專利名稱：Dna的同時(shí)分離和定量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從介質(zhì)中的其它物質(zhì)中分離確定量的DNA靶物質(zhì)的方法，以產(chǎn)生適量分離的DNA靶物質(zhì)以供進(jìn)行進(jìn)一步加工或分析。本發(fā)明尤其涉及用含有二氧化硅的固體支持物分離確定量的DNA靶物質(zhì)的方法，所述固體支持物能可逆結(jié)合確定量的DNA靶物質(zhì)，例如含有二氧化硅或二氧化硅衍生物的磁性反應(yīng)顆粒。
將DNA分型作為測試親子關(guān)系和鑒別犯罪現(xiàn)場存在的生物樣品的工具，需要研制分離和定量小量基因組DNA的可靠方法。在美國，開發(fā)這種系統(tǒng)的需要來自聯(lián)邦調(diào)查局建立的得自人類基因組DNA的13個(gè)短串聯(lián)重復(fù)(STR)基因座的分析結(jié)果的數(shù)據(jù)庫。將這些結(jié)果加入稱為組合DNA指數(shù)系統(tǒng)(CODIS)的集中數(shù)據(jù)庫中。STR分析系統(tǒng)是基于使用擴(kuò)增反應(yīng)，其能使人們分析非常少量的DNA，甚至低于亞納克的數(shù)量。然而，只有當(dāng)待擴(kuò)增的DNA數(shù)量在限定范圍內(nèi)，且其基本上與可抑制或干擾擴(kuò)增反應(yīng)的污染物分離時(shí)，擴(kuò)增才可以良好進(jìn)行。因此，在STR基因座可擴(kuò)增和分析之前，靶DNA必須是純化和定量的，以降低擴(kuò)增假象的幾率。在其它應(yīng)用如DNA測序中，定量是重要的。
目前用于分離和定量基因組DNA以用于遺傳相同性分型的方法，要消耗大量時(shí)間，且太雜亂不能自動(dòng)操作。例如，以下方法典型用于分離和定量基因組DNA，以擴(kuò)增和分析STR基因座，如CODIS基因座。首先，使用各種裝置和體積從個(gè)體獲得血液或口腔擦拭物。其次，將這些樣品加工為各種純度和完整性的分離DNA。第三，將DNA定量以用于下游方法，以便可使用適當(dāng)數(shù)量以避免假象。第四，將DNA用包括特異于每個(gè)待分析的STR基因座的引物的反應(yīng)擴(kuò)增。最后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠或毛細(xì)電泳系統(tǒng)上分析，以鑒別基因型。一種設(shè)計(jì)用于共擴(kuò)增和分析所有13個(gè)CODIS基因座的商購系統(tǒng)，見GenePrintPowerPlexTM1.1和GenePrintPowerPlexTM2.1系統(tǒng)(Promega公司，Madison，Wisconsin)血液中白細(xì)胞是DNA的主要來源。由于個(gè)體差別或基于取樣品時(shí)個(gè)體健康情況所致的取自給定個(gè)體的樣品差別，血液中白細(xì)胞含量有顯著差異。由于所用擦拭物類型和樣品加工前的貯存條件不同，口腔擦拭物樣品中也存在相似差異。
通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增基因組DNA以進(jìn)行如上述DNA分型分析，太少的模板產(chǎn)生低條帶密度或不發(fā)生條帶擴(kuò)增。過量的DNA模板隨之產(chǎn)生過擴(kuò)增。過擴(kuò)增可通過過量假象峰和打滑條帶(直在主要等位基因峰之下的次要峰)加以識(shí)別。還可能有高發(fā)的背景活性和“pull-up”，這是指在多重反應(yīng)中不能分離不同顏色的條帶。如果存在過量的假象，需要再擴(kuò)增較少量的DNA。當(dāng)存在過量DNA并用毛細(xì)電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，打滑帶是特別明顯的。同樣，在測序時(shí)，當(dāng)存在太多的DNA模板時(shí)，全長擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生受抑制。換而言之，在PCR擴(kuò)增中，過量的DNA模板可導(dǎo)致存在部分純化的片段和低量的完整擴(kuò)增產(chǎn)物。
更特別的，當(dāng)使用PCR或其它擴(kuò)增方法擴(kuò)增DNA時(shí)，當(dāng)在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增太多的DNA時(shí)，則該樣品過擴(kuò)增，預(yù)期帶的信號(hào)強(qiáng)度趨于落在檢測儀器期望范圍之外。傳統(tǒng)的，這些困難可通過在純化DNA后對(duì)其進(jìn)行定量而最小化，這需要另外的步驟，時(shí)間和金錢。在遺傳相同性測試中，在推薦使用的分析系統(tǒng)中存在過量DNA常常導(dǎo)致無法解釋的結(jié)果；這可浪費(fèi)非常有限的樣品，尤其在法醫(yī)學(xué)分析的情況下。
另一種需要精確定量核酸的DNA應(yīng)用是測序。DNA測序是在這樣的靶DNA的樣品上最佳進(jìn)行的，該靶DNA已經(jīng)從介質(zhì)中可干擾測序反應(yīng)的其它物質(zhì)中分離。還必需在測序反應(yīng)開始之前，對(duì)靶DNA樣品進(jìn)行定量。例如，在DNA測序方面，測序反應(yīng)中DNA模板的數(shù)量必須在相當(dāng)狹窄范圍內(nèi)。例如，當(dāng)使用質(zhì)粒DNA時(shí)，當(dāng)用BigDyeChemistry(Perkin Elmer Biosystems)時(shí)，推薦使用150-300ng的DNA。當(dāng)使用相同測序系統(tǒng)用PCR產(chǎn)物作測序模板時(shí)，推薦使用40-80ng DNA。太多的模板可產(chǎn)生短序列閱讀長度，較低的分辨力或較高的誤差率。太少的模板，信號(hào)強(qiáng)度太弱而不能進(jìn)行最佳序列閱讀。
質(zhì)粒DNA是測序反應(yīng)的DNA的典型來源。由于每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)粒拷貝數(shù)的差異，所用生長培養(yǎng)基的不同，和細(xì)胞量的濃度的差異等因素，細(xì)菌培養(yǎng)物群體中質(zhì)粒DNA的含量也相當(dāng)不同。
有許多方法通用于定量樣品中DNA靶物質(zhì)。一種這樣的方法是分光光度確定。在此方法中，未知濃度樣品的吸光度，在相當(dāng)于DNA靶物質(zhì)的最大吸光度的波長讀取。例如，在260nm的吸光度(A260)用于確定溶液中DNA的濃度，在280nm的吸光度(A280)用于確定溶液中蛋白質(zhì)的濃度。在260nm讀取的1個(gè)吸光度相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml的單鏈DNA和RNA，和大約20μg/ml單鏈寡核苷酸。260nm和280nm讀數(shù)之間的比率(A260/A280)可用于評(píng)估給定的靶核酸與在280nm吸收的蛋白質(zhì)和任何其它物質(zhì)的分離的程度。純化的核酸制品的A260/A280至少為大約1.8。分光光度分析法的限制是沒有足夠的靈敏度用于檢測和定量少量的核酸。如果樣品中核酸濃度少于大約500ng/ml，或如果樣品被吸收或猝滅紫外線輻射的其它物質(zhì)污染，則得到不準(zhǔn)確的結(jié)果。
在DNA分離后對(duì)其進(jìn)行定量的另一種方法，是使用嵌入染料如溴化乙錠，SyberGreen(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)，或PicoGreen(Molecular Probes，Eugene，OR)。當(dāng)沒有足夠的DNA準(zhǔn)確進(jìn)行分光光度法測定時(shí)，通常使用染料。當(dāng)用紫外線(UV)光源觀測時(shí)，溴化乙錠的熒光數(shù)量與DNA總量成比例。因此，已知量的DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線和已知數(shù)量但未知濃度的樣品可于瓊脂糖凝膠中電泳，然后將此凝膠用溴化乙錠染色，并用UV觀測。這種類型凝膠稱為生產(chǎn)凝膠。樣品中DNA數(shù)量可通過將樣品的熒光與標(biāo)準(zhǔn)熒光對(duì)比而確定。相似的，此方法可在溶液中用DNA嵌入染料進(jìn)行。DNA水平低于大約25pg/ml可用PicoGreen檢測。生產(chǎn)凝膠方法或使用染料確定溶液中DNA數(shù)量的限制是需要將產(chǎn)量的目測、分光光度或熒光近似值與另一DNA樣品對(duì)比。用這種方法所得結(jié)果的可變性較高，且其還由于DNA樣品中存在污染成分而導(dǎo)致誤差。
至少有兩個(gè)商購試劑盒適于在分離后確定少量的人體基因組DNA。這些是ACESTM2.0人DNA定量探針Plus系統(tǒng)，由LifeTechnologies公司生產(chǎn)(Gaithersburg，MD)，和Quantiblot人DNA定量試劑盒，由PE應(yīng)用生物系統(tǒng)生產(chǎn)(Foster City，CA)。這些試劑盒典型用于實(shí)驗(yàn)室中用人DNA進(jìn)行遺傳相同性試驗(yàn)。Quantiblot系統(tǒng)是基于靈長類動(dòng)物特異性生物素?；墓押塑账崽结樑c分離的DNA樣品的雜交?？赏ㄟ^比色或化學(xué)發(fā)光檢測；兩種檢測法能定量0.15-10ng的人DNA。然而，試驗(yàn)需要2小時(shí)。另外，化學(xué)發(fā)光法需要X光膠片和處理能力，且只可用于靈長類DNA。ACESTM系統(tǒng)是一種類似的系統(tǒng)，其需要DNA樣品與膜結(jié)合，并與人特異性DNA探針雜交，通過發(fā)光進(jìn)行觀測。此系統(tǒng)能定量0.04-40ng的人DNA。這兩種系統(tǒng)均具有與嵌入染料相同的限制；即它們要求通過與另一種DNA樣品相比估測產(chǎn)量。
本領(lǐng)域需要一種能從含有過量DNA靶物質(zhì)的樣品中取出確定量的DNA靶物質(zhì)的方法。這些確定量的DNA然后可用于其中存在過量的DNA對(duì)獲得有效結(jié)果不利的方法。這種方法包括但非限于PCR擴(kuò)增，STR分析，DNA測序和遺傳相同性測試。
另外，現(xiàn)有的定量系統(tǒng)不易于自動(dòng)操作，并對(duì)DNA制品中殘余的污染物敏感。由于要分析和數(shù)據(jù)庫化大量的樣品，需要結(jié)合常規(guī)STR基礎(chǔ)的步驟的高通量方法，而不損失低通量的需要。用于從樣品中分離DNA并在純化過程中定量DNA的系統(tǒng)將不需要加工步驟，并將對(duì)本領(lǐng)域是顯著的貢獻(xiàn)。對(duì)假象比常規(guī)定量方法更不敏感的方法也是需要的。
本系統(tǒng)包括用基于磁性顆粒的分離方法從細(xì)胞樣品的其它物質(zhì)中分離DNA靶物質(zhì)。此方法操作靈活，因?yàn)榇判苑蛛x可采用低通量手工形式或高通量自動(dòng)形式。
簡而言之，本發(fā)明一方面包括一種從介質(zhì)中的其它物質(zhì)中分離確定量DNA靶物質(zhì)的方法，其通過(a)提供一種包括DNA靶物質(zhì)的介質(zhì)；(b)提供能可逆結(jié)合可限定量DNA靶物質(zhì)的個(gè)別量(discrete quantity)二氧化硅磁性顆粒；(c)通過組合二氧化硅磁性顆粒和介質(zhì)形成二氧化硅顆粒和DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物；(d)通過應(yīng)用外部磁場從介質(zhì)中除去含有DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物；及(任選地)(e)通過洗脫DNA靶物質(zhì)從復(fù)合物中分離DNA靶物質(zhì)，從而獲得確定量的DNA靶物質(zhì)。優(yōu)選的，(a)步中提供的DNA靶物質(zhì)的數(shù)量相對(duì)于顆粒可逆結(jié)合量是過量的。根據(jù)隨后的應(yīng)用和所提供的二氧化硅磁性顆粒的量，洗脫步驟可以是非必需的。
除了二氧化硅磁性顆粒之外，以上方法還可用含有二氧化硅的固體支持物進(jìn)行。當(dāng)使用其它含有二氧化硅的固體支持物時(shí)，含有DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物可從介質(zhì)中通過各種方法除去，如離心或過濾。
本發(fā)明方法的一優(yōu)選實(shí)踐包括以下步驟將含有DNA靶物質(zhì)的某一類型介質(zhì)樣品與磁性顆粒在存在離液鹽的情況下混合，其中磁性顆粒具有已知或可確定的吸附介質(zhì)中DNA靶物質(zhì)的能力。當(dāng)樣品是細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞裂解釋放DNA靶物質(zhì)至溶液中，從而與顆粒形成復(fù)合物。在洗掉其它細(xì)胞成分后，可將DNA靶物質(zhì)以個(gè)別體積洗脫，產(chǎn)生具有確定的DNA靶物質(zhì)濃度的溶液。此方法適用于從眾多不同類型樣品中分離DNA靶物質(zhì)，樣品類型包括但非限于全血，血白細(xì)胞，精細(xì)胞，口腔細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品中DNA數(shù)量相對(duì)于顆粒結(jié)合量是過量的。這種樣品可以任何眾多不同形式之一存在，包括但非限于液體形式，凍干形式，干燥于在犯罪現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的材料上，或位于固體支持物上(例如在棉簽上的頰細(xì)胞或?yàn)V紙上的血細(xì)胞)。如果需要可應(yīng)用附加的步驟以從固體支持物除去細(xì)胞。純化的DNA靶物質(zhì)可貯存于洗脫緩沖液中，或附著于磁性顆粒。因此，可獲得DNA靶物質(zhì)的多個(gè)樣品，并在需要時(shí)使用。
本發(fā)明另一方面涉及一種從介質(zhì)中的其它物質(zhì)中分離確定量的DNA靶物質(zhì)的方法，使用一種優(yōu)選形式的二氧化硅磁性顆粒，即硅質(zhì)氧化物(siliceous oxide)包被的磁性顆粒，其中該優(yōu)選的顆粒每ml能可逆結(jié)合可限定量的DNA靶物質(zhì)。本發(fā)明的此方面包括以下步驟形成一種包含包括DNA靶物質(zhì)的介質(zhì)，硅質(zhì)氧化物包被的磁性顆粒和離液鹽的混合物。鹽濃度是足以使DNA靶物質(zhì)吸附于顆粒。將此混合物溫育，或以混合物形式保持，直至DNA吸附于混合物中硅質(zhì)氧化物包被的磁性顆粒。然后將硅質(zhì)氧化物包被的磁性顆粒用磁力從混合物中除去。通過將顆粒與洗脫緩沖液接觸，將確定量的DNA靶物質(zhì)從硅質(zhì)氧化物包被的磁性顆粒中洗脫。
本發(fā)明另一方面涉及一種試劑盒，以從含有DNA靶物質(zhì)的介質(zhì)中分離確定量DNA靶物質(zhì)。此試劑盒包括懸浮于第一種容器水溶液中的硅質(zhì)氧化物包被的個(gè)別量的磁性顆粒，其中此顆粒具有可逆結(jié)合特異類型樣品介質(zhì)中可限定量的DNA靶物質(zhì)的能力。任選的，此試劑盒可包括根據(jù)本發(fā)明的方法從含有DNA靶物質(zhì)的介質(zhì)中分離確定量DNA靶物質(zhì)所需的其它成分。例如，此試劑盒還可包含在第二種容器中的離液鹽和在第三種容器中的清洗緩沖液，和說明書。
本發(fā)明的另一方面涉及一種確定校準(zhǔn)模型以定量相應(yīng)類型樣品中DNA靶物質(zhì)的方法。此方法包括(a)提供第一種介質(zhì)，其包括個(gè)別量的相應(yīng)類型樣品；(b)提供第二種介質(zhì)，其包括不同的個(gè)別量的相應(yīng)樣品；(c)將第一種個(gè)別量的二氧化硅磁性顆粒與第一種介質(zhì)混合，其中二氧化硅磁性顆粒能可逆結(jié)合介質(zhì)中確定量的DNA靶物質(zhì)；(d)將第二種確定量的二氧化硅磁性顆粒與第二種介質(zhì)混合，其中二氧化硅顆粒能可逆結(jié)合確定量的DNA靶物質(zhì)，從而形成二氧化硅磁性顆粒與第二種介質(zhì)中DNA靶物質(zhì)的第二種復(fù)合物；(e)應(yīng)用外部磁場，從第一種介質(zhì)中除去第一種復(fù)合物，從第二種介質(zhì)中除去第二種復(fù)合物；(f)從第一種復(fù)合物和第二種復(fù)合物中分別洗脫DNA靶物質(zhì)，從第一種復(fù)合物中產(chǎn)生分離的DNA靶物質(zhì)的第一種洗脫液，從第二種復(fù)合物中產(chǎn)生分離的DNA靶物質(zhì)的第二種洗脫液；(g)確定第一種和第二種洗脫液中DNA靶物質(zhì)的量。優(yōu)選的，(c)步中提供的顆粒的第一種個(gè)別量與(d)步中提供的第二種顆粒個(gè)別量相同。
如實(shí)施例3例證的一種校準(zhǔn)方法，包括確定從最小規(guī)格樣品中(可得DNA的最小量)純化靶DNA所必需的顆粒數(shù)量，以便DNA靶物質(zhì)過量存在，且所得純化的靶DNA也在所需的靶范圍內(nèi)。在確定最小規(guī)格樣品所需的顆粒數(shù)量后，重要的是保證從較大規(guī)格樣品中的純化也產(chǎn)生在所需濃度或產(chǎn)量范圍的純化的靶DNA。此方法通常確定易于得自所需規(guī)格范圍樣品的最大量的DNA，其中得自每個(gè)樣品的靶DNA數(shù)量在靶DNA的所需靶范圍內(nèi)。
如實(shí)施例8所例證，另一種校準(zhǔn)方法是依賴于使用已知含有大量過量DNA靶物質(zhì)的樣品，以便用于純化的顆粒范圍已知是限制所得DNA靶物質(zhì)的數(shù)量的因素。使用這種方法，使為應(yīng)用提供所需實(shí)用性(在實(shí)施例8中，此應(yīng)用是DNA測序)的最高和最低量靶DNA與使靶DNA數(shù)量的純化在該應(yīng)用所需的范圍內(nèi)的用于純化的粒子量相關(guān)。當(dāng)靶物質(zhì)是DNA時(shí)，在每種產(chǎn)生的用于如上所述構(gòu)建校準(zhǔn)模型的洗脫液中的靶物質(zhì)的數(shù)量優(yōu)選通過DNAQuant或PicoGreen分析確定。
有許多可利用本發(fā)明的應(yīng)用。其中兩種應(yīng)用包括DNA測序，尤其自動(dòng)DNA測序，和遺傳分析包括核酸擴(kuò)增反應(yīng)，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。在每種應(yīng)用中，DNA靶物質(zhì)的數(shù)量必須保持在熟知的范圍內(nèi)。遺傳分析可包括例如用于法醫(yī)學(xué)或親子鑒定中的遺傳鑒別，和用于臨床實(shí)驗(yàn)室中的遺傳分析。在這種情況中，其有助于在每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中具有幾乎相同數(shù)量DNA靶物質(zhì)。一致的數(shù)量在凝膠分析中產(chǎn)生一致的條帶密度和有限的假象。本發(fā)明還用于與其它擴(kuò)增系統(tǒng)聯(lián)合，如轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增。
優(yōu)選的，此方法易于自動(dòng)操作，從多個(gè)樣品中同時(shí)分離和定量DNA靶物質(zhì)。例如，此方法可易于從取自人群中多個(gè)個(gè)體的血液或其它組織樣品中，分離確定量的靶基因組DNA。分離及定量的基因組DNA的相應(yīng)基因座，如STR基因座，然后可用任一種已知的遺傳分析方法擴(kuò)增和分析。見例如Promega公司的GenePrintSTR分析系統(tǒng)。當(dāng)將其用于如上述在多個(gè)反應(yīng)中分離，定量和共擴(kuò)增多個(gè)STR基因座，如CODIS基因座時(shí)(如使用Promega公司的GenePrintPowerPlex系統(tǒng))，這種DNA分型結(jié)果數(shù)據(jù)庫中信息量可迅速提高。在這種數(shù)據(jù)庫中存在更多的數(shù)據(jù)，就有更多有效的數(shù)據(jù)用于鑒別個(gè)體，尤其在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中。
用本發(fā)明的方法分離的DNA靶物質(zhì)完全沒有污染物，可用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)另外加工或分析。從各種不同的介質(zhì)中分離和定量各種不同的DNA靶物質(zhì)的此方法的具體應(yīng)用，通過以下詳細(xì)闡述將顯而易見。
通過以下詳細(xì)闡述和權(quán)利要求書，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的其它特點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用。
圖2是如實(shí)施例7所述，在存在不同量MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒的情況下擴(kuò)增STR基因座后，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分級(jí)分離后，通過熒光檢測擴(kuò)增的人基因組DNA的和分離自K562組織培養(yǎng)細(xì)胞的DNA的STR基因座產(chǎn)生的激光打印圖，。
圖3示出通過凝膠電泳和用溴化乙錠染色后，分級(jí)分離的基因組DNA樣品的照片，其中基因組DNA樣品如實(shí)施例10所述使用多孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒分離自人全血。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分參考以下術(shù)語加以闡述本文中術(shù)語“確定量(defined quantity)”是指相對(duì)狹窄范圍內(nèi)的量。如果此范圍未知，則可如以下所述確定適用于特異樣品類型和顆粒類型的范圍(即可限定量)。此范圍的差異部分由于所用構(gòu)建校準(zhǔn)模型的定量方法所限。
“樣品類型”是指含有DNA靶物質(zhì)的樣品的形式和來源。各種樣品類型包括但非限于液態(tài)血液，在固體支持物如紙或棉簽上的干燥血液，或口腔細(xì)胞，唾液等。
“DNA靶物質(zhì)”是指包括但非限于質(zhì)粒DNA，基因組DNA，染色體DNA，經(jīng)限制酶消化產(chǎn)生的DNA片段，通過擴(kuò)增反應(yīng)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的擴(kuò)增的DNA，和單鏈DNA。
“校準(zhǔn)模型”是指特異于特定反應(yīng)條件，樣品類型和顆粒類型的一系列數(shù)據(jù)，其將顆粒和樣品數(shù)量與得自純化過程的DNA靶物質(zhì)的確定量相關(guān)。
“含有二氧化硅的固體支持物”是指一種包含二氧化硅或二氧化硅衍生物的固體支持物(如二氧化硅紙或二氧化硅膜)，其能可逆結(jié)合確定量的DNA靶物質(zhì)。二氧化硅可包被于固體支持物上或摻入其中。二氧化硅磁性顆粒是特別優(yōu)選的含有二氧化硅的固體支持物。盡管詳細(xì)說明中涉及了使用特別優(yōu)選的二氧化硅磁性顆粒，本發(fā)明還包括應(yīng)用其它含有二氧化硅的固體支持物的方法。
“分離”和“分離自”是指將一些污染物從靶物質(zhì)中除去。
“磁性顆?！笔侵笡]有磁場但暴露于磁場時(shí)形成磁偶極子的物質(zhì)，即在有磁場的情況下可被磁化，但不在這種磁場中自身無磁性的物質(zhì)?！按判浴卑槾判曰虺槾判晕镔|(zhì)?！按判浴币舶〞簳r(shí)磁性材料，如具有低居里溫度的鐵磁性或亞鐵磁性材料，條件是在根據(jù)本發(fā)明的方法使用含有這種物質(zhì)的二氧化硅磁性顆粒分離生物物質(zhì)時(shí)，這種暫時(shí)磁性材料是順磁性的。
使用磁性顆粒分離和純化多肽分子如蛋白質(zhì)或抗體已有多年。近年來，研制了分離核酸物質(zhì)的磁性顆粒和使用磁性顆粒的方法。文獻(xiàn)中闡述了一些不同類型的用于核酸分離的磁性顆粒，這些類型的顆粒有許多可商購。一個(gè)這種顆粒類型是磁性反應(yīng)玻珠，優(yōu)選是可控孔規(guī)格的。見例如CPG公司的磁性多孔玻璃(MPG)顆粒(LincolnPark，美國新澤西)；或如美國專利No.4395271；4233169；或4297337所述的多孔磁性玻璃顆粒，在此并入?yún)⒖?。核酸物質(zhì)趨于緊密結(jié)合玻璃，然而一旦結(jié)合則難以將其除去。因此，從磁性玻璃顆粒中的洗脫效率與從含有更少量核酸結(jié)合物質(zhì)如二氧化硅的顆粒中的洗脫效率相比較低。另一種設(shè)計(jì)用于直接結(jié)合和分離核酸的磁性反應(yīng)顆粒，是由包埋有較小鐵磁性顆粒并用玻璃包被的瓊脂糖顆粒。見例如美國專利5395498。
“二氧化硅磁性顆粒(silica magnetic particle)”是指由硅膠，硅質(zhì)氧化物，固體二氧化硅如玻璃或硅藻土形式的二氧化硅組成的或上述兩或多種形式的混合物組成的磁性顆粒?！肮枘z”是指層析級(jí)硅膠，一種可從許多不同來源商購的物質(zhì)。最通常的是通過將含有硅酸鹽如硅酸鈉的溶液酸化為pH小于10或11，然后使酸化的溶液膠凝而制備的硅膠。見例如Kirk-Othmer Encyclopedia of ChemicalTechnology，第6卷，第4版，Mary Howe-Grant編輯，John Wiley&Sons出版，1993，pp773-775?！岸趸璐判灶w?！眱?yōu)選是指具有上述特性的每mg二氧化硅磁性顆粒結(jié)合可限定量DNA靶物質(zhì)能力的顆粒。本發(fā)明使用的二氧化硅磁性顆粒優(yōu)選還包含摻入硅膠基質(zhì)中的鐵磁性物質(zhì)。
本發(fā)明分離和定量DNA靶物質(zhì)的方法，可使用任何二氧化硅包被的固體支持物進(jìn)行，該支持物能可逆結(jié)合確定量的DNA靶物質(zhì)。然而，本發(fā)明的方法優(yōu)選用硅質(zhì)氧化物包被的二氧化硅磁性顆粒(SOCM顆粒)進(jìn)行，SOCM顆粒是PCT出版物WO98/31840揭示的，在此并入?yún)⒖?。本發(fā)明優(yōu)選用具有以下物理特性的二氧化硅磁性顆粒進(jìn)行。
本發(fā)明方法中使用的二氧化硅磁性顆?？梢允侨我环N不同規(guī)格的。所用顆粒類型將被校準(zhǔn)以確定其對(duì)一種樣品類型的DNA的結(jié)合量。較小的二氧化硅顆粒提供更多的吸附表面積(每重量單位基礎(chǔ)為1)，但較小的顆粒與較大的顆粒相比，在向其中摻入磁性材料的量方面受限。本發(fā)明所用的多孔二氧化硅磁性顆粒大小的中間值為大約1-25微米，優(yōu)選大約3-15微米。顆粒大小分布也可以變化。然而，優(yōu)選相對(duì)狹窄的顆粒大小分布。優(yōu)選顆粒大小分布是這樣的，大約80％重的顆粒在中間值的約10微米范圍內(nèi)，更優(yōu)選在8微米范圍，最優(yōu)選在6微米范圍內(nèi)。
本發(fā)明的磁性顆?？梢允嵌嗫谆驘o孔的。當(dāng)磁性顆粒是多孔的時(shí)，此孔優(yōu)選是在可控范圍內(nèi)足夠大的，以使靶核酸物質(zhì)進(jìn)入固相顆粒內(nèi)部，并結(jié)合在孔內(nèi)表面上的功能基團(tuán)或二氧化硅上。當(dāng)磁性顆粒是多孔二氧化硅磁性顆粒時(shí)，每個(gè)二氧化硅磁性顆粒的總孔體積，通過氮BET方法測定，優(yōu)選為至少大約0.2ml/g顆粒質(zhì)量。特別優(yōu)選用作pH依賴型離子交換層析基質(zhì)組分的多孔二氧化硅磁性顆粒的總孔體積，通過氮BET方法測定，優(yōu)選為至少大約50％的孔體積包含于直徑為600?；蚋蟮目字?。高度優(yōu)選的多孔二氧化硅磁性顆粒具有以下特性平均顆粒直徑為大約5.0-8.5微米，BET表面積為大約18-55微米/gm，及酸浸提抗性小于大約7ppm Fe2O3。這種顆?？梢允堑米訮romega公司的多孔MagneSilTM顆粒。
術(shù)語“無孔“是指本發(fā)明所用的二氧化硅磁性顆粒，如果它們確實(shí)有孔，則其具有比上述多孔二氧化硅磁性顆粒更小的孔。特別地，“無孔”磁性顆粒的孔太小以至于不能通過DNA靶物質(zhì)。與相同直徑的多孔顆粒相比，無孔顆粒還具有更小的表面積和更小的吸附任何給定的DNA靶物質(zhì)的能力。這一差異的結(jié)果是，當(dāng)使用相同克重量的顆粒從相同介質(zhì)中分離DNA靶物質(zhì)時(shí)，多孔顆粒比無孔顆粒具有較大的結(jié)合和釋放更大量DNA靶物質(zhì)的能力。然而，用無孔顆粒分離的DNA靶物質(zhì)趨于含有較少的污染物。優(yōu)選的無孔二氧化硅磁性顆粒具有以下特性平均顆粒直徑為大約14.5微米，BET表面積為大約3微米/gm，酸浸提抗性小于大約2ppm Fe2O3。這種顆?？梢允堑米訮romega公司的無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒。
至少有兩種商購二氧化硅磁性顆粒特別優(yōu)選用于本發(fā)明中，得自PerSeptive生物系統(tǒng)的BioMag磁性顆粒，和得自Promega公司的多孔和無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒。
“復(fù)合物”是指有DNA靶物質(zhì)吸附于其的二氧化硅磁性顆?；蚱渌卸趸璧墓腆w支持物。DNA靶物質(zhì)的至少一部分能在適當(dāng)條件下，從二氧化硅磁性顆粒中釋放(即可逆結(jié)合)。釋放的DNA靶物質(zhì)的精確百分率不重要，只要其與給定的反應(yīng)條件相對(duì)一致。
“離液鹽”是指特定離子的鹽，當(dāng)其在水溶液中以足夠高的濃度存在時(shí)，使其中的蛋白質(zhì)不折疊及核酸喪失二級(jí)結(jié)構(gòu)。離液離子具有這些作用據(jù)認(rèn)為是因?yàn)樗鼈兤茐拇嬖谟谝簯B(tài)水中的氫鍵網(wǎng)，從而使變性的蛋白質(zhì)和核酸比其正確折疊或構(gòu)成的相應(yīng)物在熱力學(xué)方面更穩(wěn)定。離液離子包括胍鹽，碘化物，高氯酸鹽，和三氯乙酸鹽離子。離液鹽包括鹽酸胍，硫氰酸胍(其有時(shí)是指異硫氰酸胍)，碘化鈉，高氯酸鈉，和三氯乙酸鈉。
同時(shí)分離和定量DNA靶物質(zhì)的方法可如下進(jìn)行第一步是構(gòu)建校準(zhǔn)模型，用于確定使用個(gè)別量的顆粒期望從特定樣品類型中獲得的DNA靶物質(zhì)的數(shù)量。任何給定的具有一般物理特征的磁性顆粒，在相同條件下每mg顆粒具有確定的吸附DNA靶物質(zhì)的能力。特別地，就給定的反應(yīng)條件而言(包括二氧化硅磁性顆粒的數(shù)量)，當(dāng)DNA超過所用顆粒的結(jié)合量時(shí)，從特異樣品類型中獲得相同數(shù)量的DNA靶物質(zhì)。因此，對(duì)給定的反應(yīng)條件，樣品類型和顆粒類型而言，構(gòu)建校準(zhǔn)模型的步驟只需進(jìn)行一次。
在構(gòu)建校準(zhǔn)模型后，在相同溶液條件下使用獲得校準(zhǔn)模型所使用的顆粒類型，將DNA靶物質(zhì)從相同類型介質(zhì)中分離。
當(dāng)待分離的DNA類型存在于細(xì)胞中時(shí)，細(xì)胞優(yōu)選在裂解緩沖液中破壞，其將DNA靶物質(zhì)釋放至裂解緩沖液中。當(dāng)DNA靶物質(zhì)存在于細(xì)胞包含的核酸靶物質(zhì)中時(shí)，細(xì)胞優(yōu)選在將溶液中的蛋白質(zhì)和其它物質(zhì)與核酸分離的裂解緩沖液中裂解，盡管當(dāng)組合時(shí)促進(jìn)核酸與二氧化硅磁性顆粒的吸附。具有靶物質(zhì)附著于其的顆粒可用磁場從其它細(xì)胞物質(zhì)中分離，并可洗掉顆粒。然后可將核酸靶物質(zhì)在個(gè)別體積的水或其它洗脫液中洗脫，產(chǎn)生確定量的DNA靶物質(zhì)。
為獲得代表性的校準(zhǔn)模型，應(yīng)在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行實(shí)際樣品分析，用于產(chǎn)生校準(zhǔn)模型。這些條件包括如下樣品類型，顆粒類型，與磁性顆粒組合的溶液條件，清洗方法包括任何清溶液的組分，任何洗脫溶液的組分，和進(jìn)行各種方法步驟的溫度。反應(yīng)條件可通過實(shí)驗(yàn)而最佳化。然而，對(duì)本發(fā)明方法而言，反應(yīng)條件的一致性比最佳化更重要。
校準(zhǔn)模型可如下獲得將裂解緩沖液加入裂解樣品細(xì)胞中，并釋放DNA靶物質(zhì)，以便其不與二氧化硅磁性顆粒復(fù)合。向待分析的各種已知或測定量的樣品類型中加入個(gè)別量(已知及優(yōu)選常量)的二氧化硅磁性顆粒。將裂解緩沖液在將磁性顆粒加入樣品之前，期間或之后加入。對(duì)全血而言，裂解緩沖液在加入二氧化硅包被的磁性顆粒之前或與其一起加入樣品中。優(yōu)選地，將裂解緩沖液與二氧化硅包被的磁性顆粒一起加入樣品中。將二氧化硅磁性顆粒與裂解的細(xì)胞在顆粒與DNA靶物質(zhì)形成復(fù)合物的條件下組合。
將DNA靶物質(zhì)和二氧化硅磁性顆粒的復(fù)合物，在存在磁場的情況下從裂解液中分離，除去并棄掉裂解液。將剩余的復(fù)合物優(yōu)選清洗至少一次以除去另外的污染物。如果包括清洗步驟，在最后的清洗步驟后，通過向復(fù)合物中加入已知體積的洗脫溶液，將DNA靶物質(zhì)從復(fù)合物中洗脫，并在磁場下從洗脫溶液中分離顆粒。洗脫溶液優(yōu)選是水。然后將含有洗脫的DNA靶物質(zhì)的已知體積的溶液進(jìn)一步分析，例如擴(kuò)增，在凝膠上電泳或通過已知方法定量。基于定量結(jié)果，可確定在洗脫液中分離的DNA靶物質(zhì)的總量。此數(shù)據(jù)提供了關(guān)于特定樣品類型的各種量的樣品的可逆結(jié)合于顆粒的DNA靶物質(zhì)的數(shù)量信息。
將額外量的任何給定介質(zhì)樣品加入個(gè)別量的顆粒中，自其中分離的DNA靶物質(zhì)的數(shù)量將提高直至顆粒達(dá)到飽和點(diǎn)?；陲柡忘c(diǎn)，再提供另外的樣品，所得的DNA靶物質(zhì)的數(shù)量不再明顯提高。當(dāng)DNA靶物質(zhì)超過顆粒的結(jié)合量時(shí)，過量的樣品和過量的DNA靶物質(zhì)可完全洗掉。優(yōu)選地，存在的DNA靶物質(zhì)超過顆粒的結(jié)合量。因此，在相同條件下，及提供的DNA超過顆粒的結(jié)合量，不管樣品的規(guī)格，從樣品中相同數(shù)量的顆粒將分離和釋放幾乎相同數(shù)量的DNA。
在低樣品濃度，可加入非常少的可控制數(shù)量的顆粒，由此DNA濃度略超過結(jié)合量。不同顆粒的結(jié)合量不同，但對(duì)特定顆粒類型，樣品類型和反應(yīng)條件只需確定一次(例如通過如實(shí)施例7所述的試驗(yàn))。因?yàn)閷?duì)分離自特定樣品的DNA數(shù)量加以控制，可避免過擴(kuò)增信號(hào)。
實(shí)施例1闡述了一種確定校準(zhǔn)模型的方法。實(shí)施例1示出無孔二氧化硅磁性顆?？赡娼Y(jié)合來自人液體全血的DNA的飽和點(diǎn)或容量(500μg或700μg)。實(shí)施例1示出血液增加4倍導(dǎo)致分離的DNA的增加大大少于4倍。如實(shí)施例1類似，實(shí)施例3示出怎樣用較大的樣品規(guī)格(200μl-1ml全血)獲得校準(zhǔn)模型。在實(shí)施例3中，DNA明顯超過顆粒的可逆結(jié)合量。因此，飽和點(diǎn)已達(dá)到，當(dāng)所用體積超過飽和點(diǎn)時(shí)，不同樣品體積的產(chǎn)量相對(duì)一致。將這些DNA樣品濃縮以足以通過分光光度法定量。A260/A280數(shù)據(jù)示出使用本發(fā)明方法樣品純度高。如實(shí)施例1和實(shí)施例3的校準(zhǔn)模型示出通過將處理?xiàng)l件保持恒定，并可控改變樣品和顆粒的量，可從給定的樣品類型中分離和定量相對(duì)狹窄范圍的DNA靶物質(zhì)。
為進(jìn)行基因組分型分析如STR，分離的DNA靶物質(zhì)的精確量不重要，只要該量在可用于分析范圍內(nèi)。此范圍依賴于所用系統(tǒng)。例如，用Promega的GenePrintPowerPlexTM1.1系統(tǒng)擴(kuò)增，每次分析應(yīng)用大約0.5-5ng的DNA(優(yōu)選大約1ng DNA)以避免過擴(kuò)增并獲得易于基因分型的樣品。因此，通過對(duì)比校準(zhǔn)模型和所用系統(tǒng)的可用范圍，可確定分離可用量的DNA靶物質(zhì)所需的樣品和顆粒的量，之后從相應(yīng)的樣品中分離DNA靶物質(zhì)。
基于要將樣品置于其中進(jìn)行分析的系統(tǒng)生產(chǎn)者的指導(dǎo)和方案，可確定所需樣品范圍。因此，為獲得所需量DNA靶物質(zhì)，可將校準(zhǔn)模型用于確定適當(dāng)參數(shù)如顆粒量，樣品量，和總分離的DNA靶物質(zhì)的適當(dāng)體積或組分。
用本發(fā)明方法分離和定量的DNA靶物質(zhì)，可得自培養(yǎng)的真核或原核細(xì)胞，或得自取自或得自組織，多細(xì)胞生物體包括動(dòng)物和植物的細(xì)胞；體液如血液，淋巴，尿液，大便，或精液；胚胎或胎兒；食品；化妝品；或任何其它來源的細(xì)胞。一些DNA是根據(jù)本發(fā)明的方法從感染細(xì)胞的細(xì)胞器，病毒，噬菌體，質(zhì)粒，類病毒等中分離的。將細(xì)胞裂解及將裂解物通常以本領(lǐng)域已知的各種方式加工，以獲得DNA的水溶液，對(duì)其應(yīng)用本發(fā)明的分離方法。發(fā)現(xiàn)在這種溶液中的DNA典型具有其它成分如蛋白質(zhì)，RNAs或其它類型成分。
DNA靶物質(zhì)可來自固體支持物如濾紙上的樣品?？赏ㄟ^將固體支持物上的至少一部分樣品置于含有離液鹽的溶液中，除去DNA靶物質(zhì)(見實(shí)施例4-5)。為促進(jìn)從固體支持物上除去DNA靶物質(zhì)，溶液溫度優(yōu)選在60-100℃，更優(yōu)選在90-100℃范圍內(nèi)。優(yōu)選地，離液鹽溶液還包括一種pH緩沖液。
不管這種物質(zhì)的來源的性質(zhì)如何，在本發(fā)明方法中分離的DNA靶物質(zhì)是在包含DNA靶物質(zhì)和其它物質(zhì)的介質(zhì)中提供的。DNA靶物質(zhì)必須存在于介質(zhì)中，以可吸附于二氧化硅磁性顆粒的形式存在。當(dāng)DNA靶物質(zhì)包含于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，細(xì)胞壁或細(xì)胞膜可產(chǎn)生不適于吸附于顆粒的物質(zhì)。甚至將這種細(xì)胞裂解或充分破壞，以使包含于其中的DNA靶物質(zhì)釋放于周圍溶液中，溶液中的細(xì)胞碎片仍可干擾靶物質(zhì)吸附于二氧化硅磁性顆粒。因此，在用本發(fā)明的方法分離的靶物質(zhì)包含于細(xì)胞內(nèi)的情況下，優(yōu)選首先通過將細(xì)胞裂解或破壞產(chǎn)生裂解物，及更優(yōu)選另外清除細(xì)胞碎片裂解物(例如離心或真空抽濾)，這些細(xì)胞碎片裂解物存在于介質(zhì)中時(shí)，可干擾靶物質(zhì)吸附于二氧化硅磁性顆粒。
許多不同的已知裂解或破壞細(xì)胞以釋放含于其中的DNA物質(zhì)的任一種方法，均適用于從細(xì)胞產(chǎn)生介質(zhì)以用于本發(fā)明。選擇從細(xì)胞中釋放DNA物質(zhì)的方法依賴于含有此物質(zhì)的細(xì)胞的性質(zhì)。例如，為使具有相對(duì)硬的細(xì)胞壁的細(xì)胞如真菌細(xì)胞或植物細(xì)胞釋放包含于其中的核酸物質(zhì)，可能需要使用劇烈處理，如用有效的蛋白酶處理，及用勻漿器剪切或用超聲器經(jīng)聲波破壞。相反，只通過將細(xì)胞懸浮于水溶液中，并加入去污劑，DNA物質(zhì)就可易于從具有脂雙層膜的細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞或動(dòng)物血細(xì)胞中釋放。
一旦如上述DNA物質(zhì)從裂解或破壞的細(xì)胞中釋放，可用許多不同的方法或組合這些方法除去干擾DNA物質(zhì)吸附二氧化硅磁性顆粒的細(xì)胞碎片。優(yōu)選將裂解或破壞的細(xì)胞的溶液離心以除去微粒細(xì)胞碎片。任選的，然后在上清中加入另一種溶液，該溶液使另外的其它物質(zhì)形成沉淀，然后通過離心從所得溶液中除去沉淀，由此對(duì)上清進(jìn)一步加工。
當(dāng)相應(yīng)的DNA物質(zhì)是初始包含于大腸桿菌細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA時(shí)，優(yōu)選通過加入堿性溶液，如氫氧化鈉溶液，形成裂解物，從細(xì)菌細(xì)胞中釋放DNA物質(zhì)。優(yōu)選在所得上清中加入一種中和溶液，如酸性緩沖液，使另外潛在的干擾物質(zhì)形成沉淀。由此形成的沉淀優(yōu)選通過離心或過濾除去。澄清的裂解物中剩余的上清是含有相應(yīng)DNA的介質(zhì)。
本發(fā)明方法的第一步提供的介質(zhì)不需含有直接從細(xì)胞釋放的核酸物質(zhì)。核酸物質(zhì)可以是擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，如使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的擴(kuò)增的DNA。核酸物質(zhì)也可以是用限制酶消化DNA產(chǎn)生的DNA片段形式。介質(zhì)也可以是熔解的或酶促消化的電泳凝膠和核酸物質(zhì)的混合物形式。在使生物學(xué)靶與周圍細(xì)胞成分中脫離后，DNA物質(zhì)不與二氧化硅磁性顆粒吸附。
二氧化硅磁性顆粒和DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物是在促進(jìn)復(fù)合物形成的條件下通過將顆粒暴露于含有DNA靶物質(zhì)的介質(zhì)而形成的。該復(fù)合物優(yōu)選是二氧化硅磁性顆粒，介質(zhì)，和離液鹽的混合物形式。
在本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中形成的混合物中離液鹽離子的濃度優(yōu)選在大約0.1-7.0M之間，但更優(yōu)選在大約0.8-4.5M之間。混合物中離液鹽離子的濃度必須足以使DNA靶物質(zhì)吸附于混合物中的二氧化硅磁性顆粒，但不能太高以防止靶物質(zhì)不可逆變性，降解或?qū)е掳形镔|(zhì)在混合物中沉淀。大分子的雙鏈DNA，如染色體DNA，在0.5-2M的離液鹽濃度是穩(wěn)定的，但在大約2M以上的離液鹽濃度已知發(fā)生沉淀。見例如美國專利No.5346994，Piotr Chomczynski，第2列，第56-63行。對(duì)比之下，較小分子的DNA如質(zhì)粒DNA，染色體DNA的限制或PCR片段，或單鏈DNA，在2-5M離液鹽濃度在溶液中仍未降解。
就本發(fā)明所用的任何離液鹽而言，在使用這種鹽進(jìn)行本發(fā)明的任何溶液中的鹽濃度，在進(jìn)行本發(fā)明的所有條件下，需保持在溶液中鹽的溶解度之下。
在本發(fā)明方法的一實(shí)踐中，將介質(zhì)和樣品的混合物溫育，直至至少一些DNA靶物質(zhì)吸附于二氧化硅磁性顆粒形成復(fù)合物。此溫育步驟是在至少0℃，優(yōu)選至少4℃，更優(yōu)選至少20℃進(jìn)行的，溫育溫度不超67℃。此溫育步驟必須在低于二氧化硅磁性顆粒開始喪失其可逆結(jié)合核酸物質(zhì)的能力的溫度下進(jìn)行。溫育步驟更優(yōu)選在室溫(即大約25℃)下進(jìn)行。
當(dāng)DNA靶物質(zhì)包含于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，需要在含有離液鹽的裂解溶液中裂解細(xì)胞，以便在相同的溶液中達(dá)到細(xì)胞裂解和復(fù)合物形成。
除了離液鹽之外，裂解溶液可含有雙極性或非離子型去污劑，如CHAPS[3-[3-膽酰胺丙基二甲基氨基]-1-丙磺酸]，或Triton X-100(Sigma，St.Loμis，MO)。優(yōu)選地，裂解溶液包括pH緩沖液使pH穩(wěn)定在大約7.0，以保持DNA結(jié)構(gòu)完整。此裂解溶液還可含有二價(jià)陽離子鰲合劑，如EDTA。此裂解溶液還可用于從固體支持物中除去DNA靶物質(zhì)。
在復(fù)合物形成后，用磁場將復(fù)合物從混合物中除去。除了磁場之外其它形式的外部力量，也可根據(jù)本發(fā)明的方法在初始除去步驟之后，用于分離DNA靶物質(zhì)。適當(dāng)?shù)钠渌獠苛α堪ǖ窍抻谥亓^濾，真空抽濾和離心。
用于從介質(zhì)中除去復(fù)合物的外部磁場，可用已知的不同方法中任一種在介質(zhì)中適當(dāng)產(chǎn)生。例如，可將磁體置于裝有含有顆粒的溶液的容器外面，使顆粒通過溶液遷移并集中在容器附著磁體部位的內(nèi)表面。然后將磁體保持在容器的外表面，這樣顆粒由于磁體產(chǎn)生的磁場附于容器的內(nèi)表面，同時(shí)將容器內(nèi)溶液輕輕倒出并棄去。然后在容器內(nèi)加入第二種溶液，并除去磁體以使顆粒移至第二種溶液中。或者，將可磁化的探針插入溶液中并使探針磁化，這樣顆粒堆積在浸入溶液中的探針的末端。然后將探針從溶液中取出，同時(shí)保持磁性，插入第二種溶液中，不再保持磁場使顆粒進(jìn)入第二種溶液中。足以從溶液中分離二氧化硅磁性顆粒的任何磁力來源，均適用于本發(fā)明分離核酸的方法中。磁性分離儀器是可商購的。見例如MagneSphereTechnology磁性分離臺(tái)或PolyATractSeries 9600TMMulti-Magnet，均得自Promega公司；MagneTight分離臺(tái)(Novagen，Madison，WI)；或Dynal磁性顆粒集中器(Dynal，Oslo，Norway)。磁力優(yōu)選是以磁性分離臺(tái)形式提供的，如Promega公司的MagneSphereTechnology磁性分離臺(tái)(Catalog Nos.Z5331-3或Z5341-3)。
本發(fā)明提供了常規(guī)和有效的從各種不同樣品類型中分離相應(yīng)DNA靶物質(zhì)的方法。以上簡要闡述了此方法的一優(yōu)選方面，其中用磁力從介質(zhì)中除去顆粒，比其中DNA靶物質(zhì)與其它二氧化硅物質(zhì)可逆結(jié)合的常規(guī)分離方法具有明顯優(yōu)勢。特別地，用此方法的磁性除去步驟代替常規(guī)二氧化硅結(jié)合和洗脫分離方法中所需的真空抽濾或離心步驟。因此，特別適于自動(dòng)操作。
在本發(fā)明方法的一優(yōu)選方面，將從介質(zhì)中除去的復(fù)合物至少清洗一次，在清洗液中漂洗。清洗除去除相應(yīng)DNA靶物質(zhì)之外的任何另外的雜質(zhì)。用于此方法優(yōu)選附加的步驟的清洗溶液優(yōu)選包含能從二氧化硅磁性顆粒中除去污染物的的溶液。此清洗溶液優(yōu)選包含鹽和溶劑，優(yōu)選醇。醇促進(jìn)清洗溶液的蒸發(fā)。在該最后的優(yōu)選形式的此清洗溶液中，醇濃度優(yōu)選至少為30％體積，更優(yōu)選至少40％體積，最優(yōu)選至少50％體積。所用的醇優(yōu)選是乙醇或異丙醇或其組合物，更優(yōu)選是乙醇。鹽優(yōu)選是緩沖液形式，最優(yōu)選是乙酸鹽形式。清洗溶液中鹽濃度要足夠高，以保證核酸物質(zhì)在清洗期間不被從磁性顆粒中洗脫。
在通過將復(fù)合物重懸于清洗溶液中從介質(zhì)中除去后，優(yōu)選將復(fù)合物清洗。復(fù)合物優(yōu)選在第一次清洗后從清洗溶液中除去，每次清洗步驟用新鮮清洗溶液至少清洗一次，更優(yōu)選清洗3次。
復(fù)合物中DNA靶物質(zhì)的數(shù)量可限定。在一些分析或分子生物學(xué)處理方法中，少量的磁性顆粒將不毒害或明顯干擾進(jìn)程。因此在適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ校瑥?fù)合物可直接處理，而不用首先從二氧化硅磁性顆粒中分離DNA靶物質(zhì)。
然而優(yōu)選地，在進(jìn)一步處理之前將DNA靶物質(zhì)從二氧化硅磁性顆粒中洗脫。這可通過將復(fù)合物暴露于洗脫液而進(jìn)行。洗脫效率(或從顆粒中除去的結(jié)合的DNA靶物質(zhì)的百分率)不重要。只要給定的反應(yīng)條件，顆粒類型和樣品類型的洗脫物百分率相對(duì)一致。只要確定量的DNA靶物質(zhì)可一致的吸附于顆粒和洗脫掉，然后可進(jìn)行定量。
洗脫溶液優(yōu)選是低離子強(qiáng)度的水溶液，更優(yōu)選是在核酸物質(zhì)穩(wěn)定和基本完整的pH下的水或低離子強(qiáng)度緩沖液。任何相同于或低于TE緩沖液(即10mM Tris-HCl，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH8.0)離子強(qiáng)度的水溶液適用于此方法的洗脫步驟中，但洗脫溶液優(yōu)選緩沖為pH在6.5-8.5之間，更優(yōu)選在7.0-8.0之間。TE緩沖液和蒸餾水或去離子水是特別優(yōu)選用于本發(fā)明的洗脫溶液。上述優(yōu)選的低離子強(qiáng)度形式的洗脫溶液保證核酸物質(zhì)從離子中釋放。其它適用于本發(fā)明方法的洗脫溶液對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在此方法洗脫步驟從復(fù)合物中洗脫的DNA物質(zhì)優(yōu)選是從二氧化硅磁性離子中分離的。
用本發(fā)明方法洗脫的DNA靶物質(zhì)，適于通過分子生物學(xué)方法分析或進(jìn)一步加工，不需進(jìn)一步分離。洗脫的DNA可通過例如通過測序，限制分析，或核酸探針雜交進(jìn)行分析。因此，本發(fā)明的方法可用作基于DNA分析的方法的一部分，以診斷疾?。昏b別病原體；檢驗(yàn)食品，化妝品，血液或血液制品，或其它被病原體污染的產(chǎn)品；法醫(yī)學(xué)檢測；親代檢測；和對(duì)胎兒和胚胎進(jìn)行性別檢測。優(yōu)選地，洗脫的基因組DNA在DNA分型方法中分析。例如，一旦純化，此DNA可用于常規(guī)擴(kuò)增和DNA分型系統(tǒng)。PowerPlexTM1.1和PowerPlexTM2.1系統(tǒng)(Promega)在兩管擴(kuò)增系統(tǒng)中提供擴(kuò)增13個(gè)核心CODIS基因座加上性鑒別基因座，amelogenin，和低打滑五核苷酸重復(fù)基因座Penta E的擴(kuò)增。這兩個(gè)系統(tǒng)一般具有3個(gè)基因座以防止樣品混合。
本發(fā)明的方法提供的洗脫的DNA可進(jìn)一步以各種方式加工，例如測序，轉(zhuǎn)錄，酶反應(yīng)。洗脫的DNA的限制片段可與載體連接，并轉(zhuǎn)化入適當(dāng)宿主中以克隆或表達(dá)。洗脫的DNA節(jié)段可通過本領(lǐng)域已知各種方法擴(kuò)增，以擴(kuò)增靶核酸節(jié)段。如果洗脫的DNA是質(zhì)粒或另一類型的自主復(fù)制DNA，可將其轉(zhuǎn)化入適當(dāng)宿主中，以克隆或表達(dá)能在轉(zhuǎn)化的宿主中表達(dá)的DNA上的基因。
可將進(jìn)行本發(fā)明的所需的組分置于試劑盒中，以從介質(zhì)中分離已知量的DNA靶物質(zhì)。這種試劑盒最基本應(yīng)含有懸浮于第一種容器中水溶液中個(gè)別量的硅質(zhì)氧化物包被的磁性顆粒，其中此顆粒具有可逆結(jié)合樣品類型介質(zhì)中可限定量的DNA靶物質(zhì)的能力。優(yōu)選地，此試劑盒還包括離液鹽。離子可懸浮于離液鹽的溶液中。優(yōu)選地，此試劑盒還包括清洗溶液。
就液態(tài)血和血跡(大約5μl-10ml血)而言，適當(dāng)?shù)脑噭┖锌砂ㄒ韵鲁煞至呀饩彌_液，清洗緩沖液，二氧化硅磁性顆粒，及任選的洗脫溶液和/或磁性臺(tái)。優(yōu)選地，裂解溶液是清洗溶液的兩倍。高通量系統(tǒng)可包括上述成分加上96孔平板。
純化質(zhì)粒的適當(dāng)試劑盒可包含細(xì)胞重懸液，裂解溶液，中和溶液，二氧化硅磁性顆粒，清洗溶液和洗脫溶液。
以下非限制性實(shí)施例闡述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案。在實(shí)施例中，及在說明書和權(quán)利要求中，除非特別說明，體積，pH和濃度均在室溫下。在以下每個(gè)實(shí)施例中，使用最優(yōu)選的形式的二氧化硅磁性顆粒，即多孔和無孔MagneSilTM顆粒。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，選擇和使用除了多孔和無孔MagneSilTM顆粒之外的二氧化硅磁性顆粒，在以下實(shí)施例中例證了本發(fā)明方法的各個(gè)方面。
表1示出使用500μg或700μg無孔MagneSilTM得自6-25μl液態(tài)血液的總DNA數(shù)量。DNA濃度是根據(jù)生產(chǎn)者的介紹用PicoGreenDNA染料確定的(分子探針，Eugene，OR)。使用的MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒數(shù)量表明近乎飽和動(dòng)力學(xué)。500μg數(shù)量是接近飽和值，700μg數(shù)量是略低于飽和值。分離的DNA數(shù)量的差異明顯低于血液體積尤其在10-25μl體積范圍內(nèi)的差異。表1
實(shí)施例2分析分離的DNA在此實(shí)施例中，將實(shí)施例1中制備的DNA用于分析在8個(gè)短串聯(lián)重復(fù)(STR)基因座上的等位基因的相同性。將如實(shí)施例1所述用700μg無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒(Promega)從血液樣品中純化的1μl DNA樣品，用Promega的GenePrintPowerPlexTM1.1系統(tǒng)(Promega #DC6091)根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)進(jìn)行擴(kuò)增。生產(chǎn)者推薦使用此系統(tǒng)每次分析用0.5-5ngDNA，最優(yōu)選用1ng DNA。
將1μl擴(kuò)增產(chǎn)物加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠上，并如GenePrintPowerPlexTM1.1系統(tǒng)技術(shù)手冊所述進(jìn)行電泳。將凝膠用FMBIOII熒光掃描儀(Hitachi，Soμth San Francisco，CA)掃描。對(duì)每個(gè)觀測的等位基因確定峰高度并歸一化。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表每個(gè)樣品的15個(gè)等位基因的平均值，從10μl血液樣品中制備的DNA產(chǎn)生的組合等位基因的高度設(shè)為1。這些數(shù)據(jù)點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn)偏差列于下表2。峰高度只變化大約2倍，且在10-25μl的血液樣品中幾乎相同。數(shù)據(jù)表明所有樣品均是易于基因分型的。
表2
實(shí)施例3無孔二氧化硅磁性顆粒和硫氰酸胍在此實(shí)施例中，基因組DNA純化自人全血。將血液預(yù)先抽吸在EDTA包被的vacμtainer中并在4℃貯存。除非特別說明，所有純化以三份進(jìn)行，所有步驟和溫育在室溫大氣壓下進(jìn)行。磁性清除血液裂解物和純化基因組DNA使用硫氰酸胍經(jīng)Promega的WizardTMGenomic DNA純化試劑盒(A1620)的溶液和無孔二氧化硅磁性顆粒進(jìn)行。
將1ml，800μl，600μl，400μl和200μl血液置于含有3.0ml Wizard基因組細(xì)胞裂解溶液的15ml試管中，混合，并溫育10分鐘。然后將試管在800×g離心10分鐘。除去溶液，剩下白細(xì)胞(wbc)沉淀于試管底。
將wbc沉淀渦旋并加入1.0ml核裂解溶液。然后渦旋試管并在37℃溫育1小時(shí)。加入330μl WizardTMGenomic蛋白質(zhì)沉淀溶液，渦旋試管并在800×g離心10分鐘。從試管中除去溶液，并移至含有100μl(100mg/ml)無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒的清潔試管中，并將溶液渦旋。
將2ml的5M硫氰酸胍(GTC)加入試管中，混合并溫育2分鐘。然后將試管置于磁性架上5分鐘。將分離自顆粒的溶液除去并棄去。加入5ml SV總RNA層析柱清洗液(Promega，Z3100)，渦旋試管5秒鐘，然后將試管再置于磁性架上2分鐘。將分離自顆粒的溶液除去并棄去。重復(fù)進(jìn)行清洗。最后用5.0ml 80％乙醇清洗。渦旋試管5秒鐘，并置于磁性架上2分鐘。將分離自顆粒的溶液除去并棄去。用80％乙醇清洗重復(fù)兩次清洗，共三次。然后將試管在磁性架上在空氣中干燥60分鐘。在從磁性架上取下后，將顆粒上的DNA在400μl的WizardTMGenomic復(fù)性溶液中洗脫5分鐘。然后將試管再置于磁性架上5分鐘，并將含有DNA的溶液移出至清潔的試管中。
通過分光光度分析(在樣品緩沖液中DNA稀釋為1∶2)，根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)通過PicoGreen分析(分子探針)和根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)通過DNAQuant分析(Promega公司)獲得DNA純化結(jié)果，并列于下表3。此結(jié)果也示于

圖1。第1-5泳道分別相當(dāng)于100，80，60，40，和20ng Promega基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)Part#6304A。第6泳道及之后是用10μl樣品加樣的。
表3
應(yīng)用分光光度分析，平均產(chǎn)量為3.11μg。最低值為2.48μg或平均值的79.8％。最高值為3.8μg或平均值的122.3％。應(yīng)用PicoGreen分析，進(jìn)一步見圖1，平均產(chǎn)量為1.6μg。最低值為1.1μg或平均值的33％，最高值為2.0μg或高于平均值20％。所有樣品均在平均值的33％內(nèi)。應(yīng)用DNAQuant分析，最低值為1.8μg，最高值為2.6μg。A260/A280值高于1.7-1.9的期望范圍，可反映出殘余的污染物的存在。實(shí)施例4從血染的S&S 903紙中分離DNA在此實(shí)施例中證明以下步驟使用如實(shí)施例1所述的裂解緩沖液，從干燥在S&S 903紙(Schleicher & Schuell)上的血液中釋放了DNA。然后將無孔磁性顆粒用于純化釋放的DNA。切下在S&S 903紙上的范圍在14mm2-100mm2及含有5μl-50μl血液的人體血跡，并置于1.5ml錐形管底。然后在含有50mm2或更少的S&S 903紙的試管中，加入如實(shí)施例1所述的100μl裂解緩沖液，在含有100mm2S&S 903紙的試管中加入200μl裂解緩沖液。將試管置于95℃，30分鐘。然后將試管從熱源移開，并用無菌移液管的尖端除去紙。通過將紙?jiān)诠鼙谏嫌靡埔汗芗舛思訅撼ミ^量的液體。然后加入含有700μg無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒的7μl水，輕輕渦旋混合。如實(shí)施例1所述進(jìn)行其余的DNA純化步驟。
將純化自每個(gè)血跡的1μl DNA用GenePrintPowerPlexTM1.1系統(tǒng)擴(kuò)增，如實(shí)施例2所述。將1μl擴(kuò)增產(chǎn)物加樣于變性凝膠上，并如GenePrintPowerPlexTM1.1系統(tǒng)技術(shù)手冊所述進(jìn)行電泳。將凝膠用FMBIOII熒光掃描儀(Hitachi，South San Francisco，CA)掃描。確定每個(gè)觀測的等位基因的峰高度并歸一化。下表4中所列的數(shù)據(jù)點(diǎn)表示每個(gè)樣品的15個(gè)等位基因的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，在10μl血液樣品中制備的DNA產(chǎn)生的組合等位基因的高度設(shè)為1。每個(gè)樣品的平均歸一化峰高度均在5％內(nèi)，表明不論DNA是否自5，10，25，或50μl血跡中分離，擴(kuò)增是一致的。
表4
下表5列出每個(gè)樣品內(nèi)峰高度之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。此偏差在16-20％之間，表明不管樣品的大小，小和大等位基因均同樣擴(kuò)增。表5
實(shí)施例5從血染的FTATM紙中分離DNA在此實(shí)施例中，示出附著于FTATM紙(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的DNA，用實(shí)施例1所述的裂解緩沖液從紙中釋放。然后將釋放的DNA用MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒純化，并用于STR分析。
將人血染的所示規(guī)格的FTATM紙(113mm2，57mm2和28mm2)，在實(shí)施例2所述的100μl裂解緩沖液中，在95℃加熱30分鐘。將紙和溶液置于沒有濾膜的自旋籃(Millipore，Bedford，MA)中，并在14000rpm在微量離心管中離心2分鐘。然后將含有700μg無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒的7μl水加入試管中，短暫渦旋，并在室溫溫育5分鐘。將試管短暫渦旋，然后置于磁性臺(tái)(Promega公司)上，在此顆粒自溶液中分離出，并除去溶液。將顆粒用100μl清洗緩沖液清洗3次(如實(shí)施例1所述)。然后將顆粒在室溫于空氣中干燥5分鐘。向具有顆粒的試管中加入100μl水，并將此試管在60℃溫育5分鐘。將試管短暫渦旋，然后在室溫置于磁性臺(tái)上，除去DNA溶液并貯存在4℃。將1μl的每種溶液用GenePrintPowerPlexTM1.1擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于變性凝膠上，并如實(shí)施例2所述用FMBIOII熒光掃描儀分析凝膠。將峰高度歸一化，并列于下表6。在此實(shí)施例中，數(shù)據(jù)示出當(dāng)使用無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒的量保持一致時(shí)，純化自不同量血染FTATM紙的DNA幾乎等量。
表6
實(shí)施例6DNA純化時(shí)變化血液保存時(shí)間在此實(shí)施例中，對(duì)比血液貯存0-131天時(shí)用本發(fā)明的方法分離的DNA的數(shù)量。在超過此時(shí)間貯存的血液中，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知DNA會(huì)不同程度降解。將人血液收集在EDTA包被的vacutainer管中，并在4℃貯存。在0，22，29，和131天后，收集血液，將來自10μl血液的DNA，如實(shí)施例1所述通過用無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒純化。將1μl每個(gè)純化的DNA溶液(每個(gè)樣品以三份分析)如實(shí)施例2所述用Promega GenePrintPowerPlex1.1系統(tǒng)擴(kuò)增。將擴(kuò)增的DNA在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并用FMBIO掃描儀確定峰高度，并相對(duì)于0天的數(shù)值歸一化，如實(shí)施例2所述。表7列出所得的歸一化峰高度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表7
所有樣品的歸一化平均峰高度的變化很小，表明適于此定量純化程序的DNA可得自貯存多達(dá)4個(gè)月的血液。第131天的樣品具有基本相同的平均峰高度，但小等位基因有些高于平均值，大等位基因有些低于平均值，這可由在使用抽吸和貯存131天后制備的樣品時(shí)，觀測到的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大表明。然而，所有的樣品均易于進(jìn)行基因分型，且峰高度在可接受的范圍內(nèi)。
令人感興趣的是，實(shí)施例6示出DNA的大小不明顯影響結(jié)合和洗脫量。因此，不用基于樣品時(shí)間(較長時(shí)間的樣品趨于降解并因此提供較小規(guī)格的DNA)調(diào)節(jié)初始校準(zhǔn)模型，即可獲得可靠的結(jié)果。實(shí)施例7在STR分析中直接使用MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒分離的基因組DNA此實(shí)施例是確定DNA是否需要從MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒洗脫，以用于STR分析。
將6個(gè)685ng等分的人基因組DNA K562(Promega公司)置于1.5ml錐形管的50μl GTC裂解緩沖液(6M硫氰酸胍，10mMEDTA，10mM Tris pH6.0，1％CHAPS，1％Triton X-100)中。在并列的實(shí)驗(yàn)中，將50μl等分人全血置于含有100μl GTC裂解緩沖液的1.5ml錐形管中。將降低量的二氧化硅磁性顆粒(2.5，0.5，0.1，0.02，0.004，0.0008μg)加入每個(gè)系列中。將樣品如下加工在1.5ml錐形管中加入400μl GTC裂解緩沖液，50μl多孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒(100mg/ml)和200μl全血。將試管渦旋大約15秒。然后將試管在室溫溫育10分鐘，并短暫渦旋5分鐘。通過將試管置于磁性臺(tái)上捕獲顆粒。然后將分離自顆粒的上清除去，并加入650μl清洗緩沖液(25％異丙醇，25％乙醇，100mM NaCl，10mM Tris，pH8.0)，并將試管短暫渦旋。重復(fù)兩次清洗，共三次清洗。然后，除去最后一次清洗液，并將顆粒重懸于20μl清洗緩沖液中。移出1μl每種分離液，并置于擴(kuò)增管底，在空氣中干燥10分鐘。然后將這些樣品用于STR分析，并與1ng K562的STR分析相對(duì)比，根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)和如實(shí)施例2所述使用GenePrintPowerPlexTM1.1系統(tǒng)。所得凝膠示于圖2。標(biāo)記為“L”的泳道相當(dāng)于等位基因梯。
表8
用降低量MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒分離的樣品和1ng K561DNA之間的對(duì)比表明極少量的基因組DNA被分離；結(jié)合于顆粒的DNA能直接用于STR反應(yīng)；通過在上述STR分析中條帶密度確定，捕獲大約相當(dāng)于1ng K562 DNA的DNA所需的顆粒量對(duì)于K562DNA為大約0.1μg，對(duì)于全血為大約0.5μg。實(shí)施例8對(duì)通過在多孔和無孔二氧化硅磁性顆粒上捕獲分離的DNA進(jìn)行測序此實(shí)施例證實(shí)通過限制加入到制備的含有比顆粒結(jié)合DNA的最大能力還多的DNA的細(xì)菌裂解物中的多孔和無孔二氧化硅包被的磁性顆粒的量，可以可靠地分離適用于自動(dòng)測序數(shù)量的DNA。此方法不需通過分光光度法或其它定量分析確定DNA的濃度和數(shù)量，DNA的濃度和數(shù)量由于DNA制備中存在污染而會(huì)有偏差。
將1ml用pGEM3Zf(+)質(zhì)粒(Promega公司，Madison，WI)轉(zhuǎn)化的DH5α細(xì)胞(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)在Beckman 2ml BioBlock(140504)的每個(gè)孔中生長過夜。在600nm細(xì)胞密度為大約2-3 OD。質(zhì)粒存在的理論數(shù)量可以為300-700個(gè)拷貝/細(xì)胞，得到產(chǎn)量為1.8-4.1μg/ml培養(yǎng)物(Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY)。將細(xì)胞在BioBlock中通過在2000×g離心10分鐘而沉淀。將培養(yǎng)基輕輕倒出，并將平板在紙巾上輕輕拍壓，以吸干任何剩余的液體。
然后，將75μl細(xì)胞重懸緩沖液(Promega，A711T)加入細(xì)胞沉淀中，并將沉淀通過來回抽吸重懸。加入75μl細(xì)胞裂解緩沖液(Promega，A712T)，并通過來回抽吸4次將溶液混合。加入100μlWizardTMPlus SV中和溶液(Promega，A713T)，并通過來回抽吸4次將溶液混合。
將BioBlock中的試管在2000×g離心10分鐘。從每個(gè)試管中取出裂解物，并置于96孔平板的適當(dāng)孔中。
在使用之前，將MagneSilTM二氧化硅包被的磁性顆粒(多孔和無孔)通過搖動(dòng)重懸。然后將如下表9所列的不同數(shù)量的每型稀釋的顆粒加入各孔中，輕輕混合并在室溫溫育10分鐘。將平板置于磁體上并使溶液澄清(大約10秒鐘)。從每個(gè)孔中除去裂解物并棄去，注意近可能不除去顆粒。將平板從磁體上取下并在每個(gè)孔中加入40μl80％的乙醇。
將顆粒通過來回抽吸重懸。將平板再置于磁體上并除去澄清的裂解物。重復(fù)進(jìn)行清洗。在第二次清洗后，將平板在磁體上放置10分鐘。如果在此時(shí)間后有任何液體流至孔底，用移液管除去。然后在每個(gè)孔中加入10μl納米純水，并通過來回抽吸混合。將平板置于磁體上使其澄清，并將上清移至清潔平板中。
然后不用再進(jìn)一步加工，用如下所列的正向和反向質(zhì)粒特異性引物(Promega公司，Madison，WI)，在ABI 377設(shè)備上根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)(ABI)，用Big-DyeTMChemistry對(duì)完整的樣品測序。盡管具有不同程度的信號(hào)強(qiáng)度和精確性，仍可對(duì)所有的樣品多至800個(gè)堿基測序。精確性列于下表9，信號(hào)強(qiáng)度列于下表10。正向引物 5’GTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO1)反向引物 5’CAGGAAACAGCTATGAC 3’(SEQ ID NO2)表9
表10
結(jié)果表明當(dāng)?shù)谝淮问褂眯沦|(zhì)粒類型，顆粒類型，或樣品類型時(shí)，需要用各種量的顆粒確定校準(zhǔn)模型。表9的結(jié)果表明無孔顆粒比等量的多孔顆粒具有較低的結(jié)合量。這將保證在同時(shí)分離/定量步驟之后存在足夠數(shù)量的DNA，以進(jìn)行DNA測序反應(yīng)。在用此類型的質(zhì)粒的所有隨后的反應(yīng)中，不再需要校準(zhǔn)，因?yàn)橐阎嗌贁?shù)量的顆粒能在所用條件下通過確定量的顆粒純化。實(shí)施例9對(duì)比根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)使用的在FTA紙上血液樣品及與細(xì)胞裂解緩沖液和二氧化硅磁性顆粒分離方法一起使用的FTA紙上血液樣品FTA紙(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)是一種貯存血跡的常規(guī)方式。然而，當(dāng)分析在FTA紙上的DNA時(shí)，存在一些技術(shù)問題。因?yàn)榕cFTA紙的高結(jié)合性，及不能通過任何已知的方法從濾紙中容易地分離DNA，所以必須使用非常小孔(punches)的紙，以消除在擴(kuò)增反應(yīng)中過量的DNA。另外，還有FTA紙的吸收給定體積液體的能力。因此，具有高或低白細(xì)胞計(jì)數(shù)的血液或具有過量體積血液的樣品產(chǎn)生不一致的結(jié)果。由生產(chǎn)者推薦的純化方法在將濾紙直接用于擴(kuò)增反應(yīng)之前，需要花費(fèi)20-30分鐘的5次清洗步驟，加上另外20分鐘在60℃的干燥步驟。此步驟在每次擴(kuò)增DNA時(shí)必須重復(fù)進(jìn)行。
在此實(shí)施例中，對(duì)比了根據(jù)生產(chǎn)者推薦的方法從FTA紙上分離DNA，和用無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒從FTA紙上分離DNA。將在FTA紙上相當(dāng)于100μl血液的113mm2的血跡，根據(jù)生產(chǎn)者的方法純化。在紙上打一個(gè)1mm的孔，并將此孔分成兩半(等于0.5mm2或0.4μl血液)。將此孔用GenePrintPowerPlexTM1.1系統(tǒng)根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)純化(Promega公司，#DC6090)，并如實(shí)施例2所述在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳。
或者，將57mm2FTA紙上的血跡在95℃在200μl裂解緩沖液中加熱30分鐘，然后將紙置于自旋籃上并離心兩分鐘以從紙上分離溶液。然后加入含有700μg無孔MagneSilTM二氧化硅磁性顆粒的7μl水，并將溶液在室溫溫育5分鐘。將試管置于磁性臺(tái)上從上清中分離顆粒。除去上清并棄去。將顆粒用清洗緩沖液如實(shí)施例1所述清洗3次，然后在室溫在空氣中干燥5分鐘。然后加入100μl水并將樣品在60℃溫育5分鐘。將顆粒在磁性臺(tái)上分離，收集含有DNA的溶液并移至清潔試管中。將1μl(等于大約0.6mm2FTA孔或大約0.5μl血液)樣品用GenePrintPowerPlexTM1.1DNA系統(tǒng)擴(kuò)增，并如實(shí)施例2所述在變性聚丙烯酰胺上電泳。
分析在丙烯酰胺凝膠上觀測的擴(kuò)增產(chǎn)物掃描圖，并將每個(gè)峰高度用平均峰高度除以獲得歸一化值。將在每個(gè)基因座上的兩個(gè)等位基因的峰高度平均。結(jié)果列于下表11。結(jié)果示出根據(jù)生產(chǎn)者的方法FTA樣品在STR擴(kuò)增反應(yīng)中峰不平衡，大等位基因擴(kuò)增不足，小等位基因過擴(kuò)增。如上所述用二氧化硅磁性顆粒從FTA濾紙從除去DNA，提供正確量的DNA用于STR擴(kuò)增反應(yīng)，并觀測到不同大小的等位基因無優(yōu)先的擴(kuò)增。表11
實(shí)施例10多孔二氧化硅磁性顆粒和全血增加樣品規(guī)格限制顆粒體積在此實(shí)施例中，將濃度為100mg/ml的常量(7μl)多孔二氧化硅磁性顆粒用在下述方法中以從各三份的100，200和300μl人全血樣品中分離DNA。洗脫的DNA通過UV分光光度法，瓊脂糖凝膠電泳，和PicoGreen分析(Molecμlar Probes，Eμgene，OR)測定。
將7μl充分混合的多孔二氧化硅磁性顆粒(100mg/ml)移液入9個(gè)2ml旋蓋錐形管中。然后將100，200和300μl的各三份人全血樣品加入3個(gè)管中。將管渦旋20秒。然后在室溫溫育10分鐘，在此期間通過渦旋混合一次。將樣品再次混合并置于磁性架上。5分鐘后，將磁性顆粒在室溫從上清中分離。然后除去上清并棄去。再重復(fù)清洗兩次，共3次。
然后，加入400μl醇清洗液，并通過渦旋混合管內(nèi)容物。將管置于磁性臺(tái)上，除去上清并棄去。用醇重復(fù)清洗兩次清洗，共三次。在除去最后的上清后，將管打開蓋在室溫在空氣中干燥10分鐘。然后將顆粒與50μl TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.3)組合。將此管混合并在5℃放置過夜。在磁性臺(tái)上將顆粒從上清中分離，并將含有洗脫的DNA的上清移至清潔試管中。將顆粒再與50μl TE合并混合，并在65℃放置過夜。將顆粒在磁性臺(tái)上從上清中分離，并將上清集合為組合的DNA洗脫物，體積為100μl。
然后組合70μl此溶液與280μl TE，通過UV分光光度儀測定溶液中DNA濃度，并在用TE為空白的UV分光光度儀上測定在260nm和280nm的吸光度。結(jié)果列于下表12。表12
然后將10μl每種樣品在1％瓊脂糖凝膠上與Promega G304A基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物(泳道2-4分別為200，100和50ng)，和λHindIII標(biāo)記G171A(泳道1)一起電泳。將凝膠用溴化乙錠染色，并在UV光下將樣品泳道與標(biāo)準(zhǔn)泳道目測對(duì)比。結(jié)果示于圖3。樣品1呈現(xiàn)含有150ng總產(chǎn)量，樣品6呈現(xiàn)含有800ng總產(chǎn)量，其它樣品總產(chǎn)量大約為250ng。這表明UV分光光度數(shù)據(jù)錯(cuò)誤提高到大約4-10倍，這可能由于殘余的醇或蛋白質(zhì)污染所致，如可通過低OD260280比率表明。
根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)進(jìn)行PicoGreen分析。結(jié)果列于下表13。從凝膠圖和PicoGreen數(shù)據(jù)中可見，9個(gè)樣品的總產(chǎn)量在大約250-959ng范圍內(nèi)。樣品6呈現(xiàn)在此范圍之外，可能由于此樣品中DNA不均衡再水合所致。
表13
使用PicoGreen定量數(shù)據(jù)，平均產(chǎn)量為418ng。最低點(diǎn)為250.8ng或平均值的60％。最高點(diǎn)為959ng(#6，大概是異常值)或平均值的229％。如果此點(diǎn)在計(jì)算平均值時(shí)忽略不計(jì)，平均值為350ng，最低點(diǎn)為250ng或平均值的71％，最高點(diǎn)為510ng或平均值的145％。
本發(fā)明結(jié)合上述優(yōu)選的實(shí)施方案已加以詳細(xì)闡述。在本發(fā)明原理和所附權(quán)利要求范圍內(nèi)可對(duì)本發(fā)明加以改動(dòng)。
權(quán)利要求
1.一種從介質(zhì)中的其它物質(zhì)中分離確定量的DNA靶物質(zhì)的方法，包括(a)提供包含DNA靶物質(zhì)的介質(zhì)；(b)提供個(gè)別量的能可逆結(jié)合可限定量DNA靶物質(zhì)的含有二氧化硅的固體支持物；(c)通過組合含有二氧化硅的固體支持物與介質(zhì)，形成含有二氧化硅的固體支持物與DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物；(d)從介質(zhì)中除去具有DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物；(e)從復(fù)合物中分離DNA靶物質(zhì)，從而獲得確定量的DNA靶物質(zhì)。
2.一種從介質(zhì)中的其它物質(zhì)中分離確定量的DNA靶物質(zhì)的方法，包括(a)提供包含DNA靶物質(zhì)的介質(zhì)；(b)提供個(gè)別量的能可逆結(jié)合可限定量DNA靶物質(zhì)的二氧化硅磁性顆粒；(c)通過組合二氧化硅磁性顆粒與介質(zhì)，形成二氧化硅磁性顆粒與DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物；(d)通過應(yīng)用外部磁場，從介質(zhì)中除去具有DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物；(e)通過洗脫DNA靶物質(zhì)，從復(fù)合物中分離DNA靶物質(zhì)，從而獲得確定量的DNA靶物質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中(a)步中提供的DNA靶物質(zhì)的量相對(duì)于顆粒的結(jié)合量是過量的。
4.權(quán)利要求2的方法，其中二氧化硅磁性顆粒是多孔的。
5.權(quán)利要求2的方法，其中二氧化硅磁性顆粒是無孔的。
6.權(quán)利要求2的方法，其中二氧化硅磁性顆粒是硅質(zhì)氧化物包被的磁性顆粒。
7.權(quán)利要求2的方法，其中介質(zhì)包括離液鹽。
8.權(quán)利要求7的方法，其中離液鹽包含硫氰酸胍。
9.權(quán)利要求2的方法，其中(a)步中提供的DNA靶物質(zhì)是聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求2的方法，其中DNA靶物質(zhì)是基因組DNA。
11.權(quán)利要求2的方法，其中DNA靶物質(zhì)是質(zhì)粒DNA。
12.權(quán)利要求10的方法，還包括在DNA分型方法中分析洗脫的基因組DNA。
13.權(quán)利要求2的方法，其中介質(zhì)是含有DNA靶物質(zhì)的固體支持物，其中DNA靶物質(zhì)在(c)步之前，通過將固體支持物與含有離液鹽的混合物組合而分離自固體支持物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中固體支持物是紙。
15.權(quán)利要求13的方法，其中將混合物從60℃加熱至大約100℃。
16.權(quán)利要求2的方法，還包括對(duì)洗脫的DNA靶物質(zhì)的至少一部分進(jìn)行測序。
17.權(quán)利要求2的方法，還包括在從介質(zhì)除去復(fù)合物之后清洗該復(fù)合物的步驟，之后從復(fù)合物中洗脫DNA靶物質(zhì)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中復(fù)合物是用包含醇和鹽的清洗溶液清洗的。
19.權(quán)利要求2的方法，其中在(e)步中洗脫的DNA靶物質(zhì)是用水洗脫的。
20.一種從介質(zhì)中其它物質(zhì)中分離確定量的DNA靶物質(zhì)的方法，包括(a)提供包含DNA靶物質(zhì)的介質(zhì)；(b)提供個(gè)別量的二氧化硅磁性顆粒，其具有每mg顆粒能可逆結(jié)合可限定量的DNA靶物質(zhì)的能力；(c)形成包含介質(zhì)，二氧化硅磁性顆粒，和離液鹽的混合物，其中混合物中離液鹽濃度足以使DNA靶物質(zhì)吸附于顆粒；(d)溫育此混合物直至至少一些DNA靶物質(zhì)吸附至二氧化硅磁性顆粒；(e)通過外部磁力從混合物中除去二氧化硅磁性顆粒和吸附的DNA靶物質(zhì)；(f)通過將顆粒暴露于洗脫溶液，從二氧化硅磁性顆粒中洗脫DNA靶物質(zhì)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中(a)步中提供的DNA靶物質(zhì)的量相對(duì)于顆粒的結(jié)合量是過量的。
22.權(quán)利要求20的方法，其中DNA靶物質(zhì)是基因組DNA。
23.權(quán)利要求20的方法，其中DNA靶物質(zhì)是質(zhì)粒DNA。
24.權(quán)利要求20的方法，還包括對(duì)洗脫的DNA靶物質(zhì)的至少一部分進(jìn)行測序。
25.權(quán)利要求20的方法，其中離液鹽包含硫氰酸胍。
26.權(quán)利要求20的方法，其中(c)步中形成的混合物中離液鹽濃度在大約0.1M-7M之間。
27.權(quán)利要求20的方法，其中二氧化硅磁性顆粒是多孔的。
28.權(quán)利要求20的方法，其中二氧化硅磁性顆粒是無孔的。
29.權(quán)利要求20的方法，還包括在從介質(zhì)除去二氧化硅磁性顆粒后清洗該二氧化硅磁性顆粒的步驟，之后從該顆粒中洗脫DNA靶物質(zhì)。
30.權(quán)利要求29的方法，其中該顆粒是用包含醇和鹽的清洗溶液清洗的。
31.權(quán)利要求20的方法，其中洗脫溶液是水。
32.一種從介質(zhì)中分離確定量DNA靶物質(zhì)的試劑盒，此試劑盒包括在第一個(gè)容器中的水溶液中懸浮的個(gè)別量的二氧化硅磁性顆粒，其中該顆粒具有可逆結(jié)合樣品類型介質(zhì)中可限定量的DNA靶物質(zhì)的能力。
33.權(quán)利要求32的試劑盒，其中樣品類型是液態(tài)血液。
34.權(quán)利要求32的試劑盒，其中樣品類型是固體支持物上的血液。
35.權(quán)利要求32的試劑盒，還包含離液鹽。
36.權(quán)利要求35的試劑盒，其中二氧化硅磁性顆粒懸浮于具有離液鹽的溶液中。
37.權(quán)利要求35的試劑盒，還包含清洗溶液。
38.一種確定校準(zhǔn)模型，以定量相應(yīng)樣品類型中的DNA靶物質(zhì)的方法，此方法包括a.提供第一種介質(zhì)，其中該第一種介質(zhì)包括個(gè)別量的相應(yīng)樣品類型；b.提供第二種介質(zhì)，其中該第二種介質(zhì)包括不同的個(gè)別量的相應(yīng)樣品類型；c.將個(gè)別量的二氧化硅磁性顆粒與第一種介質(zhì)混合，其中二氧化硅磁性顆粒能可逆結(jié)合確定量的DNA靶物質(zhì)，從而形成二氧化硅磁性顆粒與第一種介質(zhì)中的DNA靶物質(zhì)的第一種復(fù)合物；d.將個(gè)別量的二氧化硅磁性顆粒與第二種介質(zhì)混合，其中二氧化硅磁性顆粒能可逆結(jié)合確定量的DNA靶物質(zhì)，從而形成二氧化硅磁性顆粒與第二種介質(zhì)中的DNA靶物質(zhì)的第二種復(fù)合物；e.通過施加外部磁場，從第一種介質(zhì)中除去第一種復(fù)合物，從第二種介質(zhì)中除去第二種復(fù)合物；f.從第一種復(fù)合物和第二種復(fù)合物中分別洗脫DNA靶物質(zhì)，從第一種復(fù)合物中產(chǎn)生分離的DNA靶物質(zhì)的第一種洗脫物，從第二種復(fù)合物中產(chǎn)生分離的DNA靶物質(zhì)的第二種洗脫物；g.確定第一種洗脫物和第二種洗脫物中DNA靶物質(zhì)的量。
39.權(quán)利要求38的方法，其中(c)步中提供的個(gè)別量的顆粒與(d)步中提供的個(gè)別量的顆粒數(shù)量相同。
40.一種從固體支持物中分離DNA靶物質(zhì)的方法，此方法包括將含有DNA靶物質(zhì)的固體支持物與離液鹽溶液在大約60℃-100℃的溫度下接觸，從而從固體支持物中分離至少一部分DNA靶物質(zhì)。
41.權(quán)利要求40的方法，其中固體支持物是紙。
42.權(quán)利要求40的方法，其中離液鹽溶液包含離液鹽和pH緩沖液。
43.權(quán)利要求40的方法，還包括分離確定量的DNA靶物質(zhì)的步驟，其是通過在分離的DNA靶物質(zhì)中加入個(gè)別量的二氧化硅磁性顆粒形成復(fù)合物；通過施加外部磁場從溶液中除去具有DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物；通過從復(fù)合物中洗脫DNA靶物質(zhì)而分離DNA靶物質(zhì)，從而獲得確定量的DNA靶物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了從介質(zhì)中的其它物質(zhì)中分離確定量的DNA靶物質(zhì)的方法。該方法可用已知量的含二氧化硅固體支持物如二氧化硅磁性顆粒進(jìn)行,所述固體支持物能可逆結(jié)合確定量的DNA靶物質(zhì),DNA靶物質(zhì)相對(duì)于該顆粒的結(jié)合量是過量的。本發(fā)明方法涉及在介質(zhì)和顆粒的混合物中形成二氧化硅磁性顆粒與DNA靶物質(zhì)的復(fù)合物,用外部磁力從混合物中分離該復(fù)合物,然后可從該復(fù)合物洗脫DNA靶物質(zhì)。洗脫的DNA靶物質(zhì)的量可基于校準(zhǔn)模型確定。本發(fā)明方法使得分離在已知數(shù)量范圍內(nèi)的DNA靶物質(zhì)。本發(fā)明方法消除了在進(jìn)一步加工如擴(kuò)增、短串聯(lián)重復(fù)(STR)分析和DNA測序前定量所純化的生物樣品的步驟。DNA靶物質(zhì)的樣品可得自液體或固體介質(zhì),如液態(tài)血或紙。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1370230SQ00811856
公開日2002年9月18日 申請日期2000年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月20日
發(fā)明者艾倫·M·特雷巴, 雷克斯·M·比特納, 蘇珊·C·科勒, 克雷格·E·史密斯, 丹尼爾·D·凱法特, 史蒂文·J·?？县惱?申請人:普羅梅加公司