專利名稱：新化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸，這里指“CASB619多核苷酸，它們編碼的多肽(這里稱為“CASB619多肽”)、重組物質(zhì)以及它們的制備方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用這種多肽和多核苷酸包括治療癌癥特別是結(jié)腸癌和自身免疫病及其它相關(guān)病癥的方法。再一方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明提供的材料鑒定激動(dòng)劑和拮抗劑/抑制劑的方法，以及用鑒定的化合物治療與CASB619多肽失衡有關(guān)的病癥的方法。再一方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)與CASB619多肽活性或水平異常有關(guān)的病癥的診斷試驗(yàn)。
據(jù)信，本發(fā)明的多肽和多核苷酸是抗腫瘤的特異性預(yù)防或治療免疫的重要病原體，因?yàn)?，相?duì)于正常細(xì)胞，它們?cè)谀[瘤中特異性表達(dá)或高度過(guò)表達(dá)，因此，可以通過(guò)抗原特異性免疫機(jī)制被尋靶，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的破壞。它們也可以用來(lái)診斷腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)。此外，它們?cè)谀承┣闆r下的異常表達(dá)會(huì)引起自身免疫的誘導(dǎo)、異常免疫應(yīng)答，這可以通過(guò)使用相同的多肽或多核苷酸進(jìn)行免疫接種矯正。在這方面，最重要的生物活性是本發(fā)明多肽的抗原和免疫原活性。本發(fā)明的多肽也可以具有CASB619多肽的至少一種其它生物活性，這使之可以作為不同于免疫應(yīng)答的治療或預(yù)防干預(yù)的靶。
在本發(fā)明一方面涉及CASB619多肽。這種多肽包括含有以下氨基酸序列的分離多肽與SEQ ID NO2全長(zhǎng)序列至少有70％的同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性的氨基酸序列。這種多肽包括含有SEQ ID NO2的氨基酸的多肽。
本發(fā)明的多肽還包括其氨基酸序列與SEQ ID NO2全長(zhǎng)序列至少有70％的同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性的分離多肽。這種多肽包括SEQ ID NO2的多肽。
本發(fā)明的多肽還包括由包括SEQ ID NO1所含的序列的多核苷酸編碼的分離多肽。
本發(fā)明還提供CASB619多肽的一種免疫原性片段，即CASB619多肽的一個(gè)連續(xù)的部分，它與含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽具有相同或基本上相同的免疫原性活性。也就是說(shuō)，該片段(必要時(shí)可與一種載體偶聯(lián))能夠產(chǎn)生能識(shí)別CASB619多肽的免疫應(yīng)答。這種免疫原性片段可包括諸如缺少N-末端前導(dǎo)序列、跨膜區(qū)域或C-末端錨定區(qū)域的CASB619多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的CASB619的免疫原性片段基本上包括一種多肽的所有胞外結(jié)構(gòu)域，其中該多肽與SEQ ID NO2在SEQ ID NO2的整個(gè)長(zhǎng)度上至少有70％的同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性。
包括CASB619表位的肽片段一般包括SEQ ID NO2的至少7個(gè)，優(yōu)選9或10個(gè)連續(xù)氨基酸。優(yōu)選的表位示于SEQ ID NO5到SEQID NO68。
包括這些表位的肽是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面。與這些表位具有相同特性的模擬表位(mimotope)和含有產(chǎn)生與CASB619分子中的表位交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答的這些模擬表位的免疫原也是本發(fā)明的部分。
因此，本發(fā)明包括含有這些表位本身和其模擬表位的分離肽。模擬表位是指與天然CASB619表位足夠相似從而能夠被識(shí)別天然分子的抗體識(shí)別的實(shí)體；(Gheysen，H.M.等，1986，“作為抗原的合成肽”，Wiley，Chichester，Ciba基金研討會(huì)119，p130-149；Gheysen，H.M.，1986，Molecular Immunology，23，7，709-715)，或者是在與合適載體偶聯(lián)時(shí)能夠產(chǎn)生與天然分子交叉反應(yīng)的抗體的實(shí)體。
上述表位的肽模擬表位可通過(guò)添加、缺失或取代所選擇的氨基酸用于特別的目的。因此，本發(fā)明的肽可被修飾以易于與一種蛋白載體連接。例如，對(duì)于某些化學(xué)結(jié)合方法，表位中需要包括一個(gè)末端半胱氨酸。此外，對(duì)于肽與一種蛋白載體結(jié)合，需要包括一個(gè)遠(yuǎn)離肽結(jié)合末端的疏水末端，使肽的未結(jié)合的游離末端保持與載體蛋白表面的結(jié)合。這降低了肽的構(gòu)象自由度，使肽更有可能呈現(xiàn)與肽在整個(gè)天然分子結(jié)構(gòu)中具有的構(gòu)象非常相似的構(gòu)象。例如，肽可被修改成具有一個(gè)N末端半胱氨酸和一個(gè)C末端疏水的酰胺化尾巴。另外，可以進(jìn)行一種或多種氨基酸的D立體異構(gòu)體的添加或取代，來(lái)制備一種有用的衍生物，用來(lái)例如增強(qiáng)肽的穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，這些修飾肽或模擬表位可以是全部或部分非肽的模擬表位，其中組成的殘基不限于20種天然氨基酸。此外，可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)使之環(huán)化，從而限制肽的構(gòu)象，使之類似于肽序列在整個(gè)分子中時(shí)的形狀。環(huán)化肽的優(yōu)選方法包括加入一對(duì)半胱氨酸殘基以形成二硫橋。
并且，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，本發(fā)明的模擬表位或免疫原可以大于上述表位，因而可以包括本文公開的序列。因此，本發(fā)明的模擬表位可以通過(guò)在一個(gè)或兩個(gè)末端加入一定數(shù)目其它天然殘基的N和/或C末端延伸來(lái)形成。肽模擬表位也可以是天然序列的反向序列，其序列方向相反；或者序列可以全部或至少部分由D-立體異構(gòu)體氨基酸組成(反轉(zhuǎn)序列，inverso sequence)。并且，肽序列也可以是反向反轉(zhuǎn)序列，其中序列方向是相反的，氨基酸是D-立體異構(gòu)體形式。這些反向或反向-反轉(zhuǎn)肽的優(yōu)勢(shì)是其為非自身的，因此可以克服免疫系統(tǒng)中的自身耐受問(wèn)題。
此外，肽模擬表位可通過(guò)諸如噬菌體顯示技術(shù)(EP 0 552 267 B1)使用能與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體來(lái)鑒定。這種技術(shù)產(chǎn)生大量的模擬天然肽的結(jié)構(gòu)的肽序列，這些肽序列因此能夠結(jié)合抗天然肽的抗體，但不一定與天然多肽具有明顯的序列同源性。這種方法的顯著優(yōu)勢(shì)是可以鑒定具有較強(qiáng)免疫原特性的肽，或可以克服使用天然肽序列時(shí)可能出現(xiàn)的潛在自身抗原耐受問(wèn)題。此外，該技術(shù)根據(jù)識(shí)別的模擬表位序列中的共有化學(xué)特性可以鑒定各個(gè)天然肽的識(shí)別特征。
肽與免疫原性載體的共價(jià)偶聯(lián)可以按本領(lǐng)域眾所周知的方式進(jìn)行。因此，例如對(duì)于直接共價(jià)偶聯(lián)，可以利用碳二亞胺、戊二醛或N-[γ-馬來(lái)酰丁酰氧]琥珀酰亞胺酯，利用常用商用異源雙功能接頭，如CDAP和SPDP(按照廠商說(shuō)明)。偶聯(lián)反應(yīng)后，免疫原可以通過(guò)透析法、凝膠過(guò)濾法和分級(jí)分離法等方便地除去并純化。
用于本發(fā)明免疫原的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。載體的功能是提供細(xì)胞因子輔助，以便幫助誘導(dǎo)抗肽的免疫應(yīng)答?？捎糜诒景l(fā)明的載體的非限制性實(shí)例包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、滅活細(xì)菌毒素如破傷風(fēng)或白喉毒素(TT和DT)或其重組片段(如TT片段C的1區(qū)或DT的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū))或結(jié)核菌素的純化蛋白衍生物(PPD)?；蛘?，模擬表位或表位可以直接與脂質(zhì)體載體輟合，它還可以包括能夠提供T細(xì)胞輔助的免疫原。優(yōu)選模擬表位對(duì)載體的比例為1∶1到20∶1，優(yōu)選每個(gè)載體負(fù)載3-15個(gè)肽。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的載體是流感嗜血桿菌的蛋白D(EP 0 594 610 B1)。蛋白D是流感嗜血桿菌的IgD結(jié)合蛋白，已由Forsgren申請(qǐng)專利(WO 91/18926，授權(quán)號(hào)EP 0 594 610 B1)。在某些情況下，例如重組免疫原表達(dá)系統(tǒng)中，可能需要使用蛋白D的片段，例如蛋白D 1/3rd(包括蛋白D的N末端100到110個(gè)氨基酸(GB9717953.5))。
呈遞本發(fā)明肽的另一種優(yōu)選方法是在重組融合分子中。例如EP 0421 635 B介紹了使用嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原顆粒以病毒樣顆粒呈遞外源多肽。這樣，本發(fā)明的免疫原可以包括在由乙肝病毒核心抗原組成的嵌合顆粒中呈遞的肽。此外，重組融合蛋白可以包括本發(fā)明的模擬表位和載體蛋白，如流感病毒NS1。對(duì)于組成本發(fā)明部分的任何重組表達(dá)蛋白，編碼這些免疫原的核酸可以也可以是本發(fā)明的一方面。
本發(fā)明中所用的肽可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的固相方法方便地合成。合適的合成可以利用T-boc或F-boc方法進(jìn)行。環(huán)化肽可以在全自動(dòng)儀器中利用眾所周知的F-moc方法和聚酰胺樹脂通過(guò)固相法合成?；蛘撸绢I(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道人工進(jìn)行該方法必需的實(shí)驗(yàn)室步驟。固相合成的技術(shù)和方法可參見“固相肽合成實(shí)用方法”，E.Atherton和R.C.Sheppard，牛津大學(xué)出版社IRL出版(1989)?；蛘?，肽可以通過(guò)重組方法制備，包括在細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)編碼模擬表位的核酸分子，然后純化表達(dá)的模擬表位。重組表達(dá)肽和蛋白的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知技術(shù)，可參見Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)。
本發(fā)明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是一種較大蛋白如前體或融合蛋白的一部分。通常優(yōu)選包括含有分泌或前導(dǎo)序列、前序列、能協(xié)助純化的序列如多組氨酸殘基，或能在重組制備過(guò)程中起穩(wěn)定作用的額外序列。而且，還考慮到加入外源性多肽或脂類尾巴或多核苷酸序列以增加最終分子的免疫原性能力。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及遺傳工程制備的可溶性融合蛋白，這種融合蛋白含有本發(fā)明的一種多肽或其片段以及各亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的各種部分。優(yōu)選的是，免疫球蛋白是人IgG特別是IgG1的恒定區(qū)部分，而融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分可簡(jiǎn)單地通過(guò)引入一個(gè)切割序列而去除，這種切割序列可用血凝因子Xa切割。而且，本發(fā)明涉及通過(guò)遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及涉及它們?cè)谒幬锖Y選、診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面還涉及編碼這種融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的例子可在國(guó)際專利申請(qǐng)Nos.WO94/29458和WO94/22914中發(fā)現(xiàn)。
蛋白質(zhì)可通過(guò)化學(xué)方法接合，或以重組融合蛋白的形式表達(dá)，這種融合蛋白形式能以較非融合蛋白高的水平在一種表達(dá)系統(tǒng)中制備。融合配體可幫助提供T輔助表位(免疫性融合配體)，優(yōu)選的是能被人識(shí)別的T輔助表位；或者能幫助蛋白比原來(lái)的重組蛋白以較高產(chǎn)量進(jìn)行表達(dá)的T輔助表位(表達(dá)增強(qiáng)子)。融合配體優(yōu)選既是一種免疫性融合配體，又是表達(dá)增強(qiáng)子配體。
融合配體包括來(lái)自流感嗜血桿菌的蛋白D和來(lái)自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血凝素)。另一種融合配體是被稱為L(zhǎng)ytA的蛋白。優(yōu)選使用該分子的C末端部分。LytA來(lái)自肺炎鏈球菌，它合成一種N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶---LytA酰胺酶(由lytA基因編碼{《基因》43(1986)265-272頁(yè)})，后者是一種自溶素，它特異性地降解肽聚糖骨架中的某些鍵。LytA蛋白的C末端區(qū)域負(fù)責(zé)與膽堿或某些膽堿類似物如DEAE的親和性。這種特性已被用于發(fā)展能用于融合蛋白表達(dá)的大腸桿菌C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。在其氨基端含有C-LytA片段的雜合蛋白的純化已經(jīng)有介紹{《生物技術(shù)》10卷(1992)795-798頁(yè)}。可以使用LytA分子中在C末端發(fā)現(xiàn)的重復(fù)部分，從殘基178開始，例如殘基188-305。
本發(fā)明還包括前面提到的多肽的變體，即通過(guò)保守性氨基酸取代與參照物不同的多肽，其中一種殘基被另一種具有相似特征的殘基取代。典型的這種取代在如下氨基酸之間Ala、Val、Leu和Ile；Ser和Thr；酸性殘基Asp和Glu；Asn和Gln；堿性殘基Lys和Arg；或芳族殘基Phe和Tyr。特別優(yōu)選的是其中幾個(gè)、5-10、1-5、1-3、1-2或1個(gè)氨基酸以任何組合方式置換、缺失或增加的變體。
本發(fā)明的多肽可以任何合適的方式進(jìn)行制備。這種多肽包括分離的天然產(chǎn)生的多肽、重組制備的多肽、合成制備的多肽、或用這些方法的組合制備的多肽。制備這種多肽的方法在本領(lǐng)域是熟知的。
另一方面，本發(fā)明涉及CASB619多核苷酸。這些多核苷酸包括含有編碼以下多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸這些多肽與SEQ IDNO2全長(zhǎng)氨基酸序列有至少70％同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性。具有至少97％的同一性的多肽是高度優(yōu)選的，而具有至少98-99％同一性的多肽是更加高度優(yōu)選的，具有至少99％同一性的多肽是最高度優(yōu)選的。這些多核苷酸包括含有編碼SEQ ID NO2的多肽的SEQ ID NO1所含的核苷酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明多核苷酸還包括含有與編碼SEQ ID NO2多肽的核苷酸序列的全部編碼區(qū)具有至少70％同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性的核苷酸序列的分離多核苷酸。具有至少97％的同一性的多核苷酸是高度優(yōu)選的，而具有至少98-99％同一性的多核苷酸是更加高度優(yōu)選的，具有至少99％同一性的多核苷酸是最高度優(yōu)選的。
本發(fā)明的多核苷酸還包括含有以下核苷酸序列的分離多核苷酸所述核苷酸序列與SEQ ID NO1全長(zhǎng)序列有至少70％同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性。具有至少97％的同一性的多核苷酸是高度優(yōu)選的，而具有至少98-99％同一性的多核苷酸是更加高度優(yōu)選的，具有至少99％同一性的多核苷酸是最高度優(yōu)選的。這些多核苷酸包括含有SEQ ID NO1多核苷酸的多核苷酸以及SEQ ID NO1的多核苷酸。這些多核苷酸可以插入合適的質(zhì)?；蛑亟M微生物載體中，用來(lái)免疫(參見例如Wolffet al.，Science 2471465-1468(1990)；Corr et al.，J.Exp.Med.1841555-1560(1996)；Doe et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.938578-8583(1996))。本發(fā)明還提供與上述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
本發(fā)明還提供CASB619多核苷酸片段，將其給予受試者時(shí)其具有與SEQ ID NO1的多核苷酸相同的免疫原特性。
本發(fā)明也提供編碼以上定義的CASB619多肽的免疫原性片段的多核苷酸。
SEQ ID NO1的核苷酸序列與人染色體1克隆RP4-641D22圖p13.1-13.3(入藏號(hào)AL157901)具有同源性。SEQ ID NO1的核苷酸序列是cDNA序列，包括編碼1013個(gè)氨基酸的SEQ ID NO2的多肽的序列(核苷酸1到3043)。編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列可以與SEQ ID NO1所含的多肽編碼序列相同，或者它可以是不同于SEQ ID NO1所含序列的序列，由于遺傳密碼的冗余(簡(jiǎn)并)，它也編碼SEQ ID NO2的多肽。SEQ ID NO2的多肽不與任何已知蛋白相關(guān)。
預(yù)期本發(fā)明優(yōu)選的多肽和多核苷酸也與其同源多肽和多核苷酸具有類似生物功能/特性。并且，本發(fā)明的優(yōu)選多肽、免疫片段和多核苷酸具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的至少一種活性。
本發(fā)明也涉及部分或其它不完整多核苷酸和多肽序列，它們?cè)诖_定相應(yīng)全長(zhǎng)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2序列前首先被鑒定。
因此，本發(fā)明一方面提供分離的多核苷酸，它(a)包括與SEQ ID NO3的全長(zhǎng)序列至少有70％的同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性的核苷酸序列；(b)具有與SEQ ID NO3的全長(zhǎng)序列至少有70％的同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性的核苷酸序列；(c)SEQ ID NO3的多核苷酸；或(d)編碼與SEQ ID NO4的全長(zhǎng)氨基酸序列至少有70％的同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性的多肽的核苷酸序列；以及SEQ ID NO3的多核苷酸。
本發(fā)明還提供一種多肽，它(a)包括與SEQ ID NO2的全長(zhǎng)序列至少有70％的同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性的氨基酸序列；(b)具有與SEQ ID NO2的全長(zhǎng)氨基酸序列至少有70％的同一性，優(yōu)選至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性的氨基酸序列；(c)包括SEQ ID NO4的氨基酸；和(d)是SEQ ID NO4的多肽；
以及由包括SEQ ID NO3所含序列的多核苷酸編碼的多肽。
SEQ ID NO3的核苷酸序列和其編碼的肽序列來(lái)自EST(已表達(dá)序列標(biāo)志)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在EST序列中不可避免有某些核苷酸序列閱讀錯(cuò)誤(見Adama，M.D.et al.，Nature 377(supp)3，1995)。因此，SEQ ID NO3的核苷酸序列和由其編碼的肽序列在序列準(zhǔn)確度方面有同樣的內(nèi)在限制。此外，SEQ ID NO3編碼的肽序列包括與最同源或結(jié)構(gòu)相似蛋白相同或密切同源和/或結(jié)構(gòu)極類似(如保守氨基酸差異)的區(qū)域。
本發(fā)明的多核苷酸可以使用標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選技術(shù)由人結(jié)腸癌細(xì)胞mRNA衍生cDNA文庫(kù)獲得(例如見Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1989)。本發(fā)明的多核苷酸也可以獲自基因組DNA文庫(kù)等天然來(lái)源或可以使用熟知的商用技術(shù)合成。
當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸用于重組生產(chǎn)本發(fā)明的多肽時(shí)，多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列本身；或與其它編碼序列位于同一讀框內(nèi)的成熟多肽編碼序列，其它編碼序列的例子為編碼一種前導(dǎo)或分泌序列、前-、原-或前原-蛋白的序列或其它任何肽部分。例如，可以編碼一種能促進(jìn)融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是一種6組氨酸肽，由pQE載體提供(Qiagen，Inc.)，見Gentz等《美國(guó)科學(xué)院院刊》86821-824，(1989)中的介紹；或是一種HA肽尾巴。該多核苷酸還可以含有非編碼5′和3′序列，如轉(zhuǎn)錄、非翻譯序列、剪接和聚腺苷化信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和序列穩(wěn)定mRNA的序列。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案包括編碼多肽變體的多核苷酸，所述變體包括SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中有幾個(gè)例如5到10、1到5、1到3、1到2或1個(gè)氨基酸殘基以任何組合方式置換、缺失或增加。
與SEQ ID NO1所含核苷酸序列相同或足夠相同的多核苷酸可以用作cDNA和基因組DNA的雜交探針或作為核酸擴(kuò)增(PCR)反應(yīng)的引物，以分離編碼本發(fā)明多肽的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆，并分離與SEQ ID NO1具有高序列相似性的其它基因(包括編碼來(lái)源于人的共生同源物(paralogs)和來(lái)自非人物種的直向同源物(orthologs)和共生同源物的基因)的cDNA和基因組克隆。一般，這些核苷酸序列與參照物序列70％相同，優(yōu)選80％相同，更優(yōu)選90％相同，最優(yōu)選95％相同。探針或引物一般包括至少15個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸，可以有至少50個(gè)核苷酸。特別優(yōu)選的探針有30到50個(gè)核苷酸。特別優(yōu)選的引物有20到25個(gè)核苷酸。具體而言，來(lái)源于同源動(dòng)物序列的多肽或多核苷酸可以用作免疫原，獲得對(duì)人基因交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸包括來(lái)源于非人物種的同源物可以通過(guò)包括以下步驟的方法獲得在嚴(yán)緊雜交條件下用具有SEQ ID NO1的序列或其片段的標(biāo)記探針篩選合適文庫(kù)；分離含有所述多核苷酸序列全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆。這種雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的嚴(yán)緊雜交條件包括42℃在含有如下成分的溶液中溫育過(guò)夜50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml的變性剪切鮭精DNA，接著在0.1x SSC中在約65℃時(shí)洗滌濾膜。因此，本發(fā)明也包括用具有SEQ ID NO1的序列或其片段的標(biāo)記探針在嚴(yán)緊雜交條件下篩選合適的文庫(kù)獲得的多核苷酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，在很多情況下，分離的cDNA序列是不完整的，其中缺少cDNA 5′末端的多肽編碼區(qū)。
對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，有幾種方法是可以使用和熟知的，可以用來(lái)獲得全長(zhǎng)DNAs或延伸短的DNAs，例如以cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法為基礎(chǔ)的方法(見諸如Frohman等，《美國(guó)科學(xué)院院刊》858998-9002，1988)。這種技術(shù)的最近修改，例如MarathonTM技術(shù)(Clontech Laboratories Inc.)，明顯簡(jiǎn)化了對(duì)較長(zhǎng)cDNAs的尋找。在MarathonTM技術(shù)中，cDNAs用從一種選擇的組織中抽提的mRNA制備，并在每個(gè)末端連上一種“接頭”序列。然后使用基因特異的和接頭特異的寡核苷酸組合進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)來(lái)擴(kuò)增“丟失”的DNA的5’末端。然后使用“巢式”引物重復(fù)PCR反應(yīng)，巢式引物即設(shè)計(jì)來(lái)與擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部退火的引物(通常為與接頭序列的3’退火的一種接頭特異性引物和與所選擇的基因序列的5’退火的一種基因特異性引物)。然后用DNA測(cè)序?qū)υ摲磻?yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過(guò)將產(chǎn)物直接與已有的DNA連接產(chǎn)生一個(gè)完整的序列，或者使用設(shè)計(jì)5’引物的新序列信息進(jìn)行一個(gè)單獨(dú)的全長(zhǎng)PCR，來(lái)構(gòu)建一個(gè)全長(zhǎng)的DNA。
本發(fā)明的重組多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法由包括表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程改造宿主細(xì)胞制備。因此，另一方面，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，涉及用該表達(dá)系統(tǒng)遺傳改造的宿主細(xì)胞，和通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可用于生產(chǎn)這些蛋白，利用衍生自本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA。
為進(jìn)行本發(fā)明的多肽的重組制備，宿主細(xì)胞可通過(guò)遺傳工程改造來(lái)整合本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)或其部分。將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞可通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)介紹的方法來(lái)完成，例如Davis等《分子生物學(xué)基本方法》(1986)和Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)。優(yōu)選的這種方法包括例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位(transvection)、顯微注射、陽(yáng)離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、劃痕接種、轟擊導(dǎo)入或感染。
優(yōu)選本發(fā)明的蛋白與反式硫氧還蛋白(TIT)共表達(dá)。與順式共表達(dá)相比，反式硫氧還蛋白共表達(dá)是優(yōu)選的，因?yàn)樗梢允箍乖袩o(wú)硫氧還蛋白，無(wú)需蛋白酶。硫氧還蛋白共表達(dá)使得本發(fā)明蛋白容易溶解。硫氧還蛋白共表達(dá)也對(duì)蛋白純化率、純化蛋白溶解性和質(zhì)量有顯著影響。
合適宿主的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母細(xì)胞和曲霉細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2和草地夜蛾Sf9的細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞。
可以使用多種表達(dá)系統(tǒng)，例如染色體、附加體和病毒衍生系統(tǒng)，例如由細(xì)菌質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的載體或由它們的組合物衍生的載體，例如由質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件衍生的載體，如粘粒和噬菌粒。表達(dá)系統(tǒng)可含有調(diào)節(jié)以及引起表達(dá)的控制區(qū)域。一般來(lái)說(shuō)，任何適合于維持、增殖或表達(dá)多核苷酸在宿主中產(chǎn)生多肽的系統(tǒng)或載體都可使用。合適的核苷酸序列可通過(guò)任何熟知的和常規(guī)的技術(shù)插入到表達(dá)系統(tǒng)中，例如Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(上文)中列出的技術(shù)?？蓪⒑线m的分泌信號(hào)整合到目標(biāo)多肽中，使翻譯蛋白分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中、周質(zhì)空間或胞外環(huán)境中。這些信號(hào)對(duì)多肽來(lái)說(shuō)可以是內(nèi)源性的，或者也可以是異源性的。
表達(dá)系統(tǒng)也可是一種重組的活微生物，例如一種病毒或細(xì)菌。目標(biāo)基因可插入到活的重組病毒或細(xì)菌的基因組中。接種和體內(nèi)感染這種活的載體將導(dǎo)致抗原的體內(nèi)表達(dá)和免疫應(yīng)答誘導(dǎo)。用于此目的的病毒和細(xì)菌是諸如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀禽痘病毒)、甲病毒(辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、微小RNA病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒)、皰疹病毒(水痘帶狀皰疹病毒等)、李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、BCG。這些病毒和細(xì)菌可以是毒性的、或用各種方法減毒來(lái)獲得一種活疫苗。這種活疫苗也是本發(fā)明的一個(gè)部分。
本發(fā)明的多肽可通過(guò)熟知的技術(shù)從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，這些技術(shù)包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選將金屬離子親和層析(IMAC)用于純化。當(dāng)多肽在胞內(nèi)合成、分離和/或純化過(guò)程中變性時(shí)，可使用熟知的用于蛋白重新折疊的技術(shù)再生活性構(gòu)象。
本發(fā)明的另一重要方面涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)、強(qiáng)化或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，包括用本發(fā)明的多肽或多核苷酸或其片段接種哺乳動(dòng)物，其量足以產(chǎn)生預(yù)防或治療癌癥和自身免疫病及相關(guān)病癥的抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明另一方面涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)、強(qiáng)化或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，包括通過(guò)指導(dǎo)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸體內(nèi)表達(dá)的載體或細(xì)胞給予本發(fā)明的多肽，從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物所述疾病的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面涉及一種免疫/疫苗制劑(組合物)，將其導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主時(shí)，誘導(dǎo)、強(qiáng)化或調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中針對(duì)本發(fā)明多肽的免疫應(yīng)答，其中組合物包括本發(fā)明的多肽或多核苷酸或本文定義的其免疫片段。疫苗制劑還可以包括合適的載體。因?yàn)槎嚯目梢栽谖钢薪到?，?yōu)選將其經(jīng)腸道外途徑給藥(如皮下、肌肉、靜脈內(nèi)或皮內(nèi)注射)。適于胃腸外給藥的制劑包括水性和非水性無(wú)菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抗菌劑和使制劑與接受者血液等滲的溶質(zhì)；以及可包含懸浮劑或增稠劑的水性和非水性無(wú)菌懸液。制劑可置于單劑量或多劑量的容器內(nèi)，例如密封的安瓶和小瓶，并可貯存于冷凍干燥的環(huán)境，只需在使用前加入無(wú)菌的液體載體。
本發(fā)明另一方面涉及體外誘導(dǎo)針對(duì)本發(fā)明多肽或多核苷酸或其片段或含有本發(fā)明多肽或多核苷酸的分子的免疫應(yīng)答，使用哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)細(xì)胞，將這些活化免疫細(xì)胞再輸入哺乳動(dòng)物以治療疾病。免疫系統(tǒng)細(xì)胞的活化可以通過(guò)在各種免疫調(diào)節(jié)分子存在或不存在時(shí)，體外溫育本發(fā)明的完整多肽或多核苷酸或含有本發(fā)明多肽或多核苷酸的分子實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)給予抗原呈遞細(xì)胞來(lái)免疫哺乳動(dòng)物，該抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)體外負(fù)荷本發(fā)明多肽或其部分或含有本發(fā)明多肽的分子被修飾，并以免疫原性途徑體內(nèi)給藥?；蛘?，抗原呈遞細(xì)胞可以用含有本發(fā)明多核苷酸或片段或含有本發(fā)明多核苷酸的載體體外轉(zhuǎn)染以表達(dá)相應(yīng)多肽，并以免疫原方式體內(nèi)給藥。
本發(fā)明的疫苗制劑也可包括佐劑系統(tǒng)，用來(lái)增強(qiáng)制劑的免疫原性。優(yōu)選佐劑系統(tǒng)優(yōu)先引發(fā)TH1型應(yīng)答。
免疫應(yīng)答大體上可分為兩個(gè)典型的種類，即體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(一般分別用起保護(hù)作用的抗體和細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制來(lái)區(qū)分)。這些應(yīng)答種類被稱為TH1型應(yīng)答(細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)和TH2型免疫應(yīng)答(體液應(yīng)答)。
典型的TH1型免疫應(yīng)答的特征是產(chǎn)生抗原特異的單元型限制的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和自然殺傷型細(xì)胞應(yīng)答。在小鼠中，TH1型應(yīng)答的特征通常是產(chǎn)生IgG2a亞型的抗體，而在人中，它們的對(duì)應(yīng)物是IgG1型抗體。TH2型免疫應(yīng)答的特征是產(chǎn)生廣譜的免疫球蛋白同種型，在小鼠中包括IgG1、IgA和IgM。
可以想象得到，這兩種類型的免疫應(yīng)答之后的驅(qū)動(dòng)力是細(xì)胞因子。高水平的TH1型細(xì)胞因子優(yōu)先誘導(dǎo)針對(duì)所給抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的TH2型細(xì)胞因子優(yōu)先誘導(dǎo)針對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答。
TH1和TH2型免疫應(yīng)答的區(qū)分不是絕對(duì)的。事實(shí)上，一個(gè)個(gè)體可以支持一種被描述為TH1優(yōu)勢(shì)或TH2優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。但是，通常方便地按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆中的介紹來(lái)考慮細(xì)胞因子的家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)，TH1和TH2細(xì)胞淋巴因子的不同分泌模式導(dǎo)致不同的功能特性?！睹庖邔W(xué)年鑒》7卷，145-173頁(yè))。通常，TH1型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ和IL-2細(xì)胞因子相關(guān)。其他通常直接與TH1型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)有關(guān)的細(xì)胞因子如IL-12不由T細(xì)胞產(chǎn)生。相反，TH2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有關(guān)。
已知特定的疫苗佐劑特別適合于刺激TH1或TH2型細(xì)胞因子應(yīng)答。疫苗接種或感染后免疫應(yīng)答的TH1∶TH2平衡的最佳指標(biāo)通常包括在體外用抗原再刺激后直接測(cè)量T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TH1或TH2細(xì)胞因子，和/或測(cè)量抗原特異的抗體應(yīng)答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，TH1型佐劑是在體外用抗原再刺激時(shí)優(yōu)先刺激分離的T細(xì)胞群體產(chǎn)生高水平的TH1型細(xì)胞因子和促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和與TH1型同種型相關(guān)的抗原特異的免疫球蛋白應(yīng)答產(chǎn)生的佐劑。
能夠優(yōu)先刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的佐劑在國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO94/00153和WO95/17209中介紹。
3 De-O-?；瘑瘟柞ｎ愔珹(3D-MPL)是一種這樣的佐劑。這可由GB2220211(Ribi)知道。它在化學(xué)上是3 De-O?；瘑瘟柞ｎ愔珹與4、5或6酰基鏈的混合物，并由Ribi Immunochem，Montana制造。3 De-O-?；瘑瘟柞ｎ愔珹的一種優(yōu)選形式在歐洲專利0 689 454(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公開。
3D-MPL顆粒優(yōu)選小到足以通過(guò)一個(gè)0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌(歐洲專利0 689 454)。
3D-MPL以每劑10μg-100μg，優(yōu)選是20-25μg的范圍存在，而抗原通常以每劑2-50μg的范圍存在。
另一個(gè)優(yōu)選的佐劑包含QS21，它是一種來(lái)自Quillaja SaponariaMolina的莖的Hplc純化的無(wú)毒組分。它可選地用來(lái)與3 De-O-?；瘑瘟柞ｎ愔珹(3D-MPL)混合，并可選地與一種載體一起使用。
制備QS21的方法在美國(guó)專利No.5,057,540中公開。
含有QS21的非反應(yīng)性的佐劑制劑在以前已有介紹(WO96/33739)。含有QS21和膽甾醇的這種制劑在與抗原一起配制時(shí)已顯示是成功的TH1刺激佐劑。
優(yōu)先刺激TH1型細(xì)胞應(yīng)答的進(jìn)一步的佐劑包括免疫調(diào)節(jié)性的寡核苷酸，例如非甲基化的CpG序列，如WO 96/02555中的公開。
不同TH1刺激性佐劑如上文所介紹的佐劑的組合也被認(rèn)為是能提供一種優(yōu)先刺激TH1型細(xì)胞應(yīng)答的佐劑。例如，QS21可與3D-MPL組合配制。OS21∶3D-MPL的比率通常為1∶10至10∶1，優(yōu)選為1∶5至5∶1，并且通常為大約1∶1。優(yōu)選的最佳組合范圍是2.5∶1至1∶1的3D-MPL∶QS21。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物還優(yōu)選含有一種載體。載體可以是一種水包油乳劑，或一種鋁鹽如磷酸鋁或氫氧化鋁。
水包油乳劑優(yōu)選包含一種可代謝的油，例如角鯊烯、α-生育酚和Tween 80。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物中的抗原與QS21和3D-MPL在這樣一種乳劑中組合。另外，該水包油乳劑可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛精。
在對(duì)人給藥時(shí)，疫苗中QS21和3D-MPL的范圍是每劑1μg-200μg，例如10-100μg，優(yōu)選是10μg-50μg。水包油通常含有2至10％的角鯊烯、2至10％的α-生育酚和0.3至3％的Tween 80。在以更穩(wěn)定的乳劑形式提供時(shí)，角鯊烯∶α-生育酚∶Tween 80的比例優(yōu)選相同或少于1。還可包含1％水平的Span85。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗優(yōu)選進(jìn)一步含有一種穩(wěn)定劑。
非毒性的水包油乳劑優(yōu)選在一種水載體中含有一種非毒性的油如角鯊?fù)榛蚪酋徬?、一種乳化劑如Tween 80。水載體可以是例如磷酸緩沖鹽水。
WO 95/17210中介紹了一種特別強(qiáng)有力的佐劑制劑，它含有在一種水包油乳劑中的QS21、3D-MPL和生育酚。
本發(fā)明還提供一種多價(jià)的疫苗組合物，它含有本發(fā)明的疫苗制劑以及其他抗原，特別是對(duì)治療癌癥、自身免疫疾病和相關(guān)病癥有用的抗原。這樣一種多價(jià)疫苗組合物可包括一種如前所述的TH1誘導(dǎo)型佐劑。
本發(fā)明也涉及多核苷酸和多肽作為診斷試劑的用途，多核苷酸為衍生自本發(fā)明的多核苷酸的引物形式，多肽為本發(fā)明的多肽特異的抗體或試劑形式。
血液或組織中能夠檢測(cè)癌發(fā)生途徑極早期變化的遺傳或生化標(biāo)志的鑒定可以幫助確定患者的最佳治療。替代腫瘤標(biāo)志如多核苷酸表達(dá)可用于診斷癌癥的不同形式和狀態(tài)。鑒定本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)水平可以用來(lái)區(qū)分癌癥的階段并對(duì)癌組織的性質(zhì)分級(jí)。區(qū)分癌癥階段是監(jiān)測(cè)癌癥的進(jìn)展，根據(jù)在活組織檢查區(qū)域是否存在惡性組織來(lái)確定。本發(fā)明的多核苷酸通過(guò)鑒定癌癥侵襲性標(biāo)志如在體內(nèi)不同區(qū)域的存在，可以幫助完善區(qū)分階段的方法。癌癥分級(jí)表明腫瘤與其同類正常組織的近似程度，是由細(xì)胞形態(tài)和其它分化標(biāo)志來(lái)評(píng)定的。本發(fā)明的多核苷酸可以用來(lái)確定腫瘤級(jí)別，因?yàn)樗鼈兛梢詭椭_定腫瘤細(xì)胞的分化狀態(tài)。
診斷實(shí)驗(yàn)通過(guò)包括確定來(lái)自受試者的樣品中異常降低或增加的多肽或mRNA水平的方法的診斷，提供了診斷或確定對(duì)癌癥、自身免疫病和相關(guān)病癥的易感性的方法。該診斷方法已知是分化表達(dá)。比較病態(tài)組織和正常組織中特定基因的表達(dá)。兩種組織中多核苷酸相關(guān)基因、mRNA或蛋白在分子量、氨基酸或核苷酸序列或相對(duì)豐度方面的差異，表明在懷疑患病的人的組織中基因或調(diào)控它的基因的變化。
降低或增加的表達(dá)可以在RNA水平測(cè)定。首先從兩種組織中分離PolyA RNA，然后使用含有Poly A+mRNA的RNA印跡或任何其它直接或間接RNA檢測(cè)法，通過(guò)例如組織切片原位雜交、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR等，可以檢測(cè)相當(dāng)于差異表達(dá)的本發(fā)明多核苷酸的基因編碼的mRNA。與正常組織相比病態(tài)組織中給定RNA的表達(dá)增加或降低，表明轉(zhuǎn)錄本和/或表達(dá)的蛋白在疾病中起作用。因此，檢測(cè)到較正常組織高或低水平的相應(yīng)于SEQ ID NO1或3的mRNA表明在患者中存在癌癥。
樣品中mRNA表達(dá)水平可以通過(guò)產(chǎn)生來(lái)自樣品的已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)文庫(kù)來(lái)確定。在文庫(kù)中EST的相對(duì)出現(xiàn)可以用來(lái)評(píng)價(jià)在起始樣品中基因轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)出現(xiàn)。該EST分析實(shí)驗(yàn)可以與參考樣品的EST分析相比較，從而確定目標(biāo)多核苷酸的相對(duì)表達(dá)水平。
其它mRNA分析可以使用基因表達(dá)系列分析(SAGE)法(Velculescu et al.，Science(1995)270-484)、差示法(例如US5,776,683)或依賴于核苷酸相互作用特異性的雜交分析來(lái)進(jìn)行。
或者，比較可以在蛋白水平進(jìn)行。兩種組織中的蛋白大小可以使用抗體比較，在來(lái)自兩種組織的蛋白提取物的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)多肽。表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位也可以使用針對(duì)相應(yīng)蛋白的抗體免疫測(cè)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知其它可以用來(lái)測(cè)定來(lái)自一個(gè)宿主的樣品中的蛋白如本發(fā)明多肽水平的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。與正常組織相比病態(tài)組織中多肽表達(dá)水平升高或降低表明表達(dá)的表達(dá)可能與疾病有關(guān)。
在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，診斷可以通過(guò)測(cè)定SEQ ID NO1或3所示至少一個(gè)序列編碼的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平來(lái)確定。病態(tài)和正常組織中的mRNA或蛋白水平的比較也可以用來(lái)追蹤疾病進(jìn)程或消退。
樣品中的多種多核苷酸序列可以使用多核苷酸陣列分析。這些可用來(lái)揭示基因的差異表達(dá)并確定基因功能。例如，SEQ ID NO1或3的多核苷酸序列陣列可以用來(lái)確定正常和癌變組織中是否有任何多核苷酸表達(dá)差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以構(gòu)建含有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針陣列，以便有效篩選遺傳突變。陣列技術(shù)是眾所周知的，可以廣泛應(yīng)用，可以用來(lái)解決分子遺傳學(xué)中的多種問(wèn)題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳可變性(參見例如M.Chee et al.，Science，Vol 274，pp610-613(1996))。
“診斷”在本發(fā)明中包括確定受試者對(duì)疾病的易感性，確定受試者是否患病，以及確定患者的預(yù)后。
本發(fā)明還涉及進(jìn)行診斷實(shí)驗(yàn)的診斷試劑盒，它包括(a)本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選SEQ ID NO1或3的核苷酸序列或其片段；(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的多肽，優(yōu)選SEQ ID NO2或4的多肽或其片段；或(d)本發(fā)明多肽的抗體，優(yōu)選SEQ ID NO2或4的多肽的抗體。
本發(fā)明的核苷酸序列對(duì)染色體定位也有價(jià)值。該序列特異性靶向人染色體上特定位置并與其雜交。根據(jù)本發(fā)明對(duì)染色體相關(guān)序列的作圖是將這些序列與基因相關(guān)疾病聯(lián)系起來(lái)的重要第一步。序列被作圖到染色體上的準(zhǔn)確位置后，序列在染色體上的物理位置可以與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(lái)。這些數(shù)據(jù)可參見例如V.McKusick，MendelianInheritance in Man(通過(guò)Jhon Hopkins University Welch醫(yī)學(xué)圖書館在線獲得)。然后已經(jīng)被作圖的澳相同染色體區(qū)域的基因和疾病的關(guān)系可以通過(guò)連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)鑒定。也可以確定受影響和未受影響個(gè)體之間cDNA或基因組相鄰的差異。
本發(fā)明多肽和其片段或類似物或表達(dá)該多肽的細(xì)胞也可以用作免疫原，產(chǎn)生對(duì)本發(fā)明多肽免疫特異性的抗體?！懊庖咛禺愋浴笔侵缚贵w對(duì)本發(fā)明多肽的親和力明顯大于其對(duì)現(xiàn)有技術(shù)其它相關(guān)多肽的親和力。
本發(fā)明另一方面提供對(duì)本發(fā)明多肽或本文中限定的其免疫片段免疫特異性的抗體。優(yōu)選該抗體是單克隆抗體。
針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體也可以通過(guò)常規(guī)途徑向動(dòng)物優(yōu)選是非人動(dòng)物給予多肽或具有表位的片段、類似物或細(xì)胞獲得。為了制備單克隆抗體，提供通過(guò)連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的任何技術(shù)均可使用。實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.和Milstein，C.《自然》256495-497(1975))、三瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等《今日免疫學(xué)》472(1983))和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等《單克隆抗體和癌癥治療》，77-96頁(yè)，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
制備單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利No.4,946,778)可修改來(lái)制備針對(duì)本發(fā)明的多肽的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因鼠或其他生物體或動(dòng)物包括其他哺乳動(dòng)物也可用來(lái)表達(dá)人源化抗體。
上述抗體可以用來(lái)分離或鑒定表達(dá)多肽的克隆或通過(guò)親和層析純化多肽。本發(fā)明的抗體也可以用來(lái)防止或治療癌癥，特別是卵巢癌和結(jié)腸癌、自身免疫病和相關(guān)病癥。
本發(fā)明其它方面涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，包括用本發(fā)明的多肽接種哺乳動(dòng)物，其量足以產(chǎn)生保護(hù)或緩解疾病癥狀或進(jìn)程的抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一方面涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，包括通過(guò)體內(nèi)指導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸表達(dá)和編碼多肽的載體給予本發(fā)明的多肽，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體保護(hù)該動(dòng)物免于該疾病。
因此，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，本發(fā)明提供一種治療與CASB619多肽活性存在、過(guò)量或低下有關(guān)的異常病癥如癌癥和自身免疫病特別是卵巢癌和結(jié)腸癌的方法。
本發(fā)明還提供一種篩選化合物鑒定刺激或抑制CASB619多肽功能的化合物的方法。一般，激動(dòng)劑或拮抗劑可以用于上述疾病的治療和預(yù)防目的。可以從多種來(lái)源鑒定化合物，例如細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞制備物、化學(xué)文庫(kù)和天然產(chǎn)物化合物。這樣鑒定的激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑根據(jù)情況可以是多肽的天然或修飾底物、配體、受體、酶等；或者可以是其結(jié)構(gòu)或功能模擬物(見Coligan et al《當(dāng)代免疫學(xué)方法》1(2)第5章(1991))。篩選方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。其它篩選方法可參見例如D.Bennett et al.，J Mol Recognition，852-58(1995)；and K.Johanson et al.，J Biol Chem，270916)9459-9471(1995)及其中的參考文獻(xiàn)。
因此，本發(fā)明提供一種篩選方法以鑒定刺激或抑制本發(fā)明多肽功能的化合物，包括選自以下的方法(a)通過(guò)直接或間接與候選化合物結(jié)合的標(biāo)記，測(cè)定候選化合物對(duì)多肽(或負(fù)載多肽的細(xì)胞或膜)或其融合蛋白的結(jié)合；(b)在標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物的存在下測(cè)定候選化合物對(duì)多肽(或負(fù)載多肽的細(xì)胞或膜)或其融合蛋白的結(jié)合；(c)使用對(duì)負(fù)載多肽的細(xì)胞或細(xì)胞膜合適的檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)試候選化合物是否導(dǎo)致多肽活化或抑制產(chǎn)生的信號(hào)；(d)將候選化合物與含有權(quán)利要求1的多肽的溶液混合，形成混合物，測(cè)定混合物中多肽的活性，比較混合物與標(biāo)準(zhǔn)品的活性；或(e)使用如ELISA實(shí)驗(yàn)等測(cè)定候選化合物對(duì)細(xì)胞中編碼該多肽的mRNA和該多肽的產(chǎn)生的影響。
本發(fā)明的多肽可以用來(lái)通過(guò)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的受體結(jié)合技術(shù)鑒定膜結(jié)合或可溶的受體。熟知的篩選方法也可以用來(lái)鑒定競(jìng)爭(zhēng)與本發(fā)明多肽受體結(jié)合的本發(fā)明多肽的激動(dòng)劑和拮抗劑。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及鑒定本發(fā)明多肽的激動(dòng)劑、拮抗劑、配體、受體、底物、酶等或降低或提高這些多肽產(chǎn)生的化合物的篩選試劑盒，其包括(a)本發(fā)明的多肽；(b)表達(dá)本發(fā)明多肽的重組細(xì)胞；(c)表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞膜；或(d)本發(fā)明多肽的抗體；該多肽優(yōu)選是SEQ ID NO2的多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易意識(shí)到，本發(fā)明的多肽也可以用于基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)多肽激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑的方法，具體如下(a)首先確定多肽的三維結(jié)構(gòu)；
(b)推測(cè)激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑的類似反應(yīng)或結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)；(c)合成預(yù)期與推測(cè)的結(jié)合或反應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合或反應(yīng)的候選化合物；(d)測(cè)試候選化合物是否確實(shí)是激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑。
基因治療也可以用來(lái)影響通過(guò)受試者相關(guān)細(xì)胞的CASB619多肽的內(nèi)源產(chǎn)生?；蛑委煹母攀鰠⒁姟度祟惙肿舆z傳學(xué)》第20章基因治療和其它基于分子遺傳學(xué)的治療途徑(及其中的參考文獻(xiàn))，TStrachan和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。
疫苗制劑的一般描述見《藥物生物技術(shù)》61卷，疫苗設(shè)計(jì)-亞單位和佐劑途徑，Powell and Newman編，Plenum Press，1995。疫苗新趨勢(shì)和發(fā)展，Voller等編，University Park Press，Baltimore，Maryland，USA。包囊在脂質(zhì)體中可參見例如Fullerton美國(guó)專利4,235,877。蛋白輟合到大分子參見例如Likhite美國(guó)專利4,372,945和Armor等美國(guó)專利4,474,757。
選定每劑疫苗中蛋白量為在典型疫苗接受者中誘導(dǎo)免疫保護(hù)應(yīng)答而沒(méi)有明顯的副作用。這個(gè)量取決于使用的具體免疫原。一般，預(yù)期每劑含有1-1000μg蛋白，優(yōu)選2-100μg，最優(yōu)選4-40μg。特定疫苗的最適量可以通過(guò)涉及觀察抗體滴度和受試者中其它應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究確定。初始接種后，受試者一般在約4周內(nèi)接受加強(qiáng)免疫。
“分離的”表示“通過(guò)人工”改變其天然狀態(tài)，即如果“分離的”組合物或物質(zhì)在自然界中存在，則它已經(jīng)從其原始環(huán)境改變或取出或者已經(jīng)取出并改變。例如，在本文中使用該術(shù)語(yǔ)時(shí)，在活動(dòng)物體內(nèi)存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但已經(jīng)與天然狀態(tài)下共存的物質(zhì)分開的同樣多核苷酸或多肽就是“分離的”。
“多核苷酸”一般指任何聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，它可以是修飾或非修飾的RNA或DNA，包括單鏈和雙鏈區(qū)域。
“變體”指不同于參照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸變體的核苷酸序列與參照多核苷酸不同。變體核苷酸序列的變化可能改變或不改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改變可能導(dǎo)致參照序列編碼的多肽中氨基酸的置換、添加、缺失、融合和截短。一般多肽變體的氨基酸序列與參照多肽不同。通常，差異有限，因此參照多肽和變體的序列在總體上是極其近似的，在許多區(qū)域是相同的。變體和參照多肽在氨基酸序列上可以有任何組合形式的一個(gè)或多個(gè)置換、添加、缺失的區(qū)別。置換或插入的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，如等位變體，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽變體可以通過(guò)誘變技術(shù)或直接合成制備。
“同一性”如同本領(lǐng)域所熟知的，是兩種或多種多肽序列或兩種或多種多核苷酸序列之間的相關(guān)性，根據(jù)具體情況，可通過(guò)序列比較來(lái)確定。在本領(lǐng)域，“同一性”還指多肽或多核苷酸序列之間序列相關(guān)的程度，根據(jù)具體情況，可通過(guò)這些序列的鏈的匹配來(lái)確定。“同一性”可使用已知的方法方便地計(jì)算，包括但不限于(《計(jì)算分子生物學(xué)》，Lesk，A.M.編輯，Oxford University Press，New York，1988；《生物計(jì)算機(jī)信息和基因組計(jì)劃》Smith，D.W.編輯，Academic Press，New York，1993；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯，HumanaPress，New Jersey，1994；《分子生物學(xué)中的序列分析》von Heine，G.，Academic Press，1987；和《序列分析引物》Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，《SIAM J.Applied Math》481073(1988)。測(cè)定同一性的方法被設(shè)計(jì)來(lái)給出檢測(cè)序列之間的最大匹配。而且，測(cè)定同一性的方法在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中編碼。用來(lái)測(cè)定兩種序列之間的同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.等《核酸研究》12(1)387(1984)、BLASTP、BLASTN(Altschul，S.F.等《分子生物學(xué)雜志》215403-410(1990)以及FASTA(Pearson和Lipman《美國(guó)科學(xué)院院刊》852444-2448(1988)。BLAST程序家族可從NCBI和其他來(lái)源獲得(《BLAST手冊(cè)》Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等《分子生物學(xué)雜志》215403-410(1990)。著名的Smith Waterman算法也可用來(lái)測(cè)定同一性。
優(yōu)選使用的算法是FASTA。使用該算法進(jìn)行多肽或多核苷酸序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括以下缺口補(bǔ)償12缺口延伸補(bǔ)償4
單字大小2，最大6用其它方法進(jìn)行多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括以下1)算法Needleman和Wunsch，《分子生物學(xué)雜志》48443-453(1970)比較矩陣BLOSSUM62，見Henikoff和Henikoff，《美國(guó)科學(xué)院院刊》8910915-10919(1992)缺口補(bǔ)償12缺口長(zhǎng)度補(bǔ)償4使用這些參數(shù)的程序可以從Genetics Computer Group，Madison WI以“缺口”程序的形式獲得。上述參數(shù)是多肽比較的缺省參數(shù)(對(duì)末端缺口無(wú)補(bǔ)償)。
多核苷酸序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括以下1)算法Needleman和Wunsch，《分子生物學(xué)雜志》48443-453(1970)比較矩陣匹配＝+10，不匹配＝0缺口補(bǔ)償50缺口長(zhǎng)度補(bǔ)償3來(lái)源Genetics Computer Group，Madison WI的“缺口”程序。
使用這些參數(shù)的程序可以從Genetics Computer Group，Madison WI以“缺口”程序的形式獲得。上述參數(shù)是多核苷酸比較的缺省參數(shù)。
例如，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與SEQ ID NO1的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的核苷酸改變。這種改變可以選自至少一個(gè)核苷酸缺失、置換(包括轉(zhuǎn)換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5′或3′末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的核苷酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參照序列中。核苷酸改變的數(shù)量如下確定SEQ ID NO1中的總核苷酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQ ID NO1的總核苷酸數(shù)中減除，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO1中的核苷酸總數(shù)，y對(duì)70％來(lái)說(shuō)是0.70，對(duì)80％來(lái)說(shuō)是0.80，對(duì)85％來(lái)說(shuō)是0.85，對(duì)90％來(lái)說(shuō)是0.90，對(duì)95％來(lái)說(shuō)是0.95，依此類推，其中如xn和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再?gòu)膞n中減除。編碼SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸的改變可能在該編碼序列中產(chǎn)生無(wú)義、錯(cuò)義或移碼突變，因此改變后的多核苷酸編碼的多肽會(huì)發(fā)生變化。
類似地，本發(fā)明的多肽序列可以與SEQ ID NO2的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的氨基酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個(gè)氨基酸缺失、置換(包括保守和非保守置換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多肽序列的氨基或羧基末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的氨基酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參照序列中。同一性百分?jǐn)?shù)一定時(shí)氨基酸改變的數(shù)量如下確定SEQ IDNO2中的總氨基酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQ ID NO2的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa-(xa·y)其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為SEQ ID NO2的總氨基酸數(shù)，y值在70％時(shí)為0.70，在80％時(shí)為0.80，在85％時(shí)為0.85，依此類推，其中若xa和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再?gòu)膞a中減除。
“同系物”是本領(lǐng)域的通用術(shù)語(yǔ)，表示與目標(biāo)序列具有高度序列相關(guān)性的多核苷酸或多肽序列。這種相關(guān)性可以通過(guò)確定以上所述待比較的序列之間的同一性和/或類似性程度來(lái)定量。屬于該通用術(shù)語(yǔ)范圍內(nèi)的術(shù)語(yǔ)是“直向同源物”和“共生同源物”，前者是其它物種中多核苷酸或多肽的功能等價(jià)物的多核苷酸或多肽，后者是指在相同物種內(nèi)考慮時(shí)的功能類似序列。
實(shí)施例實(shí)時(shí)RT-PCR(U.Gibson，1996.Genome Research6,996)用來(lái)比較來(lái)自多個(gè)患者的相應(yīng)的腫瘤和正常結(jié)腸組織中候選抗原mRNA轉(zhuǎn)錄本的豐度。此外，一系列正常組織中候選基因的mRNA水平也通過(guò)該方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
正常和癌變結(jié)腸總RNA使用TriPure試劑(Boehringer)由速凍活檢樣品中提取。正常組織總RNA購(gòu)自InVitrogen或使用TriPure試劑由速凍活檢樣品中提取。DNA酶處理后使用oligo-dT磁性珠(Dynal)從總RNA中純化PolyA+mRNA。使用SybrII染料(MolecularProbes)通過(guò)分光熒光測(cè)定法(VersaFluor，BioRad)進(jìn)行mRNA的定量。實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的引物采用Perkin-Elmer Primer Express軟件使用TaqMan擴(kuò)增條件的缺省選擇設(shè)計(jì)。
實(shí)時(shí)反應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR方法組合，每一反應(yīng)使用2ng純化mRNA。實(shí)時(shí)檢測(cè)時(shí)加入SybrI染料(Molecular Probes)至最終稀釋度為1/75000。擴(kuò)增(40個(gè)循環(huán))和實(shí)時(shí)檢測(cè)在Perkin-Elmer BiosystemsPE7700系統(tǒng)中使用常規(guī)儀器設(shè)置進(jìn)行。Ct值使用PE7700序列測(cè)定軟件計(jì)算。獲得每一個(gè)患者的兩個(gè)Ct值腫瘤Ct(CtT)和相應(yīng)正常結(jié)腸Ct(CtN)。實(shí)時(shí)PCR獲得的Ct值與靶模板拷貝數(shù)是對(duì)數(shù)-線性相關(guān)。因?yàn)樵诔Ｒ?guī)實(shí)驗(yàn)條件下PCR擴(kuò)增的效率與理論擴(kuò)增效率接近，由2(CtN-CtT)可估計(jì)兩種組織中相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平(即腫瘤中mRNA過(guò)表達(dá)倍數(shù))。對(duì)24個(gè)患者的活檢樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。計(jì)算每個(gè)患者的mRNA過(guò)表達(dá)水平。然后由該數(shù)據(jù)集計(jì)算候選抗原的平均mRNA過(guò)表達(dá)水平和患者過(guò)表達(dá)候選抗原的比例。單個(gè)值相對(duì)相同樣品中的肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化(比例)，如

圖1所示。該值為1相當(dāng)于與肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平相同。結(jié)果以對(duì)數(shù)標(biāo)尺示出。
代表28種不同組織的48個(gè)正常組織樣品也通過(guò)同樣方法測(cè)定。候選抗原的Ct值與相同組織樣品中獲得的肌動(dòng)蛋白的值比較。結(jié)果相對(duì)于肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，示于圖2。
結(jié)腸癌/正常結(jié)腸樣品中的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果總結(jié)
結(jié)論相對(duì)于鄰近正常結(jié)腸，CASB619在67％結(jié)腸癌樣品中過(guò)表達(dá)，平均水平為近200倍。正常組織中的表達(dá)限于其它消化道組織以及主要的氣管和睪丸。
目前產(chǎn)生DNA微陣列技術(shù)的實(shí)例包括1)Affymetrix“基因芯片(GeneChip)”陣列，其中寡核苷酸使用光能無(wú)機(jī)圖形法(photolithographicprocess)在芯片表面合成2) DNA斑點(diǎn)技術(shù)，其中少量DNA溶液通過(guò)機(jī)器人沉積然后固定在固相表面(如玻璃)。兩種情形下，芯片均以自目標(biāo)組織(如正常組織、腫瘤等)中提取的cDNA或cRNA雜交并以放射活性或以熒光報(bào)告分子標(biāo)記。標(biāo)記的材料與芯片雜交，結(jié)合在芯片上各個(gè)序列的探針的量使用特制的掃描儀確定。實(shí)驗(yàn)可以使用單熒光報(bào)告分子(或放射活性)進(jìn)行，或者可以用兩種報(bào)告分子進(jìn)行。后一種情形下，兩種樣品中的每一個(gè)均以一種報(bào)告分子標(biāo)記。兩種標(biāo)記樣品然后競(jìng)爭(zhēng)與DNA芯片上的序列雜交。確定芯片上每個(gè)序列的兩種熒光信號(hào)的比例。該比例用來(lái)計(jì)算兩種樣品中轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度。詳細(xì)方法可獲自多種來(lái)源，包括“DNA微陣列實(shí)用方法，SchenaM.Oxford University Press 1999”和互聯(lián)網(wǎng)(http//cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html，http//arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/)和特定銷售商(如Affymetrix)實(shí)施例3EST圖譜對(duì)實(shí)驗(yàn)抗原組織表達(dá)鑒定的補(bǔ)充途徑是探測(cè)人“已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)”數(shù)據(jù)庫(kù)。EST是由特定組織或細(xì)胞系提取的多種mRNA制備的cDNA的小片段。這些數(shù)據(jù)庫(kù)目前提供來(lái)自數(shù)百種cDNA組織文庫(kù)包括各類腫瘤組織和疾病狀態(tài)的大量EST(106)。通過(guò)檢索工具(Blast)，進(jìn)行CASB616序列的比較檢索，以便進(jìn)一步探索組織表達(dá)。
CASB619的EST分布
總之，與CASB619匹配的93％EST來(lái)源于腫瘤組織、牛組織或正常生殖器官。這表明該基因在該組織的表達(dá)更常見。
實(shí)施例4RNA-DNA印跡分析通過(guò)Advantage PCR(見上)擴(kuò)增限定量的混合腫瘤和相應(yīng)的正常結(jié)腸cDNA。多個(gè)正常組織的信使RNA也使用相同的方法擴(kuò)增。擴(kuò)增的cDNA(1μg)在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。該膜與用候選TAA cDNA片段制備的探針雜交(AlkPhos DirectSystem)。RNA-DNA分析提供了轉(zhuǎn)錄本大小、剪接變體存在和腫瘤和正常組織中轉(zhuǎn)錄本豐度的信息。
實(shí)施例5RNA印跡分析RNA印跡使用1μg polyA+mRNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備。放射活性探針使用Ready-to-Go系統(tǒng)(Pharmacia)制備。
實(shí)施例6鑒定全長(zhǎng)cDNA序列結(jié)腸癌cDNA文庫(kù)使用λZap II系統(tǒng)(Stratagene)由5微克polyA+mRNA構(gòu)建。按照提供的方法，但在逆轉(zhuǎn)錄步驟使用SuperscriptII(LifeTechnologies)。構(gòu)建Oligo-dT引發(fā)的和隨機(jī)引發(fā)的文庫(kù)。篩選每一文庫(kù)時(shí)涂布約1.5×106獨(dú)立噬菌體。嗜菌斑轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，與用AlkPhos Direct標(biāo)記的cDNA探針雜交。陽(yáng)性噬菌體通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。由瓊脂平板上切下陽(yáng)性噬菌體，在500微升SM緩沖液中洗脫，通過(guò)基因特異性PCR證實(shí)。洗脫的噬菌體通過(guò)體內(nèi)切除轉(zhuǎn)變成單鏈M13噬菌體。噬菌體然后通過(guò)感染大腸桿菌轉(zhuǎn)變成雙鏈質(zhì)粒DNA。感染的細(xì)菌鋪板，然后用cDNA探針進(jìn)行第二輪篩選。由陽(yáng)性細(xì)菌克隆純化質(zhì)粒DNA并對(duì)雙鏈測(cè)序。當(dāng)全長(zhǎng)基因不能直接由cDNA文庫(kù)獲得時(shí)，缺失的序列使用RACE技術(shù)分離(Marathon Kit，ClonTech)。該方法依賴于逆轉(zhuǎn)錄mRNA成雙鏈cDNA，將接頭連接到cDNA的末端，并使用基因特異性引物和一個(gè)接頭寡核苷酸擴(kuò)增所需cDNA的末端。Marathon PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)質(zhì)粒(pCRII-TOPO)中并測(cè)序。
獲得的序列(SEQ ID NO1)具有一個(gè)1013氨基酸的推測(cè)開放讀框(SEQ ID NO2)。對(duì)推測(cè)的蛋白序列進(jìn)行了細(xì)胞定位預(yù)測(cè)計(jì)算(PSORThttp//psort.nibb.ac.jp/and TopPredhttp//www.biokemi.su.se/～sever/toppred2/toppred_source.html)。CASB619似乎具有肽信號(hào)，和一到三個(gè)跨膜區(qū)(低置信度預(yù)測(cè))。未發(fā)現(xiàn)其它基元或結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例77.1腫瘤特異性抗原的表達(dá)和純化在微生物宿主中的表達(dá)或體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)被用于產(chǎn)生用作疫苗目的的本發(fā)明抗原，或產(chǎn)生通過(guò)免疫組織化學(xué)鑒定天然表達(dá)蛋白所需的抗體的快速純化和生成或進(jìn)一步純化所需的蛋白片段或完整蛋白。
重組蛋白可在兩種微生物宿主大腸桿菌和酵母(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)中表達(dá)。這可以選擇對(duì)于特定抗原產(chǎn)生最有利特性的表達(dá)系統(tǒng)。一般，重組抗原將在大腸桿菌中表達(dá)，試劑蛋白在酵母中表達(dá)。
表達(dá)策略首先涉及重組抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)。一般，表達(dá)融合配偶體(EFP)被置于N末端，以提高表達(dá)水平，在N末端還可以包括用來(lái)調(diào)節(jié)抗原的免疫原特性的區(qū)域、免疫融合配偶體(IFP)。此外，親和用來(lái)幫助進(jìn)一步純化的融合配偶體(AFP)被置于C末端。
當(dāng)獲得了重組菌株，通過(guò)評(píng)價(jià)表達(dá)水平鑒定重組產(chǎn)物，通過(guò)分析粗提取物的行為預(yù)測(cè)蛋白的進(jìn)一步溶解性。
在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)后，通過(guò)SDS-PAGE分析全部提取物。重組蛋白在染色凝膠上顯色，使用特異性抗體通過(guò)蛋白印跡分析鑒定。
不同型式表達(dá)抗原的比較可以選擇出最有希望的候選者，它將用于進(jìn)一步純化和免疫分析。
純化方案使用重組蛋白中存在His親和尾時(shí)的常規(guī)方法。在典型的實(shí)驗(yàn)中，過(guò)濾破碎細(xì)胞，將無(wú)細(xì)胞提取物上樣到特異性保留重組蛋白的離子金屬親和層析(IMAC；Ni++NTA，來(lái)自Qiagen)上。
保留的蛋白通過(guò)磷酸緩沖液中的0-500mM咪唑梯度(可能存在變性劑)洗脫。
7.2抗體制備和免疫組織化學(xué)少量相對(duì)純化的蛋白可被用于產(chǎn)生免疫工具，以便a)通過(guò)正?；虬┌Y組織切片的免疫組織化學(xué)檢測(cè)表達(dá)；b)檢測(cè)表達(dá)并在純化過(guò)程中跟蹤蛋白(ELISA/蛋白印跡)；或c)鑒定/定量純化蛋白(ELISA)。
7.2.1多克隆抗體免疫用100μg蛋白通過(guò)肌肉內(nèi)途徑免疫2-3只兔子3次，每次間隔3周，蛋白配制在佐劑3D-MPL/QS21中。每次免疫3周后取血樣，使用作為包被抗原的蛋白按照標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)ELISA測(cè)定血清中的抗體滴度。
ELISA96孔微量板(maxisorb Nunc)用5μg蛋白4℃包被過(guò)夜。37℃用PBS NCS 1％飽和1小時(shí)后，加入兔血清的系列稀釋液(1/10開始)，37℃ 1H 30。PBS Tween洗滌3次后，加入抗兔生物素化抗血清(Amersham)(1/5000)。洗滌平板，加入過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的鏈親和素(1/5000)，37℃ 30分鐘。洗滌后，加入50μl TMB(BioRad)7分鐘，然后用硫酸終止反應(yīng)。在450nm測(cè)定OD，通過(guò)SoftmaxPro計(jì)算中點(diǎn)稀釋度。
7.2.2單克隆抗體免疫用5μg純化蛋白以3周的間隔免疫5只BALB/c小鼠3次。第2次后14天和第3次后1周取血。以純化蛋白作為包被抗原通過(guò)Elisa測(cè)定血清。根據(jù)這些結(jié)果(中點(diǎn)稀釋度＞10000)，選擇1只小鼠用于融合。
融合/HAT選擇根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法使用PEG 40％和DMSO 5％將脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤融合。細(xì)胞接種96孔板，每孔2.5×104-105細(xì)胞，在HAT培養(yǎng)基上選擇抗性克隆。檢測(cè)雜交瘤的上清中特異性抗體的含量，如結(jié)果為陽(yáng)性，將雜交瘤進(jìn)行2輪有限稀釋。2輪篩選后，選擇3個(gè)雜交瘤用于腹水生成。
7.2.3免疫組織化學(xué)當(dāng)?shù)玫娇贵w后，在正常和癌變組織切片上進(jìn)行免疫染色，以便確定◇癌變與正常組織中本發(fā)明抗原水平或◇表達(dá)抗原的一定類型癌癥的比例◇如果其它癌癥類型也表達(dá)抗原◇在癌變組織中包括抗原的細(xì)胞的比例組織樣品制備切開后，組織樣品置于OCH化合物中的軟木盤中，在已在液氮(一160℃)中深度冷凍的異戊烷中速凍。將樣品保存在-70℃待用。在低溫室(-20℃、-30℃)中切出7-10μm切片。
染色組織切片在室溫干燥5分鐘，室溫下在丙酮中固定l0分鐘，再次干燥，用PBS 0.5％BSA 5％血清飽和。室溫下30分鐘后，使用抗原特異性抗體進(jìn)行直接或間接染色。直接染色特異性更好，但染色較弱，而間接染色染色更強(qiáng)，但特異性較差。
7.3針對(duì)本發(fā)明抗原的人細(xì)胞免疫應(yīng)答分析本發(fā)明抗原的免疫關(guān)聯(lián)可以通過(guò)體外引發(fā)人T細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)。所有T淋巴細(xì)胞系和樹突細(xì)胞來(lái)源于健康供體(優(yōu)選HLA-A2亞型)PBMC(外周血單核細(xì)胞)。HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠也用于篩選HLA-A2.1肽。
通過(guò)每周體外刺激產(chǎn)生和維持新發(fā)現(xiàn)的抗原特異性CD8+T細(xì)胞系。CD8細(xì)胞系針對(duì)抗原和抗原衍生肽的裂解活性和 IFN產(chǎn)生使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。
使用兩種策略產(chǎn)生抗原特異性CD8+T細(xì)胞基于肽的途徑和基于完整基因的途徑。兩種途徑均需要新發(fā)現(xiàn)抗原的全長(zhǎng)cDNA，以準(zhǔn)確讀框克隆在合適的傳遞系統(tǒng)中，或者用來(lái)預(yù)測(cè)HLA結(jié)合肽序列。
基于肽的途徑
HLA-A2結(jié)合肽序列太古Parker算法(Parker，K.C.，M.A.Bednarek，and J.E.Coligan.1994基于單獨(dú)肽側(cè)鏈的獨(dú)立結(jié)合將潛在HLA-A2結(jié)合肽分級(jí)的方案。免疫學(xué)雜志，152163和http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)或Rammensee方法(Rammensee，F(xiàn)riede，Stevanovic，MHC配體和肽基元表1，免疫遺傳學(xué)41，178-228，1995；Rammensee，Bachmann，StevanovicMHC配體和肽基元。Landes Bioscience 1997，和http134.2.96.221/scriptsh/laserver.dll/home.htm)。然后在HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠模型(Vitiello et al)中篩選肽。
a)預(yù)測(cè)的結(jié)合HLA A0201基因座的表位a.1)HLA-A*0201九聚體
°含有該亞序列的分子估計(jì)解離半時(shí)間a.2)HLA A02_01十聚體
°含有該亞序列的分子估計(jì)解離半時(shí)間HLA_A0205
HLA A0203
簡(jiǎn)而言之，用佐劑配制的HLA-A2肽免疫轉(zhuǎn)基因小鼠，不能誘導(dǎo)CD8應(yīng)答的肽(定義為有效裂解肽脈沖處理的自體同源脾細(xì)胞)在人系統(tǒng)中進(jìn)一步處理。
人樹突細(xì)胞(根據(jù)Romani等培養(yǎng))用肽脈沖處理并用于刺激CD8-分選的T細(xì)胞(Facs)。刺激幾周后，CD8細(xì)胞系首先在肽脈沖處理的自體同源BLCL(EBV-B轉(zhuǎn)化細(xì)胞系)上測(cè)試。為了確證肽的準(zhǔn)確體內(nèi)加工，CD8細(xì)胞系將在cDNA轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞(HLA-A2轉(zhuǎn)染的LnCaP，Skov3或CAMA腫瘤細(xì)胞)上測(cè)試。
基于全基因的途徑用基因槍轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B7.1轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞、重組痘病毒(Kim等)或腺病毒(Butterfield等)感染的樹突細(xì)胞引發(fā)和刺激CD8+T細(xì)胞系。病毒感染細(xì)胞可非常有效地呈遞抗原肽，因?yàn)榭乖愿咚奖磉_(dá)，但只能使用一次，以避免病毒T細(xì)胞系的過(guò)度生長(zhǎng)。
交替刺激后，CD8+細(xì)胞系在如上所述的cDNA轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系上測(cè)試。確定肽特異性和身份以證實(shí)免疫有效性。
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本申請(qǐng)書中引用的所有出版物和參考文獻(xiàn)，包括但不限于專利和專利申請(qǐng)，在這里都全文引入作為參考，如同它們各自都特別地和個(gè)別地在此全文列出。序列信息SEQ ID NO1atggctgagcctgggcacagccaccatctctccgccagagtcaggggaagaactgagaggcgcataccccggctgtggcggctgctgctctgggctgggaccgccttccaggtgacccagggaacgggaccggagcttcatgcctgcaaagagtctgagtaccactatgagtacacggcgtgtgacagcacgggttccaggtggagggtcgccgtgccgcataccccgggcctgtgcaccagcctgcctgaccccgtcaagggcaccgagtgctccttctcctgcaacgccggggagtttctggatatgaaggaccagtcatgtaagccatgcgctgagggccgctactccctcggcacaggcattcggtttgatgagtgggatgagctgccccatggctttgccagcctctcagccaacatggagctggatgacagtgctgctgagtccaccgggaactgtacttcgtccaagtgggttccccggggcgactacatcgcctccaacacggacgaatgcacagccacactgatgtacgccgtcaacctgaagcaatctggcaccgttaacttcgaatactactatccagactccagcatcatctttgagtttttcgttcagaatgaccagtgccagcccaatgcagatgactccaggtggatgaagaccacagagaaaggatgggaattccacagtgtggagctaaatcgaggcaataatgtcctctattggagaaccacagccttctcagtatggaccaaagtacccaagcctgtgctggtgagaaacattgccataacaggggtggcctacacttcagaatgcttcccctgcaaacctggcacgtatgcagacaagcagggctcctctttctgcaaactttgcccagccaactcttattcaaataaaggagaaacttcttgccaccagtgtgaccctgacaaatactcagagaaaggatcttcttcctgtaacgtgcgcccagcttgcacagacaaagattatttctacacacacacggcctgcgatgccaacggagagacacaactcatgtacaaatgggccaagccgaaaatctgtagcgaggaccttgagggggcagtgaagctgcctgcctctggtgtgaagacccactgcccaccctgcaacccaggcttcttcaaaaccaacaacagcacctgccagccctgcccatatggttcctactccaatggctcagactgtacccgctgccctgcagggactgaacctgctgtgggatttgaatacaaatggtggaacacgctgcccacaaacatggaaacgaccgttctcagtgggatcaacttcgagtacaagggcatgacaggctgggaggtggctggtgatcacatttacacagctgctggagcctcagacaatgacttcatgattctcactctggttgtgccaggatttagacctccgcagtcggtgatggcagacacagagaataaagaggtggccagaatcacatttgtctttgagaccctctgttctgtgaactgtgagctctacttcatggtgggtgtgaattctaggaccaacactcctgtggagacgtggaaaggttccaaaggcaaacagtcctatacctacatcattgaggagaacactaccacgagcttcacctgggccttccagaggaccacttttcatgaggcaagcaggaagtacaccaatgacgttgccaagatctactccatcaatgtcaccaatgttatgaatggcgtggcctcctactgccgtccctgtgccctagaagcctctgatgtgggctcctcctgcacctcttgtcctgctggttactatattgaccgagattcaggaacctgccactcctgcccccctaacacaattctgaaagcccaccagccttatggtgtccaggcctgtgtgccctgtggtccagggaccaagaacaacaagatccactctctgtgctacaatgattgcaccttctcacgcaacactccaaccaggactttcaactacaacttctccgctttggcaaacaccgtcactcttgctggagggccaagcttcacttccaaagggttgaaatacttccatcactttaccctcagtctctgtggaaaccagggtaggaaaatgtctgtgtgcaccgacaatgtcactgacctccggattcctgagggtgagtcagggttctccaaatctatcacagcctacgtctgccaggcagtcatcatccccccagaggtgacaggctacaaggccggggtttcctcacagcctgtcagccttgctgatcgacttattggggtgacaacagatatgactctggatggaatcacctccccagctgaacttttccacctggagtccttgggaataccggacgtgatcttcttttataggtccaatgatgtgacccagtcctgcagttctgggagatcaaccaccatccgcgtcaggtgcagtccacagaaaactgtccctggaagtttgctgctgccaggaacgtgctcagatgggacctgtgatggctgcaacttccacttcctgtgggagagcgcggctgcttgcccgctctgctcagtggctgactaccatgctatcgtcagcagctgtgtggctgggatccagaagactacttacgtgtggcgagaacccaagctatgctctggtggcatttctctgcctgagcagagagtcaccatctgcaaaaccatagatttctggctgaaagtgggcatctctgcaggcacctgtactgccatcctgctcaccgtcttgacctgctacttttggaaaaagaatcaaaaactagagtacaagtactccaagctggtgatgaatgctactctcaaggactgtgacctgccagcagctgacagctgcgccatcatggaaggcgaggatgtagaggacgacctcatctttaccagcaagaagtcactctttgggaagatcaaatcatttacctccaagaggactcctgatggatttgactcagtgccgctgaagacatcctcaggaggcccagacatggacctgtgaGAGGCACTGCCTGCCTCACCTGCCTCCTCACCTTGCATAGCACCTTTGCAAGCCTGCGGCGATTTGGGTGCCAGCATCCTGCAACACCCACTGCTGGAAATCTCTTCATTGTGGCCTTATCAGATGTTTGAATTTCAGATCTTTTTTTATAGAGTACCCAAACCCTCCTTTCTGCTTGCCTCAAACCTGCCAAATATACCCACACTTTGTTTGTAAAAaaaAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ ID 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序列表<110>Smithkline Beecham Biologicals S.A.
<120>新化合物<130>BC45226<160>68<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>3280<212>DNA<213>人<400> 1atggctgagc ctgggcacag ccaccatctc tccgccagag tcaggggaag aactgagagg 60cgcatacccc ggctgtggcg gctgctgctc tgggctggga ccgccttcca ggtgacccag120ggaacgggac cggagcttca tgcctgcaaa gagtctgagt accactatga gtacacggcg180tgtgacagca cgggttccag gtggagggtc gccgtgccgc ataccccggg cctgtgcacc240agcctgcctg accccgtcaa gggcaccgag tgctccttct cctgcaacgc cggggagttt300ctggatatga aggaccagtc atgtaagcca tgcgctgagg gccgctactc cctcggcaca360ggcattcggt ttgatgagtg ggatgagctg ccccatggct ttgccagcct ctcagccaac420atggagctgg atgacagtgc tgctgagtcc accgggaact gtacttcgtc caagtgggtt480ccccggggcg actacatcgc ctccaacacg gacgaatgca cagccacact gatgtacgcc540gtcaacctga agcaatctgg caccgttaac ttcgaatact actatccaga ctccagcatc600atctttgagt ttttcgttca gaatgaccag tgccagccca atgcagatga ctccaggtgg660atgaagacca cagagaaagg atgggaattc cacagtgtgg agctaaatcg aggcaataat720gtcctctatt ggagaaccac agccttctca gtatggacca aagtacccaa gcctgtgctg780gtgagaaaca ttgccataac aggggtggcc tacacttcag aatgcttccc ctgcaaacct840ggcacgtatg cagacaagca gggctcctct ttctgcaaac tttgcccagc caactcttat900tcaaataaag gagaaacttc ttgccaccag tgtgaccctg acaaatactc agagaaagga960tcttcttcct gtaacgtgcg cccagcttgc acagacaaag attatttcta cacacacacg1020gcctgcgatg ccaacggaga gacacaactc atgtacaaat gggccaagcc gaaaatctgt1080agcgaggacc ttgagggggc agtgaagctg cctgcctctg gtgtgaagac ccactgccca1140ccctgcaacc caggcttctt caaaaccaac aacagcacct gccagccctg cccatatggt1200tcctactcca atggctcaga ctgtacccgc tgccctgcag ggactgaacc tgctgtggga1260tttgaataca aatggtggaa cacgctgccc acaaacatgg aaacgaccgt tctcagtggg1320atcaacttcg agtacaaggg catgacaggc tgggaggtgg ctggtgatca catttacaca1380gctgctggag cctcagacaa tgacttcatg attctcactc tggttgtgcc aggatttaga1440cctccgcagt cggtgatggc agacacagag aataaagagg tggccagaat cacatttgtc1500tttgagaccc tctgttctgt gaactgtgag ctctacttca tggtgggtgt gaattctagg1560accaacactc ctgtggagac gtggaaaggt tccaaaggca aacagtccta tacctacatc1620attgaggaga acactaccac gagcttcacc tgggccttcc agaggaccac ttttcatgag1680gcaagcagga agtacaccaa tgacgttgcc aagatctact ccatcaatgt caccaatgtt1740atgaatggcg tggcctccta ctgccgtccc tgtgccctag aagcctctga tgtgggctcc1800tcctgcacct cttgtcctgc tggttactat attgaccgag attcaggaac ctgccactcc1860tgccccccta acacaattct gaaagcccac cagccttatg gtgtccaggc ctgtgtgccc1920tgtggtccag ggaccaagaa caacaagatc cactctctgt gctacaatga ttgcaccttc1980tcacgcaaca ctccaaccag gactttcaac tacaacttct ccgctttggc aaacaccgtc2040actcttgctg gagggccaag cttcacttcc aaagggttga aatacttcca tcactttacc2100ctcagtctct gtggaaacca gggtaggaaa atgtctgtgt gcaccgacaa tgtcactgac2160ctccggattc ctgagggtga gtcagggttc tccaaatcta tcacagccta cgtctgccag2220gcagtcatca tccccccaga ggtgacaggc tacaaggccg gggtttcctc acagcctgtc2280agccttgctg atcgacttat tggggtgaca acagatatga ctctggatgg aatcacctcc2340ccagctgaac ttttccacct ggagtccttg ggaataccgg acgtgatctt cttttatagg2400tccaatgatg tgacccagtc ctgcagttct gggagatcaa ccaccatccg cgtcaggtgc2460agtccacaga aaactgtccc tggaagtttg ctgctgccag gaacgtgctc agatgggacc2520tgtgatggct gcaacttcca cttcctgtgg gagagcgcgg ctgcttgccc gctctgctca2580gtggctgact accatgctat cgtcagcagc tgtgtggctg ggatccagaa gactacttac2640gtgtggcgag aacccaagct atgctctggt ggcatttctc tgcctgagca gagagtcacc2700atctgcaaaa ccatagattt ctggctgaaa gtgggcatct ctgcaggcac ctgtactgcc2760atcctgctca ccgtcttgac ctgctacttt tggaaaaaga atcaaaaact agagtacaag 2820tactccaagc tggtgatgaa tgctactctc aaggactgtg acctgccagc agctgacagc 2880tgcgccatca tggaaggcga ggatgtagag gacgacctca tctttaccag caagaagtca 2940ctctttggga agatcaaatc atttacctcc aagaggactc ctgatggatt tgactcagtg 3000ccgctgaaga catcctcagg aggcccagac atggacctgt gagaggcact gcctgcctca 3060cctgcctcct caccttgcat agcacctttg caagcctgcg gcgatttggg tgccagcatc 3120ctgcaacacc cactgctgga aatctcttca ttgtggcctt atcagatgtt tgaatttcag 3180atcttttttt atagagtacc caaaccctcc tttctgcttg cctcaaacct gccaaatata 3240cccacacttt gtttgtaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3280<210>2<211>1013<212>PRT<213>人<400> 2Met Ala Glu Pro Gly His Ser His His Leu Ser Ala Arg Val Arg Gly15 10 15Arg Thr Glu Arg Arg Ile Pro Arg Leu Trp Arg Leu Leu Leu Trp Ala20 25 30Gly Thr Ala Phe Gln Val Thr Gln Gly Thr Gly Pro Glu Leu His Ala35 40 45Cys Lys Glu Ser Glu Tyr His Tyr Glu Tyr Thr Ala Cys Asp Ser Thr50 55 60Gly Ser Arg Trp Arg Val Ala Val Pro His Thr Pro Gly Leu Cys Thr65 70 75 80Ser Leu Pro Asp Pro Val Lys Gly Thr Glu Cys Ser Phe Ser Cys Asn85 90 95Ala Gly Glu Phe Leu Asp Met Lys Asp Gln Ser Cys Lys Pro Cys Ala100 105 110Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Gly Thr Gly Ile Arg Phe Asp Glu Trp Asp115 120 125Glu Leu Pro His Gly Phe Ala Ser Leu Ser Ala Asn Met Glu Leu Asp130 135 140Asp Ser Ala Ala Glu Ser Thr Gly Asn Cys Thr Ser Ser Lys Trp Val145 150 155 160Pro Arg Gly Asp Tyr Ile Ala Ser Asn Thr Asp Glu Cys Thr Ala Thr165 170 175Leu Met Tyr Ala Val Asn Leu Lys Gln Ser Gly Thr Val Asn Phe Glu180 185 190Tyr Tyr Tyr Pro Asp Ser Ser Ile Ile Phe Glu Phe Phe Val Gln Asn195 200 205Asp Gln Cys Gln Pro Asn Ala Asp Asp Ser Arg Trp Met Lys Thr Thr210 215 220Glu Lys Gly Trp Glu Phe His Ser Val Glu Leu Asn Arg Gly Asn Asn225 230 235 240Val Leu Tyr Trp Arg Thr Thr Ala Phe Ser Val Trp Thr Lys Val Pro245 250 255Lys Pro Val Leu Val Arg Asn Ile Ala Ile Thr Gly Val Ala Tyr Thr260 265 270Ser Glu Cys Phe Pro Cys Lys Pro Gly Thr Tyr Ala Asp Lys Gln Gly275 280 285Ser Ser Phe Cys Lys Leu Cys Pro Ala Asn Ser Tyr Ser Asn Lys Gly290 295 300Glu Thr Ser Cys His Gln Cys Asp Pro Asp Lys Tyr Ser Glu Lys Gly305 310 315 320Ser Ser Ser Cys Asn Val Arg Pro Ala Cys Thr Asp Lys Asp Tyr Phe325 330 335Tyr Thr His Thr Ala Cys Asp Ala Asn Gly Glu Thr Gln Leu Met Tyr340 345 350Lys Trp Ala Lys Pro Lys Ile Cys Ser Glu Asp Leu Glu Gly Ala Val355 360 365Lys Leu Pro Ala Ser Gly Val Lys Thr His Cys Pro Pro Cys Asn Pro370 375 380Gly Phe Phe Lys Thr Asn Asn Ser Thr Cys Gln Pro Cys Pro Tyr Gly385 390 395 400Ser Tyr Ser Asn Gly Ser Asp Cys Thr Arg Cys Pro Ala Gly Thr Glu405 410 415Pro Ala Val Gly Phe Glu Tyr Lys Trp Trp Asn Thr Leu Pro Thr Asn420 425 430Met Glu Thr Thr Val Leu Ser Gly Ile Asn Phe Glu Tyr Lys Gly Met435 440 445Thr Gly Trp Glu Val Ala Gly Asp His Ile Tyr Thr Ala Ala Gly Ala450 455 460Ser Asp Asn Asp Phe Met Ile Leu Thr Leu Val Val Pro Gly Phe Arg465 470 475 480Pro Pro Gln Ser Val Met Ala Asp Thr Glu Asn Lys Glu Val Ala Arg485 490 495Ile Thr Phe Val Phe Glu Thr Leu Cys Ser Val Asn Cys Glu Leu Tyr500 505 510Phe Met Val Gly Val Asn Ser Arg Thr Asn Thr Pro Val Glu Thr Trp515 520 525Lys Gly Ser Lys Gly Lys Gln Ser Tyr Thr Tyr Ile Ile Glu Glu Asn530 535 540Thr Thr Thr Ser Phe Thr Trp Ala Phe Gln Arg Thr Thr Phe His Glu545 550 555 560Ala Ser Arg Lys Tyr Thr Asn Asp Val Ala Lys Ile Tyr Ser Ile Asn565 570 575Val Thr Asn Val Met Asn Gly Val Ala Ser Tyr Cys Arg Pro Cys Ala580 585 590Leu Glu Ala Ser Asp Val Gly Ser Ser Cys Thr Ser Cys Pro Ala Gly595 600 605Tyr Tyr Ile Asp Arg Asp Ser Gly Thr Cys His Ser Cys Pro Pro Asn610 615 620Thr Ile Leu Lys Ala His Gln Pro Tyr Gly Val Gln Ala Cys Val Pro625 630 635 640Cys Gly Pro Gly Thr Lys Asn Asn Lys Ile His Ser Leu Cys Tyr Asn645 650 655Asp Cys Thr Phe Ser Arg Asn Thr Pro Thr Arg Thr Phe Asn Tyr Asn660 665 670Phe Ser Ala Leu Ala Asn Thr Val Thr Leu Ala Gly Gly Pro Ser Phe675 680 685Thr Ser Lys Gly Leu Lys Tyr Phe His His Phe Thr Leu Ser Leu Cys690 695 700Gly Asn Gln Gly Arg Lys Met Ser Val Cys Thr Asp Asn Val Thr Asp705 710 715 720Leu Arg Ile Pro Glu Gly Glu Ser Gly Phe Ser Lys Ser Ile Thr Ala725 730 735Tyr Val Cys Gln Ala Val Ile Ile Pro Pro Glu Val Thr Gly Tyr Lys740 745 750Ala Gly Val Ser Ser Gln Pro Val Ser Leu Ala Asp Arg Leu Ile Gly755 760 765Val Thr Thr Asp Met Thr Leu Asp Gly Ile Thr Ser Pro Ala Glu Leu770 775 780Phe His Leu Glu Ser Leu Gly Ile Pro Asp Val Ile Phe Phe Tyr Arg785 790 795 800Ser Asn Asp Val Thr Gln Ser Cys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Thr Ile805 810 815Arg Val Arg Cys Ser Pro Gln Lys Thr Val Pro Gly Ser Leu Leu Leu820 825 830Pro Gly Thr Cys Ser Asp Gly Thr Cys Asp Gly Cys Asn Phe His Phe835 840 845Leu Trp Glu Ser Ala Ala Ala Cys Pro Leu Cys Ser Val Ala Asp Tyr850 855 860His Ala Ile Val Ser Ser Cys Val Ala Gly Ile Gln Lys Thr Thr Tyr865 870 875 880Val Trp Arg Glu Pro Lys Leu Cys Ser Gly Gly Ile Ser Leu Pro Glu885 890 895Gln Arg Val Thr Ile Cys Lys Thr Ile Asp Phe Trp Leu Lys Val Gly900 905 910Ile Ser Ala Gly Thr Cys Thr Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu Thr Cys915 920 925Tyr Phe Trp Lys Lys Asn Gln Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Ser Lys Leu930 935 940Val Met Asn Ala Thr Leu Lys Asp Cys Asp Leu Pro Ala Ala Asp Ser945 950 955 960Cys Ala Ile Met Glu Gly Glu Asp Val Glu Asp Asp Leu Ile Phe Thr965 970 975Ser Lys Lys Ser Leu Phe Gly Lys Ile Lys Ser Phe Thr Ser Lys Arg980 985 990Thr Pro Asp Gly Phe Asp Ser Val Pro Leu Lys Thr Ser Ser Gly Gly995 10001005Pro Asp Met Asp Leu1010<210>3<211>677<212>DNA<213>人<400> 3ttttttaatt tacaaacaaa gtgtgggtat atttggcagg tttgaggcaa gcagaaagga60gggtttgggt actctataaa aaaagatctg aaattcaaac atctgataag gccacaatga 120agagatttcc agcagtgggt gttgcaggat gctggcaccc aaatcgccgc acgttgcaaa 180ggtgctatgc aaggtgagga ggcaggtgag gcaggcagtg cctctcacag gtccatgtct 240gggcctcctg aggatgtctt cagcggcact gagtcaaatc catcaggagt cctcttggag 300gtaaatgatt tgatcttccc aaagagtgac ttcttgctgg taaagatgag gtcgtcctct 360acatcctcgc cttccatgat ggcgcagtgt cagctgctgg caggtcacag tccttgagag 420tagcattcat caccagcttg gagtacttgt actctagttt ttgattcttt ttccaaaagt 480agcaggtcaa gacggtgagc aggatggcag tacaggtgcc tgcagagatg cccactttca 540gccagaaatc tatggttttg cagatggtga ctctctgctc aggcagagaa atgccaccag 600agcatagctt gggttctcgc cacacgtaag tagtcttctg gatcccagcc acacagctgc 660tgacgatagc atggtag 677<210>4<211>105<212>PRT<213>人<400>4Tyr His Ala Ile Val Ser Ser Cys Val Ala Gly Ile Gln Lys Thr Thr15 10 15Tyr Val Trp Arg Glu Pro Lys Leu Cys Ser Gly Gly Ile Ser Leu Pro20 25 30Glu Gln Arg Val Thr Ile Cys Lys Thr Ile Asp Phe Trp Leu Lys Val35 40 45Gly Ile Ser Ala Gly Thr Cys Thr Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu Thr50 55 60Cys Tyr Phe Trp Lys Lys Asn Gln Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Ser Lys65 70 75 80Leu Val Met Asn Ala Thr Leu Lys Asp Cys Asp Leu Pro Ala Ala Asp85 90 95Thr Ala Pro Ser Trp Lys Ala Arg Met100 105<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>5Arg Leu Trp Arg Leu Leu Leu Trp Ala1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列
<400>6Ser Leu Ala Asp Arg Leu Ile Gly Val1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>7Ser Leu Pro Glu Gln Arg Val Thr Ile1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>8Lys Leu Cys Ser Gly Gly Ile Ser Leu1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>9Ala Ala Ala Cys Pro Leu Cys Ser Val1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>10Ser Ala Leu Ala Asn Thr Val Thr Leu1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>11Phe Val Phe Glu Thr Leu Cys Ser Val1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>12Glu Leu Pro His Gly Phe Ala Ser Leu1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>13Leu Ile Phe Thr Ser Lys Lys Ser Leu1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>14Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Ser Lys Leu1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>15Lys Thr Ile Asp Phe Trp Leu Lys Val1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>16Ser Val Ala Asp Tyr His Ala Ile Val1 5<210>17<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>17Leu Leu Leu Pro Gly Thr Cys Ser Asp1 5<210>18<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>18Ala Leu Ala Asn Thr Val Thr Leu Ala1 5<210>19<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>19Thr Leu Cys Ser Val Asn Cys Glu Leu1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>20Asn Thr Asp Glu Cys Thr Ala Thr Leu1 5
<210>21<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>21Ser Leu Pro Asp Pro Val Lys Gly Thr1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>22Ser Leu Phe Gly Lys Ile Lys Ser Phe1 5<210>23<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>23Cys Thr Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>24Ile Val Ser Ser Cys Val Ala Gly Ile1 5<210>25<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>25Lys Met Ser Val Cys Thr Asp Asn Val1 5<210>26<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>26Val Leu Val Arg Asn Ile Ala Ile Thr1 5<210>27<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>27Glu Leu Asn Arg Gly Asn Asn Val Leu1 5<210>28
<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>28Ala Thr Leu Met Tyr Ala Val Asn Leu1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>29Val Ala Val Pro His Thr Pro Gly Leu1 5<210>30<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>30Arg Leu Trp Arg Leu Leu Leu Trp Ala1 5<210>31<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>31Ser Ala Gly Thr Cys Thr Ala Ile Leu1 5<210>32<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>32Gly Ile Ser Leu Pro Glu Gln Arg Val1 5<210>33<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>33Lys Thr Val Pro Gly Ser Leu Leu Leu1 5<210>34<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>34Arg Leu Ile Gly Val Thr Thr Asp Met1 5<210>35<211>9<212>PRT
<213>人工序列<400>35Thr Leu Ala Gly Gly Pro Ser Phe Thr1 5<210>36<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>36Tyr Ile Ile Glu Glu Asn Thr Thr Thr1 5<210>37<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>37Ile Ala Ile Thr Gly Val Ala Tyr Thr1 5<210>38<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>38Val Thr Gln Gly Thr Gly Pro Glu Leu1 5<210>39<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>39Ser Leu Phe Gly Lys Ile Lys Ser Phe Thr1 5 10<210>40<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>40Ala Ile Val Ser Ser Cys Val Ala Gly Ile1 5 10<210>41<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>41Ser Ala Ala Ala Cys Pro Leu Cys Ser Val1 5 10<210>42<211>10<212>PRT<213>人工序列
<400>42His Leu Glu Ser Leu Gly Ile Pro Asp Val1 5 10<210>43<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>43Lys Ile Tyr Ser Ile Asn Val Thr Asn Val1 5 10<210>44<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>44Ser Leu Ala Asp Arg Leu Ile Gly Val Thr1 5 10<210>45<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>45Ile Leu Lys Ala His Gln Pro Tyr Gly Val1 5 10<210>46<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>46Val Met Ala Asp Thr Glu Asn Lys Glu Val1 5 10<210>47<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>47Leu Leu Trp Ala Gly Thr Ala Phe Gln Val1 5 10<210>48<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>48Gly Thr Cys Thr Ala Ile Leu Leu Thr Val1 5 10<210>49<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>49Ile Thr Ser Pro Ala Glu Leu Phe His Leu1 5 10<210>50<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>50Leu Ile Gly Val Thr Thr Asp Met Thr Leu1 5 10<210>51<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>51Thr Leu Pro Thr Asn Met Glu Thr Thr Val1 5 10<210>52<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>52Leu Met Tyr Lys Trp Ala Lys Pro Lys Ile1 5 10<210>53<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>53Asp Leu Ile Phe Thr Ser Lys Lys Ser Leu1 5 10<210>54<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>54Gly Leu Lys Tyr Phe His His Phe Thr Leu1 5 10<210>55<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>55Gly Thr Lys Asn Asn Lys Ile His Ser Leu1 5 10<210>56<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>56Ser Asp Asn Asp Phe Met Ile Leu Thr Leu1 5 10
<210>57<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>57Leu Val Arg Asn Ile Ala Ile Thr Gly Val1 5 10<210>58<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>58Gly Leu Cys Thr Ser Leu Pro Asp Pro Val1 5 10<210>59<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>59Thr Leu Lys Asp Cys Asp Leu Pro Ala Ala1 5 10<210>60<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>60Val Ile Phe Phe Tyr Arg Ser Asn Asp Val1 5 10<210>61<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>61Ser Ile Thr Ala Tyr Val Cys Gln Ala Val1 5 10<210>62<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>62Ser Val Cys Thr Asp Asn Val Thr Asp Leu1 5 10<210>63<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>63Ser Leu Cys Gly Asn Gln Gly Arg Lys Met1 5 10<210>64<211>10
<212>PRT<213>人工序列<400>64Asn Met Glu Thr Thr Val Leu Ser Gly Ile1 5 10<210>65<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>65Asn Ile Ala Ile Thr Gly Val Ala Tyr Thr1 5 10<210>66<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>66Gly Ile Arg Phe Asp Glu Trp Asp Glu Leu1 5 10<210>67<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>67Phe His Phe Leu Trp Glu Ser Ala Ala Ala1 5 10<210>68<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>68Phe Leu Trp Glu Ser Ala Ala Ala Cys1 權(quán)利要求
1.含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列與SEQ IDNO2的氨基酸序列的全長(zhǎng)序列具有至少70％的同一性。
2.權(quán)利要求1的分離多肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
3.權(quán)利要求1的分離多肽，含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO2的分離多肽。
5.含有權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的多肽的免疫原性片段的多肽，其中所述免疫原性片段的免疫原活性基本上與SEQ ID NO2的多肽相同。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽是更大融合蛋白的一部分。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽，與載體蛋白化學(xué)輟合。
8.編碼權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽的分離多核苷酸。
9.含有編碼與SEQ ID NO2的氨基酸序列的全長(zhǎng)序列具有至少70％同一性的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸或與該分離多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
10.含有與編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列的全部編碼區(qū)具有至少70％同一性的核苷酸序列的分離多核苷酸或與該分離多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
11.含有與SEQ ID NO1的核苷酸序列的全長(zhǎng)序列具有至少70％同一性的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸或與該分離多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
12.權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)限定的分離多核苷酸，其中同一性為至少95％。
13.一種分離的多核苷酸，選自(a)含有編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列的多核苷酸；(b)SEQ ID NO1的多核苷酸；和(c)通過(guò)在嚴(yán)緊雜交條件下用標(biāo)記探針篩選合適的文庫(kù)獲得的多核苷酸，所述探針具有SEQ ID NO1的序列或其片段，所述多核苷酸編碼一種與SEQ ID NO2的蛋白具有相似免疫原特性的蛋白，或者是與所述多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
14.含有權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的分離多核苷酸的表達(dá)載體或重組活微生物。
15.含有權(quán)利要求14的表達(dá)載體或權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的分離多核苷酸的宿主細(xì)胞。
16.生產(chǎn)權(quán)利要求1-7的多肽的方法，包括在足以產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞并由培養(yǎng)基中回收該多肽。
17.含有有效量的權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽和可藥用載體的疫苗。
18.含有有效量的權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的多核苷酸和可藥用載體的疫苗。
19.含有有效量的抗原呈遞細(xì)胞和可藥用載體的疫苗，所述細(xì)胞通過(guò)體外負(fù)載權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽而被修飾或在體外被遺傳修飾以表達(dá)權(quán)利要求1-7的多肽。
20.權(quán)利要求17-19任一項(xiàng)的疫苗，還包括TH-1誘導(dǎo)佐劑。
21.權(quán)利要求20的疫苗，其中TH-1誘導(dǎo)佐劑選自3D-MPL、QS21、QS21和膽固醇的混合物以及CpG寡核苷酸。
22.對(duì)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽或免疫片段免疫特異性的抗體。
23.鑒定刺激或抑制權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽功能的化合物的篩選方法，包括選自以下的方法(a)通過(guò)直接或間接與候選化合物結(jié)合的標(biāo)記，測(cè)定候選化合物與所述多肽(或負(fù)載該多肽的細(xì)胞或膜)或其融合蛋白的結(jié)合；(b)在標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物存在時(shí)，測(cè)定候選化合物與所述多肽(或負(fù)載該多肽的細(xì)胞或膜)或其融合蛋白的結(jié)合；(c)使用對(duì)負(fù)載該多肽的細(xì)胞或細(xì)胞膜合適的檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)定候選化合物是否導(dǎo)致該多肽激活或抑制產(chǎn)生的信號(hào)；(d)將候選化合物與含有權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽的溶液混合形成混合物，測(cè)定混合物中的多肽活性，比較混合物與標(biāo)準(zhǔn)品的活性；或(e)使用如ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定候選化合物對(duì)細(xì)胞中編碼所述多肽的mRNA和所述多肽的產(chǎn)生的影響。
24.通過(guò)免疫預(yù)防或治療治療受試者的方法，包括將權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的多核苷酸與哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的細(xì)胞體外溫育，體外誘導(dǎo)針對(duì)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的分子的免疫應(yīng)答，然后將這些活化的免疫細(xì)胞再輸入哺乳動(dòng)物中以治療疾病。
25.權(quán)利要求24的方法，其中治療是針對(duì)卵巢癌或結(jié)腸癌。
26.權(quán)利要求1-5的多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑。
27.一種化合物，其為(a)權(quán)利要求1-5的多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑；(b)權(quán)利要求8-13的分離多核苷酸；或(c)調(diào)節(jié)編碼權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列表達(dá)的核酸分子；其用于治療。
28.診斷受試者中與權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽活性或表達(dá)有關(guān)的疾病或?qū)膊〉囊赘行缘姆椒?，包括分析?lái)自該受試者的樣品中所述多肽的存在或其量。
29.診斷受試者中與權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的多核苷酸活性或表達(dá)有關(guān)的疾病或?qū)膊〉囊赘行缘姆椒?，包括分析?lái)自該受試者的樣品中所述多核苷酸的存在或其量。
30.診斷受試者中與權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽活性或表達(dá)有關(guān)的結(jié)腸癌或?qū)Y(jié)腸癌的易感性的方法，包括分析來(lái)自該受試者的樣品中所述多肽的存在或其量。
31.診斷受試者中與權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的多核苷酸活性或表達(dá)有關(guān)的疾病或?qū)膊〉囊赘行缘姆椒ǎǚ治鰜?lái)自該受試者的樣品中所述多核苷酸的存在或其量。
32.一種分離的多核苷酸，選自(a)含有與SEQ ID NO3的全長(zhǎng)序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的分離多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO3的多核苷酸的分離多核苷酸；(c)SEQ ID NO3的多核苷酸。
33.含有權(quán)利要求14的表達(dá)載體或重組活微生物的活疫苗組合物。
34.權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的多核苷酸在制備治療癌癥的藥物中的用途。
35.權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的多核苷酸在制備治療結(jié)腸癌的藥物中的用途。
36.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽在制備治療癌癥的藥物中的用途。
37.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽在制備治療結(jié)腸癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了CASB619多肽和多核苷酸以及通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了在診斷中應(yīng)用CASB619多肽和多核苷酸的方法,預(yù)防和治療癌癥,特別是卵巢癌和結(jié)腸癌,自身免疫病和相關(guān)病癥的疫苗。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1351661SQ00805597
公開日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月26日
發(fā)明者C·E·M·布魯克, J·-P·卡薩特, T·科切, C·維納爾斯丫德巴索爾斯 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司