專利名稱：一種加樣裝置及加樣方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于分子生物學(xué)及細(xì)胞生物反應(yīng)，特別是用于各種定量檢測(cè)以及對(duì)微量污染高度敏感的實(shí)驗(yàn)室操作中的加樣裝置，其中所述加樣裝置中包括獨(dú)立地含有參與所述反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液的多元容器。本發(fā)明還涉及利用所述加樣裝置進(jìn)行加樣的方法及其用途。
在很多分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作中，需要加入?yún)⑴c特定反應(yīng)的多種反應(yīng)試劑和/或緩沖液。目前普遍的做法是由實(shí)驗(yàn)操作者將反應(yīng)所需的緩沖液及試劑，任選地分別稀釋，并逐一加樣。對(duì)于該領(lǐng)域中諸多定量檢測(cè)，由于多種試劑均需要由操作者在每次檢測(cè)前配制，必然增加因加樣引起的誤差和由于操作者不同或操作批次不同所造成的誤差。另一方面，由于參與反應(yīng)的各種試劑及緩沖液之間常常會(huì)發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)，或者是某些試劑的貯存濃度與反應(yīng)濃度不一致，因此，不能在操作前將待加樣試劑混合加樣或者混合保存。這樣的加樣方法不但使操作敏鎖，更使操作時(shí)間延長(zhǎng)，而且增加了引入污染物的可能性，往往導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果或造成實(shí)驗(yàn)失敗。為了解決目前分子生物學(xué)和/或細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域多種反應(yīng)中存在的上述問(wèn)題，降低各實(shí)驗(yàn)室之間關(guān)于同一檢驗(yàn)和/或?qū)嶒?yàn)因不同操作者甚至同一操作者不同批次操作造成的上述誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確度和可信性，迫切需要能有效克服上述缺陷的用于這類反應(yīng)中的加樣裝置和加樣方法。
本發(fā)明一方面提供了一種用于分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，特別是用于各種定量檢測(cè)以及對(duì)微量污染高度敏感的實(shí)驗(yàn)室操作中的加樣裝置，其中包括獨(dú)立地含有參與所述反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液的多元容器。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于分子生物學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，特別是用于各種定量檢測(cè)以及對(duì)微量污染高度敏感的實(shí)驗(yàn)室操作中的多個(gè)反應(yīng)物加樣的方法，其中利用本發(fā)明的加樣裝置將參與所述反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)物相互獨(dú)立地同時(shí)或幾乎同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)的容器中。
在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)涉及的多種定量檢測(cè)中，一般需要加入多種試劑和/或緩沖液，由于這些試劑和/或緩沖液之間存在發(fā)生相互反應(yīng)的可能，通常不能將其按將進(jìn)行的反應(yīng)所需事先混合后貯存，而只能在實(shí)驗(yàn)前完成混合并加樣，或者只能在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由操作者按反應(yīng)要求劑量逐一加樣。這樣的操作方法，不但使實(shí)驗(yàn)操作步驟繁雜，花費(fèi)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不利于進(jìn)行大批量標(biāo)本的檢測(cè)，而且由于操作者不同，增加了反應(yīng)結(jié)果的系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差，影響了結(jié)果的可信性。通過(guò)采用本發(fā)明所述的加樣裝置和加樣方法，就可以大大減少這種人為操作帶來(lái)的誤差，提高檢測(cè)質(zhì)量。
另一方面，在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作中，樣品的污染，即使是極其微量的污染的存在，常常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，甚至實(shí)驗(yàn)失敗。一些高度敏感的實(shí)驗(yàn)中，污染源常常很難明確，因此難以避免。比如PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，每20個(gè)擴(kuò)增周期后，目標(biāo)分子的數(shù)量可以擴(kuò)增104～106倍。經(jīng)過(guò)巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)目標(biāo)分子的敏感性理論上可以低至1個(gè)DNA分子拷貝。因此，即使有一個(gè)污染性DNA分子混入，也將導(dǎo)致假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)。為了防止上述污染，目前實(shí)驗(yàn)室中一般采取如下方式1)全部使用一次性反應(yīng)用具和專用實(shí)驗(yàn)用品，并使用帶有過(guò)濾的加樣頭；2)操作者經(jīng)常更換手套和口罩；3)實(shí)施例行清潔，無(wú)流動(dòng)空氣，且在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)間里分別完成加樣過(guò)程和PCR產(chǎn)物鑒定過(guò)程。但是，即使如此，由熟練操作者進(jìn)行PCR操作時(shí)，還是常有假陽(yáng)性結(jié)果發(fā)生。污染源可能是接觸所致，也可能是由空氣中存在的微量分子所致。減少加樣時(shí)反應(yīng)容器暴露于空氣的時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟，是克服上述污染發(fā)生的有效手段。這類污染問(wèn)題也給細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞培養(yǎng)帶來(lái)很多困難。特別是在氣侯潮濕、溫?zé)岬拿酚昙竟?jié)，常常發(fā)生由空氣中霉菌作為污染源引起的污染。由于空氣中潛在的霉菌雖經(jīng)紫外燈消毒、經(jīng)消毒劑蒸汽消毒后仍能存活，且目前尚無(wú)針對(duì)霉菌污染的有效滅菌或抑菌措施，因此，污染常常難以避免，造成實(shí)驗(yàn)失敗。類似地，減少細(xì)胞培養(yǎng)容器暴露于空氣的時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟，能夠大大減少發(fā)生污染的可能性。
除減少污染，提高定量檢測(cè)質(zhì)量之外，使用本發(fā)明所述加樣裝置和加樣方法還可以明顯縮短操作時(shí)間，簡(jiǎn)化操作。為實(shí)現(xiàn)大批量標(biāo)本的檢測(cè)提供了可能性?？梢詫⑻囟ǚ磻?yīng)所需的多個(gè)反應(yīng)物通過(guò)工業(yè)化方法和手段預(yù)先大批量配制并貯存于本發(fā)明所述裝置中。進(jìn)行所需反應(yīng)時(shí)，利用本發(fā)明裝置可以將所述多個(gè)反應(yīng)物同時(shí)或幾乎同時(shí)加入反應(yīng)容器中，使操作更加簡(jiǎn)單、迅速、加樣量準(zhǔn)確。
本發(fā)明一方面提供了一種用于分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，特別是用于對(duì)微量污染高度敏感的實(shí)驗(yàn)室操作中的加樣裝置，所述加樣裝置中包括獨(dú)立地含有參與所述反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液的多元容器。本發(fā)明的加樣裝置可用于涉及多個(gè)反應(yīng)物的定性及定量實(shí)驗(yàn)，包括測(cè)定樣品中特定蛋白質(zhì)量的反應(yīng)；測(cè)定特定酶的單位活性的反應(yīng)；特別是適用于基于PCR擴(kuò)增的各種檢測(cè)，以確定樣品中是否含有的特定cDNA、mRNA和DNA，及測(cè)定其含量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述加樣裝置可用于進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述加樣裝置可用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程。
在所述加樣裝置中，所包含的多元容器的數(shù)量取決于進(jìn)行特定反應(yīng)所需的反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液的數(shù)量，通常為2-30個(gè)，優(yōu)選為2-20個(gè)，更優(yōu)選為2-10個(gè)，甚至更優(yōu)選為2-5個(gè)。
在所述加樣裝置中，所包含的各個(gè)反應(yīng)物為特定反應(yīng)中所需的量，且各個(gè)反應(yīng)物可各自獨(dú)立地為液體、膠體、懸濁液或乳濁液或粉末形式，優(yōu)選地為液體、膠體、懸濁液或乳濁液形式。
本發(fā)明的加樣裝置中，所述的多元容器可以由反應(yīng)中的各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液可接受的穩(wěn)定的惰性材料制成，即在常規(guī)的制備、貯藏或運(yùn)輸條件下，不與各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液發(fā)生反應(yīng)，也不會(huì)由于材料結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致物理性損壞，造成容器破裂。此外，所述惰性材料還應(yīng)當(dāng)不吸附各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液，使得在加樣時(shí)各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)溶液能夠完全加入反應(yīng)容器中，不在各個(gè)多元容器中殘留。適合制備本發(fā)明的多元容器的材料包括例如高分子材料、玻璃，尤其是經(jīng)硅烷化的高分子材料、金屬、玻璃和襯有防水性復(fù)合層的紙質(zhì)材料等。材料的選擇應(yīng)取決于所構(gòu)成的容器中容納的用于特定酶反應(yīng)之反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液的性質(zhì)，以使容器自身以及其中的反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液在正常的制備、運(yùn)輸或儲(chǔ)藏條件下保持穩(wěn)定。
在本發(fā)明的加樣裝置中，所述的多元容器可相互聯(lián)結(jié)或相互獨(dú)立，只要各個(gè)多元容器的形狀在整體上與進(jìn)行反應(yīng)的容器相配合，并便于加樣。其中聯(lián)結(jié)可通過(guò)物理或化學(xué)方法進(jìn)行。所述的物理或化學(xué)方法包括捆綁、擠壓、粘合、疇形，容器之間的相互關(guān)系可以是平面結(jié)構(gòu)組合、空間立體組合等方式。
此外，本發(fā)明的加樣裝置中，所述多元容器還可以由整體材料中相互隔離的空洞作為貯存容器構(gòu)成。所述的整體材料為如上所述的各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液可接受的穩(wěn)定的惰性材料。所述空洞的形狀可以是規(guī)則的或不規(guī)則的，只要各個(gè)空洞的體積可容納特定反應(yīng)中所需的量的各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液，并且該空洞的形狀在加樣過(guò)程中不會(huì)影響各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液完全加入反應(yīng)容器中。構(gòu)成本發(fā)明加樣裝置中多元容器的整體材料可為連成一體的如上所述的相同種的材料或不同種的材料。
本發(fā)明的加樣裝置中，所述多元容器上各自還具有在裝載樣品后可密封且在加樣時(shí)可打開(kāi)的封口，并且各個(gè)容器上的封口可為一個(gè)或多個(gè)。其中本發(fā)明裝置中各個(gè)容器的封口優(yōu)選為一次性封口。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，封口可以是多種形式，包括本領(lǐng)域公知的易折安瓿形式，通過(guò)與容器開(kāi)口相互配合的蓋，覆蓋于容器開(kāi)口之上的薄膜，與容器連為一體的易拉蓋，等等。所述封口也應(yīng)當(dāng)由如上所述的各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液可接受的穩(wěn)定的惰性材料制成。并且取決于形成的封口形式，所選用的材料可以與容器為相同種材料或不同種材料。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所述的加樣裝置中包含的反應(yīng)所需量的各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液，可在制備好該加樣裝置后以工業(yè)化生產(chǎn)方式加入到相應(yīng)的容器中，并進(jìn)行密封。在進(jìn)行反應(yīng)之前，打開(kāi)各個(gè)容器的封口，方便地將其中的各個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液加入反應(yīng)容器中。其中所述的打開(kāi)是指將封口的至少一部分除去，使容器中的反應(yīng)物得以完全進(jìn)入反應(yīng)容器之中。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，取決于加樣裝置中多元容器的形狀以及封口的方式，所述封口的打開(kāi)可以經(jīng)過(guò)穿刺、擠壓、切割、撕裂、折斷、離心等作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而使容器中的反應(yīng)物完全進(jìn)入反應(yīng)容器之中。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于分子生物學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，特別是用于各種定量檢測(cè)以及對(duì)微量污染高度敏感的實(shí)驗(yàn)室操作中的多個(gè)反應(yīng)物加樣的方法，其中利用本發(fā)明的加樣裝置將參與所述反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)物相互獨(dú)立地同時(shí)或幾乎同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)的容器中。其中參與所述反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)物獨(dú)立地為液體、膠體、懸濁液、乳濁液或粉末形式的反應(yīng)所需的量。也可以按反應(yīng)的要求依次打開(kāi)各個(gè)容器的封口，分別加入反應(yīng)所需的反應(yīng)物。
按照不同反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作要求，本發(fā)明可采用不同的裝置。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在定量PCR反應(yīng)加樣時(shí)，本發(fā)明所述加樣裝置采用了與PCR反應(yīng)使用的特定微量離心管相適應(yīng)的加樣口，加樣裝置的多元容器中分別加入PCR反應(yīng)所需的多種試劑及緩沖液。所述試劑及緩沖液一般包括DNA聚合酶PCR反應(yīng)緩沖液，DNTP混合物，Mg++離子和/或其它試劑，如DMSO等及石蠟油，這些試劑分別以該反應(yīng)所需的量預(yù)先裝入本發(fā)明加樣裝置的各個(gè)容器中，置于-8℃～-80℃冷凍保存。使用時(shí)，于4℃～室溫環(huán)境中放置1～30分鐘，使液體融化，同時(shí)將待檢標(biāo)本加樣于反應(yīng)管中，將本裝置封口打開(kāi)，與加入待檢標(biāo)本的離心管相連，以大約1,000轉(zhuǎn)/分的速度離心1～10分鐘將試劑及緩沖液加入反應(yīng)管，去除本加樣裝置，將PCR反應(yīng)管封蓋，進(jìn)行PCR反應(yīng)。一般對(duì)于20個(gè)樣品而言，加樣時(shí)間在18分鐘以內(nèi)，準(zhǔn)確率可達(dá)100％。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，采用與RNA純化實(shí)驗(yàn)所用試管(通常為1.8ml微量離心管，或5ml、50ml微量離心管)相符的本發(fā)明加樣裝置，分別加入RNA純化用各種試劑。其中本發(fā)明加樣裝置的各個(gè)容器中預(yù)先加入了RNA提取及純化過(guò)程中所需的適當(dāng)濃度的試劑和緩沖液，包括苯酚，醋酸緩沖液，異丙醇及氯仿。將本發(fā)明的加樣裝置保存于-4℃。使用時(shí)，打開(kāi)封口，如上述條件離心，使試劑入純化所用反應(yīng)管。眾所周知，由于RNA穩(wěn)定性差，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間應(yīng)盡可能縮短。采用本發(fā)明加樣裝置及加樣方法，可明顯縮短加樣時(shí)間。使用本發(fā)明加樣裝置及加樣方法純化RNA，純化效果明顯提高，用吸收光譜法檢測(cè)A260/A280可達(dá)1.805～1.87，高于用目前美國(guó)Gibco公司出品的Trizol試劑純化得到的RNA的純度，其僅為A260/A2801.65～1.68。
結(jié)合本發(fā)明附圖和下面的實(shí)施例，將以舉例的方式進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的加樣裝置，以及利用所述加樣裝置進(jìn)行加樣的方法，由此體現(xiàn)本發(fā)明所述加樣裝置及加樣方法優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的諸多方面。本發(fā)明所述的加樣裝置絕不僅限于此處給出的實(shí)施例。


圖1.表示配合進(jìn)行基于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的微量離心管之形狀的加樣裝置。其中圖1a為該加樣裝置的A-A剖面圖；圖1b為該加樣裝置的主視圖(半剖)。
圖2.表示配合進(jìn)行RNA分離純化的離心管之形狀的加樣裝置。其中圖2a為該加樣裝置的A-A剖面圖；圖2b為該加樣裝置的主視圖(半剖)。
圖3.表示配合細(xì)胞培養(yǎng)所用的微量滴定板之形狀的本發(fā)明加樣裝置。其中圖3a為該加樣裝置的俯視圖；圖3b為該加樣裝置的主視圖(半剖)。
實(shí)施例1一種用于進(jìn)行基于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)的加樣裝置用于進(jìn)行基于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)的本發(fā)明加樣裝置可以如圖1所示。該裝置為由壁3圍成的管，其頂部封閉，中間帶有若干隔片1，將管分成相應(yīng)數(shù)量的腔3，構(gòu)成所述多元容器，管的底部由封口4封閉。該加樣裝置由經(jīng)硅烷化的聚苯乙烯材料制成，裝置的外形被制成與進(jìn)行PCR反應(yīng)所用的微量離心管形狀相配合的曲線形式。在加樣前通過(guò)將封口處帶有惰性防水襯里的紙質(zhì)材料撕去，將所述多元容器的各個(gè)反應(yīng)物加入反應(yīng)容器中。實(shí)施例2巢式PCR定性檢測(cè)微量CEA mRNA的比較本實(shí)驗(yàn)使用如實(shí)施例1所述本發(fā)明加樣裝置及加樣方法加樣，以常規(guī)加樣法加樣為對(duì)照，進(jìn)行微量CEA mRNA的定性檢測(cè)。比較兩種加樣方法在所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性及操作步驟、操作時(shí)間上的差別。本實(shí)驗(yàn)由二名PCR反應(yīng)操作經(jīng)驗(yàn)均為3年以上的熟練實(shí)驗(yàn)操作人員在相同的條件下，同樣的試劑及反應(yīng)管中進(jìn)行巢式PCR加樣操作。巢式PCR結(jié)果由瓊脂糖凝膠電泳及溴乙錠染色后進(jìn)行檢定。結(jié)果在上述兩種加樣方法，陽(yáng)性標(biāo)本檢出率均為100％(10/10)。在利用常規(guī)加樣方法對(duì)陰性標(biāo)本進(jìn)行的檢測(cè)中，兩個(gè)操作者所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，分別為20％和10％。而采用本發(fā)明加樣裝置及加樣方法對(duì)陰性標(biāo)本進(jìn)行的檢測(cè)中，兩個(gè)操作者所進(jìn)行的檢測(cè)中陰性標(biāo)本符合率均達(dá)到100％。在加樣所需的操作時(shí)間上，二個(gè)操作者分別對(duì)10個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本與10個(gè)陰性標(biāo)本進(jìn)行一一間隔加樣，采用常規(guī)加樣方法檢驗(yàn)時(shí)，上述兩個(gè)操作者之一所用時(shí)間分別為52分鐘和68分鐘，另一位操作者耗時(shí)59分鐘和55分鐘。而用本發(fā)明所述加樣裝置及加樣方法進(jìn)行檢測(cè)，第一位操作者所用加樣時(shí)間僅為16分鐘和21分鐘，另一位操作者耗時(shí)18分鐘及24分鐘。
具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下操作者A具有4年的PCR反應(yīng)操作經(jīng)驗(yàn)B具有3年的PCR反應(yīng)操作經(jīng)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本1)陽(yáng)性樣本從乳腺癌患者末梢血具核細(xì)胞抽提的RNA制備的cDNA；2)陰性樣本雙蒸水檢測(cè)方法巢式PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳及溴乙錠染色后檢測(cè)操作一采用常規(guī)操作法進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)步驟1.將10個(gè)陽(yáng)性樣本與10個(gè)陰性樣本間隔排放、編號(hào)；步驟2.依次向進(jìn)行PCR反應(yīng)的微量離心管中加入樣品1μl；
步驟3.開(kāi)始計(jì)時(shí)。向1.8ml微量離心管中加入PCR反應(yīng)液，其中所述反應(yīng)液包括10×PCR緩沖液(50mM MgCl2，10mM各種dNTP)，引物A和引物B，DNA聚合酶和H2O；步驟4.分別向各反應(yīng)管中加入如上配制的反應(yīng)液25μl；步驟5.分別向各反應(yīng)管中加一滴石蠟油覆蓋，計(jì)時(shí)完畢；步驟6.PCR反應(yīng)循環(huán)95℃5分鐘，96℃1分鐘，63℃1分鐘，72℃1分鐘，共30次。之后再72℃5分鐘4℃；步驟7.再次PCR，以引物C代替引物B，操作同上1～6；步驟8.將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及溴乙錠染色，觀察結(jié)果。
操作二采用本發(fā)明裝置及加樣方法進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)步驟1和2同常規(guī)操作法；步驟3.計(jì)時(shí)開(kāi)始。打開(kāi)含有引物A和B的本發(fā)明所述加樣裝置，與反應(yīng)管相連接，5,000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，使加樣裝置中各反應(yīng)容器內(nèi)的反應(yīng)物進(jìn)入反應(yīng)管，取下裝置，蓋上反應(yīng)管；步驟4.輕輕振蕩反應(yīng)管，使液體混勻，再次于5000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，計(jì)時(shí)完畢；步驟5.同常規(guī)操作法之步驟6步驟6.重復(fù)前面的操作，其中使用含有引物C代替引物B的本發(fā)明加樣裝置；步驟7.同常規(guī)操作法之步驟8。
所得檢測(cè)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間分別示于表1和表2中。
表1.檢測(cè)結(jié)果
*注左側(cè)欄為常規(guī)方法檢測(cè)結(jié)果右側(cè)為本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果表2.操作時(shí)間(單位分鐘)
實(shí)施例3一種用于提取并純化RNA樣品的本發(fā)明加樣裝置用于進(jìn)行RNA樣品提取及純化的本發(fā)明加樣裝置可以如圖2所示。該裝置為由壁7圍成的管，其頂部封閉，中間帶有若干隔片5，將管分成相應(yīng)數(shù)量的腔6，構(gòu)成所述多元容器，管的底部由封口8封閉。該加樣裝置由經(jīng)DEPC處理的硅烷化聚苯乙烯材料制成，其中裝置的外形可以與RNA提取和純化所用的50ml離心管的管口形狀相配合。在加樣前去掉蓋在封口8處的聚苯乙烯蓋，將該加樣裝置與所用離心管對(duì)接，通過(guò)離心將各多元容器中的反應(yīng)物加入已經(jīng)預(yù)先含有目標(biāo)樣本的反應(yīng)管中。實(shí)施例4比較ACGP方法、Trizol方法與采用本發(fā)明加樣方法在RNA提取及純化中的應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)比較了目前較普遍采用的RNA提取及純化方法Trizol試劑方法和ACGP方法與采用如實(shí)施例3所述的本發(fā)明的加樣裝置及加樣操作進(jìn)行RNA提取及純化的效率和操作時(shí)間。三種提取和純化RNA的方法的比較結(jié)果見(jiàn)表3。
從細(xì)胞中提取RNA是目前分子生物學(xué)研究與臨床檢測(cè)中常用的方法。首先裂解細(xì)胞，然后進(jìn)行RNA純化。由于細(xì)胞裂解后大量的RNase釋放出來(lái)，RNA很容易被降解。因此，盡快將蛋白質(zhì)與RNA分離是保證純化成功的關(guān)鍵。而所得純化的RNA處于高純度狀態(tài)，是保證RNA穩(wěn)定貯存的關(guān)鍵。目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中大量應(yīng)用ACGP方法進(jìn)行RNA純化，此方法可以得到最終高純度的RNA。但是，由于ACGP方法中應(yīng)用的各種試劑不能相互混合，逐一加樣耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，操作也繁雜，使每次不能同時(shí)純化大量的標(biāo)本。為了簡(jiǎn)化操作手續(xù)，GIBCO公司目前開(kāi)發(fā)了Trizol試劑，使多種試劑混合保存，一次加樣，簡(jiǎn)化了操作手續(xù)，提高了操作效率，使RNA與蛋白質(zhì)能夠盡快分離。但是，經(jīng)Trizol試劑純化的RNA，最終的純度大大低于ACGP方法純化的結(jié)果，OD260/OD280只能達(dá)到1.6～1.7。
采用本發(fā)明的加樣裝置及加樣方法進(jìn)行RNA樣本的提取和純化，可以使操作簡(jiǎn)化，RNA與蛋白質(zhì)盡快分離，利于保持各試劑的穩(wěn)定性和發(fā)揮最佳效率。
具體操作步驟如下1.裂解細(xì)胞用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)至HT-29細(xì)胞成單層生長(zhǎng)，后用磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞一次，加入細(xì)胞裂解液(4.0mol/l硫氰酸胍，0.1mol/Tris-HCl，1％β-巰基乙醇)，用刮棒將粘稠裂解物刮到邊緣，移入10個(gè)1.8ml的離心管中；2.分別采用A、B、C方法加樣并計(jì)時(shí)；方法A提取RNA并純化的常規(guī)ACGP方法向細(xì)胞裂解液中逐一加入下列試劑，并混勻3mM醋酸緩沖液、苯酚、氯仿/異丙醇混合液(49∶1)；方法BTrizol試劑各反應(yīng)管中加入1.5ml Trizol試劑；方法C取裝有ACGP試劑的本發(fā)明加樣裝置與離心管結(jié)合，5000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，使各試劑加入反應(yīng)管，卸下本裝置。
3. 13,000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，分離上清液；4.向上清液中加入異丙醇0.6ml混勻，13,000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘；5.保留沉淀，向沉淀中加入75％乙醇，13,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；6.保留沉淀，離心后真空干燥1分鐘；7.每管中加入DEPC水20μl，溶解RNA；表3 提取及純化RNA樣本的比較結(jié)果
由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，采用本發(fā)明的加樣裝置及加樣方法提取并純化RNA，在操作時(shí)間上優(yōu)于常規(guī)ACGP方法，在RNA純化質(zhì)量上優(yōu)于Trizol方法。實(shí)施例5用于向細(xì)胞培養(yǎng)板加樣的裝置用于向細(xì)胞培養(yǎng)板加樣的本發(fā)明裝置如圖3所示。該裝置為由壁9圍成的管，其頂部封閉，中間帶有若干隔片10，將管分成相應(yīng)數(shù)量的腔11，構(gòu)成所述多元容器，管的底部由封口12封閉。為了便于多次重復(fù)使用及滅菌，其由不銹鋼材料制成，其在封口處帶有螺口，便于重復(fù)打開(kāi)和封閉封口12。多元容器的封口形狀及尺寸應(yīng)與所用6孔、24孔或96孔板的形狀尺寸相配合。在加樣前旋開(kāi)所述裝置的封口12，將該加樣裝置與所用細(xì)胞培養(yǎng)板對(duì)接，利用重力作用或通過(guò)短暫離心將各多元容器中的反應(yīng)物加入進(jìn)行反應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板中。實(shí)施例6使用本發(fā)明的加樣裝置研究TNF-α、IL-6抑制Colo 201腫瘤生長(zhǎng)的作用眾所周知，縮短操作時(shí)間，減少細(xì)胞培養(yǎng)物與外界暴露的時(shí)間，是防止污染的重要措施。本實(shí)驗(yàn)比較了使用如實(shí)施例5所述的本發(fā)明的加樣裝置與常規(guī)操作方法在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞與外界的暴露時(shí)間。研究二種不同的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6對(duì)Colo 201腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
由于實(shí)驗(yàn)操作較為復(fù)雜，使用本發(fā)明的加樣裝置及加樣方法較常規(guī)操作所需實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間明顯縮短。以MTT方法檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(參見(jiàn)表4)，二者在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性方面基本相同。
具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下1.將Colo 201細(xì)胞(購(gòu)于ATCC)配制成106/ml，以100μl/孔的量接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃5％CO2氣氛中培養(yǎng)過(guò)夜；(一)按常規(guī)方法的加樣操作2.將細(xì)胞因子TNF-α和IL-6以RPMI-1640培養(yǎng)液分別配制成1000ng/ml、200ng/ml、40ng/ml、8ng/ml、1.6ng/ml、0ng/ml的濃度；3.細(xì)胞培養(yǎng)板1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘后，吸去培養(yǎng)物上清液，開(kāi)始計(jì)時(shí)。按下述表4所示的方案加入配制的各種含細(xì)胞因子的培養(yǎng)液后，計(jì)時(shí)結(jié)束。37℃，5％CO2氣氛下培養(yǎng)48小時(shí)。表4 96孔板中各孔中所加細(xì)胞因子及相應(yīng)加樣量
其中*表示加入IL-6的孔；+表示加入TNF-α的孔；-表示加入IL-6+TNF-α的孔。
(二)采用本發(fā)明裝置的加樣操作2.取預(yù)先每個(gè)容器加入40微升RPMI-1640的如實(shí)施例5所述的可重復(fù)使用的加樣裝置，打開(kāi)包裝，按常規(guī)加樣方案每孔加入10μl各含有IL-6、TNF-α100ng、20ng、4ng、0.8ng、0.16ng和0ng和分別含有上述二種液體的混合液。
3.取出細(xì)胞培養(yǎng)板，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，吸除上清液。計(jì)時(shí)開(kāi)始將本加樣裝置置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，旋開(kāi)裝置封口，1,000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，使反應(yīng)液加入細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中。取下本裝置，蓋上培養(yǎng)板蓋，計(jì)時(shí)完畢。將細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃、5％CO2氣氛下培養(yǎng)48小時(shí)。
4.取出細(xì)胞培養(yǎng)板，1,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，吸除培養(yǎng)上清液，并用PBS洗滌一次。
比較用常規(guī)加樣法與本裝置加樣法進(jìn)行MTT方法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)際操作結(jié)果表明，兩種加樣方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。而二種加樣方法中細(xì)胞暴露時(shí)間明顯不同，利用本發(fā)明的加樣裝置與常規(guī)加樣法相比加樣時(shí)間明顯縮短，結(jié)果如下表5所示。表5 本發(fā)明加樣方法與常規(guī)加樣方法在不同實(shí)驗(yàn)中引起的細(xì)胞暴露時(shí)間
實(shí)施例7 本發(fā)明加樣裝置及加樣方法用于熒光定量PCR方法檢測(cè)GAPDH在進(jìn)行PCR定量檢測(cè)時(shí)，由于檢測(cè)中需應(yīng)用的試劑之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此，不能將這些試劑混合后保存。目前應(yīng)用方法是在每一次檢測(cè)前配制反應(yīng)試劑的混合液并及時(shí)使用。但是，由于混合液配制者不同及某些難以預(yù)測(cè)的因素，造成既使由同一操作者操作，不同試劑配制批次之間誤差很大。如果能夠降低批間誤差，就可以增加批次之間、實(shí)驗(yàn)室之間檢測(cè)結(jié)果的可比性，提高可信性。
使用如實(shí)施例1所述的本發(fā)明裝置，可以將各種試劑分別貯存于由其中的腔圍成的各個(gè)多元容器，并采用一次性大批量配制反應(yīng)用試劑按反應(yīng)要求量貯存于本裝置中。每次應(yīng)用時(shí)，取裝有所需反應(yīng)試劑的如實(shí)施例所述的本發(fā)明裝置直接加樣。這樣，不但使操作更簡(jiǎn)便，而且由于避免了每批次試劑重新制備所造成的誤差，使檢測(cè)的精確度提高。由于采用大批量的試劑制備，還可對(duì)每批制備的試劑進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè)。使檢測(cè)結(jié)果更加可信，更具有科學(xué)性。
所用標(biāo)本為GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品，分別含GAPH cDNA濃度為10拷貝/μl、100拷貝/μl及1,000拷貝/μl。具體實(shí)驗(yàn)操作如下(一)常規(guī)加樣法的步驟1.配制反應(yīng)液其中在總量為50μl/管的反應(yīng)液體積中含有10×PCR反應(yīng)液5μl，50mM MgCl210μl，dNTP(10mM)5μl，引物5μl，熒光標(biāo)記的探針0.5μl，Tag酶(10U)5μl，ddH2O 19.5μl；2.將制備的cDNA標(biāo)本重復(fù)三次加樣，每管1μl；3. 50μl/管中加入反應(yīng)試劑；4.加1滴石蠟油；5.用PCR自動(dòng)熒光定量分析儀進(jìn)行檢測(cè)及定量(二)采用本發(fā)明裝置的加樣法的步驟1.將常規(guī)加樣方法中所用各種試劑及石蠟油分別按反應(yīng)量加入本發(fā)明裝置的各個(gè)獨(dú)立容器中，-20℃保存?zhèn)溆茫?.按常規(guī)加樣方法步驟2所述加入待測(cè)標(biāo)本；3.取出步驟1中所得本發(fā)明裝置，室溫放置1分鐘后，打開(kāi)包裝，與裝有待測(cè)標(biāo)本的反應(yīng)管連接，4℃下2,000rpm離心1分鐘，取下加樣裝置，蓋上反應(yīng)管；4.同常規(guī)方法操作中的步驟5。
將如上所述兩種操作的檢測(cè)結(jié)果之批內(nèi)誤差比較示于如下表6；將如上所述兩種操作的檢測(cè)結(jié)果之批間誤差比較示于如下表7。表6.批內(nèi)誤差檢測(cè)結(jié)果的比較
表7.批間誤差檢測(cè)結(jié)果的比較
由上述結(jié)果可知，1)用常規(guī)方法加樣所得檢測(cè)結(jié)果與采用本發(fā)明裝置的加樣方法比較，二者在檢測(cè)的批內(nèi)誤差方面相近，但本發(fā)明的批間誤差明顯低于常規(guī)方法的檢測(cè)結(jié)果；2)用本發(fā)明的裝置加樣明顯使操作更簡(jiǎn)便迅速。
權(quán)利要求
1.一種用于分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的多個(gè)反應(yīng)物的加樣裝置，其中包括獨(dú)立地含有多個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液的多元容器。
2.權(quán)利要求1的加樣裝置，其中所述實(shí)驗(yàn)為細(xì)胞培養(yǎng)。
3.權(quán)利要求1的加樣裝置，其中所述實(shí)驗(yàn)為定量PCR反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1的加樣裝置，其中所述多個(gè)反應(yīng)物為反應(yīng)所需的量，且各自獨(dú)立地為液體、膠體、懸濁液、乳濁液或粉末形式。
5.權(quán)利要求1的加樣裝置，其中所述容器由高分子材料、金屬、玻璃、或襯有防水性復(fù)合層的紙質(zhì)材料制成。
6.權(quán)利要求1的加樣裝置，其中所述的多元容器相互聯(lián)結(jié)。
7.權(quán)利要求6的加樣裝置，其中所述的多元容器通過(guò)物理或化學(xué)方法相互聯(lián)結(jié)。
8.權(quán)利要求7的加樣裝置，其中所述的物理或化學(xué)方法包括捆綁、擠壓、粘合等方式相互聯(lián)結(jié)或鑄型。
9.權(quán)利要求1的加樣裝置，其中所述多元容器由整體材料中相互隔離的空洞構(gòu)成，各容器之間的空間位置可以是平面結(jié)構(gòu)組合，或?yàn)榱Ⅲw空間組合。
10.權(quán)利要求9的加樣裝置，其中所述整體材料為高分子材料、金屬、玻璃、襯有防水性復(fù)合層的紙質(zhì)材料。
11.權(quán)利要求9的加樣裝置，其中所述整體材料為連成一體的相同種類的材料或不同種類的材料。
12.權(quán)利要求1的加樣裝置，其中所述多元容器相互獨(dú)立。
13.權(quán)利要求1的加樣裝置，其中所述多元容器上各自有在裝載樣品后可密封且在加樣時(shí)可打開(kāi)的封口。
14.權(quán)利要求13的加樣裝置，其中所述的封口為一次性封口或多次使用的封口。
15.權(quán)利要求13的加樣裝置，其中所述的封口可為一個(gè)或多個(gè)。
16.權(quán)利要求13的加樣裝置，其中所述封口獨(dú)立地由高分子材料、金屬、玻璃、襯有防水性復(fù)合層的紙質(zhì)材料制成。
17.權(quán)利要求13的加樣裝置，其中所述的打開(kāi)是指將封口的至少一部分除去，使容器中的反應(yīng)物得以流出。
18.權(quán)利要求13的加樣裝置，其中所述封口可以經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)、穿刺、擠壓、折斷、撕裂或離心作用而被打開(kāi)，使容器中的反應(yīng)物得以完全排出。
19.權(quán)利要求1的加樣裝置，其中所述的多元容器的整體形狀與進(jìn)行反應(yīng)所用的容器相適應(yīng)。
20.一種用于分子生物學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的多個(gè)反應(yīng)物加樣的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的加樣裝置。
21.權(quán)利要求20的加樣方法，其中多個(gè)反應(yīng)物獨(dú)立地為液體、膠體、懸濁液、乳濁液或粉末形式的反應(yīng)所需的量。
22.權(quán)利要求20的加樣方法，其中打開(kāi)所有容器的封口，將參與反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)物相互獨(dú)立地同時(shí)或幾乎同時(shí)全部加入進(jìn)行反應(yīng)的容器中。
23.權(quán)利要求20的加樣方法，其中按反應(yīng)的要求依次打開(kāi)各個(gè)容器的封口，在時(shí)間上分別加入反應(yīng)所需的反應(yīng)物。
24.權(quán)利要求20的加樣方法，其中所述實(shí)驗(yàn)為細(xì)胞培養(yǎng)。
25.權(quán)利要求20的加樣方法，其中所述實(shí)驗(yàn)為定量PCR反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于分子生物學(xué)及細(xì)胞生物反應(yīng),特別是用于各種定量檢測(cè)以及對(duì)微量污染高度敏感的實(shí)驗(yàn)室操作中的加樣裝置,其中所述加樣裝置中包括獨(dú)立地含有參與所述反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)物和/或反應(yīng)緩沖液的多元容器。本發(fā)明還涉及利用所述加樣裝置進(jìn)行加樣的方法及其用途。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1370984SQ0110490
公開(kāi)日2002年9月25日 申請(qǐng)日期2001年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月23日
發(fā)明者安曉勇 申請(qǐng)人:安曉勇