專利名稱：禾草花粉過敏原的分離和提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從禾草花粉中快速而有效地分離和提純1、2、3、10和13型這5種過敏原的方法。用來提純過敏原的天然原料是甜草類，例如梯牧草(Phleum pratense)的花粉。其提純基于疏水作用色譜法、凝膠過濾和陽(yáng)離子交換色譜法的新型組合。如此獲得的蛋白質(zhì)可用于改進(jìn)花粉過敏的診斷并可用于花粉過敏疾病治療的藥物制劑。
1型過敏具有世界范圍的重要性。工業(yè)化國(guó)家人口中高達(dá)20％的人受到諸如過敏性鼻炎、結(jié)膜炎或支氣管哮喘的困擾，這都是由存在于空氣中的各種過敏原(空氣過敏原)所致，這些過敏原是由各種各樣的來源釋放的，例如植物、螨蟲、貓或狗。這些1型過敏患者中，高達(dá)40％又表現(xiàn)出在禾草花粉過敏原情況下的特異IgE反應(yīng)(Freidhoff等人，1986，J Allergy Clin Immunol 78，1190～201)。
誘發(fā)1型過敏的物質(zhì)是蛋白質(zhì)、糖蛋白或多肽。經(jīng)黏膜攝入之后，這些過敏原便與過敏者的肥大細(xì)胞表面上鍵合的IgE分子起反應(yīng)。如果兩個(gè)或更多個(gè)IgE分子通過一個(gè)過敏原彼此連接起來，則導(dǎo)致由效應(yīng)細(xì)胞分泌出遞質(zhì)(例如組胺、前列腺素)和細(xì)胞因子，并從而產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。
根據(jù)具有抗特定過敏原的IgE抗體的過敏患者的相對(duì)頻率，可劃分為主要和次要過敏原。在梯牧草的情況下，Phl p1(Petersen等人，1993，J Allergy Clin.Immunol.92，789～796)、Phl p 5(Matthiesen和Lwenstein，1991，Clin.Exp.Allergy，21，297～307；Petersen等人，1992)、Phl p 6(Petersen等人，1995，Int.Arch.AllergyImmunol，108，49～54)以及Phl p 2/3(Dolecek等人，1993)迄今已被表征為主要過敏原；而Phl p 4(Lwenstein，1978，Prog.Allergy25，1～62)和來自黑麥草(Lolium perenne)的10及11型(Ansari等人，1987，J.Allergy Clin.Immunol.80，229～235)則作為次要過敏原。另外，最近又公開了另一種高分子量主要過敏原，被命名為Phlp 13。1和13型過敏原是被糖基化的。
聯(lián)系到本發(fā)明，1、2、3、10和13型過敏特別重要。天然過敏原的現(xiàn)行提純方法基于在每種情況下個(gè)別蛋白質(zhì)的分離。借助采用特異抗體的親和色譜法，目前已提純出，例如來自黑麥草(Boutin等人，1996，Int.Arch.Allergy Immunol.112，218～225)和梯牧草(Grobe等人，1999，Eur.J.Biochem.263，33～40)的1型過敏原。然而該方法的能力有限，并且是采用極端pH值條件實(shí)施的，因此不能保證獲得天然構(gòu)象。其它方法是基于色譜步驟的各種多級(jí)組合順序。此時(shí)可獲得每種情況的個(gè)別過敏原，例如10型(Ansari等人，1987，J.Allergy Clin.Immunol.80，229～235)或3型(Ansari等人，1989，Biochemistry，28，8665～8670)。其它過敏原則被丟失或者不能用這類方法制備純凈形式。
DNA序列數(shù)據(jù)是現(xiàn)成的，尤其是關(guān)于Phl p 1的(Laffer等人，1994，J.Allergy Clin.Immunol.94，1190～98；Petersen等人，1995，J.Allergy Clin.Immunol.95(5)，987～994)、Phl p 5的(Vrtala等人，1993，J.Immunol.151(9)，4773～4781)、Phl p 6的(Petersen等人，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108(1)，55～59)以及Phl p2的(Dolecek等人，1993，F(xiàn)EBS 335(3)，299～304)。借助cDNA序列，就可能生產(chǎn)出在診斷和治療中使用的重組過敏原(Scheiner和Kraft，1995，Allergy 50，384～391)。
對(duì)過敏進(jìn)行有效治療的經(jīng)典做法是特異性免疫療法或減敏療法(Fiebig，1995，Allergo J.4(6)，336～339；Bousquet等人，1998，J.Allergy Clin Immunol.102(4)，558～562)。在這些方法中，患者接受劑量遞增的天然過敏原提取物的皮下注射。然而，該方法會(huì)帶來過敏反應(yīng)或甚至過敏性休克的危險(xiǎn)。為了最大限度減少此種危險(xiǎn)，可采用類變應(yīng)原形式的創(chuàng)新制劑。它們是比未處理提取物明顯減少IgE反應(yīng)性但T-細(xì)胞反應(yīng)性相同的化學(xué)改性過敏原提取物(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377～382)。
若有高度提純的過敏原，可更大程度地達(dá)到療效的優(yōu)化。來自天然過敏原的規(guī)定混合物能夠代替上述提取物，因?yàn)楹笳?，除了含有各種各樣過敏原之外還含有相對(duì)大量的免疫原性但非變應(yīng)性的伴生蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)并非該特異性免疫療法所必須的。使用過敏原混合物還使得制備對(duì)應(yīng)于患者過敏譜的患者-特異過敏原混合物成為可能。用高純度天然過敏原達(dá)到安全減敏目的的現(xiàn)實(shí)前景是由改性過敏原提供的，其中IgE抗原決定簇因二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的不可逆改性而被破壞，但不會(huì)損害療效所必需的T-細(xì)胞抗原決定簇。
本發(fā)明也可有利地用于過敏性疾病，特別是花粉熱的體外和體內(nèi)診斷。為此，在用來檢測(cè)IgE抗體的成熟方法中，使用各類提純的過敏原。
本發(fā)明涉及一種生化提純方法，它通過高效三級(jí)提純從水性短期花粉提取物中分離4種主要過敏原和1種次要過敏原。所使用的天然原料是禾本科花粉，例如，梯牧草(Phleum pratense)、黑麥草(Lolium perenne)、鴨茅(Dactylis glomerata)、草地早熟禾(Poa pratensis)、絆根草(Cynodon dactylon)、絨毛草(Holcuslanatus)等。

圖1表示出從禾草花粉提取物中提純所提到的5種過敏原的流程。過敏原名稱Phl p 1～Phl p 13對(duì)應(yīng)于本文中其它地方使用的過敏原1～13的名稱。
因此，本發(fā)明涉及一種分離基本純凈的1、2、3、10和13型禾草過敏原的方法，其中制備一種禾本科花粉的水性提取物，然后可溶性組分接受疏水作用色譜法處理、凝膠過濾步驟，以及如果需要的話，陽(yáng)離子交換色譜法處理。
按照本發(fā)明，也可實(shí)施一類色譜術(shù)的多個(gè)步驟，然而一般而言，該方法非常有效，以致每種情況下一個(gè)分離步驟就足夠了。
該方法尤其適合從物種梯牧草(Phleum pratense)、黑麥草(Lolium perenne)、鴨茅(Dactylis glomerata)、牛尾草(Festucapratensis)、絨毛草(Holcus lanatus)、草地早熟禾(Poa pratensis)、黑麥(Secale cereale)的花粉中提取所述過敏原。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用tris/HCl緩沖水溶液來進(jìn)行提取。然而，按照本發(fā)明也可使用其它已知的緩沖水溶液。
為提純所述過敏原，采用提取物的可溶性組分。為此，提取物在18,000～30,000×g下離心3～8min、優(yōu)選5min，然后取上清液以做進(jìn)一步提純。此外也可通過其它方法，例如用過濾，分離掉不溶解組分。
第一色譜提純步驟采用疏水作用色譜法，例如用Sepharose實(shí)施。在該步驟中，大量雜質(zhì)被固定在載體上，而所需要的過敏原則處于流過色譜柱的級(jí)分中。也可使用相應(yīng)的其它載體材料。
因此，本發(fā)明涉及一種相應(yīng)的方法，其中1、2、3、10和13型禾草過敏原借助于疏水作用色譜法與其它組分分離開來。
在隨后的提純步驟中，禾草過敏原被分成三個(gè)級(jí)分，其中1型和13型各代表一個(gè)級(jí)分，而2、3和10型則代表第3級(jí)分。因此，本發(fā)明特別是涉及這樣一種方法，其中1和13型過敏原在隨后的凝膠過濾步驟中作為單獨(dú)的級(jí)分得到，并與2、3和10型過敏原分離開來。
然后，按照本發(fā)明，后者可以利用隨后的色譜步驟通過陽(yáng)離子交換劑彼此分離開來。因此，本發(fā)明涉及這樣一種方法，其中在凝膠過濾步驟后獲得的2、3和10型過敏原借助隨后的陽(yáng)離子交換色譜法彼此分離開來。
所述過敏原，鑒于本身是已知的，故可通過其已知的不同物理、化學(xué)、生物學(xué)或免疫學(xué)性質(zhì)加以鑒別，特別是利用等電聚焦、紫外吸收測(cè)定、SDS-PAGE電泳以及特異性抗體。這些方法和技術(shù)是已知的并普遍描述過。
按照本發(fā)明獲得的過敏原的得率，以最初使用的禾草花粉總蛋白為基準(zhǔn)介于0.5～1.5％。
本發(fā)明也可用于改進(jìn)體內(nèi)和體外診斷，作為分辨過敏原組分的患者-特異性過敏譜鑒別的一部分。因此，本發(fā)明涉及一種利用按權(quán)利要求1～6獲得的過敏原來實(shí)現(xiàn)花粉過敏體內(nèi)和體外診斷的方法。
本發(fā)明還可用于制備禾草花粉過敏特異性免疫療法用的改良制劑，這是通過分離掉那些雖是致免疫的、但與該療法無關(guān)的提取物組分來實(shí)現(xiàn)的。此外還可以通過提純后過敏原的化學(xué)反應(yīng)來制取類變應(yīng)原制劑。因此，本發(fā)明還涉及一種藥物制劑，它包含一種或多種按照本發(fā)明方法制取的過敏原以及，如果需要的話，相應(yīng)的助劑和賦形劑。
該方法詳細(xì)內(nèi)容如下
來自梯牧草花粉的天然過敏原按三步法(見圖1)進(jìn)行提純。將花粉用tris/HCl緩沖溶液(20mM tris/HCl，1mM EDTA，pH8.0)進(jìn)行30min水相提取之后，通過離心分離提取物，優(yōu)選20,000×g進(jìn)行5min。該tris/HCl緩沖溶液(20mM tris/HCl，1mM EDTA，pH8.0)的上清液用1M硫酸銨處理，隨后接受疏水作用色譜法處理(高效苯基-瓊脂糖凝膠(Phenyl-Sepharose High Performance)，Pharmacia出品)。在典型的色譜柱中裝填50～100ml載體材料，并在約5ml/min的流速下進(jìn)行操作。流過色譜柱的級(jí)分包含五種過敏原類別的蛋白質(zhì)1型(30～35kDa)、2型(11kDa)、3型(12kDa)、10型(13kDa)和13型(55～60kDa)。這之后是減少其體積，優(yōu)選用超濾或冷凍干燥。
隨后在第二步中，根據(jù)其不同的分子量，采用Superdex75制劑級(jí)(Pharmacia出品)或者適合此目的的類似已知載體材料通過凝膠過濾將13和1型過敏原從低分子量過敏原中分離出來。洗脫介質(zhì)優(yōu)選是50mM的碳酸氫銨。在約5ml/min的流速下操作色譜柱。獲得3個(gè)級(jí)分，分別包含過敏原1和13(各一個(gè)單獨(dú)級(jí)分)以及2、3和10(在一個(gè)級(jí)分中)。
一同洗脫到凝膠過濾的第3級(jí)分中的低分子量2、3和10型過敏原，用陽(yáng)離子交換色譜法彼此分開。為此，凍干的樣品被溶解在水性緩沖液中，優(yōu)選20mM的磷酸鹽緩沖液，pH7.2，然后加入到與此種緩沖液(例如，Source S)處于平衡的陽(yáng)離子交換柱中。流過交換柱的級(jí)分包含酸性過敏原2。被結(jié)合的過敏原3和10在約20倍于柱體積的洗脫過程中依靠0～500mM NaCl鹽梯度先后被洗脫下來。由此，各類低分子量過敏原被分離為其各自的單獨(dú)過敏原。其它陽(yáng)離子交換劑材料也可用于本發(fā)明中。
鑒于本發(fā)明方法的特征在于特定的色譜步驟順序以及色譜介質(zhì)的選擇，因此憑借所提供的本發(fā)明方法，本發(fā)明提供一種提取多個(gè)高純度天然禾草過敏原的高級(jí)生產(chǎn)方法，它不費(fèi)事或不費(fèi)時(shí)并且在技術(shù)上可行。由于所用提純方法對(duì)蛋白質(zhì)作用非常溫和，因此它們的構(gòu)象和抗原性得以保留。這是過敏性疾病成功診斷的先決條件。
權(quán)利要求
1.一種用來分離基本純凈的1、2、3、10和13型禾草過敏原的方法，其特征在于，制備一種禾本科花粉的水性提取物，然后此可溶性組分接受疏水作用色譜法處理、凝膠過濾步驟以及，如果需要的話，陽(yáng)離子交換色譜法處理。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，使用物種梯牧草、黑麥草、鴨茅、牛尾草、絨毛草、草地早熟禾、黑麥的花粉來進(jìn)行提取。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，提取是利用tris/HCl緩沖水溶液進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求1～3之一的方法，其特征在于，在第一步中，1、2、3、10和13型禾草過敏原利用疏水作用色譜法從其它組分中分離出來。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，1和13型過敏原通過隨后的凝膠過濾步驟作為單獨(dú)的級(jí)分得到，并從2、3和10型過敏原中分離出來。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于，凝膠過濾步驟后獲得的2、3和10型過敏原通過隨后的陽(yáng)離子交換色譜法彼此分離開來。
7.一種采用按照權(quán)利要求1～6獲得的過敏原對(duì)花粉過敏進(jìn)行體內(nèi)和體外診斷的方法。
8.一種藥物制劑，它包含按照權(quán)利要求1～6之一獲得的一種或多種過敏原以及相應(yīng)的助劑和賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及從禾草花粉中將1、2、3、10和13型這5種過敏原快速而有效地分離及提純的方法。所述禾草花粉的提純基于疏水作用色譜法、凝膠過濾和陽(yáng)離子交換色譜法的新型組合。該新型方法獲得的蛋白質(zhì)有助于改進(jìn)花粉過敏的診斷并可用于花粉原疾病治療的藥物制劑。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1372567SQ00811875
公開日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2000年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月24日
發(fā)明者R·蘇克, O·克洛姆維爾, H·菲比希 申請(qǐng)人:默克專利股份公司