專利名稱：一種檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種試劑盒，特別是一種基于IgG2b、IgM兩種單抗的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
1、免疫診斷在日本血吸蟲病防治中的重要性血吸蟲病是一種廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)的人獸共患寄生蟲病，全球76個國家和地區(qū)的約2億人口受感染，有6億人口受感染威脅。我國是日本血吸蟲病流行區(qū)，建國初期曾嚴(yán)重影響了人們的正常生產(chǎn)和生活。經(jīng)過50多年的防治，已經(jīng)取得了舉世矚目的成就，到2003年全國共有血吸蟲病病人數(shù)843007人，較建國初期(1161. 2萬人)減少了 92.74%。已有廣東、上海、福建、廣西、浙江等5省(區(qū)、市)阻斷了血吸蟲病的傳播；僅剩湖南、湖北、江西、安徽、江蘇等5省湖區(qū)及川、滇山區(qū)未得到控制。我們在欣喜的同時，也面臨著進一步防治工作的巨大挑戰(zhàn)。隨著防治工作的深入，人群感染度不斷下降，低度流行區(qū)擴大，血吸蟲病的病原學(xué)診斷在現(xiàn)場大范圍的應(yīng)用越來越困難，不但敏感性差、費時費力， 且不易被群眾和工作人員接受。另一方面，現(xiàn)在控制血吸蟲病的主要手段是吡喹酮化療，但大規(guī)模、反復(fù)單一藥物化療，可能產(chǎn)生藥物抗性，據(jù)國外報道，已經(jīng)出現(xiàn)具吡喹酮抗性的曼氏血吸蟲株，因此研制用于血吸蟲病低度流行區(qū)的敏感性和特異性更高的診斷手段已經(jīng)被列為第三大世界血吸蟲病防治規(guī)劃優(yōu)先研究項目。2、循環(huán)抗原在日本血吸蟲病免疫診斷中的作用經(jīng)過幾十年的發(fā)展，血吸蟲病免疫診斷技術(shù)已具有較高的敏感性、特異性和可行性。檢測血吸蟲循環(huán)抗體是一種成本低、操作簡單的檢測，也是目前現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查時應(yīng)用最廣的途徑，但循環(huán)抗體在治療后相當(dāng)長一段時間內(nèi)仍保持較高水平，不易區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，無法在現(xiàn)場應(yīng)用時確定目標(biāo)化療人群；而且難以反映藥物療效，不宜用作療效考核的評價指標(biāo)。另一種途徑是檢測循環(huán)抗原，循環(huán)抗原(circulating antigen, CAg) 是存在于患者血液、唾液、尿液等體液中的血吸蟲蟲體的代謝產(chǎn)物及分泌物，檢測患者血清或尿液中的循環(huán)抗原，可評估蟲負(fù)荷數(shù)和活動性感染，可以作為診斷的依據(jù)。而且，在治療后，CiVg轉(zhuǎn)陰較快，檢測循環(huán)抗原可以作為療效考核的依據(jù)，基于循環(huán)抗原檢測的各種方法層出不窮，但都困擾在敏感性低、特異性不強的問題上，因此尋找敏感性高、特異性強的循環(huán)抗原檢測方法和技術(shù)是血吸蟲病免疫診斷的新方向。3.單克隆抗體技術(shù)在血吸蟲病免疫診斷技術(shù)中的應(yīng)用自Kohler和Milstein(197 發(fā)明單克隆抗體制備技術(shù)以來，單抗技術(shù)廣泛運用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的各個領(lǐng)域，為疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療提供了重要的手段。單克隆抗體是由一個細(xì)胞產(chǎn)生的，其成分(類，亞類，型和結(jié)合P位等)是同源的，只針對復(fù)雜抗原的一個抗原決定簇，并有相同的親和性，抗體滴度也很高，檢測循環(huán)抗原具有高度的特異性，抗原和單抗可規(guī)?；a(chǎn)，方法簡便實用，且具有較好的療效考核價值，可區(qū)分現(xiàn)癥感染與既往感染，可用于血吸蟲病的免疫診斷和流行病學(xué)現(xiàn)場調(diào)查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒及制備方法，所述的這種檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒及制備方法要解決現(xiàn)有技術(shù)的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法敏感性低、特異性不強的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被有包被原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、包被緩沖液、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、血吸蟲病陰性血清、顯色液和終止液，所述的包被有包被原的酶標(biāo)板是包被抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b的酶標(biāo)板，所述的酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體 IgM。進一步的，所述的濃縮洗滌液為濃度是0. 01 0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 4，所述的磷酸鹽緩沖液還含有吐溫20和疊氮化鈉，所述的吐溫20在所述的磷酸鹽緩沖液中的質(zhì)量百分比為1%，所述的疊氮化鈉在所述的磷酸鹽緩沖液中的質(zhì)量百分比為 0. 3%。進一步的，所述的樣品稀釋液為洗滌緩沖液，洗滌緩沖液為上述濃縮洗滌液的 18-22倍稀釋的工作液；優(yōu)選的為上述濃縮洗滌液的20倍稀釋工作液。進一步的，所述的酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體IgM，所述的顯色液由第一顯色液和第二顯色液組成，第一顯色液為過氧化氫溶液，第二顯色液為四甲基聯(lián)苯胺溶液，終止液為2mol/L的硫酸。進一步的，所述的酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體 IgM，所述的顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，所述的終止液為lmol/L的氫氧化鈉緩沖液。進一步的，所述的血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒灨腥狙x的家兔血清，所述的血吸蟲病陰性血清為健康人血清或正常兔血清。進一步的，所述的酶標(biāo)板為96孔可拆卸聚苯乙烯酶標(biāo)板。進一步的，所述的包被緩沖液為pH值9. 6的0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液。進一步的，所述的包被抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體的酶標(biāo)板中的日本血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體IgG2b由保藏號為CGMCC NO :4978的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。進一步的，所述的酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體中的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體IgM由保藏號為CGMCC NO 3642的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了一種上述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，包括如下步驟1) 一個制備包被有包被原的酶標(biāo)板的步驟，所述的包被有包被原的酶標(biāo)板是包被抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體的酶標(biāo)板；2)包括一個制備酶標(biāo)記物的步驟，所述的酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體，采用辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記；3)包括一個制備包被緩沖液的步驟；4)包括一個制備濃縮洗滌液的步驟；5)包括一個制備樣品稀釋液的步驟；6)包括一個制備血吸蟲病陽性血清和血吸蟲病陰性血清的步驟；
7)包括一個制備顯色液和一個制備終止液的步驟；8)包括一個將上述產(chǎn)品組裝的步驟。進一步的，所述的包被有包被原的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記物中的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體均采用雜交瘤技術(shù)制備的，包括如下步驟，1) 一個動物免疫的步驟，在所述的動物免疫的步驟中，先制備日本血吸蟲的可溶性抗原，然后通過日本血吸蟲的可溶性抗原免疫動物；2) —個細(xì)胞融合的步驟，取骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫脾細(xì)胞按1 5 1 10比例在PEG4000作用下進行融合；3) 一個雜交瘤細(xì)胞篩選和克隆化的步驟；4)將單克隆細(xì)胞株注入動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的步驟；5) 一個純化抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體的步驟。進一步的，在一個制備包被有包被原的酶標(biāo)板的步驟中，用包被緩沖液將抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b，然后將抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b加入酶標(biāo)板的孔中孵育，倒去包被液，用濃縮洗滌液洗后，拍干后真空密封保存。進一步的，在一個制備濃縮洗滌液的步驟中，所述的濃縮洗滌液為濃度是0.01 0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 4，所述的磷酸鹽緩沖液還含有吐溫20和疊氮化鈉，所述的吐溫20在所述的磷酸鹽緩沖液中的質(zhì)量百分比為1%，所述的疊氮化鈉在所述的磷酸鹽緩沖液中的質(zhì)量百分比為0. 3%。進一步的，在一個制備樣品稀釋液的步驟中，所述的樣品稀釋液為洗滌緩沖液，洗滌緩沖液為上述濃縮洗滌液的18-22倍稀釋的工作液，優(yōu)選的為上述濃縮洗滌液的20倍稀
釋工作液。進一步的，在一個制備顯色液和終止液的步驟中，所述的酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體IgM，所述的顯色液由第一顯色液和第二顯色液組成，第一顯色液為過氧化氫溶液，第二顯色液為四甲基聯(lián)苯胺溶液，終止液為2mol/L 的硫酸。進一步的，在一個制備顯色液和終止液的步驟中，所述的酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體IgM，所述的顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，所述的終止液為lmol/L氫氧化鈉緩沖液。進一步的，在一個制備血吸蟲病陽性血清和血吸蟲病陰性血清的步驟中，所述的血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒灨腥狙x的家兔血清，所述的血吸蟲病陰性血清為健康人血清或正常兔血清。本發(fā)明還提供了一種小鼠雜交瘤細(xì)胞，其保藏號為CGMCC NO :4978。本發(fā)明還提供了一種血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC NO 4978的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明的一種抗血吸蟲可溶性抗原(SEA)的單克隆細(xì)胞株，其分類命名為小鼠雜交瘤細(xì)胞(日本血吸蟲病單克隆抗體細(xì)胞株A1E3)，該細(xì)胞株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2010年3月 3號，保藏號為CGMCC NO :3642，該細(xì)胞株是由小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫脾細(xì)胞融合得到的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明的一種抗血吸蟲可溶性抗原(SEA)的單克隆細(xì)胞株，其分類命名為小鼠雜交瘤細(xì)胞(細(xì)胞株D9G8)，該細(xì)胞株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2011年6月21日，保藏號CGMCC NO 4978。該細(xì)胞株是由小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫脾細(xì)胞融合得到的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明的試劑盒的工作原理是將待測血清樣品滴于包被好的抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的特異單克隆抗體的固相載體中，保溫反應(yīng)并洗滌后，加入酶標(biāo)記抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的單克隆抗體，保溫反應(yīng)并洗滌后，形成抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原 (SEA)的特異單克隆抗體-循環(huán)抗原-酶標(biāo)抗血吸蟲SEA單克隆抗體夾心復(fù)合物，加入底物顯色，終止顯色后通過酶標(biāo)議讀數(shù)，確定樣品陰陽性結(jié)果，陽性標(biāo)本形成有色產(chǎn)物，而陰性則無。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點。本發(fā)明的試劑盒操作簡便、快速，檢測急、 慢性血吸蟲病病人血清，檢出率高，適合醫(yī)院檢驗科、疾病防控中心、社康中心等部門用于血吸蟲病的臨床診斷、療效考核和流行病學(xué)調(diào)查，具有很高的實用價值。本發(fā)明的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的雙抗體夾心法為兩步法，敏感性高、特異性強、重復(fù)性好，分別適合批量標(biāo)本的檢測和療效考核。


圖1是本發(fā)明的一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法的原理圖，其中，1代表包被抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)單克隆抗體(Anti-SEA-IgG2b)的固相載體；2代表血清 (循環(huán)抗原)；3代表酶標(biāo)記抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體(HRP-Anti-SEA-IgM) ；4代表抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原單克隆抗體-循環(huán)抗原-酶標(biāo)記抗血吸蟲SEA單克隆抗體夾心復(fù)合物。
具體實施例方式實施例1抗血吸蟲SEA單克隆抗體的制備方法如下(一 )動物免疫①抗原制備將每只感染1500條日本血吸蟲尾蚴(來自中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所)的7只新西蘭兔在42天后按常規(guī)方法解剖，從肝臟中分離收集蟲卵并凍干。取干卵稱重，按1 %的比例溶于0. 9 %的生理鹽水中，研磨后，置4°C冷浸，期間每天振搖2次，每次2分鐘。4天后冰浴超聲粉碎，每次3分鐘，間歇3分鐘，共3次。再如上冷浸 2天，10000rpm4°C離心30分鐘，取上清，收集分裝，用Braford法測定抗原蛋白濃度，_20°C 保存?zhèn)溆?。②免疫動物的選擇選用6 8w的雌性BALB/c小鼠(來自中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所)。初次免疫將血吸蟲可溶性抗原(SEA)與弗氏完全佐劑混合并乳化完全，按25 100 μ g/只劑量腹腔注射小鼠。4周后用相同劑量的SEA與弗氏不完全佐劑混合乳化進行加強免疫，以后每隔2周，再用SEA單獨加強免疫2次，用ELISA法檢測免疫效價，達到1/10000以上時，進行最后一次尾靜脈加強免疫，三天后取脾臟融合。
(二)細(xì)胞融合取骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫脾細(xì)胞按1 5 1 10比例在 PEG4000作用下進行融合，融合好后雜交細(xì)胞通過在含有次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基喋呤(aminopterin，Α)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，Τ)的培養(yǎng)基(HAT)中進行選擇生長，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。(三)雜交瘤細(xì)胞篩選和克隆化雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即用SEA進行篩選，挑選出針對SEA的雜交瘤細(xì)胞株進行克隆化，直到獲得分泌穩(wěn)定的針對SEA的單克隆細(xì)胞株。一種抗血吸蟲可溶性抗原(SEA)的單克隆細(xì)胞株，其分類命名為小鼠雜交瘤細(xì)胞(日本血吸蟲病單克隆抗體細(xì)胞株Α1Ε3和細(xì)胞株D9G8)，該細(xì)胞株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中，保藏號分別為CGMCC NO :3642和CGMCC NO :4978。(四)將此抗小鼠雜交瘤細(xì)胞(CGMCC3642和4978)注入BALB/c小鼠腹腔內(nèi)， 1 2周后小鼠腹腔產(chǎn)出大量的抗體，小心抽取腹水，離心得到大量針對SEA的單克隆抗體腹水上清?？谷毡狙x可溶性蟲卵抗原(SEA)單克隆抗體(Anti-SEA-IgG2b)由保藏號為CGMCC NO :4978的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)單克隆抗體(Anti-SEA-IgM)由保藏號為CGMCC NO :3642的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。(五)所述的血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的單克隆抗體的純化方法如下①飽和硫酸銨溶液的配制500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結(jié)晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調(diào)pH至7.8。②鹽析吸取IOml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5. Oml ；繼續(xù)緩慢攪拌30min ；lOOOOr/min離心15min ；棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30min，同法離心；重復(fù)前一步1 2次；沉淀物溶于1. 5ml PBS (0. 01mol/L pH7. 2)或 Tris-HCl 緩沖液中。③脫鹽常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過kphadex G_50層析柱， 以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速lml/min。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2% NaHCO3, lmmol/L EDTA溶液中煮lOmin，用蒸餾水清洗透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮透析袋lOmin，冷至室溫即可使用(并可于0.2mol/L EDTA 溶液中，4°C保存?zhèn)溆?。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50 100倍體積的PBS或Tris-HCl 緩沖液透析) 12 M小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑(碘化汞11.5g，碘化鉀 8g，加蒸餾水50ml，待溶解后，再加20% Na0H50ml)檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。④蛋白質(zhì)含量的測定(Pr)(mg/ml) = (1. 45 X OD280-O. 74 X OD260) X 稀釋倍數(shù)；或 (Pr) =OD28tlX 稀釋倍數(shù)/3⑤分裝凍存?zhèn)溆谩?六)標(biāo)記抗血吸蟲可溶性抗原(SEA)的單克隆抗體所述標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)或堿性磷酸酶(alkal ine phosohatase，AP)，其標(biāo)記過程如下:(1)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG 氨基結(jié)合，形成khiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過碘酸鈉氧化先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定^^1 氏堿。其操作步驟如下
a)將 5mg HRP 溶于 0. 5ml 0. lmol/L NaHCO3 溶液中；加 0. 5ml 10mmol/LNaI04 溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時；b)加 0. 75ml 10. lmol/L Na2CO3 混勻；c)加入0. 75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等(15mg/ml)，混勻；d)稱取kphadex G25干粉0. 3g，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用(避光)3小時或4°C過夜；e)用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30min ；再加入3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(或4°C 過夜)；f)將交聯(lián)物過kphadex G200或kpharose 6B(2. 5 X 50cm)層析純化，分管收集第一峰；g)酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定酶活性和抗體活性的測定，可應(yīng)用ELISA法、免疫擴散、 DAB-H2O2顯色反應(yīng)測定酶結(jié)合物的酶活性，抗體活性及效價、特異性；h)HRP抗體結(jié)合物的保存加入等量甘油后，小量分裝-20°C存放，防止反復(fù)凍融； 或加入等量60%甘油4°C保存；不宜加NaN3或酚防腐，否則會影響酶活性，必要時還可以凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護劑。(2)堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記堿性磷酸酶(AP)用于標(biāo)記抗體，常用戊二醛一步法， 將酶和單抗混合，再加入適量戊二醛，使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個醛基結(jié)合，制備成結(jié)合物。其程序如下a)將5mg AP加入Iml抗體溶液Qmg/ml)中溶解，裝入透析袋，于4°C對0. Olmol/ L pH 7. 2PBS透析18小時，換液三次。b)加入2. 5%戊二醛20ul，室溫作用1_2小時，4°C對PBS透析過夜，其間換液三次。c)換用0. 05mol/L PH8. OTris-HCl緩沖液透析，4°C過夜，換液三次。d)取出標(biāo)記抗體，用含1 % BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至鈿1，即為AP標(biāo)記物原液。e)每毫升中加入0. 4ml甘油，小量分裝，保存?zhèn)溆?。實施?抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)單克隆抗體IgG2b、抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)單克隆抗體IgM單抗效價測定(1)包被血吸蟲病可溶性蟲卵抗原(SEA) 1 μ g/ml(2)酶羊抗鼠 IgG-HRP 1 8000 ；羊抗鼠 IgM-HRP 1 8000(3)ELISA 反應(yīng)時間30min/30min/10min(4)結(jié)果濃度(yg/mL)10310. 30. 10. 030. 01陽參陰參稀釋比例1:1001::3001:1000130001:100001300001:100000IgG2b2.8362.7182.1701. 8861. 3430. 8190. 3171.309 0.215IgM3.1383.2703.1032. 9042. 4541. 3970. 554如上表所示，IgG^最高效價可達1 30000，而IgM最高效價為1 100000。實施例3 —種檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被有包被原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、包被緩沖液、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、陰性血清、顯色液、終止液，所述的包被有包被原的酶標(biāo)板是包被抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體的酶標(biāo)板，所述的酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體。進一步的，所述的濃縮洗滌液為0. 01 0. 05mol/L, pH值7. 0-7. 4，含有吐溫 20,0. 3%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液。進一步的，所述的樣品稀釋液為洗滌緩沖液，洗滌緩沖液為上述濃縮洗滌液的20 倍稀釋工作液。進一步的，當(dāng)所述的酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶時，顯色液為過氧化氫(A液)和四甲基聯(lián)苯胺(B液)，終止液為2mol/L的硫酸。進一步的，當(dāng)所述的酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶時，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，終止液為lmol/L氫氧化鈉緩沖液。進一步的，所述的血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒灨腥狙x家兔血清，所述的血吸蟲病陰性血清為健康人血清或正常兔血清。進一步的，所述的酶標(biāo)板為96孔可拆卸聚苯乙烯酶標(biāo)板；進一步的，所述的包被緩沖液為pH值9. 6，0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液。具體的所述的一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法如下1)包被有包被原的酶標(biāo)板用包被緩沖液(pH值9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液)將抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b稀釋成20 μ g/ml，在96孔可拆卸聚苯乙烯酶標(biāo)板每孔加入100μ 1，37°C孵育池，倒去包被液，用19倍稀釋的濃縮洗滌液洗2 3次，每次30s，拍干后真空密封保存。2)酶標(biāo)記物如實施例一(六)(1)所述，為HRP標(biāo)記；3)濃縮洗滌液0. 01 0. 05mol/L pH值7. 0-7. 4，含有吐溫20、0. 3%疊氮化
鈉的磷酸鹽緩沖液；4)樣品稀釋液所述的樣品稀釋液為洗滌緩沖液，洗滌緩沖液為上述濃縮洗滌液的18-22倍稀釋的工作液，優(yōu)選的為上述濃縮洗滌液的20倍稀釋工作液。5)血吸蟲病人陽性血清、陰性血清陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒灨腥狙x尾蚴家兔血清；陰性血清為健康人血清或正常兔血清。6)顯色液所述當(dāng)酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶時，顯色液為過氧化氫(A液) 51. 4ml0. 2mol/L 的 Na2HPO4 與 48. 6ml0. lmol/L 的檸檬酸混合并用 HCl 調(diào) pH 至 5. 1 5. 4，最后加入67 μ 1 30%的H2O2 ；四甲基聯(lián)苯胺(B液)將四甲基聯(lián)苯胺50mg，無水乙醇5ml， 0. lmol/L 的檸檬酸，0. lmol/L 的 EDTA 0. 5ml，加蒸餾水至 100ml。7)終止液將純硫酸與蒸餾水按體積比1 17的比例混合得到2mol/L硫酸溶液。實施例4 一種檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測方法如圖1所示，將人或鼠、兔類血清等待測樣品(2)滴于包被好抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b的固相載體(1)中，保溫反應(yīng)并洗滌后，加入酶標(biāo)記抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的單克隆抗體(3)，保溫反應(yīng)并洗滌后，形成抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b-循環(huán)抗原-酶標(biāo)抗血吸蟲SEA單克隆抗體IgM夾心復(fù)合物(4)，加底物顯色后陽性標(biāo)本形成有色產(chǎn)物，而陰性則無，終止顯色后通過酶標(biāo)議讀數(shù)，確定樣品陰陽性結(jié)果。實施例5 —種檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測方法將人或家兔陽性、陰性血清100 μ 1滴于包被有包被原的酶標(biāo)板中，370C孵育25 30min后，倒出孔內(nèi)液體，用19倍稀釋的濃縮洗滌液液洗3 5次，每次30s，拍干，加入HRP 標(biāo)記抗血吸蟲SEA單克隆抗體，37°C孵育25 30min，倒出孔內(nèi)液體，用19倍稀釋的濃縮洗滌液洗3 5次，每次30s，拍干，加底物顯色液100 μ 1后37°C避光顯色5 lOmin，每孔加入終止液Omol/L硫酸溶液)50μ 1，混勻，用酶標(biāo)議測定每孔吸光值(0D值)，樣品OD值大于規(guī)定的陰性對照OD值的2. 1倍，即判為陽性，小于此值判為陰性。實施例6試劑盒特異性檢測20份急性血吸蟲病人血清、46份慢性血吸蟲病人血清、20份正常人血清，采用實施例4制備的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測，結(jié)果檢測急性、慢性血吸蟲病人血清陽性率分別為100%和86. 9%,20份正常人血清特異性為100%。2.現(xiàn)場初步應(yīng)用用實施例4制備的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測72份來自現(xiàn)場的血吸蟲病人抗體陽性血清樣本，結(jié)果檢測到循環(huán)抗原陽性結(jié)果為37份，而糞檢結(jié)果僅為9 份，這樣大大提高了糞檢的漏檢率1倍)，而同時又縮小了因抗體長期存在而造成的假陽性，非常適合血吸蟲病流行區(qū)現(xiàn)場的大規(guī)模篩查。
1權(quán)利要求
1.一種檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于包括包被有包被原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、包被緩沖液、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、血吸蟲病陰性血清、顯色液和終止液，所述的包被有包被原的酶標(biāo)板是包被抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b的酶標(biāo)板，所述的酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體 IgM。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的濃縮洗滌液是濃度為0. 01 0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 4，所述的磷酸鹽緩沖液還含有吐溫20和疊氮化鈉，所述的吐溫20在磷酸鹽緩沖液中的質(zhì)量百分比為 1%，所述的疊氮化鈉在磷酸鹽緩沖液中的質(zhì)量百分比為0. 3%。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的樣品稀釋液為洗滌緩沖液，所述的洗滌緩沖液為濃縮洗滌液的18-22倍稀釋的工作液。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgM，所述的顯色液由第一顯色液和第二顯色液組成，第一顯色液為過氧化氫溶液，第二顯色液為四甲基聯(lián)苯胺溶液，終止液為2mol/L的硫酸。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgM，所述的顯色液為 4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，所述的終止液為lmol/L的氫氧化鈉緩沖液。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒灨腥狙x的家兔血清，所述的血吸蟲病陰性血清為健康人血清或正常家兔血清。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的包被緩沖液是PH值為9. 6的0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
8.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的包被抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體的酶標(biāo)板中的日本血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b由保藏號為CGMCC NO :4978的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
9.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體中的抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgM 由保藏號為CGMCC NO 3642的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
10.權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)一個制備包被有包被原的酶標(biāo)板的步驟，所述的包被有包被原的酶標(biāo)板是包被抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體的酶標(biāo)板；2)包括一個制備酶標(biāo)記物的步驟，所述的酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體，采用辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記；3)包括一個制備包被緩沖液的步驟；4)包括一個制備濃縮洗滌液的步驟；5)包括一個制備樣品稀釋液的步驟；6)包括一個制備血吸蟲病陽性血清和血吸蟲病陰性血清的步驟；7)包括一個制備顯色液和一個制備終止液的步驟；8)包括一個將上述產(chǎn)品組裝的步驟。
11.如權(quán)利要求10所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征在于所述的包被有包被原的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記物中的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體均采用雜交瘤技術(shù)制備的，包括如下步驟，1)一個動物免疫的步驟，在所述的動物免疫的步驟中，先制備日本血吸蟲的可溶性抗原，然后通過日本血吸蟲的可溶性抗原免疫動物；2)—個細(xì)胞融合的步驟，取骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫脾細(xì)胞按1 5 1 10比例在 PEG4000作用下進行融合；3)一個雜交瘤細(xì)胞篩選和克隆化的步驟；4)將單克隆細(xì)胞株注入動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的步驟；5)一個純化抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體的步驟。
12.如權(quán)利要求10所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征在于在制備包被有包被原的酶標(biāo)板的步驟中，用包被緩沖液將抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b，然后將抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b加入酶標(biāo)板的孔中孵育，倒去包被液，用濃縮洗滌液洗，然后拍干真空密封保存。
13.如權(quán)利要求10所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征在于在制備包被緩沖液的步驟中，所述的包被緩沖液為PH值等于9. 6的0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
14.如權(quán)利要求10所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征在于在制備濃縮洗滌液的步驟中，所述的濃縮洗滌液是濃度為0. 01 0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液，PH值為7. 0-7. 4，所述的磷酸鹽緩沖液還含有吐溫20和疊氮化鈉，所述的吐溫 20在所述的磷酸鹽緩沖液中的質(zhì)量百分比為1%，所述的疊氮化鈉在所述的磷酸鹽緩沖液中的質(zhì)量百分比為0.3%。
15.如權(quán)利要求10所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征在于在制備樣品稀釋液的步驟中，所述的樣品稀釋液為洗滌緩沖液，洗滌緩沖液為濃縮洗滌液的18-22倍稀釋的工作液。
16.如權(quán)利要求10所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征在于在制備顯色液和終止液的步驟中，所述的酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體IgM，所述的顯色液由第一顯色液和第二顯色液組成，第一顯色液為過氧化氫溶液，第二顯色液為四甲基聯(lián)苯胺溶液，終止液為2mol/L的硫酸。
17.如權(quán)利要求10所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征在于在制備顯色液和終止液的步驟中，所述的酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體IgM，所述的顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，所述的終止液為 lmol/L氫氧化鈉緩沖液。
18.如權(quán)利要求10所述的檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征在于在制備血吸蟲病陽性血清和血吸蟲病陰性血清的步驟中，所述的血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒灨腥狙x的家兔血清，所述的血吸蟲病陰性血清為健康人血清或正常兔血清。
19.一種小鼠雜交瘤細(xì)胞，其特征在于其保藏號為CGMCC NO :4978.
20.一種血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體，其特征在于由保藏號為CGMCC NO :4978的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被有包被原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、包被緩沖液、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、血吸蟲病陰性血清、顯色液、終止液，包被有包被原的酶標(biāo)板是包被抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgG2b的酶標(biāo)板,酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體IgM。本發(fā)明還提供了上述的試劑盒的制備方法，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒敏感性高、特異性強、重復(fù)性好，分別適合批量標(biāo)本的檢測和療效考核。
文檔編號G01N33/577GK102353788SQ20111029858
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者周洋, 張玲玲, 田利光, 艾琳, 蔡玉春, 郭儉, 陳家旭, 陳木新, 陳韶紅 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所