專利名稱：用于檢測(cè)c－反應(yīng)蛋白和結(jié)合c－反應(yīng)蛋白的成分之間的相互作用的能實(shí)施hts的方法和 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分別檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白(CRP)及C1q和結(jié)合CRP和C1q的成分之間的相互作用的能HTS的方法和檢測(cè)系統(tǒng)，涉及分別檢測(cè)含有CRP和C1q的溶液的濃度，和涉及檢測(cè)影響CRP及C1q分別和與其結(jié)合的成分的相互作用的物質(zhì)背景技術(shù)C-反應(yīng)蛋白(CRP)是感染或組織損害后血清濃度會(huì)快速并極大地增加的急性期的血漿蛋白質(zhì)(Volanakis(2001)，Molecular Immunology38，189-197)。在Ca2+離子存在的情況下，CRP結(jié)合磷酸膽堿(PCh)。在病原生物體的多糖中及損壞的和壞死的細(xì)胞的細(xì)胞膜中，后者非常常見(jiàn)。
補(bǔ)體是免疫系統(tǒng)的一部分，并且主要參與抗體介導(dǎo)的免疫防御。補(bǔ)體的三個(gè)生理學(xué)功能是抗細(xì)菌感染，聯(lián)系先天性和獲得性免疫及移除免疫復(fù)合物和凋亡細(xì)胞。在經(jīng)典的、替代的和甘露糖-凝集素的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)之間可以進(jìn)行區(qū)分(Walport(2001)，N Engl J Med 344，1058-1066)。經(jīng)典的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)引起細(xì)菌細(xì)胞的裂解，并且從與抗體(該抗體結(jié)合細(xì)胞表面)結(jié)合的C1q或結(jié)合PCh的CRP開(kāi)始。
C-反應(yīng)蛋白可以用做標(biāo)記，此外還可以用做冠心病的預(yù)測(cè)因子，而冠心病是工業(yè)化國(guó)家中最常見(jiàn)的死亡原因(Rifai和Ridker(2001)，ClinicalChemistry 47，403-411)。
新的研究(Jialal等(2001)，Circulation103，1933-1935)推測(cè)降低CRP水平或阻斷CRP介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，例如由于結(jié)合C1q引起的補(bǔ)體活化，可以用于冠心病的預(yù)防和治療。
因此，首先，期望提供可以用簡(jiǎn)單的方法檢測(cè)血漿中CRP和/或C1q濃度的方法；其次，提供可以鑒定如下物質(zhì)的方法，其中所述物質(zhì)以調(diào)節(jié)方式，即激活或抑制方式作用于CRP和/或C1q與其它成分的相互作用，特別是作用于CRP和C1q之間的相互作用。
例如Jiang等，(1991)，J.Immunol.146，2324-2330和Agrawal等，(2001)，J.Immunol.166，3998-4004已經(jīng)描述了檢測(cè)CRP結(jié)合C1q的方法。這兩篇公開(kāi)出版物利用了ELISA方法。這兩種方法都是費(fèi)時(shí)和費(fèi)材料，多階段的非均相方法。因此，為了實(shí)施該方法，最初，總是需要將反應(yīng)物之一固定到固相。而且，需要多個(gè)的洗滌步驟。
Lebdue等(1998)，Ann Clin Biochem35，745-753描述了CRP的免疫濁度測(cè)定方法。為此，將樣品與聚苯乙烯顆粒上加載的抗-CPR抗體溫育。因?yàn)樾枰獫岫扔?jì)和必需使用相對(duì)大量的樣品以實(shí)施該方法，所以該方法有嚴(yán)重的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供可以用簡(jiǎn)單的方式檢測(cè)血漿中CRP或C1q的濃度，并允許鑒定以調(diào)節(jié)、激活或抑制方式作用于CRP或C1q與其它成分的相互作用(特別是作用于C1q和CRP之間的相互作用)的物質(zhì)的方法，所述方法比先前所述方法更敏感，更節(jié)省成本，更節(jié)省材料，并可以更簡(jiǎn)單和/或更快速地實(shí)施，所以其有利地區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)。
通過(guò)檢測(cè)兩個(gè)成分的結(jié)合事件的方法可以達(dá)到該目的，所述成分直接或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)成分結(jié)合CRP或C1q，該方法包括下面的步驟(a)首先引入含有CRP或C1q的溶液；(b)向所述含有CRP或C1q的溶液添加至少一種供體成分或含有至少一種供體成分的一組成分，所述供體成分是包含能在光源激發(fā)后發(fā)射信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的成分，并且所述供體成分能直接或能通過(guò)來(lái)源于所述成分組的一種或多種成分結(jié)合CRP或C1q，(c)向所述含有CRP或C1q的溶液添加至少一種受體成分或含有至少一種受體成分的一組成分，所述受體成分是包含能接收(b)的化合物或化合物組所發(fā)射的信號(hào)并能以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))的成分，并且所述受體成分能直接或能通過(guò)所述成分組的一種或多種成分結(jié)合CRP或C1q，(d)利用光源激發(fā)(b)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))，(e)檢測(cè)(c)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))所發(fā)射的電磁輻射，以檢測(cè)所述的結(jié)合事件。
優(yōu)選地，這里(c)發(fā)射的電磁輻射是熒光輻射。例如，(d)的光源可以是激光器或燈，例如氦燈或鹵素?zé)簟＠?，利用光電倍增管可以檢測(cè)(e)的電磁輻射。
優(yōu)選地，本發(fā)明所用的成分是多肽或包含多肽。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種成分是抗體，該抗體可以是單克隆或多克隆抗體。
如果使用一組成分，優(yōu)選地，所述的成分能空間上相繼地結(jié)合CRP或C1q，或者相互結(jié)合。所述的結(jié)合以結(jié)合級(jí)聯(lián)的形式發(fā)生，其中的一個(gè)例子是抗體(第一抗體，第二抗體等)的相繼結(jié)合。優(yōu)選地，這里根據(jù)(b)和(c)直接結(jié)合CRP或C1q的成分在每種情況下都是結(jié)合CRP或C1q的特定結(jié)合區(qū)或特定表位的成分，且(b)的所述結(jié)合CRP或C1q的成分與(c)的結(jié)合CRP-或C1q的成分結(jié)合不同的結(jié)合位點(diǎn)。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，直接結(jié)合CRP-或C1q的成分之一是CRP-或C1q天然的結(jié)合伙伴，在CRP的情況下，其特別優(yōu)選地是C1q，并且反之亦然。如果供體或受體成分直接結(jié)合CRP或C1q，那么在這種情況下，供體或受體成分相應(yīng)地是包含供體或受體基團(tuán)的C1q或CRP。當(dāng)使用一組能形成結(jié)合級(jí)聯(lián)的成分時(shí)，C1q或CRP相應(yīng)地是結(jié)合CRP或C1q的第一個(gè)成分，由此供體或受體成分可以結(jié)合CRP或C1q。而該組成分的其余成分特別優(yōu)選地是抗體分子。
因此，例如，當(dāng)最初引入含有CRP的溶液時(shí)，在該實(shí)施方式中，優(yōu)選地，供體或受體成分本身包含C1q，或者供體或受體成分可以通過(guò)C1q與CRP結(jié)合。在這種情況下，供體或受體成分可以含有抗-C1q的抗體或能結(jié)合所述抗-C1q抗體的第二抗體。因此，在每種情況下，其它成分(受體或供體成分)將包含抗-CRP的抗體或能結(jié)合抗-CRP抗體的抗體或抗后者的第三抗體。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，(b)(供體基團(tuán))和/或(c)(受體基團(tuán))的至少一種化合物或一組化合物位于顆粒上，優(yōu)選地，所述顆粒的平均直徑在150nm至250nm之間，特別優(yōu)選地是大約200nm。因此，供體或受體成分包含所述顆粒，在這種情況下，該顆?？梢杂删酆喜牧现瞥?。
本發(fā)明的方法是能實(shí)施HTS(高通量篩選，high throughput screening)的方法，并且該方法可以在均相中一步實(shí)施。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)“混合和測(cè)量”原則實(shí)施本發(fā)明的方法，由此不僅相當(dāng)省時(shí)而且可以獲得高精確度的測(cè)量數(shù)據(jù)。
在小于利用前述非均相方法時(shí)所需時(shí)間的10％的時(shí)間內(nèi)，本發(fā)明的方法即能夠允許待測(cè)定的C1q與CRP結(jié)合，及鑒定影響所述結(jié)合的物質(zhì)和待測(cè)定的復(fù)雜介基中CRP或C1q的濃度。
此新方法的一個(gè)特定的特征性性質(zhì)是使得可以在溶液中監(jiān)測(cè)兩種蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，因?yàn)闆](méi)有一種反應(yīng)物需要被固定到固相上。而且，不需要例如通過(guò)熒光團(tuán)的結(jié)合來(lái)修飾CRP或C1q，就可以直接測(cè)定從生物來(lái)源獲得的蛋白質(zhì)。因此，該方法具有特定的優(yōu)點(diǎn)，即可以在蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)測(cè)定它，因此排除了在固定和/或修飾所述蛋白質(zhì)時(shí)將出現(xiàn)的變性風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是與常規(guī)方法比較，本發(fā)明方法顯著減少了樣品體積。因此，可以利用小于10μl的體積，以最小化材料成本。而且，可以利用CRP或C1q濃度小于1nM，甚至小于100pM的高稀釋度溶液。此外，它是非常靈敏的方法。而且，如上述，這是第一個(gè)可以高通量篩選能影響由CRP和C1q結(jié)合導(dǎo)致的補(bǔ)體活化的物質(zhì)的方法。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)單線態(tài)氧，信號(hào)從(a)的至少一種化合物和一組化合物(供體基團(tuán))轉(zhuǎn)移到(b)的至少一種化合物或一組化合物。
在這種情況下，優(yōu)選地，供體基團(tuán)包含通過(guò)激光激發(fā)后能將三線態(tài)氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧的化合物，而受體基團(tuán)包含能被單線態(tài)氧激發(fā)的至少一種第一化合物和能以無(wú)發(fā)射方式吸收由單線態(tài)氧可激發(fā)的基團(tuán)吸收的能量并以熒光輻射形式發(fā)射該能量的第二化合物。
形成的單線態(tài)氧可以從供體基團(tuán)擴(kuò)散到受體基團(tuán)，并且與那里存在的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)反應(yīng)。該過(guò)程中所釋放的能量被轉(zhuǎn)移給熒光團(tuán)，該熒光團(tuán)最后以熒光輻射形式發(fā)射所述能量，可以用光電倍增管檢測(cè)該能量?？梢詸z測(cè)到信號(hào)的前提條件是供體和受體珠在空間上鄰近，因?yàn)樵谒芤褐袉尉€態(tài)氧不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生衰變。因此選擇該方法中將要使用的結(jié)合成分，以便當(dāng)出現(xiàn)結(jié)合事件時(shí)，優(yōu)選地，供體和受體基團(tuán)之間的距離小于200nm，這是因?yàn)樵诟蟮木嚯x時(shí)，由于單線態(tài)氧的衰變時(shí)間，通過(guò)單線態(tài)氧進(jìn)行有效能量轉(zhuǎn)移是不可能的。
在該實(shí)施方式中，特別優(yōu)選位于顆粒上的供體基團(tuán)和受體基團(tuán)，優(yōu)選地，所述顆粒平均直徑是150至250nm，特別優(yōu)選地是大約200nm。這里，所述顆粒優(yōu)選的應(yīng)用方式是使帶有供體基團(tuán)的顆粒的終濃度是1-40μg/ml，帶有受體基團(tuán)的顆粒的終濃度是1-80μg/ml。所述顆粒的結(jié)合能力可以例如，是大約0.1nM到1nM/μg/ml顆粒。
在該方法中，特別優(yōu)選使用Perkin-Elmer Life Sciences的Alpha-Screen-Beads做為顆粒。在該實(shí)施方式中，利用激光，通過(guò)以680nm波長(zhǎng)照射來(lái)激發(fā)供體基團(tuán)，并且可以在520nm和600nm之間的波長(zhǎng)檢測(cè)受體基團(tuán)發(fā)射的輻射。
因此，在這種情況下，可以用首先引入帶有供體和受體基團(tuán)的供體和受體珠的方式進(jìn)行本發(fā)明的方法。然后，本身能結(jié)合或者能通過(guò)另外的成分結(jié)合CRP或C1q的成分與所述供體和受體珠結(jié)合。如上所述，這些成分可以是C1q或CRP，或者可以是抗CRP或抗C1q的抗體，或者可以是抗所述抗CRP或抗C1q的抗體的第二抗體。
在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)無(wú)發(fā)射能量轉(zhuǎn)移，特別優(yōu)選地通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，信號(hào)從(a)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))轉(zhuǎn)移到(b)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))。
在這種情況下，可以例如用這樣一種方式進(jìn)行該方法，即(a)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))包含含有銪鹽的化合物，并且(b)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))可以包含別藻藍(lán)蛋白(Grepin等，(2000)，Drug Discovery Today 5，212)。做為可替代的方案，供體和受體基團(tuán)可以是適于無(wú)發(fā)射能量轉(zhuǎn)移的染料。而且，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有適于無(wú)發(fā)射能量轉(zhuǎn)移，特別是適于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的化合物(參見(jiàn)，例如，Pope等(1999)，Drug Discovery Today4，350)。
在該實(shí)施方式中，優(yōu)選地，以這樣一種方式，即使得結(jié)合后供體和受體基團(tuán)之間的距離小于10nm的方式選擇將要使用的結(jié)合成分，因?yàn)樵诟缶嚯x時(shí)，有效的無(wú)發(fā)射能量轉(zhuǎn)移是不可能的。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法用于檢測(cè)具有未知CRP或C1q含量的CRP或C1q溶液的濃度，優(yōu)選地，所述溶液是血漿或血清，或者是通過(guò)適宜的生理緩沖液或水稀釋的血漿或血清。例如，所述方法可以用于診斷目的，特別是用于檢測(cè)生物體的炎癥狀態(tài)和/或用于檢測(cè)心搏停止和/或中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。
因此，本發(fā)明同樣地涉及可以用于檢測(cè)CRP或C1q和結(jié)合CRP或C1q的成分之間的結(jié)合事件的能實(shí)施HTS的診斷測(cè)定系統(tǒng)，其包括下面的成分(a)至少一種供體成分或含有至少一種供體成分的一組成分，所述供體成分是包含在光源激發(fā)后能發(fā)射信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的成分，并且所述供體成分能直接或能通過(guò)來(lái)源于該組成分的一種或多種成分結(jié)合CRP或C1q，(b)至少一種受體成分或含有至少一種受體成分的一組成分，所述受體成分是包含能接收(b)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并能夠以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物的成分，并且所述受體成分能直接或能通過(guò)該組成分的一種或多種成分結(jié)合CRP或C1q，這里優(yōu)選地，該能實(shí)施HTS的測(cè)定系統(tǒng)還包括下面的另外成分(c)在生理緩沖液或水中稀釋的血液或，血清或血漿，(d)用于激發(fā)(a)的至少一種化合物或一組化合物的光源，(e)用于檢測(cè)(b)所發(fā)射的電磁輻射的檢測(cè)系統(tǒng)。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(a)之前和/或步驟(b)之前和/或步驟(c)之前和/或步驟(d)之前添加至少一種待檢測(cè)物質(zhì)以觀察是否所述的待檢測(cè)物質(zhì)影響結(jié)合事件。在該方法中，可以檢測(cè)以調(diào)節(jié)、抑制或激活的方式作用于CRP或C1q和結(jié)合物的相互作用，特別是作用于CRP和C1q之間的相互作用的物質(zhì)。優(yōu)選地，這涉及在HTS方法中篩選待檢測(cè)物質(zhì)的文庫(kù)以檢測(cè)具有期望特性的物質(zhì)。
因此，本發(fā)明同樣地涉及用于檢測(cè)活性物質(zhì)的能進(jìn)行HTS的測(cè)定系統(tǒng)，其中所述活性物質(zhì)以調(diào)節(jié)的方式作用于CRP或C1q和結(jié)合CRP或C1q的成分之間的相互作用，所述系統(tǒng)包括下面的成分(a)至少一種供體成分或含有至少一種供體成分的一組成分，所述供體成分是包含至少一種化合物或一組化合物的成分，該化合物或該組化合物在光源激發(fā)后能發(fā)射信號(hào)(供體基團(tuán))，并且所述供體成分能直接或能通過(guò)來(lái)源于該組成分的一種或多種成分結(jié)合CRP或C1q，(b)至少一種受體成分或含有至少一種受體成分的一組成分，所述受體成分是包含至少一種化合物或一組化合物的成分，該化合物或該組化合物能接收(b)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)，并且所述受體成分能直接或能通過(guò)所述該組成分的一種或多種成分結(jié)合CRP或C1q，(C)至少一種待檢測(cè)化合物。
這里優(yōu)選地，能實(shí)施HTS的測(cè)定系統(tǒng)還包括下面的另外成分(d)用于激發(fā)(a)的至少一種化合物或一組化合物的光源，(e)用于檢測(cè)(b)所發(fā)射的電磁輻射的檢測(cè)系統(tǒng)，
(f)含有CRP或C1q的溶液。
這里優(yōu)選地，本發(fā)明能實(shí)施HTS的測(cè)定系統(tǒng)用于實(shí)施上述本發(fā)明的方法。因此，測(cè)定系統(tǒng)的部分和成分的具體實(shí)施方式
對(duì)應(yīng)于本發(fā)明方法中所使用的上述具體實(shí)施方式
。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是示例性實(shí)施方式中所述方法的圖解。這里，所用的供體成分是抗C1q抗體，供體基團(tuán)位于結(jié)合所述抗C1q抗體的顆粒上。在這種情況下，供體成分可以通過(guò)C1q結(jié)合CRP。受體成分在這種情況下是抗兔第二抗體，受體基團(tuán)位于結(jié)合所述抗兔第二抗體的顆粒上。在這種情況下，受體成分可以通過(guò)來(lái)源于兔的抗CRP抗體結(jié)合CRP。
示例性實(shí)施方式測(cè)定CRP與C1q結(jié)合的結(jié)合試驗(yàn)。
利用來(lái)源于Packard Bioscience的Alphascreen檢測(cè)試劑盒進(jìn)行該試驗(yàn)，該試劑盒包含供體和受體珠，所述供體珠包含在規(guī)定波長(zhǎng)激發(fā)后能將三線態(tài)氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧的化合物，并且所述受體珠包含單線態(tài)氧可激發(fā)的化合物，以及能以無(wú)發(fā)射能量轉(zhuǎn)移的方式接受來(lái)自所激發(fā)的化合物的能量并發(fā)射熒光輻射的化合物。這里，在每種情況下，所述化合物包埋在水凝膠基質(zhì)中。所用的珠子已經(jīng)被制造商預(yù)先包被，即供體珠用鏈霉抗生物素蛋白預(yù)包被，受體珠用抗兔抗體預(yù)包被。
表1所用材料概述

反應(yīng)緩沖液的制備在Alpha-Screen-系統(tǒng)中使用下面的反應(yīng)緩沖液20mM Tris-HCl，pH7.2，150mM NaCl，5mM CaCl2，1mM磷酸膽堿，0.1％BSA。通過(guò)在H2O中溶解3.15g Tris-HCl和8.77g NaCl，用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)到7.2，加水到1升制備Tris-NaCl緩沖液母液。在室溫下貯藏緩沖液。通過(guò)向50mlTris-NaCl緩沖液添加36.7mg CaCl2，12.9mg磷酸膽堿和50mg BSA制備反應(yīng)緩沖液。
抗C1q抗體的生物素?；癁榱耸箍笴1q抗體結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白包被的供體珠，首先需要生物素?；罢?。為此，在室溫下，用200mlPBS透析100μl抗C1q多克隆抗血清2次，1小時(shí)。添加(Milli-Q水中的)20μl 1.5mM磺基-NHS溶液后，在室溫下放置溶液30分鐘，然后用PBS再次透析2次，以除去過(guò)多的生物素酰化試劑。
測(cè)定程序通過(guò)最初引入2μl供體珠/抗-CRP溶液，然后添加2μl C1q、2μl CRP和2μl受體珠/抗-CRP進(jìn)行該測(cè)定。這產(chǎn)生了下面的終濃度CRP1nM；C1q10nM；抗-CRP7.3nM；抗C1q1∶1500；供體珠20μg/ml；受體珠40μg/ml。在陰性對(duì)照中，反應(yīng)緩沖液代替CRP溶液、C1q溶液或這兩種溶液。在室溫下溫育2小時(shí)后，利用AlphaQuest讀數(shù)器讀出數(shù)據(jù)。
結(jié)果在1nM的CRP濃度和10nM的C1q濃度時(shí)測(cè)定發(fā)射的輻射的強(qiáng)度，結(jié)果如下(列出了光電倍增管計(jì)數(shù))在缺少CRP和缺少C1q的情況下952在存在CRP和缺少C1q的情況下1255在缺少CRP和存在C1q的情況下1114在存在CRP和存在C1q的情況下80376
如所能看到的，陰性對(duì)照沒(méi)有提供陽(yáng)性結(jié)果，而當(dāng)混合含有C1q和CRP的溶液時(shí)，可以觀察到強(qiáng)的信號(hào)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)兩個(gè)成分的結(jié)合事件的方法，其中所述成分可以直接或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)成分與CRP結(jié)合，該方法包括下面的步驟(a)首先引入含有CRP的溶液；(b)向所述含有CRP的溶液添加至少一種供體成分或含有至少一種供體成分的一組成分，所述供體成分是包含在光源激發(fā)后能發(fā)射信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的成分，并且所述供體成分能直接或能通過(guò)來(lái)源于該組成分的一種或多種成分結(jié)合于CRP，(c)向所述含有CRP的溶液添加至少一種受體成分或含有至少一種受體成分的一組成分，所述受體成分是包含能接收(b)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))的成分，并且所述受體成分能直接或能通過(guò)該組成分中的一種或多種成分結(jié)合于CRP，(d)利用光源激發(fā)(b)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))，(e)檢測(cè)(c)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))所發(fā)射的電磁輻射，以檢測(cè)所述的結(jié)合事件。
2.一種用于檢測(cè)兩個(gè)成分的結(jié)合事件的方法，其中，所述成分可以直接或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)成分結(jié)合C1q，該方法包括下面的步驟(a)首先引入含有C1q的溶液；(b)向所述含有C1q的溶液添加至少一種供體成分或含有至少一種供體成分的一組成分，所述供體成分是包含在光源激發(fā)后能發(fā)射信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的成分，并且所述供體成分能直接或能通過(guò)來(lái)源于該組成分的一種或多種成分結(jié)合于C1q，(c)向所述含有C1q的溶液添加至少一種受體成分或含有至少一種受體成分的一組成分，所述受體成分是包含能接收(b)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))的成分，并且所述受體成分能直接或能通過(guò)該組成分中的一種或多種成分結(jié)合于C1q，(d)利用光源激發(fā)(b)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))，(e)檢測(cè)(c)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))所發(fā)射的電磁輻射，以檢測(cè)所述的結(jié)合事件。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中電磁輻射是熒光輻射。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中(d)的光源是激光器或燈。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中利用光電倍增管進(jìn)行(e)的檢測(cè)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中根據(jù)(b)和/或(c)的成分組的成分可以在空間上相繼地結(jié)合CRP或互相結(jié)合。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其中根據(jù)(b)和/或(c)的成分組的成分可以在空間上相繼地結(jié)合C1q或互相結(jié)合。
8.如權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的方法，其中所述成分是多肽或包含多肽。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中至少一種成分是抗體。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中該抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一種成分是CRP的天然結(jié)合伙伴。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中CRP的天然結(jié)合伙伴是C1q。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中權(quán)利要求1(a)或權(quán)利要求1(b)的成分組包含C1q和抗C1q的抗體。
14.如權(quán)利要求2所述的方法，其中至少一種成分是C1q的天然結(jié)合伙伴。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中天然結(jié)合伙伴是CRP。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中權(quán)利要求2(a)或權(quán)利要求2(b)的成分組包含CRP和抗CRP的抗體。
17.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中通過(guò)無(wú)發(fā)射能量轉(zhuǎn)移，信號(hào)從(b)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))轉(zhuǎn)移到(c)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中無(wú)發(fā)射能量轉(zhuǎn)移是熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
19.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中信號(hào)通過(guò)單線態(tài)氧轉(zhuǎn)移。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1(b)或2(b)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))包含通過(guò)激光激發(fā)后能將三線態(tài)氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧的化合物，并且其中根據(jù)權(quán)利要求1(b)或2(b)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))包含至少一種單線態(tài)氧可激發(fā)的第一化合物并包含至少一種第二化合物，該第二化合物能以無(wú)發(fā)射方式吸收可由單線態(tài)氧激發(fā)的所述化合物吸收的能量并以熒光輻射形式進(jìn)行發(fā)射。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中供體基團(tuán)和/或受體基團(tuán)位于顆粒上。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中顆粒平均直徑大約是200nm。
23.如權(quán)利要求1到22任一項(xiàng)所述的方法，其用于檢測(cè)具有未知CRP含量的CRP溶液的濃度。
24.如權(quán)利要求1到22任一項(xiàng)所述的方法，其用于檢測(cè)具有未知C1q含量的C1q溶液的濃度。
25.如權(quán)利要求23或24所述的方法，其中該溶液是血清、血漿或用生理緩沖液或用水稀釋的血清或血漿。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其是用于檢測(cè)生物體的炎癥狀態(tài)和/或用于檢測(cè)心搏停止和/或中風(fēng)危險(xiǎn)的診斷方法。
27.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其是可以一步實(shí)施的能進(jìn)行HTS的均相方法。
28.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括在步驟(a)之前和/或步驟(b)之前和/或步驟(c)之前和/或步驟(d)之前添加至少一種待檢測(cè)物質(zhì)的額外步驟，以觀察是否所述待檢測(cè)物質(zhì)影響CRP和結(jié)合CRP的成分之間的結(jié)合事件。
29.如權(quán)利要求2所述的方法，其包括在步驟(a)之前和/或步驟(b)之前和/或步驟(c)之前和/或步驟(d)之前添加至少一種待檢測(cè)物質(zhì)的額外步驟，以觀察是否所述待檢測(cè)物質(zhì)影響C1q和結(jié)合C1q的成分之間的結(jié)合事件。
30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其用于檢測(cè)以調(diào)節(jié)、抑制或激活方式作用于結(jié)合事件的物質(zhì)。
31.用于檢測(cè)CRP和結(jié)合CRP的成分之間的結(jié)合事件的能實(shí)施HTS的診斷檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括下面的成分(a)至少一種供體成分或含有至少一種供體成分的一組成分，所述供體成分是包含在光源激發(fā)后能發(fā)射信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的成分，并且所述供體成分能直接或能通過(guò)來(lái)源于該組成分的一種或多種成分結(jié)合于CRP，(b)至少一種受體成分或含有至少一種受體成分的一組成分，所述受體成分是包含能接收(b)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))的成分，并且所述受體成分能直接或能通過(guò)該組成分中的一種或多種成分結(jié)合于CRP。
32.用于檢測(cè)C1q和結(jié)合C1q的成分之間的結(jié)合事件的能實(shí)施HTS的診斷檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括下面的成分(a)至少一種供體成分或含有至少一種供體成分的一組成分，所述供體成分是包含在光源激發(fā)后能發(fā)射信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的成分，并且所述供體成分能直接或能通過(guò)來(lái)源于該組成分的一種或多種成分結(jié)合于C1q，(b)至少一種受體成分或含有至少一種受體成分的一組成分，所述受體成分是包含能接收(b)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))的成分，并且所述受體成分能直接或能通過(guò)所述該組成分中的一種或多種成分結(jié)合于C1q。
33.如權(quán)利要求31或32所述的能實(shí)施HTS的檢測(cè)系統(tǒng)，其還包括下面額外的成分(c)血清或血漿，或用生理緩沖液或水稀釋的血清或血漿(d)用于激發(fā)(a)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的光源，(e)用于檢測(cè)(b)所發(fā)射的電磁輻射的檢測(cè)系統(tǒng)。
34.用于檢測(cè)活性物質(zhì)的能實(shí)施HTS的測(cè)定系統(tǒng)，其中，所述活性物質(zhì)以調(diào)節(jié)的方式作用于CRP和結(jié)合CRP的成分之間的相互作用，所述系統(tǒng)包括下面的成分(a)至少一種供體成分或含有至少一種供體成分的一組成分，所述供體成分是包含在光源激發(fā)后能發(fā)射信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的成分，此外，該供體成分能接收由(a)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并能以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)，并且該供體成分能直接或能通過(guò)來(lái)源于該組成分的一種或多種成分結(jié)合于CRP，(b)至少一種受體成分或含有至少一種受體成分的一組成分，所述受體成分是包含能接收(b)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))的成分，并且所述受體成分能直接或能通過(guò)該組成分中的一種或多種成分結(jié)合于CRP，(c)至少一種待檢測(cè)化合物。
35.用于檢測(cè)活性物質(zhì)的能實(shí)施HTS的測(cè)定系統(tǒng)，其中，所述活性物質(zhì)以調(diào)節(jié)的方式作用于C1q和結(jié)合C1q的成分之間的相互作用，所述系統(tǒng)包括下面的成分(a)至少一種供體成分或含有至少一種供體成分的一組成分，所述供體成分是包含光源激發(fā)后能發(fā)射信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的成分，并且所述供體成分能接收(a)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并能以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)，并且所述供體成分能直接或能通過(guò)來(lái)源于該組成分的一種或多種成分結(jié)合于C1q，(b)至少一種受體成分或含有至少一種受體成分的一組成分，所述受體成分是包含能接收(b)的化合物或一組化合物所發(fā)射的信號(hào)并以電磁輻射形式發(fā)射該信號(hào)的至少一種化合物或一組化合物(受體基團(tuán))的成分，并且所述受體成分能直接或能通過(guò)該組成分中的一種或多種成分結(jié)合于C1q，(c)至少一種待檢測(cè)化合物。
36.如權(quán)利要求34或35所述的能實(shí)施HTS的測(cè)定系統(tǒng)，其還包括下面額外的成分(d)用于激發(fā)(a)的至少一種化合物或一組化合物(供體基團(tuán))的光源，(e)用于檢測(cè)(b)所發(fā)射的電磁輻射的檢測(cè)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)C－反應(yīng)蛋白(CRP)或C1q和結(jié)合CRP或C1q的成分之間的相互作用的、能實(shí)施HTS的方法和檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)此檢測(cè)方法和檢測(cè)系統(tǒng)可以確定含有CRP或C1q的溶液的濃度，和鑒定能影響CRP或C1q和與其結(jié)合的成分之間的相互作用，特別是CRP和C1q之間的相互作用的物質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1745300SQ03813442
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2003年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月12日
發(fā)明者A·坎特, A·波默羅 申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬(wàn)特德國(guó)有限公司