專(zhuān)利名稱(chēng)：用于固定生理物質(zhì)的底物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于固定生理物質(zhì)(a physiological material)的底物(substrate)及其制備方法，且更具體地，本發(fā)明涉及用于固定帶有均勻和高密度的官能團(tuán)的生理物質(zhì)的底物及其制備方法。
背景技術(shù)：
近來(lái)，世界上對(duì)開(kāi)發(fā)用于分析諸如核酸、蛋白質(zhì)、酶、抗體和抗原這樣的生理物質(zhì)活性的技術(shù)的需求迅速增加。就這類(lèi)需求而言，建議使用生物芯片，其中通過(guò)采用半導(dǎo)體加工技術(shù)將所需的生理物質(zhì)分子固定在某些微小的區(qū)域，由此易于通過(guò)以生物化學(xué)方式檢測(cè)上述生物芯片而獲得生理上有用的信息。
生物芯片是常規(guī)的半導(dǎo)體芯片的形式，不過(guò)在其上面整合的是諸如酶、蛋白質(zhì)、抗體、DNA、微生物、動(dòng)物和植物細(xì)胞及器官、神經(jīng)元等這樣的生物有機(jī)物質(zhì)。可以將所述的生物芯片分類(lèi)為固定DNA探針的“DNA芯片”；固定諸如酶、抗體、抗原等這樣的蛋白質(zhì)的“蛋白質(zhì)芯片”；以及通過(guò)預(yù)處理、生化反應(yīng)、檢測(cè)和產(chǎn)生自動(dòng)分析功能的數(shù)據(jù)分析功能整合的“芯片上的實(shí)驗(yàn)室”。
為了成功開(kāi)發(fā)這類(lèi)生物芯片，重要的是找到一種用于固定生理物質(zhì)的方法，其中可以在生理物質(zhì)與底物之間有效形成界面，并且可以以最大程度地利用所述生理物質(zhì)的內(nèi)在固有功能。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)各種技術(shù)，例如通過(guò)使DNA與碳化二亞胺反應(yīng)而活化DNA的5’-磷酸基和通過(guò)使活化的DNA與底物表面上的官能團(tuán)反應(yīng)以便將所述DNA固定在所述底物表面而將生理物質(zhì)固定在玻璃載玻片、硅片、微孔板、管、球形珠、帶有多孔層的表面等的表面上。
USP No.5,858,653中公開(kāi)了能夠與靶生理物質(zhì)反應(yīng)的離子基團(tuán)如季銨基團(tuán)、質(zhì)子化的叔胺或磷鎓和用于結(jié)合底物表面的帶有光活性基團(tuán)或熱化學(xué)活性基團(tuán)的聚合物。USP No.5,981,734中教導(dǎo)了當(dāng)用帶有氨基或醛基的聚丙烯酰胺凝膠固定DNA時(shí)，該DNA可以通過(guò)穩(wěn)定的雜交鍵與底物結(jié)合而易于促進(jìn)分析的進(jìn)行。USP No.5,869,272中公開(kāi)了包括選自樹(shù)枝狀聚合物、星形聚合物、分子自組裝聚合物、聚合型硅氧烷和通過(guò)用氨基硅烷對(duì)硅片進(jìn)行旋轉(zhuǎn)涂敷形成的成膜膠乳的化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合層。USP No.5,869,272中還公開(kāi)了一種通過(guò)檢測(cè)光活性表面的視覺(jué)顏色改變來(lái)測(cè)定細(xì)菌抗原的方法。USP No.5,919,523中公開(kāi)了一種載體的制備方法，在該載體上用甘氨酸或絲氨酸摻涂氨基硅烷處理的底物或用胺、亞胺或基于酰胺的有機(jī)聚合物涂覆該底物。USP No.5,985,551中公開(kāi)了一種通過(guò)在氨基硅烷處理的底物上使用光刻法技術(shù)而在固體底物上形成氨基的方法，該方法包括下列步驟給固定DNA的區(qū)域賦予親水性功能并給其它區(qū)域賦予氟硅氧烷疏水性功能以便在底物上形成所需圖案的DNA斑點(diǎn)。
在上述專(zhuān)利中，通過(guò)制備自組裝的單層硅烷分子而產(chǎn)生固定層。優(yōu)選硅烷是氨基烷氧基硅烷，因?yàn)樗粫?huì)產(chǎn)生酸性副產(chǎn)物且它可以產(chǎn)生具相對(duì)高密度的帶有官能團(tuán)的分子層。盡管已經(jīng)進(jìn)行了大量研究而使用氨基烷氧基硅烷獲得帶有高密度官能團(tuán)的均勻單層，但是尚未獲得均勻和高密度的具有官能團(tuán)且生產(chǎn)時(shí)間較短的氨基硅烷單層。
生物芯片的性能還受到用作載體的底物性質(zhì)的影響。也就是說(shuō)，為了在對(duì)致密排列進(jìn)行雜交分析時(shí)應(yīng)用光譜技術(shù)，底物應(yīng)是透光的且底物表面與生理物質(zhì)之間的結(jié)合應(yīng)是穩(wěn)定的。
一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)給鈉石灰玻璃涂敷(coat)氨基硅烷化合物來(lái)制備固定底物。然而，鈉石灰玻璃是含有約12％以上鈉的低等級(jí)玻璃。存在于這類(lèi)玻璃中的鈉易于沉積，從而導(dǎo)致玻璃的透明性退化和硅氧烷鍵或玻璃與硅烷之間的鍵離解。固定層由此失去了與底物的結(jié)合強(qiáng)度且難以獲得均勻密度的官能團(tuán)。
為了解決上述難題，WO 99/40038中建議使用硼硅酸鹽或硼硅酸鋁(boroaluminosilicate)玻璃，但它的缺點(diǎn)是過(guò)于昂貴。
發(fā)明概述為了解決上述難題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于固定帶有均勻和高密度的官能團(tuán)的生理物質(zhì)的底物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過(guò)簡(jiǎn)單過(guò)程制備用于固定生理物質(zhì)的底物的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種包括用于固定生理物質(zhì)的底物的生物芯片。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)部分將在下文中描述且部分可以從本說(shuō)明書(shū)中顯而易見(jiàn)或可以通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而得知。
為了實(shí)現(xiàn)這些目的，本發(fā)明提供了一種用于固定生理物質(zhì)的底物，它包括底物、在所述底物上形成的首層和在該首層(primer layer)上形成的固定層，其中所述的首層用于增進(jìn)所述底物與所述固定層之間的結(jié)合。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備用于固定生理物質(zhì)的底物的方法，該方法包括下列步驟給底物涂敷帶有官能團(tuán)的化合物以形成首層；給所述首層涂敷帶有能夠固定生理物質(zhì)的官能團(tuán)的化合物以形成固定層，其中所述的首層能夠增進(jìn)底物與固定層之間的結(jié)合。
本發(fā)明還提供了一種包括固定在底物表面上的生理物質(zhì)的生物芯片。
附圖簡(jiǎn)述對(duì)本發(fā)明更完全地理解及其許多附加的優(yōu)點(diǎn)是容易明白的，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)參照下列具體描述并結(jié)合圖考慮時(shí)更好地理解它們。


圖1是說(shuō)明本發(fā)明固定生理物質(zhì)的底物的制備方法的示意圖；圖2是表示常規(guī)自組裝單層的截面圖；圖3是表示本發(fā)明用于具有三維交聯(lián)結(jié)構(gòu)的固定生理物質(zhì)的底物的截面圖。
圖4A和4B分別是表示對(duì)用于固定生理物質(zhì)的本發(fā)明實(shí)施例1和2底物進(jìn)行浸入試驗(yàn)的結(jié)果的照片；且圖5A和5B分別是表示用于固定生理物質(zhì)的本發(fā)明實(shí)施例1和6底物的發(fā)光影象的照片。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述下文進(jìn)一步具體地描述本發(fā)明。
圖1是說(shuō)明制備用于固定生理物質(zhì)的底物的方法的示意圖。正如圖1中所示，用于固定生理物質(zhì)的底物10在底物10與固定層30之間包括首層20。該首層20阻斷堿性物質(zhì)從鈉石灰玻璃基質(zhì)中的沉積且能夠改善底物10與固定層30的固定官能團(tuán)之間的結(jié)合。它還極易與氨基硅烷反應(yīng)，使得它產(chǎn)生均勻排列的高密度官能團(tuán)。
本發(fā)明的底物10例如為玻璃、硅片(silicone wafer)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯等，但并不限于它們。它還可以是微孔板、管、球形珠或多孔層的形式。
用于形成能夠增進(jìn)在底物10與固定層30之間結(jié)合的首層的實(shí)例包括，但不限于選自式1和式2所代表的化合物及其混合物的任意化合物M(OR1)n(1)其中M是選自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素組成的組的元素；且優(yōu)選選自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb組成的組；R1是氫原子或C1-20烷基或C6-12芳族基且優(yōu)選是氫原子、甲基、乙基、丙基、丁基或苯基；且n是3-4的值且根據(jù)M的化合價(jià)來(lái)決定；[M’(OR2)m]p(R3)q(2)其中M’是選自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素組成的組的元素且優(yōu)選選自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb組成的組；R2是氫原子、鹵原子或C1-20烷基或C6-12芳族基團(tuán)且優(yōu)選是氫原子、氯或甲基、乙基、丙基、丁基或苯基；R3是任選被C1-6取代基取代的亞甲基(methylene)或苯基；m是2-3的值且根據(jù)M’的化合價(jià)來(lái)決定；p是2-4的數(shù)值；且q是1-20的數(shù)值。
由式(1)代表的化合物的優(yōu)選實(shí)例是四烷醇硅(silicon tetraalkoxide)，如原硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate)、三丁醇鋁(aluminum tributoxide)、四丁醇鋯(zirconium tetrabutoxide)等。
由式(2)代表的化合物的實(shí)例是雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷、雙(三甲氧基甲硅烷基)己烷、雙(三乙基氧基甲硅烷基)甲烷、1，9-雙-(三氯甲硅烷基)壬烷、雙(三正丁氧基錫)甲烷、雙(三異丙氧基鈦)己烷(bis(triisoipropoxytitanium)hexane)、1，4-雙(三甲氧基甲硅烷基乙基)苯等。
在將式(1)化合物與式(2)化合物混合使用的情況中，它們的重量比優(yōu)選在0.01∶99.9-100.0、更優(yōu)選在50∶50-95∶5的范圍。
通過(guò)給底物涂布涂敷組合物來(lái)形成首層，所述的涂敷組合物包括能夠增進(jìn)底物與固定層之間結(jié)合的化合物。通過(guò)將用于形成首層的化合物溶于稀釋溶劑中來(lái)制備涂敷組合物。稀釋溶劑是水與有機(jī)溶劑的混合物且所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選是醇溶劑，諸如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇；溶纖劑溶劑，諸如甲基溶纖劑；與水相容的任意有機(jī)溶劑，諸如丙酮類(lèi)；或它們的任意混合物。
將用于形成首層的化合物溶于溶劑中且通過(guò)水解反應(yīng)和縮合反應(yīng)形成低聚物。為了增加反應(yīng)速率，添加諸如乙酸、硝酸、鹽酸等這樣的任意有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸以便將涂敷用組合物的pH調(diào)節(jié)至2-10。
該涂敷組合物包括用量為0.1-90wt％、優(yōu)選1-50wt％的形成首層的化合物。在化合物的用量低于0.1wt％的情況中，底物與固定層之間結(jié)合的增進(jìn)作用不充分，而在化合物的用量高于90wt％的情況中，該涂敷組合物不能施加到底物上。
通過(guò)給底物涂布涂敷組合物而簡(jiǎn)單地制備首層。該涂敷方法的實(shí)例包括、但不限于濕涂覆法，諸如浸入、噴霧、旋轉(zhuǎn)涂敷或印刷。正如圖1中所示，該首層的表面上帶有能夠與固定官能團(tuán)結(jié)合的硅醇基(SiOH)。
優(yōu)選在100-400℃的溫度下加熱涂敷的底物以便增加涂敷層的密度并增進(jìn)與底物的結(jié)合。在加熱溫度低于100℃的情況中，表面強(qiáng)度不足且諸如鈉這樣的堿性物質(zhì)幾乎很少被阻斷。另一方面，在加熱溫度高于400℃的情況中，表面的硅烷醇基退化而使涂敷層與底物之間的結(jié)合降低。
通過(guò)在首層表面上施加包括固定官能團(tuán)的化合物而獲得固定層，從而得到用于固定生理物質(zhì)的底物。本文中的術(shù)語(yǔ)“固定層”指的是帶有用于固定生理物質(zhì)的固定官能團(tuán)的任意化合物的涂敷層。
所述的固定官能團(tuán)例如為氨基、醛、巰基或羧基，但并不限于它們。帶有固定基團(tuán)的化合物可以由式(3)代表Y-R4-Si(R5)3(3)其中Y隨生理物質(zhì)的端基的不同而改變且至少是一種選自氨基、醛、巰基和羧基組成的組的官能團(tuán)；
R4選自C1-20烷基、C6-20芳族基團(tuán)、酯基和亞胺基組成的組；且優(yōu)選是甲基、乙基、丙基或丁基；而R5選自羥基、C1-20烷氧基、乙酰氧基、鹵素及其組合組成的組且優(yōu)選是羥基、乙氧基或乙酰氧基。
帶有氨基作為固定官能團(tuán)的式(3)化合物的優(yōu)選實(shí)例包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、2-氨基十一烷基三甲氧基硅烷、氨基苯基三甲氧基硅烷和N-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷。帶有巰基的化合物優(yōu)選例如為3-巰基丙基三甲氧基硅烷、3-巰基丙基三乙氧基硅烷等。帶有醛基的化合物優(yōu)選例如為4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛等。帶有羧基的化合物優(yōu)選例如為羧甲基三甲氧基硅烷、羧甲基三乙氧基硅烷等。
為了降低固定基團(tuán)的親水性并改善三維交聯(lián)結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性，可以將式(3)的化合物與由下列式(4)代表的疏水性硅烷化合物混合 其中R6選自C1-14烷基、任選被優(yōu)選的甲基、乙基或丙基取代的C6-12芳族基團(tuán)和CX3組成的組，其中X是鹵素，且優(yōu)選是甲基、乙基或丙基；R7和R8各自獨(dú)立地選自C1-14烷氧基、乙酰氧基、羥基和鹵素組成的組且優(yōu)選是甲氧基、乙氧基、乙酰氧基或氯；R9選自氫、C1-14烷基和C6-12芳族基團(tuán)組成的組且優(yōu)選是甲基或乙基；k是1-15的整數(shù)。
可以通過(guò)向帶有固定官能團(tuán)的化合物中添加疏水性硅烷化合物來(lái)控制固定層的親水性、效率、用量和形狀。疏水性硅烷化合物例如為甲基三甲氧基硅烷、丙基三乙酰氧基硅烷等。
當(dāng)將式(3)的硅烷化合物與式(4)的疏水性硅烷化合物混合時(shí)，它們的重量比為0.01∶99.99-100.0且優(yōu)選50∶50-95∶5。
通過(guò)給首層涂布涂敷組合物來(lái)制備固定層，通過(guò)將式(3)的化合物和任選的式(4)的化合物溶于稀釋溶劑中來(lái)制備涂敷組合物。
稀釋溶劑是有機(jī)溶劑、水或有機(jī)溶劑與水的混合物。有機(jī)溶劑優(yōu)選是醇溶劑，諸如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇；溶纖劑溶劑，諸如甲基溶纖劑；與水相容的任意有機(jī)溶劑，諸如丙酮類(lèi)；或它們的任意混合物。由于稀釋溶劑是與水相容的有機(jī)溶劑，所以硅烷低聚物易于共聚得到涂敷組合物且對(duì)環(huán)境有利。
用于形成固定層的涂敷組合物包括0.1-90wt％、優(yōu)選0.1-50wt％的硅烷化合物。當(dāng)硅烷化合物的用量低于0.1wt％時(shí)，不足以形成固定官能團(tuán)；而當(dāng)硅烷化合物的用量高于90wt％時(shí)，涂敷組合物不能施加到底物上且獲得的涂敷層過(guò)厚而難以防止裂化。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，用包括硅烷低聚物與稀釋溶劑的涂敷組合物來(lái)形成固定層，其中通過(guò)使帶有固定官能團(tuán)的硅烷化合物在水或含有水與有機(jī)溶劑的混合溶劑中共聚合來(lái)獲得硅烷低聚物。稀釋溶劑選自水、有機(jī)溶劑以及水與有機(jī)溶劑的混合溶劑組成的組。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以通過(guò)將帶有固定官能團(tuán)的硅烷化合物與選自水和水與有機(jī)溶劑混合溶劑的稀釋溶劑混合來(lái)獲得涂敷組合物。硅烷化合物在水或含有水與有機(jī)溶劑的混合溶劑中共聚合而形成硅烷低聚物(oligomer)。
當(dāng)帶有作為固定官能團(tuán)的氨基的式(3)化合物之一的氨基硅烷化合物在水中聚合時(shí)，獲得了由下列式(5)代表的化合物 其中r是共聚度。
使式(3)化合物中官能團(tuán)是氨基的氨基硅烷化合物與式(4)的疏水性硅烷化合物彼此聚合成由下列式(6)代表的氨基硅烷低聚物 其中R6與式(4)中所定義的相同；且s和t分別為共聚度。
為了提高反應(yīng)速率，添加諸如乙酸、硝酸、鹽酸等這樣的任意的有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸催化劑以將涂敷組合物的pH調(diào)節(jié)至2-10。共聚合反應(yīng)優(yōu)選在0℃-100℃的溫度下進(jìn)行1-24小時(shí)。
硅烷低聚物維持穩(wěn)定的反應(yīng)相當(dāng)速率而不會(huì)參與進(jìn)一步的反應(yīng)，因?yàn)槿缡?5)和(6)中所示，氨基端基通過(guò)涂敷用組合物中的氫鍵與羥基端基結(jié)合。
此外，根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案，將帶有固定官能團(tuán)的硅烷化合物溶于水或含有水與有機(jī)溶劑的混合溶劑從而通過(guò)共聚合反應(yīng)得到涂敷組合物中的硅烷低聚物水合物。
可以通過(guò)與形成首層相同的方法形成固定層。也就是說(shuō)，可以使用諸如浸涂、噴霧、旋轉(zhuǎn)涂敷或印刷這樣的任意濕涂敷法，但并不限于它們。正如圖1中所示，固定層的官能團(tuán)與首層表面上存在的硅烷醇基反應(yīng)。
涂敷的硅烷低聚物熱固并縮合以提供帶有三維交聯(lián)結(jié)構(gòu)的固定層。熱固溫度優(yōu)選為100-300℃。當(dāng)溫度低于100℃時(shí)，不足以發(fā)生縮合反應(yīng)；而當(dāng)該溫度高于300℃時(shí)，氨基迅速退化(degenerate)。
正如圖2中所示，在底物1上形成的常規(guī)固定層是自組裝單層。制備該自組裝單層的時(shí)間期限延長(zhǎng)且難以獲得具有均勻密度的官能團(tuán)。
本發(fā)明可以提供具有如圖3中所示三維交聯(lián)結(jié)構(gòu)的固定層，從而提供均勻的官能團(tuán)。此外，用相對(duì)短的時(shí)間制備具有高密度官能團(tuán)的固定層。
所述的三維交聯(lián)結(jié)構(gòu)防止了在固定或洗滌步驟中使用溶劑洗滌時(shí)固定層的消失和生理物質(zhì)的分離。因此，由于這種結(jié)構(gòu)特性而改善了熱穩(wěn)定性和試劑穩(wěn)定性。
在固定層與底物之間存在的首層改善了固定層與底物之間的結(jié)合并阻斷了降低結(jié)合強(qiáng)度的任何堿性物質(zhì)，從而穩(wěn)定地保護(hù)了固定官能團(tuán)。
通過(guò)分析激光束連續(xù)照射時(shí)從固定層熒光染料中發(fā)射出的光來(lái)測(cè)定固定基團(tuán)的密度，其中所述的染料是異硫氰酸酯或琥珀酰亞胺醚活化的四乙基羅丹明-異硫氰酸酯(SCN-TMR)或異硫氰酸熒光素(FITC)。
密度分析結(jié)果表明本發(fā)明用于固定生理物質(zhì)的底物帶有均勻和高密度的極為穩(wěn)定的固定官能團(tuán)。
本發(fā)明還提供了通過(guò)使生理物質(zhì)與底物上的固定官能團(tuán)結(jié)合或通過(guò)使活化而帶有官能團(tuán)的生理物質(zhì)結(jié)合在底物上并洗滌掉未反應(yīng)的生理物質(zhì)而形成預(yù)定圖案而制備的生物芯片。所述的生理物質(zhì)優(yōu)選與固定層反應(yīng)1-24小時(shí)。
本文的術(shù)語(yǔ)“生理物質(zhì)”指的是來(lái)源于生物體及其等同物的生理物質(zhì)或體外制備的生理物質(zhì)。例如，它包括酶、蛋白質(zhì)、抗體、細(xì)菌(microbe)、動(dòng)物和植物細(xì)胞和器官、神經(jīng)元、DNA和RNA且優(yōu)選是DNA、RNA或蛋白質(zhì)，其中所述的DNA可以包括cDNA、基因組DNA和寡核苷酸；所述的RNA可以包括基因組RNA、mRNA和寡核苷酸；且所述的蛋白質(zhì)可以包括抗體、抗原、酶、肽等。
用于使生理物質(zhì)在固定層上顯示出圖案的方法可以是光刻法、壓電印刷法、微量吸移法、點(diǎn)樣法(spotting)等中的任意方法。
下文參照實(shí)施例來(lái)具體地解釋本發(fā)明。然而，不應(yīng)將這些實(shí)施例在任何意義上理解為限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1將3g的原硅酸四乙酯加入到包括90g乙醇與7g水的稀釋溶劑混合物中并通過(guò)添加硝酸而將該體系的pH調(diào)節(jié)至pH為2以獲得用于形成首層的涂敷組合物。將玻璃載玻片浸入所述的涂敷組合物中并給其涂敷該涂敷組合物且在200℃下加熱至在玻璃載玻片上形成首層。將5g的3-氨基丙基三甲氧基硅烷與15g的水混合并在60℃下反應(yīng)8小時(shí)而得到氨基硅烷低聚物水合物。將10g的氨基硅烷低聚物水合物溶于90g的乙醇中而得到用于形成固定層的涂敷組合物。將首層涂敷的玻璃載玻片浸入該涂敷組合物并給其涂敷該涂敷組合物且然后在120℃下熱固60分鐘而形成用于固定生理物質(zhì)的底物。
實(shí)施例2將3g的原硅酸四乙酯和0.3g的雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷加入到包括90g乙醇與7g水的稀釋溶劑混合物中并通過(guò)添加硝酸而將該體系的pH調(diào)節(jié)至pH為2以獲得用于形成首層的涂敷用組合物。將玻璃載玻片浸入所述的涂敷組合物中并涂敷該涂敷組合物且在200℃下加熱至在玻璃載玻片上形成首層。然后按照與實(shí)施例1中所述相同的方法獲得用于固定生理物質(zhì)的底物。
實(shí)施例3將3g的原硅酸四乙酯加入到包括90g乙醇與7g水的稀釋溶劑混合物中并通過(guò)添加硝酸而將該體系的pH調(diào)節(jié)至pH為2以獲得用于形成首層的第一種涂敷組合物。將19g的正丁醇鋯溶于包括8g乙酰基丙酮與73g乙醇的稀釋溶劑混合物中而得到用于形成首層的第二種涂敷組合物。將玻璃載玻片浸入重量比為9∶1的第一種涂敷組合物與第二種涂敷組合物的涂敷組合物混合物中并將其涂敷該涂敷組合物混合物且在200℃下加熱至在玻璃載玻片上形成首層。將2.5g的3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶于7.5g水與90g乙醇的稀釋溶劑混合物中并在60℃下反應(yīng)8小時(shí)而得到用于形成固定層的含有氨基硅烷低聚物水合物的涂敷組合物。將首層涂敷的玻璃載玻片浸入所述的涂敷組合物中并涂敷該涂敷組合物、然后在100℃下熱固60分鐘，隨后得到用于固定生理物質(zhì)的底物。
實(shí)施例4將3g的原硅酸四乙酯加入到包括90g乙醇與7g水的稀釋溶劑混合物中并通過(guò)添加硝酸而將該體系的pH調(diào)節(jié)至pH為2以獲得用于形成首層的第一種涂敷組合物。將17g的異丙醇鈦(titanium isopropoxide)溶于包括6g乙?；c77g乙醇的稀釋溶劑混合物中而得到用于形成首層的第二種涂敷組合物。將玻璃載玻片浸入重量比為9∶1的第一種涂敷組合物與第二種涂敷組合物的涂敷組合物混合物中并將其涂敷該涂敷組合物混合物且在200℃下加熱至在玻璃載玻片上形成首層。然后按照與實(shí)施例3中所述相同的方法獲得用于固定生理物質(zhì)的底物。
實(shí)施例5將3g的原硅酸四乙酯加入到包括90g乙醇與7g水的稀釋溶劑混合物中并通過(guò)添加硝酸而將該體系的pH調(diào)節(jié)至pH為2以獲得用于形成首層的第一種涂敷組合物。將24g的正丁醇鋁溶于包括10g乙?；c66g乙醇的稀釋溶劑混合物中而得到用于形成首層的第二種涂敷組合物。將玻璃載玻片浸入重量比為9∶1的第一種涂敷組合物與第二種涂敷組合物的涂敷組合物混合物并將其涂敷該涂敷組合物混合物，然后在200℃下加熱至在玻璃載玻片上形成首層。然后按照與實(shí)施例3中所述相同的方法獲得用于固定生理物質(zhì)的底物。
實(shí)施例6將2.5g的氨基丙基三甲氧基硅烷加入到包括90g乙醇與7.5g水的混合溶劑中并在60℃下反應(yīng)8小時(shí)而得到用于形成固定層的含氨基硅烷低聚物水合物的涂敷組合物。將玻璃載玻片浸入該涂敷組合物中并將其涂敷該涂敷組合物，隨后在100℃下熱固60分鐘，然后獲得用于固定生理物質(zhì)的底物。
用于固定官能團(tuán)的穩(wěn)定性試驗(yàn)將按照本發(fā)明實(shí)施例1-6方法制備的用于固定生理物質(zhì)的底物浸入100℃的沸水中6小時(shí)并用Au/Ag膠粒(獲自Mitsubishi Material.Co.)的配制溶液染色。圖4A和4B是浸入過(guò)程前(a)和經(jīng)過(guò)6小時(shí)后(b)實(shí)施例1和2底物的照片。如圖4A中所示，用于固定生理物質(zhì)的實(shí)施例1底物上的染色程度在浸入沸水后(b)與浸入前(a)相比有輕度的下降。此外，如圖4B中所示，實(shí)施例2底物的染色程度(b)幾乎與浸入前(a)相同。就實(shí)施例6而言，染色程度下降。
固定官能團(tuán)的密度測(cè)定將用于固定生理物質(zhì)的實(shí)施例1-6的底物浸入100℃的沸水中1小時(shí)并用FITC的二甲基甲酰胺溶液標(biāo)記該固定層。將激光束連續(xù)照射到該固定層上并通過(guò)ScanArray4000(由GSILUMONICS生產(chǎn))檢測(cè)從該層上FITC中發(fā)射出的光。表1顯示其結(jié)果。
表1
一般來(lái)說(shuō)，熒光強(qiáng)度越高，則固定基團(tuán)越容易保留?？梢钥闯霰景l(fā)明用于固定生理物質(zhì)的底物可以保護(hù)穩(wěn)定和高密度的固定官能團(tuán)。
生物芯片的發(fā)光影象分析將用于固定生理物質(zhì)的實(shí)施例1-6的底物浸入100℃的沸水中1小時(shí)并與帶有15個(gè)堿基的寡核苷酸探針DNA反應(yīng)以便將該DNA固定在表面上。隨后將底物浸入含有用熒光染料Cy3(獲自Mersham Pharmacia，Inc.)標(biāo)記的靶DNA的樣品溶液中并與該靶DNA反應(yīng)，然后將其洗滌掉而獲得DNA芯片。用激光束照射該DNA芯片并通過(guò)ScanArray4000(由GSI LUMONICS生產(chǎn))檢測(cè)從該DNA芯片上發(fā)射出的光。圖5A和5B分別表示實(shí)施例1和本發(fā)明可以通過(guò)提供能夠增進(jìn)底物與固定層之間結(jié)合的首層而保護(hù)固定層。此外，所述的首層阻斷了來(lái)源于底物的堿性物質(zhì)以便使固定官能團(tuán)保持穩(wěn)定。本發(fā)明還提供了通過(guò)簡(jiǎn)單過(guò)程固定帶有均勻和高密度的固定官能團(tuán)的生理物質(zhì)的底物。
實(shí)施例7將5g的3-氨基丙基三甲氧基硅烷與15g水混合并在60℃下反應(yīng)8小時(shí)而得到氨基硅烷低聚物水合物。將10g的氨基硅烷低聚物水合物溶于90g的乙醇中而得到用于形成固定層的含氨基硅烷低聚物水合物的涂敷組合物。將玻璃載玻片浸入該涂敷組合物中并將其涂敷該涂敷組合物，然后在120℃下熱固60分鐘而獲得用于固定生理物質(zhì)的底物。
實(shí)施例8按照與實(shí)施例7中所述相同的方法獲得用于固定生理物質(zhì)的底物，但用3.55g的3-氨基丙基三甲氧基硅烷和1.45g的甲基三甲氧基硅烷替換3-氨基丙基三甲氧基硅烷。
實(shí)施例9按照與實(shí)施例7中所述相同的方法獲得用于固定生理物質(zhì)的底物，但用3.55g的3-氨基乙基三甲氧基硅烷和1.45g的甲基三甲氧基硅烷替換3-氨基丙基三甲氧基硅烷。
對(duì)比例1將0.1g的氨基丙基三甲氧基硅烷加入到9.9g的甲苯中而得到用于形成固定層的涂敷組合物。將玻璃載玻片浸入該涂敷組合物中并涂敷該涂敷組合物，隨后在120℃下熱固60分鐘，從而得到用于固定生理物質(zhì)的底物。固定官能團(tuán)的密度測(cè)定將用于固定生理物質(zhì)的實(shí)施例7-9和對(duì)比例1的底物用FITC的二甲基甲酰胺溶液標(biāo)記。使激光束連續(xù)照射到固定層上并通過(guò)ScanArray4000(由GSI LUMONICS生產(chǎn))檢測(cè)從該層上FITC中發(fā)射出的光。表2顯示其結(jié)果。
表2
一般來(lái)說(shuō)，熒光強(qiáng)度越高，則固定基團(tuán)越容易保留。正如表2中所示，實(shí)施例7-9的熒光強(qiáng)度顯著超過(guò)對(duì)比例1的熒光強(qiáng)度。這表明本發(fā)明用于固定生理物質(zhì)的底物帶有一定密度的固定官能團(tuán)。
盡管已經(jīng)參照優(yōu)選實(shí)施方案具體地描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解可以對(duì)本發(fā)明作各種修改和替換而不會(huì)脫離所附權(quán)利要求中所列的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.用于固定生理物質(zhì)的底物，包括涂敷有首層和在該首層上的固定層的底物材料，所述的首層包括帶有官能團(tuán)且能夠增進(jìn)所述底物材料與固定層之間結(jié)合的化合物；且所述的固定層包括具有能夠固定生理物質(zhì)的官能團(tuán)。
2.權(quán)利要求1所述的底物，其中所述的首層包括選自由下列式1和式2所代表的化合物及其混合物M(OR1)n(1)[M’(OR2)m]p(R3)q(2)其中M和M’各自獨(dú)立地選自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素組成的組；R1選自氫原子、C1-20烷基和C6-12芳族基團(tuán)；R2選自氫原子、鹵原子、C1-20烷基和C6-12芳族基團(tuán)；R3是任選被C1-6取代基取代的亞甲基或苯基；n是3-4的值且根據(jù)M的化合價(jià)來(lái)決定；m是2-3的值且根據(jù)M’的化合價(jià)來(lái)決定；p是2-4的數(shù)值；且q是1-20的數(shù)值。
3.權(quán)利要求2所述的底物，其中所述的首層包括由式1代表的化合物。
4.權(quán)利要求3所述的底物，其中M選自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb組成的組；且R1選自氫、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
5.權(quán)利要求3所述的底物，其中所述的化合物選自四烷醇硅、三丁醇鋁和四丁醇鋯。
6.權(quán)利要求2所述的底物，其中所述的首層包括由式2代表的化合物。
7.權(quán)利要求6所述的底物，其中M’選自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb組成的組；且R2選自氫、氯、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
8.權(quán)利要求6所述的底物，其中所述的化合物選自1，4-雙(三甲氧基甲硅烷基乙基)苯、雙(三甲氧基甲硅烷基)己烷、雙(三乙基氧基甲硅烷基)甲烷、1，9-雙-(三氯甲硅烷基)壬烷、雙(三正丁氧基錫)甲烷、雙(三異丙氧基鈦)己烷和雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷組成的組。
9.權(quán)利要求2所述的底物，其中所述的首層包括由式1和式2所代表的化合物的混合物，其中式(1)化合物與式(2)化合物的重量比在50∶50-95∶5的范圍。
10.權(quán)利要求2所述的底物，其中所述的固定層包括式(3)的化合物Y-R4-Si(R5)3(3)其中Y隨所述生理物質(zhì)的端基的不同而改變且至少是一種選自氨基、醛、巰基和羧基組成的組的官能團(tuán)；R4選自C1-20烷基、C6-20芳族基團(tuán)、酯基和亞胺基組成的組；且R5選自羥基、C1-20烷氧基、乙酰氧基、鹵素及其組合組成的組。
11.權(quán)利要求10所述的底物，其中所述的式(3)的化合物選自3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、2-氨基十一烷基三甲氧基硅烷、氨基苯基三甲氧基硅烷、N-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷、3-巰基丙基三甲氧基硅烷、3-巰基丙基三乙氧基硅烷、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、羧甲基三甲氧基硅烷、羧甲基三乙氧基硅烷及其混合物組成的組。
12.權(quán)利要求1所述的底物，其中所述的固定層包括具有式(4)的疏水性硅烷化合物 其中R6選自C1-14烷基、C6-12芳族基團(tuán)、取代的C6-12芳族基團(tuán)和CX3組成的組，其中X是鹵素；R7和R8各自獨(dú)立地選自C1-14烷氧基、乙酰氧基、羥基和鹵素組成的組；R9選自氫、C1-14烷基和C6-12芳族基團(tuán)組成的組；且k是1-15的整數(shù)。
13.權(quán)利要求12所述的底物，其中R6是甲基、乙基或丙基；R7和R8各自獨(dú)立地選自甲氧基、乙氧基、乙酰氧基和氯組成的組；且R9是甲基或乙基。
14.一種用于能夠增進(jìn)底物與固定層之間結(jié)合的首層的用涂敷組合物，該涂敷組合物包括稀釋溶劑，其中溶解有選自由下列式1和式2所代表的化合物及其混合物M(OR1)n(1)[M’(OR2)m]p(R3)q(2)其中M和M’各自獨(dú)立地選自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素組成的組；R1選自氫原子、C1-20烷基和C6-12芳族基團(tuán)；R2選自氫原子、鹵原子、C1-20烷基和C6-12芳族基團(tuán)；R3是任選被C1-6取代基取代的亞甲基或苯基；n是3-4的值且根據(jù)M的化合價(jià)來(lái)決定；m是2-3的值且根據(jù)M’的化合價(jià)來(lái)決定；p是2-4的數(shù)值；且q是1-20的數(shù)值。
15.權(quán)利要求14所述的涂敷組合物，其中所述的首層包括由式1代表的化合物。
16.權(quán)利要求15所述的涂敷組合物，其中M選自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb組成的組；且R1選自氫、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
17.權(quán)利要求15所述的涂敷組合物，其中所述的化合物選自四烷醇硅、三丁醇鋁和四丁醇鋯及其混合物組成的組。
18.權(quán)利要求14所述的涂敷組合物，其中所述的首層包括由式2代表的化合物。
19.權(quán)利要求18所述的涂敷組合物，其中M’選自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb組成的組；且R2選自氫、氯、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
20.權(quán)利要求18所述的涂敷組合物，其中所述的化合物選自1，4-雙(三甲氧基甲硅烷基乙基)苯、雙(三甲氧基甲硅烷基)己烷、雙(三乙基氧基甲硅烷基)甲烷、1，9-雙-(三氯甲硅烷基)壬烷、雙(三正丁氧基錫)甲烷、雙(三異丙氧基鈦)己烷、雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷及其混合物組成的組。
21.權(quán)利要求14所述的涂敷組合物，其中所述的首層包括由式1和式2所代表的化合物的混合物，其中式(1)化合物與式(2)化合物的重量比在50∶50-95∶5的范圍。
22.權(quán)利要求14所述的涂敷組合物，其中所述的有機(jī)溶劑是至少一種選自醇溶劑、溶纖劑溶劑和丙酮類(lèi)組成的組的溶劑。
23.一種用于底物的固定層的涂敷組合物，該涂敷組合物包括含有水的稀釋溶劑，其中溶解有選自由式(3)代表的化合物Y-R4-Si(R5)3(3)其中Y隨所述生理物質(zhì)的端基的不同而改變且至少是一種選自氨基、醛、巰基和羧基組成的組的官能團(tuán)；R4選自C1-20烷基、C6-20芳族基團(tuán)、酯基和亞胺基組成的組；且R5選自羥基、C1-20烷氧基、乙酰氧基、鹵素及其組合組成的組。
24.權(quán)利要求23所述的涂敷組合物，其中R4是甲基、乙基、丙基或丁基；且R5是羥基、乙氧基或乙酰氧基。
25.權(quán)利要求23所述的涂敷組合物，其中所述的式(3)的化合物選自3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、2-氨基十一烷基三甲氧基硅烷、氨基苯基三甲氧基硅烷、N-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷、3-巰基丙基三甲氧基硅烷、3-巰基丙基三乙氧基硅烷、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、4-三甲氧基甲硅烷基丁醛、羧甲基三甲氧基硅烷、羧甲基三乙氧基硅烷及其混合物組成的組。
26.權(quán)利要求23的涂敷組合物，其中所述的稀釋溶劑基本上由水組成。
27.權(quán)利要求23的涂敷組合物，其中所述的稀釋溶劑包括水和有機(jī)溶劑。
28.權(quán)利要求23的涂敷組合物，該涂敷組合物進(jìn)一步包括溶于稀釋溶劑中的疏水性硅烷化合物，該疏水性硅烷化合物具有式(4) 其中R6選自C1-14烷基、C6-12芳族基團(tuán)、取代的C6-12芳族基團(tuán)和CX3組成的組，其中X是鹵素；R7和R8各自獨(dú)立地選自C1-14烷氧基、乙酰氧基、羥基和鹵素組成的組；R9選自氫、C1-14烷基和C6-12芳族基團(tuán)組成的組；且k是1-15的整數(shù)。
29.權(quán)利要求28所述的涂敷組合物，其中R6是甲基、乙基或丙基；R7和R8各自獨(dú)立地選自甲氧基、乙氧基、乙酰氧基和氯組成的組；且R9是甲基或乙基。
30.權(quán)利要求28所述的涂敷組合物，其中式(3)的化合物與式(4)的化合物的重量比為50∶50-95∶5。
31.一種包括固定在權(quán)利要求1所述底物表面上的生理物質(zhì)的生物芯片。
32.權(quán)利要求31的生物芯片，其中所述的生理物質(zhì)選自酶、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、細(xì)菌、微生物、動(dòng)物和植物細(xì)胞及器官以及神經(jīng)元組成的組。
33.一種制備用于固定生理物質(zhì)的底物的方法，該方法包括通過(guò)在所述底物材料上涂敷首層涂敷組合物而在底物材料上形成首層，所述的首層涂敷組合物包括稀釋溶劑，其中溶解有具有官能團(tuán)且能夠增進(jìn)所述底物材料與固定層之間結(jié)合以形成首層涂敷的底物的化合物；且通過(guò)在所述首層上涂敷固定層涂敷組合物而形成固定層，所述的固定層涂敷組合物包括稀釋溶劑，其中溶解有具有能夠固定生理物質(zhì)以形成固定涂敷底物的化合物。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的首層涂敷組合物包括選自由下列式1和式2所代表的化合物及其混合物M(OR1)n(1)[M’(OR2)m]p(R3)q(2)其中M和M’各自獨(dú)立地選自元素周期表4B、3A、4A和5A族元素組成的組；R1選自氫原子、C1-20烷基和C6-12芳族基團(tuán)；R2選自氫原子、鹵原子、C1-20烷基和C6-12芳族基團(tuán)；R3是任選被C1-6取代基取代的亞甲基或苯基；n是3-4的值且根據(jù)M的化合價(jià)來(lái)決定；m是2-3的值且根據(jù)M’的化合價(jià)來(lái)決定；p是2-4的數(shù)值；且q是1-20的數(shù)值。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中M和M’各自獨(dú)立地選自Si、Zr、Ti、Al、Sn、In和Sb組成的組；且R1選自氫、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基；而R2選自氫、氯、甲基、乙基、丙基、丁基和苯基。
36.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的首層涂敷組合物包括由式1代表的化合物。
37.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的首層涂敷組合物包括由式2代表的化合物。
38.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的固定層涂敷組合物包括式(3)的化合物Y-R4-Si(R5)3(3)其中Y隨所述生理物質(zhì)的端基的不同而改變且至少是一種選自氨基、醛、巰基和羧基組成的組的官能團(tuán)；R4選自C1-20烷基、C6-20芳族基團(tuán)、酯基和亞胺基組成的組；且R5選自羥基、C1-20烷氧基、乙酰氧基、鹵素及其組合組成的組。
39.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的固定層涂敷組合物包括具有式(4)的疏水性硅烷化合物 其中R6選自C1-14烷基、C6-12芳族基團(tuán)、取代的C6-12芳族基團(tuán)和CX3組成的組，其中X是鹵素；R7和R8各自獨(dú)立地選自C1-14烷氧基、乙酰氧基、羥基和鹵素組成的組；R9選自氫、C1-14烷基和C6-12芳族基團(tuán)組成的組；且k是1-15的整數(shù)。
40.權(quán)利要求33所述的方法，進(jìn)一步包括在約100℃-約400℃的溫度下加熱所述首層涂敷的底物。
41.權(quán)利要求33所述的方法，進(jìn)一步包括在約100℃-約300℃的溫度下加熱所述固定層涂敷的底物。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于固定生理物質(zhì)的底物。該底物包括底物材料，在該底物材料上形成的首層和在該首層上形成的固定層。所述的首層能夠增強(qiáng)所述底物與所述固定層之間的結(jié)合。通過(guò)簡(jiǎn)便的方法可以使用于固定生理物質(zhì)的底物能夠提供具有穩(wěn)定、均勻和高密度的固定層。
文檔編號(hào)G01N33/544GK1407116SQ02130479
公開(kāi)日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2002年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月21日
發(fā)明者徐康一, 南宮吉納, 吳恩圭, 崔榮鍍, 李仁鎬, 樸泰俊, 金憲秀 申請(qǐng)人:三星Sdi株式會(huì)社