Lett.2002，2169-173)。利用上述輕度光活化步驟，不用化學還原劑，以Ag與肽之摩爾比為0.1∶1，產(chǎn)生了有極強熒光性的肽一包囊化的納米點。與在其它支架里形成納米點所需的高比例相比，這個比例產(chǎn)生了許多更有熒光性的品種。在當量支架濃度下，3∶1的Ag與樹枝狀分子之比是樹枝狀分子包囊化的所必需的，而從BSA(牛血清清蛋白)產(chǎn)生熒光就需要更高的比例(高的Ag濃度)，上兩個結(jié)果就確實意味著該肽優(yōu)先結(jié)合納米簇。這種初步結(jié)果指出，即使對未優(yōu)化的肽來說，非特定標記應(yīng)當不成問題，這是由于極強的肽-銀相互作用。加之，用此肽熒光圖象幾乎沒有全紅和橙色發(fā)射體，表明比那些由大樹枝狀分子穩(wěn)定的納米點有更窄的熒光分布。因此，即使是肽包囊化的初步嘗試，這一更強更特定結(jié)合也優(yōu)選產(chǎn)生了一種以更窄的粒徑分布，在肽支架里的更短發(fā)射波長(大概更小)的Ag納米簇。這一結(jié)果強力支持如下的假說高選擇性的納米點結(jié)合肽可經(jīng)由推薦的篩選方法來鑒定，而不同的肽可能使不同粒徑/顏色的納米點穩(wěn)定。
極小，有強熒光性和非常光穩(wěn)定的水溶性Ag納米點已經(jīng)產(chǎn)生。它只有幾個由PAMAM樹枝狀分子和短肽包囊化的的原子。非常有利的光學性質(zhì)已經(jīng)產(chǎn)生了具有全可見區(qū)粒徑相關(guān)發(fā)射的、非常光穩(wěn)定、和強力吸收和發(fā)射的物質(zhì)。我們可以利用單分子顯微鏡和水溶性貴金屬納米簇來產(chǎn)生和表征那些更強有力的標記方法和材料。這些特定的，多色的標記使那些高靈敏度的單分子實驗成為可能、大大提高了容易程度和實驗簡單性。這一類型的新熒光探針開發(fā)的關(guān)鍵在于單分子方法在探索生物系統(tǒng)復(fù)雜性方面的一般適用范圍和利用。
實施例8用于銀納米點包囊化的最佳肽的鑒定因為Ag是生物相容的，且能做到無毒，這就為開發(fā)一種可能達到的最小和最亮的體內(nèi)熒光標記提供極好機會。上述這些方法可應(yīng)用在肽支架里面金和銅納米點的形成。樹枝狀分子-包囊化的納米點已能用作小型、極亮的生物相容標記。盡管比綠色熒光蛋白(GFP)小得多，3.272kD2級PAMAM樹枝狀分子仍然大于多數(shù)有機染料。為進一步探究Ag納米點用作生物標記的開發(fā)潛力，對那些特異地結(jié)合在不同大小金屬納米簇的特定肽序列作鑒定，對其用作生物分子的特異性多色標記之真實前景作評估。對于Ag納米點熒光通過肽文庫的建立和搜索，對那些最緊密結(jié)合的序列作鑒定。對在這些序列里形成的納米點之穩(wěn)定性、光活化、和光物理性能作測定。與樹枝狀分子主體比較的相對穩(wěn)定性也作評估。照這樣，對納米簇在樹枝狀分子與肽間的轉(zhuǎn)移作了研究。
實驗方法許多蛋白質(zhì)-配體相互作用的研究利用噬菌體展示技術(shù)來鑒定那些結(jié)合其它分子的肽(Wolcke & Weinhold，Nucleosides NucleotidesNucleic Acids 2001，201239-41；Krook等人，Biochem，BiopHys，Res，Commun，1994，204849-54；Nicholls等人，J.Molecular Recognition1996，9652-7(1996)；Stern & Gershoni，Methods Mol，Biol.1998，87，137-54)。盡管是一種有效的方法，噬菌體展示也需要把相互作用組分之一固定在固體表面。基于噬菌體的肽文庫篩選的應(yīng)用最近也已在合成和穩(wěn)定單一的無機材料中得到了證明(Whaley等人，Nature2000，405665-668；Lee，等人Science 2002，296892-895；Seeman &Belcher，Proc，Natl.Acad.Sci，USA 2002，996451-6455)。
因為靶肽會使溶液中的強Ag納米簇熒光穩(wěn)定，Agn結(jié)合型肽的鑒定則通過一種基于大腸桿菌的系統(tǒng)(FliTrx隨機肽展示文庫，Invitrogen)與熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)偶聯(lián)來完成。這兩種技術(shù)的組合將允許進行基于溶液的篩選策略。使用主要的細菌鞭毛蛋白(FliC)和硫氧還蛋白(TrxA)，F(xiàn)liTrx肽文庫把肽展示在大腸桿菌表面上。市場上買得到的Fli Trx文庫由不同組插入硫氧還蛋白之活性部位環(huán)的隨機十二肽的組成，該硫氧還蛋白本身插入鞭毛蛋白的非必需區(qū)。隨機十二肽被形成在TrxA里的二硫鍵限定。給培養(yǎng)物添加色氨酸，能誘導(dǎo)肽蛋白融合體的表達，而這將保證全部肽融合體同時展示。當誘導(dǎo)后，該融合蛋白就輸出并裝配在細菌細胞表面組裝成鞭毛，提供受限肽的展示。因這些肽是以高拷貝數(shù)產(chǎn)生在大腸桿菌的外面，對這些肽穩(wěn)定Ag納米點熒光的性能進行了測定。然后用流式細胞術(shù)按照熒光性質(zhì)對細菌群體進行分選，以分離那些發(fā)射熒光的細菌。
Agn納米點在展示的Fli Trx肽上產(chǎn)生的最佳化用上述鑒定的Agn通過光學顯微鏡來測定在細菌表面上形成肽包囊化的納米點的最佳光還原條件(見實施例7)。合成了一種編碼九肽序列的寡核苷酸，以及側(cè)翼BglII和EcoRV識別序列(Operon Co.)并將其克隆到來自Invitrogen Co的pFli Trx載體之多克隆位點上。這一構(gòu)建體將把肽如上所述地插入鞭毛蛋白的非必需區(qū)。分離質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入宿主菌株GI826(Invitrogen)導(dǎo)致該肽在大腸桿菌表面展示。然后用此菌株來鑒定那些當用FACS來篩選FliTrx文庫時適于產(chǎn)生熒光肽-包囊化的Ag納米點的光活化和化學還原條件。當用藍光照射和當使其受到BH4還原時，評估細胞的生存力以及產(chǎn)生Ag納米點的效率。起初，來自個體細菌的總熒光，將作為通過光學顯微鏡許多不同Ag+濃度的光還原時間的一個函數(shù)來測量。這一方法非常簡單，它包括用溶液中的電子供體來光化學地還原Ag離子(Tani & Murofushi，J.Imag.Sci.Technol.1994，981-9；Stellacci等人，Adv.Mater.2002，14194；Eachus等人，Annu.Rev.Phys.Chem.1999，50117-144).此方法使用情況良好，這是因為相對于電子激發(fā)的分子之能級來說，Ag的能級有利(Tani & Murofushi，J.Imag.Sci.Technol.1994，981-9；Marchetti等人J.Phys.Chem.B1998，1025287-5297；Stellacci等人，Adv.Mater.2002，14194；Eachus等人..Annu.Rev.Phys.Chem.1999，50117-144)。光還原提供控制納米簇粒徑和顏色的機會，這是由于只有幾個原子(即Ag2～8)構(gòu)成的Ag納米簇之不同的還原勢。或者，可通過慢慢添加多達1個當量的NaBH4或其它還原劑來利用化學還原，借此也產(chǎn)生熒光納米點。產(chǎn)生最強熒光的Ag納米點標記的大腸桿菌細胞的條件就是全部文庫搜索研究的初始條件。使用鑒定了的強熒光產(chǎn)生條件，把熒光細菌培養(yǎng)物洗滌、接著懸浮在磷酸鹽緩沖劑中以供FACS分析。此洗過的大腸桿菌懸浮液也將在顯微鏡載物臺上再測定總熒光，以便評估當試樣制備之際細菌表面存在的熒光之穩(wěn)定性。
通過隨機肽展示文庫鑒定特異性Ag納米點的結(jié)合序列使用一種商品展示文庫(Invitrogen)，該文庫包括1.8×108的多樣性，以鑒定那些特異地與Ag納米簇相互作用的肽序列。制備的文庫將分為50小瓶并冷凍，以供總熒光測定時Ag納米點結(jié)合條件的個體分析和最佳化。各小瓶將包括大部分肽文庫并在光學顯微鏡載物臺上經(jīng)由低倍率物鏡測定最佳Agn結(jié)合條件。首先，文庫培養(yǎng)物在有色氨酸的情況下生長6小時以誘導(dǎo)融合鞭毛蛋白的表達，培養(yǎng)物先用磷酸鹽緩沖液洗滌然后用硝酸銀孵育，以通過光還原形成銀納米點。
流式細胞計量術(shù)能使細胞/粒子粒徑與熒光相關(guān)。將產(chǎn)生FSC(正向散射，定義相對大小)和SSC(側(cè)向散射，定義相對粒度)的點曲線圖(CellQuest程序)來確定一個使用FACS時規(guī)定細菌群體的“門”。將按總熒光強度分布來把細菌分選。三個熒光檢測波道是可用的FL1，530nm(30nm寬度)，F(xiàn)L2，585nm(42nm寬)和FL3，650nm及以上，上述波道可單用或并用于細胞分選。預(yù)料大部分帶Ag納米簇非結(jié)合肽的細菌熒光極微而只有帶顯著熒光的被回收。但是，各波道的熒光強度和正向散射一起將用來鑒定那些起因于Agn結(jié)合和穩(wěn)定的強熒光細胞，使采集的細菌在氨芐青霉素選擇瓊脂平板上培養(yǎng)以分離單一菌落。各單一菌落將被保存并再次用流式細胞計量術(shù)和光學顯微鏡檢驗以確認相關(guān)的熒光表型。一旦測定熒光強度，就從那些帶有明亮納米點熒光的細菌中分離質(zhì)粒DNA，并通過直接測序分析來確定肽序列。陽性克隆序列的對比可產(chǎn)生一連續(xù)的共有肽序列；或者，也可識別一種由不連續(xù)的保守殘基形成的結(jié)構(gòu)基序。通過固相肽合成法來合成所確定的序列，通過類似于上述研究的熒光顯微技術(shù)、光物理表征法和質(zhì)譜測定法來表征其與Ag納米點的結(jié)合性能。
在FliTrx肽展示系統(tǒng)內(nèi)建立用戶定義的文庫帶有各種肽長度的鞭毛蛋白展示文庫能夠利用pFliTrx載體而產(chǎn)生，可以代替商品文庫篩選。將合成15bp(5a.a.)、27bp(9a.a.)、45bp(15a.a.)和60bp(20a.a.)的簡并寡核苷酸，在該寡核苷酸側(cè)翼有Bgl ∏和EcoRV限制性識別序列(Operon Co.)。用所述兩酶消化寡核苷酸混合物，并克隆到已被該兩酶所切的pFli Trx載體里。從菌落集合中分離出來的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入測試菌株GI 826，重復(fù)上述的篩選方法。
此法利用氨基酸的天然多樣性選擇特異的Ag納米簇結(jié)合來形成一種生物相容性的強熒光納米點。在許多方法中這是一種類似于把(His)6標簽基因結(jié)合到目的蛋白質(zhì)的N端或C端的通用方法，該蛋白質(zhì)是將要經(jīng)由與Ni起特異反應(yīng)而純化的。類似地，此研究定義的Agn結(jié)合型肽能夠特異和選擇性地結(jié)合Ag納米簇，借此增強其熒光。加之，F(xiàn)ACS的多熒光檢測波道也能夠鑒定一序列的肽，該肽優(yōu)選穩(wěn)定不同粒徑，因而不同顏色的納米點。
Agn納米簇結(jié)合型肽的表征法一旦常規(guī)地鑒定和合成了最佳肽的長度和序列，熒光納米簇的環(huán)境穩(wěn)定性和光物理性能就象上述樹枝狀分子-包囊化的納米點那樣直接測定。很可能特定序列用優(yōu)選穩(wěn)定特定的納米簇粒徑并具有比在PAMAM樹枝狀分子主體里可能更窄的發(fā)射，而同樣的粒子計數(shù)方法將用來表征鑒定那些包囊化的在各特性肽里的各類納米簇數(shù)目。其實，即便在使用的那種產(chǎn)生并穩(wěn)定Ag納米點熒光的初始肽里，也看到納米點粒徑分布較之樹枝狀分子包囊化的里的更窄。由于Agn與堿性殘基的親合力，較大的納米簇可能被更堿性序列優(yōu)選穩(wěn)定。這可能在肽-Ag結(jié)合相互作用中賦予粒徑和因而是納米點的選擇性。結(jié)果，這種Ag納米點結(jié)合肽的基因選擇可能產(chǎn)生種種各自穩(wěn)定不同納米簇的肽。這將產(chǎn)生許多帶有不同光學性能的各種可編程標記，各自都能用作獨立的單生物分子標記。為了測定在各鑒定Agn結(jié)合肽里的納米簇粒徑分布及其相關(guān)給定顏色的發(fā)射源數(shù)目，將要對合成、并接著測Agn納米點結(jié)合的全部肽做質(zhì)譜測定(ESI和MALDI)。此相關(guān)單納米點熒光顯微技術(shù)、整體吸收和發(fā)射，以及質(zhì)譜分析涉及區(qū)分肽和銀離子的濃度，直接表征鑒定各經(jīng)由FACS文庫的篩選的肽的結(jié)合常數(shù)。
實施例9樹枝狀分子和肽間Ag納米簇的轉(zhuǎn)移由于銀鹽通常在水中的溶解度非常有限，由于其極小的溶度積和存在于生物介質(zhì)中的大量氯離子。AgCl很可能會從與生物相關(guān)的溶液中沉淀出來。這會帶來一個潛在問題把Agn納米簇運送給那些上述研究中規(guī)定的肽，且可能限制強熒光Ag納米簇的直接遞送。但是發(fā)現(xiàn)，當包囊化在樹枝狀分子主體中時，Ag納米簇非常穩(wěn)定并在生理鹽水濃度保持很亮的熒光。連小的2級PAMAM樹枝狀分子實際上都使Ag納米簇免于AgCl沉淀。而且，樹枝狀分子是熟知的、能使其內(nèi)部裝有的物質(zhì)穿過生物膜運送(Toth等人.，STP Pharma Sci.1999，993-99；Bielinska等人，Biomaterials 2000，21877-887；Lmo等人，Macromolecules2002，353456-3462；Yoo等人，Pharm.Res.1999，16；1799-1804；Wiwattanapatapee等人，Pharm Res.2000，17991-998；Esfand & Tomalia，DrugDiscov.Today 2001，6427-436)，在開發(fā)體內(nèi)標記實驗方面是一種有價值的性能。因此，對小的PAMAM樹枝狀分子進行了作為載體的研究，該載體把Ag納米簇直接轉(zhuǎn)移到那些鑒定的、強力結(jié)合Ag納米簇的肽上。用同樣的篩選方法進行了Ag納米點轉(zhuǎn)移作為肽的鑒定和選擇的研究。不是使用于有效標記那些在Fli Trx文庫里的肽之銀離子濃度最佳化，而是當觀察顯微鏡載物臺上的溶液(用10×物鏡)以監(jiān)測納米點交換時，調(diào)節(jié)樹枝狀分子-包囊化的納米點的濃度。一旦標記E.coli細胞的情況得到鑒定，為那些含有能從樹枝狀分子獲得納米點的肽細胞之肽文庫就被明確地篩選出來。因為流式細胞計量術(shù)能根據(jù)散射和熒光選擇細胞，很小的樹枝狀分子在各通道都是不可探測出來的。只有那些大到足以散射足夠光來引發(fā)采集的細胞，從而避免由于樹枝狀分子-包囊化的納米點熒光的假陽性。加之FliTrx文庫里的各個細菌都有成千成萬的肽拷貝，因而提供一種更強熒光信號的潛力。只有那些顯示強熒光和散射光的細胞才被采集、氨芐青霉素選擇生長，并測序。這種樹枝狀分子-肽文庫納米點轉(zhuǎn)移可能有利于特定環(huán)境條件下的較低級PAMAM樹枝狀分子，諸如在那些使樹枝狀分子-包囊化的納米點更易逃脫的特定pH，對pH最穩(wěn)定的肽-包囊化的納米點因而可能在未來標記實驗中非常實用。這一額外的篩選方法將進一步選擇那些能夠優(yōu)先從樹枝狀分子提取Ag納米簇的肽，為體外和體內(nèi)簡易地標記蛋白質(zhì)提供了可能性。
權(quán)利要求
1.一種包含水溶性熒光標記的組合物，該標記包含包囊化的貴金屬納米簇。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中該貴金屬納米簇包含2～8個貴金屬原子。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中該貴金屬是金。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中該貴金屬是銀。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中該貴金屬是銅。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中該包囊化的貴金屬納米簇的熒光量子產(chǎn)率大于約1％，飽和強度為約1～1000W/cm2。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中在約460nm下的低激發(fā)強度為約30W/cm2。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中該熒光標記顯示偏振光譜發(fā)射，并顯示偶極發(fā)射模式。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中該熒光標記的光譜發(fā)射提供有關(guān)生物狀態(tài)的信息。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中該生物狀態(tài)選自生物部分的定量和定性存在；生物部分的結(jié)構(gòu)、組成、和構(gòu)象；生物部分在環(huán)境中的定位；生物部分間的相互作用；生物化合物結(jié)構(gòu)的變化和在細胞過程中的變化。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中該貴金屬納米簇帶有不定的電荷。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中當熒光標記被激發(fā)時，在pH約3～約8范圍內(nèi)發(fā)熒光。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中該熒光標記的直徑為約小于1nm到15nm。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中該貴金屬納米簇在光漂白前發(fā)射多于約108個光子。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中當包含多于一種貴金屬納米簇的組合物被激發(fā)時，大于約80％的貴金屬納米簇發(fā)熒光長達約30分鐘以上。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中該貴金屬納米簇在514.5nm或476nm下，在約300W/cm2的連續(xù)激發(fā)能激發(fā)時發(fā)熒光且其中熒光是飽和熒光。
17.權(quán)利要求1的組合物，其中該貴金屬納米簇被包囊化在樹枝狀分子里。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中該樹枝狀分子包含聚酰胺胺。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中聚酰胺胺樹枝狀分子選自0級、1級、2級、3級、4級和更高級聚酰胺胺樹枝狀分子。
20.權(quán)利要求18的組合物，其中聚酰胺胺樹枝狀分子是2級、或4級羥基封端的聚酰胺胺樹枝狀分子。
21.權(quán)利要求1的組合物，其中該貴金屬納米簇被包囊化在肽里。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中肽的長度為約5～500個氨基酸。
23.權(quán)利要求21的組合物，其中肽的長度約為5～20個氨基酸。
24.權(quán)利要求21的組合物，其中該肽包含如SEQ ID No1中確定的多肽序列。
25.一種樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇的制備方法，它包括下列步驟a)把樹枝狀分子、含貴金屬的水溶液、和水性溶劑混合，以產(chǎn)生混合溶液；b)添加還原劑；c)接著添加足量酸性化合物把混合溶液調(diào)至中性范圍pH；和d)攪拌調(diào)好pH的混合溶液使樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇得以形成。
26.權(quán)利要求25的方法，其中還原劑選自光、化學還原劑、及其組合。
27.權(quán)利要求25的方法，其中從步驟a)到步驟c)混合溶液的溫度為約65°F～約100°F。
28.權(quán)利要求27的方法，其中該混合溶液的溫度為約68°F～約74°F。
29.權(quán)利要求25的方法，其中貴金屬選自銀、金、和銅。
30.權(quán)利要求25的方法，其中含貴金屬的水溶液選自AgNO3溶液、HAuCl4·nH2O溶液、和CuSO4·nH2O溶液。
31.權(quán)利要求25的方法，其中含貴金屬的水溶液為HAuCl4·nH2O，且其中攪拌調(diào)好pH的混合溶液至少1小時使樹枝狀分子包囊化的金納米簇得以形成。
32.權(quán)利要求31的方法，其中攪拌調(diào)好pH的混合溶液約48小時，使其形成樹枝狀分子包囊化的金納米簇。
33.權(quán)利要求25的方法，其中當在約460nm的約30W/cm2低激發(fā)強度激發(fā)時，該樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇顯示偏振光譜發(fā)射。
34.權(quán)利要求25的方法，其中當樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇被激發(fā)時的光譜發(fā)射至少部分取決于納米簇的粒徑。
35.權(quán)利要求25的方法，其中該樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇能在pH約3～8范圍內(nèi)發(fā)熒光。
36.權(quán)利要求25的方法，其中該樹枝狀分子包囊化的貴金屬納米簇在光漂白前發(fā)射多于約106個光子。
37.權(quán)利要求25的方法，其中當多于一種貴金屬納米簇在514.5nm或476nm約300W/cm2的連續(xù)激發(fā)能激發(fā)時，大于約90％的貴金屬納米簇發(fā)熒光長達30分鐘以上。
38.權(quán)利要求25的方法，其中該樹枝狀分子包含聚酰胺胺。
39.權(quán)利要求38的方法，其中該聚酰胺胺樹枝狀分子選自0級、1級、2級、3級、4級和更高級聚酰胺胺樹枝狀分子。
40.一種肽包囊化的能發(fā)熒光的貴金屬納米簇的制備方法，它包括下列步驟a)把肽、含貴金屬的水溶液、和蒸餾水混合，以產(chǎn)生混合溶液；b)添加還原劑；c)接著添加足量酸性化合物把混合溶液調(diào)至中性范圍pH；和d)攪拌調(diào)好pH的混合溶液使肽包囊化的貴金屬納米簇得以形成。
41.權(quán)利要求40的方法，其中該還原劑選自光，化學還原劑及其組合。
42.權(quán)利要求40的方法，其中步驟a)貴金屬與肽的摩爾比為約0.1∶1。
43.權(quán)利要求40的方法，其中從步驟a)到步驟c)混合溶液的溫度為約65°F～約100°F。
44.權(quán)利要求43的方法，其中該混合溶液的溫度為約68°F～約74°F
45.權(quán)利要求40的方法，其中該貴金屬選自銀、金、和銅。
46.權(quán)利要求40的方法，其中含貴金屬的水溶液選自AgNO3、HAuCl4·nH2O、和CuSO4·nH2O。
47.權(quán)利要求40的方法，其中肽的長度為約5～500個氨基酸。
48.權(quán)利要求40的方法，其中肽的長度為約5～20個氨基酸。
49.權(quán)利要求40的方法，其中該肽包括如SEQ ID No1中確定的多肽序列。
50.權(quán)利要求40的方法，其中該肽包囊化的貴金屬納米簇的粒徑為約小于1nm到約15nm。
51.權(quán)利要求40的方法，其中該肽包囊化的貴金屬納米簇能在pH約3～9范圍內(nèi)發(fā)熒光。
52.權(quán)利要求40的方法，其中該肽包囊化的貴金屬納米簇在光漂白前發(fā)射多于約106個光子。
53.權(quán)利要求40的方法，其中當多于一種貴金屬納米簇在514.5nm或476nm約300W/cm2的連續(xù)激發(fā)能激發(fā)時，大于90％的貴金屬納米簇發(fā)熒光長達約30分鐘以上。
54.一種監(jiān)測目的分子的方法，包括a)使包含包囊化的貴金屬納米簇的水溶性熒光標記附著在目的分子上，其中該熒光標記發(fā)出發(fā)射光譜；和b)檢測該熒光標記的發(fā)射光譜。
55.權(quán)利要求54的方法，其中該貴金屬納米簇包含2～8個貴金屬原子。
56.權(quán)利要求54的方法，其中該貴金屬選自金、銀、和銅。
57.權(quán)利要求54的方法，其中該包囊化的貴金屬納米簇在低激發(fā)強度發(fā)熒光，且其中該包囊化的貴金屬納米簇的飽和強度在納米簇激發(fā)高峰約為1～1000W/cm2。
58.權(quán)利要求57的方法，其中該低激發(fā)強度在約460nm為約30W/cm2。
59.權(quán)利要求54的方法，其中該熒光標記顯示偏振光譜發(fā)射，并顯示偶極發(fā)射模式。
60.權(quán)利要求54的方法，其中該熒光標記的發(fā)射光譜提供有關(guān)生物狀態(tài)的信息。
61.權(quán)利要求60的方法，其中該生物狀態(tài)選自生物部分的定量和定性存在；生物部分的結(jié)構(gòu)、組成、和構(gòu)象；生物部分在周圍環(huán)境中的定位；生物部分間的相互作用；生物化合物結(jié)構(gòu)的變化和細胞過程的變化。
62.權(quán)利要求54的方法，其中當熒光標記被激發(fā)時，它能在pH約為3～9范圍內(nèi)發(fā)熒光。
63.權(quán)利要求54的方法，其中該貴金屬納米簇在光漂白前發(fā)射多于約106個光子。
64.權(quán)利要求54的方法，其中當含有多于一個貴金屬納米簇的組合物被激發(fā)時，大于約80％的貴金屬納米簇發(fā)熒光長達約30分鐘以上。
65.權(quán)利要求64的方法，其中該貴金屬納米簇在514.5nm或476nm約300W/cm2的連續(xù)激發(fā)能激發(fā)時發(fā)熒光，且其中熒光是飽和或不飽和的熒光。
66.權(quán)利要求54的方法，該法還包括使連接體分子附著在包囊化的貴金屬納米簇的起始步驟，其中該連接體分子能使熒光標記附著在目的分子上。
67.權(quán)利要求54的方法，其中該目的分子存在于生物樣品里。
68.權(quán)利要求54的方法，其中該熒光標記的直徑為約小于1nm到15nm。
69.權(quán)利要求54的方法，其中該貴金屬納米簇被包容在樹枝狀分子里。
70.權(quán)利要求69的方法，其中該樹枝狀分子包含聚酰胺胺。
71.權(quán)利要求70的方法，其中該聚酰胺胺樹枝狀分子選自0級、1級、2級、3級、4級、和更高級聚酰胺胺樹枝狀分子。
72.權(quán)利要求70的方法，其中該聚酰胺胺樹枝狀分子是2級、或4級羥基封端的聚酰胺胺樹枝狀分子。
73.權(quán)利要求54的方法，其中該貴金屬納米簇被包囊化在肽里。
74.權(quán)利要求73的方法，其中該肽在細胞里表達。
75.權(quán)利要求73的方法，其中該肽包含融合多肽。
76.權(quán)利要求73的方法，其中該肽的長度為約5～500個氨基酸。
77.權(quán)利要求73的方法，其中該肽的長度為約5～20個氨基酸。
78.權(quán)利要求73的方法，其中該肽的長度為約20～40個氨基酸。
79.權(quán)利要求73的方法，其中該肽包含如SEQ ID No1中確定的多肽序列。
全文摘要
公開一種能用于檢測的組合物，它包含一種包囊化的貴金屬納米簇。還公開該包囊化的貴金屬納米簇的制備方法、和使用包囊化的貴金屬納米簇的方法。優(yōu)選的是貴金屬納米簇被樹枝狀分子或肽包囊化。該包囊化的貴金屬納米簇有特征性光譜發(fā)射，其中該光譜發(fā)射靠控制包囊材料的性質(zhì)而變化，如控制納米簇的尺寸和/或樹枝狀分子的級別，而且其中該發(fā)射用來提供關(guān)于生物狀態(tài)的信息。
文檔編號G01N33/58GK1672052SQ03818525
公開日2005年9月21日 申請日期2003年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月27日
發(fā)明者R·M·迪克森, 鄭杰 申請人:佐治亞技術(shù)研究公司