專利名稱：一種定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效液相色譜(HPLC)分析方法，具體涉及以HPLC定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法。
背景技術(shù)：
曲酸雙棕櫚酸酯是一種曲酸脂肪酸衍生物，近來被認(rèn)為是一種效果顯著的、較為穩(wěn)定的皮膚美白劑，關(guān)于曲酸脂肪酸衍生物的美白機(jī)理及其對皮膚作用過程的研究也得到相當(dāng)?shù)闹匾?。尤其是對曲酸脂肪酸衍生物?jīng)皮滲透行為的研究，可在美白產(chǎn)品研制中為配方的合理性提供依據(jù)，而準(zhǔn)確測定曲酸脂肪酸衍生物含量是這些研究工作的必要手段之一。特別是測定生物樣本如皮膚浸出液中的微量曲酸脂肪酸衍生物，要求有高精度、高靈敏度的方法。然而，目前還尚未有過曲酸脂肪酸衍生物定量測定方法的相關(guān)報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
由于目前尚未有相應(yīng)的測定方法可以與曲酸脂肪酸衍生物在藥物代謝動力學(xué)等學(xué)科中的研究相適應(yīng)，本發(fā)明的目的就在于提供一種簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確度高、精確度好且回收率高的定量分析方法。
本發(fā)明提供的是一種高效液相色譜定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法，采用反相分配柱，柱溫25-45℃，流動相四氫呋喃/甲醇＝45/55～15/85，流速0.8～1.5ml/分。
本發(fā)明采用的反相分配柱選擇C18色譜柱，例如，采用YWG C18250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm或Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm等，均能得到良好的色譜分離圖譜，而從性能/價格比考慮，以YWG C18250×4.6mm 10μm為佳。
本發(fā)明的高效液相色譜定量分析方法中，采用柱溫25-45℃均能達(dá)到與雜質(zhì)的有效分離，最佳柱溫為35℃。
本發(fā)明的高效液相色譜定量分析方法中，采用流動相四氫呋喃/甲醇＝45/55～15/85均能達(dá)到與雜質(zhì)的有效分離，而以流動相四氫呋喃/甲醇＝25/75分離效果最佳。
本發(fā)明的高效液相色譜定量分析方法中，采用的流速為0.8～1.5ml/分，以1.0ml/分分離效果為最佳。


圖1是四種不同流動相配比的曲酸雙棕櫚酸酯色譜圖。
圖2是曲酸雙棕櫚酸酯的紫外線吸收光譜圖，圖中KAD為曲酸雙棕櫚酸酯，THF為四氫呋喃。
圖3是不同柱溫下曲酸雙棕櫚酸酯色譜分離圖。
圖4是曲酸雙棕櫚酸酯液相色譜定量校正曲線。
圖5是分析條件調(diào)整前的7#、8#色譜分離圖。圖中，KAD為曲酸雙棕櫚酸酯，C-a為產(chǎn)品中的一種基質(zhì)成分，P-II為促滲透劑。
圖6是分析條件調(diào)整后的7#、8#色譜分離圖。圖中，KAD為曲酸雙棕櫚酸酯，C-a為產(chǎn)品中的一種基質(zhì)成分，P-II為促滲透劑。
具體實施例方式
①流動相的選擇曲酸雙棕櫚酸酯為弱極性化合物，難溶于水，微溶于甲醇、乙腈，在丙酮、四氫呋喃中有較好的溶解性，故采用非水系反相分配層析原理，用四氫呋喃/甲醇為流動相作色譜分析。
②流速的選擇取不同流動相流速作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，從保留時間、分離效果、色譜峰形等幾方面進(jìn)行比較，選擇適宜的流速。
③色譜柱的選擇根據(jù)反相分配層析原理及待測成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，確定以C18柱為首選分析柱。具體選用YWG C18250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm、Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm等多種牌號或型號的C18色譜柱。
④檢測波長的選擇將曲酸雙棕櫚酸酯純品用四氫呋喃溶解，在波長190nm～400nm范圍內(nèi)作吸光度掃描。從紫外吸收光譜圖(圖2)可見曲酸雙棕櫚酸酯在217、250nm處分別有峰值吸收，因為四氫呋喃在217nm附近也有較大吸收，故以主吸收波長250nm作為檢測曲酸雙棕櫚酸酯的首選波長。
⑤柱溫比較不同柱溫條件下所得到的樣品色譜圖，選擇合適柱溫，使待測成分與試樣中共存成分得到最佳分離。
以上所述的分析條件選擇是以曲酸雙棕櫚酸酯純品為對象而確立的，在方法的實際應(yīng)用中，遇到的樣品大部分都是多組分的，出現(xiàn)干擾的情況很多。對于這些干擾成分可以通過樣品預(yù)處理的方法去除，如液-液萃取、固相萃取等；或者通過調(diào)整分析條件組合，如流動相配比、柱溫等，使待測成分與干擾成分得到有效分離。
實施例1 HPLC分析條件的確定本實施例采用Waters高效液相色譜系統(tǒng)Alliance 2690泵，YWG C18 250×4.6mm 10μm柱，2487紫外/可見光檢測器，Millennium 32軟件系統(tǒng)；試劑甲醇和四氫呋喃均為HPLC專用，水為蒸餾—去離子水。
(1)流動相的選擇用不同配比的四氫呋喃/甲醇為流動相作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，得到一組譜圖(圖1)?？梢钥吹?，四氫呋喃/甲醇比例從45/55～15/85時，均能達(dá)到較好的分離，而色譜峰保留時間隨甲醇比例增加逐漸后移，與雜質(zhì)峰的分離度也逐次增大，以四氫呋喃/甲醇配比為25/75分離效果最好。如果四氫呋喃/甲醇比例大于45/55或小于15/85，只要能有效分離，也可使用。
(2)流速的選擇取0.8ml/分鐘、1.0ml/分鐘、1.5ml/分鐘等不同流動相流速作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，均能達(dá)到有效分離，而從保留時間、分離效果、色譜峰形等幾方面比較后認(rèn)為流速1.0ml/分鐘為最佳。
(3)色譜柱的選擇選用YWG C18250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm、Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm等多種牌號或型號的C18色譜柱分別作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，均能得到良好的色譜分離圖譜，而從性能/價格比考慮，以YWG C18250×4.6mm 10μm色譜柱為佳。
(4)檢測波長的選擇將曲酸雙棕櫚酸酯純品用四氫呋喃溶解，在波長190nm～400nm范圍內(nèi)作吸光度掃描。從紫外吸收光譜圖(圖2)可見曲酸雙棕櫚酸酯在217、250nm處分別有峰值吸收，因為流動相溶劑四氫呋喃在次吸收峰217nm附近也有較大吸收，故以主吸收波長250nm作為檢測曲酸雙棕櫚酸酯的首選波長。
(5)柱溫的選擇分別在25℃、30℃、35℃、45℃柱溫條件下作曲酸雙棕櫚酸酯色譜分析，所得到的樣品色譜圖(見圖3)表明在25～45℃范圍內(nèi)均達(dá)到很好的分離，保留時間隨柱溫的升高而明顯前移，且雜質(zhì)峰的分離度也有明顯變化。實際應(yīng)用中，可在25～45℃范圍內(nèi)或低于或高于此范圍選擇合適柱溫，使待測成分與試樣中共存成分得到最佳分離。
實施例2 定量相關(guān)性實驗用一組不同含量的曲酸雙棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)系列樣品按上述分析條件分別作色譜分析，將得到的色譜峰面積與含量作線性回歸分析，所得到的回歸曲線具有良好的線性關(guān)系(圖4)，相關(guān)系數(shù)r＝0.9995。
實施例3 回收率與重復(fù)性實驗在兩個不含曲酸雙棕櫚酸酯的護(hù)膚霜中加入曲酸雙棕櫚酸酯，使其含量參考值分別為10.0、100μg/g，充分混合后按本方法平行測定10次，結(jié)果見表1。
表1、方法回收率與重復(fù)性實驗結(jié)果測定 標(biāo)準(zhǔn)平均平均標(biāo)準(zhǔn) 相對樣品號 次數(shù) 加入量 回收量 回收率 偏差 標(biāo)準(zhǔn)偏差次 μg/g μg/g ％ SDRSD％110 10 9.8998.91.81.8210 100 99.699.61.31 1.3
實施例4 在“幾種美白劑及其配方經(jīng)皮滲透合理設(shè)計最佳配方”研究中，應(yīng)用本方法測定各種促滲透劑對曲酸雙棕櫚酸酯透皮效果的影響(1)含曲酸雙棕櫚酸酯樣品的制備在甲醇∶四氫呋喃(40∶60)的溶劑中可充分溶解＜0.1mg/ml的曲酸雙棕櫚酸酯。制備樣品時根據(jù)試樣中曲酸雙棕櫚酸酯的含量范圍按所述溶解極限決定稀釋度。
(2)美白霜試樣分析美白霜試樣7#與8#基本配方組分相似，配方8#添加了促滲透劑P-II，用類似本發(fā)明條件的高效液相色譜法進(jìn)行分析測定，分析條件為YWG C18250×4.6mm10μm柱、流動相配比甲醇∶四氫呋喃75∶25、流速1.0ml/分鐘、柱溫30℃、檢測波長250nm。試樣7#、8#的HPLC色譜圖見圖5，圖中可見8#配方中曲酸雙棕櫚酸酯與組分C-a(產(chǎn)品中的一種基質(zhì)成分)、組分P-II不能完全分離，因此定量分析的準(zhǔn)確性受到影響。利用本發(fā)明的測定方法，對流動相配比、柱溫等條件作適當(dāng)調(diào)整后再對配方7#、8#作色譜分析(將流動相配比與柱溫分別調(diào)整為85∶15和40℃)，得到的色譜圖見圖6。將圖5、圖6進(jìn)行比較可以看到分析條件調(diào)整后，試樣中各組分得到完全分離，可以準(zhǔn)確定量試樣中的曲酸雙棕櫚酸酯及其它成分。
權(quán)利要求
1.高效液相色譜定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法，其特征在于采用反相分配柱，柱溫25-45℃，流動相四氫呋喃/甲醇＝45/55～15/85，流速0.8～1.5ml/分，檢測波長為250nm。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中反相分配柱為C18柱。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中反相分配柱選自YWG C18 250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm和Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中反相分配柱為YWG C18 250×4.6mm10μm。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中柱溫為35℃。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中流動相四氫呋喃/甲醇＝25/75。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中流速為1.0ml/分。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以高效液相色譜法定量分析曲酸雙棕櫚酸酯的方法，該方法在柱溫25－45℃、流動相四氫呋喃/甲醇＝45/55～15/85、流速0.8～1.5ml/分鐘、檢測波長250nm條件下利用反相分配層析原理對樣品進(jìn)行分析，具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點。
文檔編號G01N30/36GK1472530SQ0213632
公開日2004年2月4日 申請日期2002年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月31日
發(fā)明者蔡惠民, 周莉 申請人:上海家化聯(lián)合股份有限公司