專利名稱：將物質(zhì)導(dǎo)入到細(xì)胞中的方法以及該方法的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在體內(nèi)和體外將物質(zhì)導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物干細(xì)胞和/或先祖細(xì)胞中的方法，以及此類方法的應(yīng)用。
以前的研究表明，短的單鏈DNA能被各種培養(yǎng)的細(xì)胞迅速內(nèi)化(Bennett，R.M.，Gabor，G.T.and Merritt，M.M.，臨床研究雜志.76，2182-2190(1985)；Loke，S.L.，Stein，C.A.，Zhang，X.H.，Mori，K.，Nakanishi，M.，Subasinghe，C.，Cohen，J.S.and Neckers，L.M.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86，3474-3478(1989)；Yakubov，L.A.，Deeva，E.A.，Zarytova，V.F.，Ivanova，E.M.，Ryte，A.S.，Yurchenko，L.V.，and Vlassov，V.V.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86，6454-6458(1989)；Iversen，P.L，Zhu，S.，Meyer，A.，and Zon，G.，反義研究和開發(fā).，2，211-222(1992)；Wu-Pong，S.，Weiss，T.L.，and Hunt，C.A.藥物研究。9，1010-1017(1992)；Chan，T.M.，F(xiàn)ramton，G and Cameron，J.S.，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)。91，110-114(1993))。有報(bào)道在人白細(xì)胞中有介導(dǎo)DNA吸收和破壞的DNA受體((Bennet，R.M.，Gabor，G.T.and Merritt，M.M.臨床研究雜志。76，2182-2190(1985))。
但是，裸露的DNA，RNA和寡核苷酸在體內(nèi)通常是不能跨越細(xì)胞膜的(Boado，R.J.，Tsukamoto，H.and Pardrige，W.M.藥理科學(xué)雜志。87，1308-1315(1998))。因此，就有了幾種介導(dǎo)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相互作用的將DNA和可溶性載體，受體結(jié)構(gòu)或綴合物相互結(jié)合的策略(參見，WO 96/15811；WO 94/25608；Kato，Y.and Sugiyama，Y.Crit.Rev.Ther.Drug Carrier syst.14，287-331(1997))。
總的說來，退化或損傷之后的神經(jīng)元的替換不是哺乳動(dòng)物大腦的特征。因此，神經(jīng)元的喪失被認(rèn)為是持續(xù)的。已經(jīng)有了在海馬形成中的長(zhǎng)期的出生后顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)退化的描述(Altman，J.and Das，G.D.，J.Comp.Neurol.124319-335(1965)；Altman，J.and Das，G.D.，自然2141098-1101(1967)；Caviness，V.S.jr.，J.CompNeurol.151113-120(1973)；Gueneau，G.，Privat，A.，Drouet，J.，and Court，L.，神經(jīng)科學(xué)發(fā)展。5，345-358(1982)；Eckenhoff，M.F.and Rakic，P.，神經(jīng)科學(xué)雜志。8，2729-2747(1988))。最近已經(jīng)知道在成人中廣泛存在著細(xì)胞發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生(Eriksson，P.S.，Perfilieva，E.，Bjork-Eriksson，T.，Alborn，A.，Nordborg，C.，Peterson，D.A.，Gage，F(xiàn).H.，自然醫(yī)藥。41313-1317(1998)。
顆粒細(xì)胞層的新生的神經(jīng)元表達(dá)分化神經(jīng)元的標(biāo)記并有和分化的顆粒細(xì)胞相應(yīng)的表型特征(Kaplan，M.S.and Bell，D.H.，神經(jīng)科學(xué)雜志。41429-1441(1984)；Cameron，H.A.，Wooley，C.S.，McEwen，B.S.，andGould，E.，神經(jīng)科學(xué)。56337-344(1993)；Cameron，H.A.，Wooley，C.S.，and Gould，E.，大腦研究。611342-346(1993))。進(jìn)一步的，這些神經(jīng)元還在苔蘚纖維中形成了軸突并與它們?cè)诤ｑRCA3中的靶形成了突觸(Seki，T.and Arai，Y.，神經(jīng)科學(xué)雜志。132351-2358(1993)；Stanfiled，B.B.，and Trice，J.E.，實(shí)驗(yàn)大腦研究。72399-406(1988))。海馬和空間學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)(McNamara，R.K.，and Skelton，R.W.，大腦研究綜述。1833-49(1993))。加入N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑或去除腎上腺可以影響先祖細(xì)胞的增殖(Cameron，H.A.，and Gould，E.，神經(jīng)科學(xué)61203-209(1994)；Cameron，H.A.，Tanapat，P.，andGould，E.，神經(jīng)科學(xué)。823490-354(1998))。隨著年齡增加彈性下降，而最近的研究表明隨著年齡的增加先祖細(xì)胞的增殖下降了但并沒有徹底消失(Kuhn，H.，Dicknson-Anson，H.，and Gage，F(xiàn).H.，神經(jīng)科學(xué)。162027-2033(1996))。最近已經(jīng)將費(fèi)時(shí)費(fèi)力從組織培養(yǎng)物中或從成年嚙齒類大腦中分離得到的干細(xì)胞移植到了成年動(dòng)物的大腦中，其中干細(xì)胞分化成了有神經(jīng)元特征的細(xì)胞(Suhonen，J.O.，Peterson，D.A.，Ray，J.，and Gage，F(xiàn).H.，自然。383624-627(1996))?，F(xiàn)在還沒有已知的干細(xì)胞標(biāo)記可以用于從成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中快速分離干細(xì)胞。該事實(shí)限制了干細(xì)胞在人類中的治療用途。到現(xiàn)在為止，還依賴于間接的方法檢測(cè)干細(xì)胞，如在分裂細(xì)胞的細(xì)胞周期的S期摻入到基因組中的修飾的核苷酸。因此，可以用免疫化學(xué)的方法檢測(cè)后代的表型。這種鑒定先祖細(xì)胞的后代的方法的限制是這些細(xì)胞不在具有先祖或干細(xì)胞的特征，意味著這些細(xì)胞缺少自我更新和發(fā)育成神經(jīng)元，星行膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力。最近公開的其他的從嚙齒類中分離干細(xì)胞的策略 可以基于非選擇性的染料染色，用抗圍繞腦室(ventricle)的所有細(xì)胞都表達(dá)的網(wǎng)蛋白(nestin)的抗體進(jìn)行免疫分選，或用帶有選擇性標(biāo)記的基因的病毒進(jìn)行非選擇性感染(Johansson，C.B.，Momma，S.，Clarke，D.L.，Risling，M.，Lendahl，U.，F(xiàn)risen，J.，細(xì)胞。9625-34(1999))。所有的這些方法都不是很有效，因此不適合于從小的人組織樣品中快速分離干細(xì)胞。因此，很重要的一點(diǎn)是要鑒定有用的標(biāo)記或特征以便能快速的分離干細(xì)胞或先祖細(xì)胞用于治療目的如自體神經(jīng)移植。
本發(fā)明基于以不同的目的在先祖細(xì)胞和干細(xì)胞中使用該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，就可能不借助于如病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)DNA。本發(fā)明提供了在體外和體內(nèi)分離先祖細(xì)胞和干細(xì)胞的新的方法。該分離以含有cDNA的質(zhì)粒的表達(dá)和免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，其中所述cDNA的表達(dá)使選擇性標(biāo)記成為可能；或者以能使選擇性鑒定成為可能的蛋白的DNA的表達(dá)或以熒光蛋白的表達(dá)，包括FACS分選，為基礎(chǔ)。本發(fā)明還提供了新的將不同的物質(zhì)如藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到先祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞中的方法。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種將包含核酸的物質(zhì)導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞或先祖細(xì)胞中的方法，其特征在于所述核酸在體外直接和所述細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞膜內(nèi)成分相互作用，從而使包含核酸的物質(zhì)通過細(xì)胞內(nèi)在的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被細(xì)胞吸收。所述方法可以在體內(nèi)或體外施行。
該方法特別適于從成體大腦中分離先祖細(xì)胞或干細(xì)胞，用于基因治療，細(xì)胞分選和診斷。
通過下面的說明書和權(quán)利要求書，本發(fā)明的特征將更明顯。
與其他已知的基于DNA和可溶性載體的結(jié)合，受體結(jié)構(gòu)或綴合物(如DNA結(jié)合蛋白，聚L-賴氨酸和整合蛋白受體配體)介導(dǎo)的與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的相互作用的方法相比，本發(fā)明有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明不依賴于DNA和任何可溶性的受體或載體的結(jié)合。另一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)行細(xì)胞的選擇性標(biāo)記，原因在于只有具有上述的內(nèi)在的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。發(fā)明詳述本發(fā)明所基于的和從哺乳動(dòng)物大腦包括人大腦干細(xì)胞和先祖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，可被用于將單鏈或雙鏈DNA或RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中并隨后可以使DNA或RNA在細(xì)胞內(nèi)保持完整和不被降解。發(fā)現(xiàn)具有該機(jī)制的細(xì)胞是來自成體的神經(jīng)干細(xì)胞和先祖細(xì)胞。
利用該轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，可以將核酸插入到細(xì)胞中。
這些核酸能夠用于鑒定從而將先祖細(xì)胞和干細(xì)胞和其他細(xì)胞分離開來，或用于藥物目的。
如上所述，本發(fā)明涉及將包含核酸的物質(zhì)導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞或先祖細(xì)胞中的方法，其特征在于所述的核酸直接和細(xì)胞膜或細(xì)胞膜內(nèi)的成分相互作用，從而使包含核酸的物質(zhì)通過細(xì)胞內(nèi)在的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被細(xì)胞吸收。該方法可以在體內(nèi)或體外使用。本發(fā)明的方法中所使用的細(xì)胞優(yōu)選來自成體。
本發(fā)明的方法中將要導(dǎo)入到細(xì)胞中的物質(zhì)是或包括例如，單鏈或雙鏈的，線性或環(huán)狀的DNA，或單鏈或雙鏈的RNA。該物質(zhì)可以是融合分子，包括核酸部分和蛋白部分，或含有特定cDNA的表達(dá)載體。術(shù)語“表達(dá)載體”在本文中指所有的由含有特定肽或蛋白質(zhì)的cDNA的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的載體或質(zhì)粒。一旦干細(xì)胞或先祖細(xì)胞吸收了該表達(dá)載體，就將導(dǎo)致所述肽或蛋白的合成。
當(dāng)該物質(zhì)是表達(dá)載體時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，優(yōu)選該cDNA產(chǎn)生的蛋白或肽能活化所述細(xì)胞的增殖和/或分化和/或譜系確定。
如上所述，本發(fā)明的方法可以在體外如組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中使用或在體內(nèi)使用。當(dāng)在體內(nèi)使用該方法時(shí)，優(yōu)選將要被轉(zhuǎn)入物質(zhì)的細(xì)胞是中樞神經(jīng)細(xì)胞。
本發(fā)明的方法可以用于幾個(gè)不同的目的，如診斷和治療。
當(dāng)在體外使用該方法時(shí)，它特別適于鑒定先祖細(xì)胞或干細(xì)胞。當(dāng)將本發(fā)明的方法用于鑒定目的時(shí)，優(yōu)選該將要導(dǎo)入細(xì)胞中的物質(zhì)能產(chǎn)生可以探測(cè)的信號(hào)或產(chǎn)生能用于選擇性鑒定干細(xì)胞和先祖細(xì)胞的肽或蛋白質(zhì)。所述的肽或蛋白接著又產(chǎn)生可以探測(cè)的信號(hào)例如熒光蛋白或標(biāo)記蛋白。干細(xì)胞或先祖細(xì)胞的合適的標(biāo)記蛋白的實(shí)例是轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的蛋白成分如受體和載體。也可通過使用標(biāo)簽化的物質(zhì)如放射性的標(biāo)簽化的核酸得到可檢測(cè)的信號(hào)。
一直以來非常希望可以從樣品中鑒定和分離先祖細(xì)胞和干細(xì)胞，該樣品由例如從病人中取出的不同結(jié)構(gòu)或來自病人的細(xì)胞培養(yǎng)物組成。
一旦鑒定了干細(xì)胞或先祖細(xì)胞，這些細(xì)胞就可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何技術(shù)將其從其他類型的細(xì)胞中分離出來。然后將這些細(xì)胞用于各種目的，如診斷目的或傳代和移植給病人。
也可以與體外方法類似的方法使用體內(nèi)方法鑒定和隨后分離細(xì)胞。當(dāng)在體內(nèi)使用該方法時(shí)，可以從大腦的不同結(jié)構(gòu)中鑒定和分離干細(xì)胞和先祖細(xì)胞。
還可以根據(jù)本發(fā)明的方法對(duì)干細(xì)胞和先祖細(xì)胞進(jìn)行傳代。該傳代可以在體內(nèi)和體外進(jìn)行。該細(xì)胞，首先可以任選地根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行鑒定和分離，然后將這些細(xì)胞和包括或含有肽或蛋白的物質(zhì)接觸，這些肽或蛋白一旦被細(xì)胞吸收就可以活化所述細(xì)胞的增殖和/分化和/或譜系確定。
還可以將本發(fā)明的體內(nèi)和體外方法用于基因治療。先將該物質(zhì)與細(xì)胞接觸，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，然后稱為藥物活性物質(zhì)。一旦被該細(xì)胞吸收，它也可能產(chǎn)生藥物活性物質(zhì)。該活性物質(zhì)還可以是例如包含編碼藥物活性物質(zhì)的cDNA的表達(dá)載體。一旦該表達(dá)載體被細(xì)胞吸收，其中的cDNA所產(chǎn)生的藥物活性物質(zhì)可能是肽或蛋白，其中肽或蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)出先祖細(xì)胞或干細(xì)胞從而影響周圍的組織或細(xì)胞。此類肽或蛋白的例子是趨向性因子或其他能夠?qū)χ車募?xì)胞或組織產(chǎn)生期望的作用的蛋白。由所述的cDNA所產(chǎn)生的肽或蛋白是一種活化或鈍化先祖細(xì)胞或干細(xì)胞的物質(zhì)，目的是為了更容易地分離先祖細(xì)胞或干細(xì)胞或?yàn)榱藦拇竽X中的先祖細(xì)胞或干細(xì)胞或在組織培養(yǎng)物的先祖細(xì)胞或干細(xì)胞中誘導(dǎo)新的神經(jīng)元或星型膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生，其中來自大腦的先祖細(xì)胞或干細(xì)胞或在組織培養(yǎng)物中的干細(xì)胞或先祖細(xì)胞是用于共同移植給病人。還可以使用有核酸和藥物活性蛋白組成的融合分子的物質(zhì)，其中核酸能使該物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。
當(dāng)在體內(nèi)進(jìn)行基因治療時(shí)，該方法可以被用于治療神經(jīng)損傷，神經(jīng)疾病，神經(jīng)缺陷或紊亂。本文中所用的術(shù)語“治療”指治愈或減輕疾病或紊亂的治療或?yàn)榱朔乐辜膊“l(fā)展的治療。治療可以是馬上治療或長(zhǎng)期治療。本文中所用的術(shù)語“病人”指根據(jù)本發(fā)明需要治療的人或非人的哺乳動(dòng)物。
還可以通過將藥物活性化合物和核酸相連接而產(chǎn)生可用于治療由于正常干細(xì)胞或先祖細(xì)胞的紊亂的治療的醫(yī)藥產(chǎn)品。當(dāng)將該核酸和干細(xì)胞或先祖細(xì)胞接觸時(shí)，它將被細(xì)胞通過細(xì)胞內(nèi)在的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制吸收到細(xì)胞內(nèi)，而且由于藥物活性化合物是和核酸相連接的，該藥物活性化合物也將被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。此類藥物產(chǎn)品還可以包括其他的物質(zhì)，例如惰性載體，或藥學(xué)上可以接受的佐劑，載體，防腐劑等，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。優(yōu)選，通過外科插入導(dǎo)管輸注到腦室中或通過插入到腰錐的注射器輸注到脊椎液中。
本發(fā)明的方法還可被用于檢測(cè)或篩選蛋白或可檢測(cè)的信號(hào)。在篩選或檢測(cè)應(yīng)用中，本發(fā)明使用了吸收包括編碼將被應(yīng)用到篩選或檢測(cè)中的DNA的干細(xì)胞。蛋白質(zhì)的例子有用于篩選新的受體拮抗劑的受體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收以及質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)可以被用在檢測(cè)裝置和篩選裝置中，其中特定蛋白如受體或酶的表達(dá)是所期望的。本發(fā)明相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法(其中需要有藥物或化合物幫助DNA吸收和表達(dá))的優(yōu)點(diǎn)在于高效和不必要有藥物，化合物或化學(xué)物質(zhì)幫助吸收和隨后的蛋白表達(dá)。
本發(fā)明將通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步進(jìn)行描述。該實(shí)施例僅僅是為了說明本發(fā)明而不應(yīng)該理解為限制本發(fā)明的范圍。


圖1A是一幅熒光顯微照片，示在50μg/ml的含GFP cDNA質(zhì)粒的培養(yǎng)基中培養(yǎng)先祖細(xì)胞的結(jié)果；圖1B是光學(xué)顯微照片圖，示和圖1A相同的結(jié)果；圖1C是一幅熒光顯微照片，示在50μg/ml的不含GFP cDNA的另一質(zhì)粒的培養(yǎng)基中培養(yǎng)先祖細(xì)胞的結(jié)果；圖1D是光學(xué)顯微照片圖，示和圖1C相同的結(jié)果。
此后，用帶有熒光顯微鏡的倒置的Leica DMIRB顯微鏡檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)。使用氬離子激光器(Spectra Physics model 2025-05，Sunnyvale，CA)在488nm激發(fā)GFP的熒光從而觀察細(xì)胞。激光通過一個(gè)488nm的線性干涉濾片，再通過一個(gè)旋光片，從而破壞光的相干使激光散射。用一個(gè)透鏡收集激光并使其通過一個(gè)熒光濾錐(LeicaI-3)進(jìn)入物鏡以激發(fā)熒光團(tuán)。得到的熒光用同一物鏡收集并用一個(gè)3-芯(3-chip)的彩色CCD照相機(jī)(Panasonic)檢測(cè)和用SuperVHS(Panasonic SVHS AG-5700)以25Hz幅收集率進(jìn)行錄像。將像帶上的CCD圖象進(jìn)行數(shù)字化加工和成象。
將先祖細(xì)胞用含有50μg/ml的帶有GFPc DNA的質(zhì)粒的培養(yǎng)基培養(yǎng)10分鐘，而不加入有助于DNA吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)的化學(xué)物質(zhì)，然后在檢測(cè)前再培養(yǎng)48小時(shí)，結(jié)果是這些細(xì)胞的熒光很強(qiáng)。圖1A是該結(jié)果的熒光照相圖，而圖1B是相應(yīng)的光學(xué)顯微圖片。
相反地，當(dāng)用其他不含GFP基因的質(zhì)粒培養(yǎng)來自成年大鼠的先祖細(xì)胞時(shí)，沒有看到熒光。圖1C和1D示使用不含GFP的質(zhì)粒時(shí)的結(jié)果。
另外，用50μg/ml的含有表達(dá)β-半乳糖苷酶的基因的質(zhì)粒培養(yǎng)先祖細(xì)胞時(shí)，而且沒有加入有助于DNA吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)的化學(xué)物質(zhì)，培養(yǎng)48小時(shí)后檢測(cè)，結(jié)果是細(xì)胞表達(dá)β-半乳糖苷酶活性。
另外還發(fā)現(xiàn)將腎臟來源的Cos-7細(xì)胞用含有50μg/ml的帶有GFPcDNA的質(zhì)粒的培養(yǎng)基培養(yǎng)10分鐘，而不加入有助于DNA吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)的化學(xué)物質(zhì)，然后在檢測(cè)前再培養(yǎng)48小時(shí)，結(jié)果是這些細(xì)胞的不表達(dá)綠色熒光蛋白。該實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)方法和先祖細(xì)胞的相同。
而且，當(dāng)用含有表達(dá)β-半乳糖苷酶的基因的質(zhì)粒培養(yǎng)cos-7細(xì)胞時(shí)，而沒有加入有助于DNA吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的化學(xué)物質(zhì)，培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)，這些細(xì)胞不表達(dá)β-半乳糖苷酶活性。
從上面的實(shí)驗(yàn)可以清楚的看出來，來自成年大鼠大腦的先祖細(xì)胞能夠在體外將雙鏈DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)到其內(nèi)部，并可以合成該DNA序列的所編碼的蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種將包含核酸的物質(zhì)導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞或先祖細(xì)胞中的方法，其特征在于所述核酸在體外直接和所述細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞膜內(nèi)成分相互作用，從而使包含核酸的物質(zhì)通過細(xì)胞內(nèi)在的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被細(xì)胞吸收。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)胞來自成體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的方法是在潮濕空氣中在37℃下施行的。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述的物質(zhì)是或包括單鏈或雙鏈，線性或環(huán)狀DNA。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述的物質(zhì)是或包括單鏈或雙鏈RNA。
6.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述的物質(zhì)是包括有核酸部分和蛋白質(zhì)部分的融合分子。
7.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述的物質(zhì)是含有特定cDNA的表達(dá)載體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的cDNA產(chǎn)生了活化所述細(xì)胞的增殖和/或分化和/或譜系確定的肽或蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述的物質(zhì)產(chǎn)生了可檢測(cè)的信號(hào)。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述的cDNA產(chǎn)生了能夠選擇性鑒定干細(xì)胞和/或先祖細(xì)胞的肽或蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)生了可以檢測(cè)的信號(hào)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是熒光蛋白。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述的可以檢測(cè)的信號(hào)是基于放射性標(biāo)記的核酸。
14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法，其中所述的細(xì)胞是組織細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法在鑒定先祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞中的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述的細(xì)胞在鑒定后被從周圍的其他細(xì)胞中分離出來。
17.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法在基因治療中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求16和17的應(yīng)用，其中所述的蛋白部分由藥物活性蛋白組成。
19.權(quán)利要求8的方法在神經(jīng)細(xì)胞傳代中的應(yīng)用。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述的傳代后的神經(jīng)適于移植到患者體內(nèi)。
21.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法的應(yīng)用，用于檢測(cè)包含含有表達(dá)質(zhì)粒的cDNA的醫(yī)藥產(chǎn)品。
22.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法用于診斷目的。
23.權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的方法的應(yīng)用，其中所述的蛋白質(zhì)或可檢測(cè)信號(hào)允許對(duì)上述的蛋白或信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)或篩選。
24.一種將包含核酸的物質(zhì)導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞或先祖細(xì)胞中的方法，其特征在于所述的核酸在體內(nèi)與所述細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞膜內(nèi)的成分進(jìn)行直接相互作用，從而使該物質(zhì)通過細(xì)胞的內(nèi)在轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被細(xì)胞吸收。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的細(xì)胞來自成體。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述的物質(zhì)是或包括單鏈或雙鏈，線性或環(huán)狀DNA。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述的物質(zhì)是或包括單鏈或雙鏈RNA。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述的物質(zhì)是包括核酸部分和蛋白質(zhì)部分的融合分子。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述的物質(zhì)是含有特定cDNA的表達(dá)載體。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的cDNA產(chǎn)生了活化所述細(xì)胞的增殖和/或分化和/或譜系確定的肽或蛋白質(zhì)。
31.權(quán)利要求24的方法，其中所述的物質(zhì)產(chǎn)生了可檢測(cè)的信號(hào)。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述的cDNA產(chǎn)生了能夠選擇性鑒定干細(xì)胞和/或先祖細(xì)胞的肽或蛋白質(zhì)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述的肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)生了可以檢測(cè)的信號(hào)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是熒光蛋白。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述的可以檢測(cè)的信號(hào)是基于放射性標(biāo)記的核酸。
36.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法，其中所述的細(xì)胞是患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞。
37.權(quán)利要求的方法在鑒定先祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞中的應(yīng)用。
38.權(quán)利要求37的應(yīng)用，其中所述的細(xì)胞在鑒定后被從周圍的其他細(xì)胞中分離出來。
39.權(quán)利要求24-38的方法在基因治療中的應(yīng)用。
40.權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中所述的蛋白部分由藥物活性蛋白組成。
41.權(quán)利要求30的方法在神經(jīng)細(xì)胞傳代中的應(yīng)用。
42.權(quán)利要求24-36任一項(xiàng)的方法的應(yīng)用，用于檢測(cè)包含含有表達(dá)質(zhì)粒的cDNA的醫(yī)藥產(chǎn)品。
43.權(quán)利要求24-36任一項(xiàng)的方法用于診斷目的。
44.權(quán)利要求30-35任一項(xiàng)的方法的應(yīng)用，其中所述的蛋白質(zhì)或可檢測(cè)信號(hào)允許對(duì)上述的蛋白或信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)或篩選。
45.權(quán)利要求24的應(yīng)用，用于治療神經(jīng)損傷，疾病，缺損或紊亂。
全文摘要
本發(fā)明公開了將包含核酸的物質(zhì)導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞或先祖細(xì)胞中的方法,其特征在于所述的核酸直接和細(xì)胞膜或細(xì)胞膜內(nèi)的成分相互作用,從而使包含核酸的物質(zhì)通過細(xì)胞內(nèi)在的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被細(xì)胞吸收。本發(fā)明還公開了所述方法的各種應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/15GK1336959SQ00802698
公開日2002年2月20日 申請(qǐng)日期2000年1月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月15日
發(fā)明者P·艾利松, O·奧爾瓦 申請(qǐng)人:A+科學(xué)投資有限公司