專利名稱：將物質轉移進細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及將待轉移進細胞的物質連續(xù)方便地轉移進細胞的方
法；通過上述方法將待轉移進細胞的物質轉移進去的細胞；以及用于 通過上述方法轉移待轉移進細胞的物質的裝置。更具體地，本發(fā)明涉 及將物質轉移進細胞的方法，所述方法包括為了使待轉移進細胞的 物質被允許吸納進細胞中，對不含待轉移進細胞的物質的液體進行電 噴霧以產生液滴，并在存在待轉移進細胞的物質的情況下將所述液體 噴霧到細胞上，或者首先將液滴噴霧到細胞上，然后將待轉移進細胞 的物質與細胞相接觸；還涉及通過上述方法已經吸納了待轉移進細胞 的物質的細胞；以及用于通過上述方法將物質轉移進細胞的裝置。
用于轉移基因(例如DNA和RNA)、蛋白質(例如酶和抗體)以 及化學物質(例如藥品)轉移進細胞的方法、通過這些方法獲得的細 胞以及利用這些方法的裝置在生物技術相關領域(例如醫(yī)藥、藥學和 農業(yè)以及臨床設置(settings )，例如基因療法和將療法靶向癌細胞) 的研究和開發(fā)中是有用的措施。
背景技術：
已經開發(fā)了很多方法和裝置用于將希望被轉移進細胞的物質轉移 進細胞的流程，特別是基因重組流程，其中基因(DNA和RNA)被引入 細胞。
例如，感受態(tài)細胞通常用于具有細胞壁(含肽葡聚糖、纖維素等， 例如，參見非專利文獻1)的細菌和酵母。其是這樣的方法，其中細 胞被改造以容易地吸納物質，然后對細胞進行熱激等處理，以允許物 質被吸納。但是，該方法存在如下問題用于培養(yǎng)待使用的細胞的條 件必須被嚴格調控，細胞必須被冷凍或用含有金屬離子的溶液處理并且還不能殺死細胞，因此該方法復雜且耗費時間(例如，參見非專利
文獻2和3)。
動物細胞通常比細菌和生物微生物的細胞增殖更慢，并且具有很 不同的細胞結構和細胞膜結構。因此，通常認為將物質轉移進動物細 胞要比轉移進微生物細胞更難，對于動物細胞來說需要非常精細的操 作。因此，將基因(例如dna或rna)或其它待轉移進細胞的物質轉 移進動物細胞無法輕易實現。
已經提出了乾向動物細胞的若干種方法。 一個例子是磷酸釣方法 (例如，參見非專利文獻4)。其是這樣的方法其中制備含有dna 的磷酸4丐顆粒，以允許其通過內吞作用被吸納。但是，該方法有所缺 陷，流程復雜且轉移效率低下。作為對該方法的改良，又提出了一種 方法，其中，使用陽離子聚合物等試劑和脂質體以允許物質被吸納進 細胞(例如，參見非專利文獻5和6)。但是，該方法也存在問題， 因為其需要非常復雜的流程來將試劑和細胞混合，并且待使用的試劑 價格昂貴。此外，這些試劑可能對細胞有致死作用(取決于劑量)，
它們僅可以在非常有限的濃度范圍內使用。
除了這些方法之外，利用病毒將物質轉移進細胞的方法也是可獲 得的(例如，參見非專利文獻7)。但是，使用病毒時，復雜的純化 流程是必需的。因為使用病毒會有如下風險物質可能被轉移進并不 靼向的細胞或組織。此外，因為使用病毒，還要考慮生物危害風險。
電穿孔是允許待轉移進細胞的物質被吸納進細胞的公知方法(例 如，參見專利文獻1)。其是這樣的方法其中向含有基因和細胞的 懸浮液應用高脈沖電壓，以允許懸浮液中含有的基因被吸納進細胞。 該方法應用廣泛，基因轉移效率高。但是，鑒于基因轉移效率與細胞 死亡率具有比例關系，物質的轉移不能獨立于細胞死亡而進行。具體
j4,該方法具有下述缺點如果脈沖條件不合適的話，不僅靶向的物 質難于轉移進細胞，并且細胞還可能死亡。此外，為了防止所謂的牽 引(towing，這是向溶液中放電)，當應用電壓時細胞懸浮液的電導 率必須被降低。為達到此目的，用離心等方法來分離和洗滌細胞的流程是必需的，其間細胞可能死亡。
此外，顆粒槍被用作為將物質轉移進細胞的方法(例如，參見專
利文獻2)。其是這樣的方法將攜帶基因的金、鵠等微顆粒射進細 胞。待轉移進細胞的物質被微顆粒攜帶，以增加整體質量，這允許細 胞以高能量擊中，以穿透細胞膜。該方法允許通過微顆粒擊中細胞的 高轉移效率，但是存在缺陷，當有很多細胞時，微顆粒不能均勻擊中 細胞，從而難于增加總的轉移效率。此外，還方法還具有下述缺點 將細胞附著到微顆粒上的流程等是必需的，耗材(例如用于攜帶物質 的微顆粒和用于釋放壓力的安全隔膜(rupture disc))價格昂貴。 此外，還有如下缺點裝置體積大，因為必須用等離子體爆炸(爆炸 性的或壓縮氣缸)來發(fā)射微顆粒，細胞被氣體沖擊分散，因為顆粒留 在細胞中故而細胞容易受到損傷，在發(fā)射重復進行后顆粒聚集在細胞 內，等等。微顆粒在細胞內的駐留和聚集是人們不想看到的，特別是 對于基因療法來說，因為細胞死亡的可能性將會增加。此外，鑒于待 使用的微顆粒的大小是0. 5至3 iLim,因此難于將該方法應用到，例如
微小的細胞上，例如，大小為大約l iim的細菌，雖然相對大的細胞， 例如，植物和動物細胞(具有10至100 jam的大小)則沒什么問題。
電噴霧被用作為高速噴霧液體的方法。電噴霧是這樣的方法，其 中，通過向噴霧管應用高壓在噴霧管的尖端收集電荷，液體被運經已 經聚集有電荷的管尖端，由此允許液體被轉化為微小帶電荷液滴，并 被高速噴霧到靶上。該方法已具體地用作為質譜中的離子化方法(例 如，參見非專利文獻8和9)。
作為利用該電噴霧的顆粒槍技術之一有這樣一種方法其中，通 過毛細管尖端向含有顆粒的懸浮液應用高壓，以將它們噴霧到細胞上 (例如，參見專利文獻3)。該方法使用電噴霧，以加速附著有待轉 移進細騰的物質的顆粒或含有物質與顆粒的液體。在某些情況下，該 方法具有缺點毛細管尖端可能被顆粒堵塞，因為使用了含有顆粒的 懸浮液。此外，與常用的顆粒槍一樣，該方法具有固體留在細胞中的 缺點。此外，每次改變待轉移進細胞的物質的時候，都必須要進行用
5于攜帶顆粒的流程，雖然要轉移一種類型的想要轉移進細胞的物質使 這并非必要。此外，用于懸浮液的液體轉移系統每次使用時必須經過 洗滌和置換，流程復雜和耗時的問題仍沒有解決。此外，鑒于含有待 轉移的物質的懸浮液被噴霧，裝置內部可能被污染。此外，火花放電 更可能在管和細胞之間發(fā)生，因為噴霧溶液中含有的溶質的量增加了 。
在背景領域的一些情況下，需要提供這樣的方法和裝置，其中， 待轉移進細胞的物質可被方便并且連續(xù)地轉移進細胞，并且不需要將 待轉移進細胞的物質附著到載體例如顆粒上，以及其中，多種類型的 待轉移進細胞的物質可在短時間內被連續(xù)轉移進多種類型的細胞。
專利文獻l:美國專利No. 4945050 專利文獻2:日本專利No. 2606856 專利文獻3:美國專利No. 6093557
非專利文獻l: H. Inoue， H. Nojima， H. 0kayama， Gene, 1990, vol. 96(1)， p23-28
非專利文獻2: J. Haensler， F. C. Szoka Jr， Bioconjugate Chem.， 1993， vol. 4， p374-379
非專利文獻3: P. L. Feigner, T. R. Gadek， M. Holra， R. Roman, H. W. Chan, M. Wenz, J. P. Northrop, G. M. Ringold， and M. Danielsen， 1147766570484—0.， )； 1987， vol. 84(21)， p7413-7
非專利文獻4: F. L. Graham, A. J. Van Der Eb， Virology, 1973， vol. 52， p446-467
非專利文獻5:J. Haensler， F. C. Szoka Jr， Bioconjugate Chera. 1993， vol. 4， p374-379
非專利文獻6: P. L. Feigner, T. R. Gadek， M. Holm, R. Roman, H. W. Chan， M. Wenz， J. P. Northrop, G. M. Ringold, and M. Danielsen, 1147765309078-0.， )； 1987， vol. 84(21)， p7413-7
非專利文獻7: D. Yu， T. Shioda， A. Kato， M. K. Hasan, Y. Sakai Y. Nagai， 1147765309078-1.， )； 1997， vol. 2(7)， p457-66
非專利文獻8: J. B. Fenn， M. Mann， C. K. Meng， S. F. Wong,C. M. Whitehouse， Science, 1989， vol. 246， p64-71
非專利文獻9: Z. Takats， J. M. Wiseman, B. Gologan， R. G. Cooks， Science, 2004， vol. 306， p471-47
發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明的一個目的是提供將想要轉移進細胞的物質引入細胞的方 法，例如，將高分子量的生物活性物質(例如基因，包括DNA和RNA) 引入細胞，所述方法能連續(xù)方便地將物質引入細胞，并且無需復雜的 栽體附著流程或者混合顆粒的流程或者無需在每次改變待轉移物質時 洗滌和置換液體轉移系統的流程，并且，所述方法能容易地將不同種 類的物質轉移進不同細胞樣品，并且還提供了通過該方法獲得的細胞 以及用于通過該方法將物質轉移進細胞的裝置。
解決問題的手段
本發(fā)明的發(fā)明人已經進行了深入的研究，以達成前述目的。結果 他們出人意料地發(fā)現，應當通過在將待轉移進細胞的物質轉移進細胞 時電噴霧不含待轉移進細胞的物質的液體，來產生液滴，并使所述液
滴與細胞相接觸，由此待轉移進細胞的多種類型的物質可被高效轉移 進多種類型的細胞。因此，本發(fā)明已被實現。
具體地，本發(fā)明涉及將物質轉移進細胞的方法，其特征在于，不 含待轉移進細胞的物質的液體^皮電噴霧到細胞上，還涉及通過該方法 獲得的細胞以及用于通過該方法將物質轉移進細胞的裝置，如下文(1 ) 至(9)所述。
(1 )用于將物質轉移進細胞的方法，所述方法包括電噴霧不含待 轉移進細胞的物質的液體，使得液滴產生，并且與細胞相接觸，從而 使得物質轉移進細胞。
(2)根據前述(1)的用于將物質轉移進細胞的方法，其中，所 述液體與和持轉移進細胞的物質共存的細胞相接觸。(3) 根據前述(1 )的用于將物質轉移進細胞的方法，其中，所 述液滴首先與細胞接觸，然后所述細胞與待轉移進細胞的物質接觸。
(4) 根據前述(3)的用于將物質轉移進細胞的方法，其中，所 述細胞與待轉移進細胞的物質在所述液滴與所述細胞接觸后的30分 鐘或更少的時間內相接觸。
(5) 根據前述(1)的用于將物質轉移進細胞的方法，其中，液 體和細胞之間的電勢差為0.1 kV至100 kV。
(6) 根據前述(1)的用于將物質轉移進細胞的方法，其中，被
電噴霧的所述液體是不含待轉移進細胞的物質的水或不含待轉移進細 胞的物質的水性溶液。
(7) 根據前述(1)的用于將物質轉移進細胞的方法，其中，所
述待轉移進細胞的物質是基因。
(8 )細胞，其中，待轉移進細胞的物質已經通過前述(1 )至(7 ) 中任一項所述的方法轉移進去。
(9)用于通過前述(l)至(7)中任一項所述的方法將物質轉移 進細胞的裝置。
發(fā)明效果
根據本發(fā)明，想要被轉移進細胞的物質，特別是基因，可無需復 雜預處理就被轉移進細胞。具體地，想要被轉移的物質可直接轉移進 細胞，而不用進行提前將所述物質附著到載體上的復雜預處理流程， 因此細胞中不會留有載體。此外，鑒于載體顆粒大小對本發(fā)明沒有加 以限制，因此本發(fā)明可應用于微米以下級至數微米的小細胞(例如細
菌)上。
此外，本發(fā)明的裝置無需任何昂貴的金屬微顆?；虬踩裟?，因 此處理成本得以降低。此外'，鑒于無需改變待噴霧的液體等，多種類 型的基因可在短時間內連續(xù)轉移進多種類型的細胞。由此，較之傳統 方法，基因重組等流程需要的時間可顯著降低，并且可對大量樣本加 以加工。附圖簡述


圖1是顯示下述情況的示意圖，其中進行電噴霧的同時保持細胞
與待轉移進細胞的物質相接觸；
圖2是顯示下述情況的示意圖，其中先進行電噴霧，然后將細胞
與待轉移進細胞的物質相接觸；
圖3是用于將物質轉移進細胞的示意圖4是用于將物質轉移進細胞的裝置的管的示意圖5是具有移動機械的、用于將物質轉移進細胞的裝置的示意圖6是用于實驗中的用于將物質轉移進細胞的裝置的圖7是熒光顯微照片，其顯示了引入了 GFP基因的CH0細胞；
圖8是電泳照片，其顯示了抗氨千青霉素菌林的質粒；
圖9是用于實施例III-l的、用于將物質轉移進細胞的裝置的示
意圖；以及
圖IO是熒光立體顯微照片，其顯示了引入了 GFP基因的雞胚。
實施本發(fā)明的最佳模式 下文中將詳細解釋本發(fā)明的實施方式。
對用于本發(fā)明的細胞并沒有特別限制，其可以是動物細胞、植物 細胞和微生物細胞中的任何。除了細胞之外，組織、器官和生物體也 包括在內。并且顯而易見地，繁殖性細胞，例如卵、精子、花粉、孢 子和種子也可^皮耙向。
本發(fā)明對于動物細胞特別有效。動物細胞被具體定義為基于五界 系統屬于動物界和屬于原生動物的生物以及源自它們的細胞。屬于動 物屆的生物是由真核細胞構成的多細胞生物，它們不具有光合能力并 且是異養(yǎng)性的。該屆包括多孔動物門、腔腸動物門、扁形動物門、袋
形動物門、環(huán)節(jié)動物門、軟體動物門、節(jié)肢動物門、毛顎動物門、棘 皮動物門、原索動物和脊稚動物門。此外，原生動物是屬于原生生物 屆的單細胞生物，它們由真核細胞構成，并且是異養(yǎng)性的。當使用細菌、酵母、有絲真菌、古生菌和植物等有細胞壁的細胞 時，可以預計到，通過使用具有受損的細胞壁或通過移除細胞壁而使 得質膜暴露的那些，轉化效率會有所提高。當存在能產生上述狀態(tài)的 物質時，可進行噴霧。此類細胞的具體例子包括感受態(tài)細胞和細胞壁
被削弱的細胞(例如原生質體)，它們可能被允許與Ca離子、Li離 子、Rb離子、Cs離子、Mg離子、Mn離子、Zn離子、纖維素酶、果膠 酶和用于制備這些細胞的其它物質共存。此外，它們可被允許與聚合 物(例如，聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚精胺、聚蓖麻毒(polyricin) 和聚乙二醇)和表面活性劑(例如脂質體和膠束)共存。為允許這些 物質共存，可適當選擇之前將它們加入要進行噴霧的細胞溶液的方法 或在噴霧階段對它們加以混合的方法。
本發(fā)明的特征在于，不含待轉移進細胞的物質的液體被電噴霧， 使得液滴產生，并與細胞相接觸，以將物質轉移進細胞。更具體地， 為使得待轉移進細胞的物質被吸納進細胞，不含待轉移進細胞的物質 的液體被電噴霧到細胞上，同時細胞保持與待轉移進細胞的物質相接 觸，或者不含待轉移進細胞的物質的液體先被電噴霧到細胞上，然后 令細胞與待轉移進細胞的物質相接觸。
電噴霧在本發(fā)明中表示通過允許液體穿過高壓應用的細管尖端
以將液體轉化為液滴，以及將小的液體微顆粒以高速噴射到靼細胞上， 這是通過液滴表面的電荷排斥實現的。圖l顯示了本發(fā)明的一種實施 方式，其中不含待轉移進細胞的物質的液體被電噴霧到細胞上，同時 細胞與待轉移進細胞的物質相接觸。
在圖1中，細胞(細胞)與待轉移進細胞的物質(材料A)共存。 不含待轉移進細胞的物質的液體(材料B)被電噴霧到其上。隨后可 以獲得已轉移進待轉移進細胞的物質(細胞中的材料A)的細胞。通 過將不含物質的液體電噴霧到與所述物質共存的細胞上來將待轉移進 細胞的物質轉移進細胞。即，液體并非用以直接轉移進細胞，而是用 于允許物質被吸納進細胞。
圖2顯示了另一實施方式，其中，不含待轉移進細胞的物質的液
10體首先被電噴霧到細胞上，然后令細胞與待轉移進細胞的物質相接觸。
在圖2中，用不含待轉移進細胞的物質的液體(材料B)對細胞 (細胞)進行噴霧。然后，加入待轉移進細胞的物質。隨后，待轉移 進細胞的物質可被轉移進細胞。當細胞在噴霧后的較短時間內與所述 物質接觸時，物質更易于轉移。這取決于細胞的狀況和類型以及噴霧 條件，但是理想地，細胞在30分鐘或更少的時間內與所述物質接觸， 優(yōu)選15分鐘或更少的時間內，更優(yōu)選3分鐘或更少的時間內。當待轉 移進細胞的物質與細胞接觸時，所述物質優(yōu)選以溶液形式存在，但其 也可以是含有所述物質的粉末等形式，只要細胞不受影響即可。
應用到管尖端的電壓可被設置為最優(yōu)值，這是從與細胞的距離、 管的尺寸、流速和待被電噴霧的液體的性質等獲得的。關于管尖端的 液體和細胞的電勢差而言，電壓優(yōu)選在O. 1 kV至lOO kV的范圍內， 更優(yōu)選在1 kV至20 kV的范圍內。當電壓低于0. 1 kV時，靶標物質 進入細胞的轉移效率較低。此外，高于100kV的電壓并非優(yōu)選的，因 為所述物質進入細胞的轉移效率預計沒有顯著提高，而細胞死亡的風 險有所增加。
管尖端的內部直徑優(yōu)選為0. 01 iLim至10 ram，更優(yōu)選為1 |iun至5 mm。小于O. 01 iim的管尖端并不優(yōu)選，因為過窄的流通通道從而需要 非常高的壓力。另一方面，當內部直徑高于10 mm時，噴霧的液體并 不轉化為液滴，從而可能不產生電噴霧。
當進行電噴霧時，管尖端和細胞之間的距離優(yōu)選為0. 1 nm至2000 mm。當所述距離比該范圍更短時，容易發(fā)生故障。當所述距離比該范 圍更長時，應用的電壓對于理想狀況而言過高了。所述距離優(yōu)選為1 nm 至500 mm。
待被電噴霧到細胞上的液體的量可以根據細胞的數量、類型和形 狀而有所改變。此外，電噴霧時間因此而改變。
具體地，例如，當直徑為3. 5 cm的培養(yǎng)i上的粘著動物細胞被電
噴霧時，待噴霧的液體的量優(yōu)選在l )iL至4mL的范圍內，更優(yōu)選在 10 pL至2 mL的范圍內。此外，當直徑為6cm的培養(yǎng)皿上的微生物菌落被電噴霧時，待噴 霧的液體的量優(yōu)選在1 jiL至8 mL的范圍內，更優(yōu)選在10 pL至4 mL 的范圍內。
為實現本發(fā)明的目標，待被電噴霧的液體需要不含對細胞產生不 利影響的物質。用水或水性溶液作為此類液體是優(yōu)選的。水可以是離 子交換水、蒸餾水或滅菌水中的任何。此外，水性溶液可含有金屬離 子、有機溶劑、大分子化合物、培養(yǎng)基、緩沖物質等。作為可被含有 于水中的金屬離子的更具體的例子，周期表中I至XV組的金屬離子是 優(yōu)選的，I至III組或VI至XII組的金屬離子是優(yōu)選的。特別地，經 常用于生物化學實驗的Li、 Na、 K、 Cs、 Mg、 Ca、 La、 Cr、 Mo、 W、 Mn、 Fe、 Co、 Ni、 Cu和Zn離子的水性溶液易于使用。這些金屬離子可以 以卣化物、有機酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、 硅酸鹽等的任何形式提供。
可被待電噴霧的液體含有的有機溶劑的例子包括甲醇、乙醇、 丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、聚丙二醇、丙酮、 曱乙酮、乙酸乙酯、二曱基亞砜、環(huán)丁砜、乙醇胺、二乙醇胺、三乙 醇胺、丙醇胺、二丙醇胺、三丙醇胺、氯仿、亞甲基氯、乙酰胺、甲 基乙酰胺、二曱基乙酰胺、N-曱基吡咯烷酮、曱酰胺、曱基甲酰胺、 二曱基甲酰胺、聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、己烷、三醋精等。
可使用的大分子化合物的例子包括聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙 二醇、聚乙烯醇、亞精胺、瓊脂、淀粉、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、 藻酸、角叉膠等。
待噴霧的液體中可含有的培養(yǎng)基的例子包括LB培養(yǎng)基、Sauton， s培養(yǎng)基、S0B培養(yǎng)基、Ham， s培養(yǎng)基、Eagle， s培養(yǎng)基、經修飾的 Eagle' s培養(yǎng)基、RPMI培養(yǎng)基、Fisher' s培養(yǎng)基、MCDB培養(yǎng)基、whi te， s培養(yǎng)基和Murashige and Skoog培養(yǎng)基。除了這些之夕卜，氨基酸、 蔗糖、山梨糖醇、蛋白胨、酵母提取物、表面活性劑、血清等也可作 為培養(yǎng)基組分被含有在內。
用于生物化學實驗中的混合物，例如，EDTA水溶液、tris(羥甲基)氨基甲烷氯化氫緩沖液(tris緩沖液)、tris-EDTA緩沖液(TE 緩沖液)、磷酸鹽緩沖液(PBS) 、 tris-乙酸-EDTA緩沖液(TAE緩沖 液)、Hanks'平衡鹽溶液(HBSS )和Eagle， s平衡鹽溶液(EBSS ) 可以作為平衡緩沖液使用。
對將在本發(fā)明中使用的水性溶液的濃度并沒有特別限制。但是如 果溶液與所用的細胞的滲透壓差異過大以至于對其有不利影響的話， 那么應當對濃度加以調節(jié)。此外，為提高轉移效率，優(yōu)選地，允許共 存在有通?？捎糜诎袠思毎幕蜣D移試劑(例如脂質體和堿性聚合 物)。
對本發(fā)明中的待轉移進細胞的物質并沒有特別限制，其特別有用 的例子是基因。具體例子包括DNA、 RNA和其相似化合物或衍生物。它 們以質粒、噬菌體、病毒、類病毒、寡聚DNA、寡聚RNA、微小RNA 等形式提供。對核苷酸序列的大小并沒有特別限制。核苷酸可以是雙 鏈或單鏈的。
此外，通常，比基因更小的物質可在本發(fā)明中更容易地轉移。此 類物質的例子包括蛋白質、肽、糖、脂類、農業(yè)化學品、殺細菌劑、 金屬離子、經熒光標記的試劑、經同位素標記的試劑等。
通過本發(fā)明的方法將物質轉移進細胞的機制尚未明確，但預測為 如下機制。當液體成為電噴霧狀態(tài)時，產生了大量的小電荷液滴。它 們被噴霧以轟擊細胞。由此，細胞內外的電場不平衡，從而在細胞膜 中產生了孔，然后再這些孔附近存在的物質被認為經由所述孔被吸納 進細胞。我們認為，這些孔在電噴霧后開始閉合，其在大約30分鐘內 恢復。
液體可在對細胞沒有致死作用或爆炸危險的氣體(例如空氣、氮 氣、二氧化碳、氬氣和SF6)氛圍下被噴霧。在這方面，空氣和氮氣 是通常使用并且易于使用的。
對壓力沒有特別限制，只要細胞可被處理而不會殺死它們即可，1 pa至1 Mpa的范圍是易于使用的。大氣壓是特別易于使用的。
為防止污染，例如其它微生物的摻入;在抗菌條件下進行噴霧是
13非常重要的。具體地，可通過在箱盒中噴霧或者通過使用干凈的櫥拒 等來防止污染。此外，鑒于可通過本發(fā)明以與重力相反的方向噴霧液 體，細胞可被置于上方，以防止在噴霧進行時摻入下落的污染來源。
對電噴霧期間的溫度沒有特別限制。細胞不會死的任何溫度都可 使用，室溫是容易使用的。
圖3顯示了用于通過本發(fā)明將物質轉移進細胞的方法將物質轉移 進細胞的裝置的示意結構，其中，電噴霧在細胞和待轉移進細胞的物 質共存的情況下進行。
所述裝置由高壓電源l、管2、液體(材料B) 3和細胞和待轉移 進細胞的物質(細胞+材料A) 4組成。向其應用電壓的液體3經由管 2噴霧到細胞和待轉移進細胞的物質4上。此時，通過高壓電源1向 液體3應用電壓。隨后，液體3被電荷化，并從管2噴霧到細胞和待 轉移進細胞的物質4上。更具體地參照該機械，用于向液體3應用電 壓的高壓電源1與管2通過電纜等相連。此外，所述的管位于細胞和 待轉移進細胞的物質4可被噴霧的位置。
通過高壓電源在應用電壓的管尖端將液體電荷化并轉化為液滴， 以產生電噴霧狀態(tài)。當應用電壓時，液滴表面的電荷排斥變得比液滴 表面張力更大，液體被制為微小的，由于電場作用，帶電荷的液滴被 高速噴霧到細胞上。鑒于電噴霧的形成取決于電壓、與細胞的距離、 管的尺寸、液體流速、液體性質等而有所變化，所述裝置具有可根據 目的加以適當調節(jié)的結構。
所述裝置具有泵，使得液體可定量供給給所述管。如果所述裝置 沒有泵的話，那么材料利用重力或壓力供給給所述的管。相反，泵使 得更容易地定量供給液體成為可能。管泵、活塞泵、隔膜泵、注射泵 等可作為泵使用，技術人員可根據目的從中選擇。
所述裝置的結構將被更具體地解釋。高壓電源在待噴霧的液體和 耙細胞之間產生電勢差。在本發(fā)明中，流經的電流的量很小，對其沒 有特別限制。lmA或更低就足夠了。高壓電源和管連到一起。它們可 通過高壓電纜相連。應用到待噴霧液體上的電壓可以是正的或負的。在本發(fā)明中，將 液滴噴霧到細胞上可以通過放電來進行，但是自然放電持續(xù)持續(xù)時間 長到損傷細胞是不優(yōu)選的。
所述管的材料可以是金屬、塑料、玻璃、陶瓷等，對其沒有特別 限制。但是，當使用非導電材料制成的管時，需要使用其中提供有與
液體相接觸的電極的管，或者在其表面涂布有導電物質的管。圖4示 意性顯示了管和高壓電源之間連接的例子。
當導電材料(例如金屬)用于A中示出的管時，管連接有電極， 使得供給其中的液體可被電荷化。B顯示了絕緣體(例如玻璃)用于 管的情況。在該情況中，導電電極(例如金屬)被放置于其中，以使 得液體被電荷化。C顯示了這樣的情況，其中，電極內部涂布有導電 物質，管的內部與高壓電源相連，以^使得液體^L電荷化。
管尖端的形狀不僅可以是直的，其還可以是錐形的，但是對其沒 有特別限制。此外，管可以是雙管結構，氣體可以與液體一起供給。 用于質譜的電噴霧管等可以用作為所述的管。此外，可使用可供給痕 量液體的納米噴霧，只要待轉移進細胞的物質的轉移效率不降低即可。
對于噴霧來說至少 一只管就是足夠的，但多只管使得將液體更廣 泛地噴霧到細胞表面成為可能，并且使得同時處理多個樣本成為可能。
其中細胞和待轉移進細胞的物質放到一起的容器并沒有被特別限 制，只要其可接收從管噴霧的液體，并且當噴霧在細胞聚集體(例如 菌落、組織和個體生物)上進行時，其是可應用的。例如，當細胞被 靶向時，容器(例如培養(yǎng)皿和試管)是易于使用的。
為對液體加以噴霧以將物質高效轉移進細胞，可制造出與地的連 接，以使得靜電勢消失，從而可獲得優(yōu)選范圍內的細胞和容器間電勢 差。具體地，當噴霧在與待轉移進細胞的物質一起放置于培養(yǎng)皿中的 細胞上進行時，優(yōu)選地，細胞通過培養(yǎng)皿中與細胞接觸的溶液或凝膠 與地相接。即使在可旋轉或被定位成使得細胞可均勻獲得液滴噴霧的 臺上放置或移動細胞時，也不會產生問題。
如果向裝置提供了電磁光學系統，那么噴霧的位置和液體噴霧上的區(qū)域程度就可被控制。例如，可通過將具有屏障(mask)、透鏡和 瞄準器功能的組分放到噴霧進行的區(qū)域上游，就可在更加固定的區(qū)域 上噴霧液滴。此外，四極透鏡等能對噴霧加以定位、掃描等等。對于 屏障功能而言，可使用有機聚合物材料、金屬或陶瓷制成的板狀(膜) 元件來確定噴霧范圍。此外，帶電荷的金屬屏障或電介質屏障元件可 用于透鏡和瞄準器功能。
在本發(fā)明中，待電噴霧的液體不一定要改變，其可以是同樣的液 體，即使細胞或待轉移物質的類型有所改變。因此，例如，可使用96 孔微板等容器，將不同物質連續(xù)轉移進每個孔中的不同細胞。例如， 如果每個孔中放有不同細胞與不同基因，那么可在短時間內進行高效 基因轉移。
具體地，例如，可通過將電噴霧管附著到可以以XY方向移動的臂 上，，來連續(xù)處理大量樣品。備選地，可以在XY臺上放置并移動細胞， 使得細胞可被移動。此外，可以使用沿著X軸移動的管和沿著Y軸移 動的臺的組合。移動機械可以是XY型的或者是階梯形的，電動、氣動 或人力中的任何可用作為這種移動的能量。它們還可被進一步提供機 械位置控制功能，使得可實現操作的自動化和節(jié)省勞力。
圖5顯示了具體移動機械。D是其中的臺以XY方向移動的機械。 E是其中的管以XY方向移動的機械。F是其中的管以X方向移動并且 其中的臺以Y方向移動的機械。
根據本發(fā)明，待轉移進細胞的物質或轉移所靶向的細胞的類型可 以改變，而無須改變待電噴霧的液體。此外，此類改變可通過應用上 述機械高效實現。此外，即使細胞被改變，待電噴霧的液體也無須改 變，從而可以實現高效轉移。此外，鑒于本發(fā)明中的主要耗材是待電 噴霧的液體，其可以是水，因此物質的轉移可以以非常低的成本進行。
此外，無需復雜流程，可通過電噴霧液體和將細胞與待轉移進細 胞的物質接觸，來將生物化學上重要的物質(例如基因)容易地轉移 進細胞。此外，在進行電噴霧之前，可以任選地加上除去用于細胞培 養(yǎng)的培養(yǎng)基或者用洗滌劑洗細胞等流程。下文中將通過實施例和比較實施例更具體地解釋本發(fā)明。但是， 本發(fā)明并不限于這些實施例。
實施例I-l
1. 實驗裝置
用于本實驗的裝置如圖6所示。
高壓電源1與管2通過高壓電纜相連，再進一步與地相接。管2 由不銹鋼制成，其是luer lock類型的，外徑為0. 36 mm,內徑是0. 18 mm。其與樣品注射端口 6相連。待噴霧的液體3從該樣品注射端口轉 移。泵5是供給空氣的管泵。通過該氣壓將待被電荷化的液體3推至 管。此時，經由纖維素乙酸鹽制成的過濾器8提供空氣。動物細胞和 待轉移進細胞的物質4倍放置到60匪的聚苯乙烯培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)皿 被設置到支柱10上。該支柱與地相接。培養(yǎng)皿的內部通過不銹鋼帶9 與支柱相連，使得內部與地相接。待噴霧的部分被設置于帶鋁框的丙 烯酸容器中，該容器具有272 x 260 x 370 mm的內部尺寸，HEPA清 潔單元7被設置在容器的頂部，其能以大約0. 25 m/s的速度以0. 5 m3/ 分鐘的量噴發(fā)(blast out )。清潔的空氣從頂部流下，在容器底部提 供了出口。
2. 將基因轉移進動物細胞 上述裝置l被用作為實驗裝置。
摻有綠色熒光蛋白(GFP)基因的質粒(4. 7 kbp)被用作為待轉 移進細胞的物質。從中華倉鼠卵巢活檢建立的成纖維細胞(CHO細胞) 被用作為細胞。CHO細胞以1.0 x 104的濃度被接種到35 mm的培養(yǎng)皿 上，在0)2培養(yǎng)箱中于37。C在a-MEM培養(yǎng)基+ 10% FBS組成的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)4天。用于細胞的培養(yǎng)基被移除，向其中加入濃度為50ng/mL 的100 pL質粒。
將100 nL水以從管尖端到支柱2 cm的JE巨離噴霧。此時，向管應 用-7 kV。電噴霧形式的水從管噴霧到培養(yǎng)皿中的動物細胞上。噴霧后， 培養(yǎng)基被放置于培養(yǎng)皿中，再培養(yǎng)4天。
17通過用熒光顯微鏡觀察到顯示出綠色熒光的細胞驗證了基因的轉
移。圖7顯示了轉移進GFP基因的CH0細胞的焚光顯微圖像。 實施例I-2
以與實施例1-1相同的方式來進行實驗，區(qū)別在于向細胞和質 粒溶液中進一步加入400 pL培養(yǎng)基后進行100 pL水的噴霧。此時， 向管應用-7kV。結果，通過用萸光顯微鏡觀察到顯示出綠色焚光的細 胞驗證了基因的轉移。
實施例I-3
以與實施例I-1相同的方式來進行實驗，區(qū)別在于向管應用-10 kV的電壓。結果，通過用焚光顯微鏡觀察到顯示出綠色熒光的細胞驗 證了基因的轉移。
實施例I-4
以與實施例I-1相同的方式來進行實驗，區(qū)別在于100(aL水被 噴霧到細胞上，而不加質粒。此時，向管應用-7kV,在噴霧后l分鐘 加入質粒溶液。結果，通過用熒光顯微鏡觀察到顯示出綠色熒光的細 胞驗證了基因的轉移。
實施例1-5
以與實施例1-1相同的方式來進行實驗。區(qū)別在于使用24孔聚 苯乙烯板作為容器，每個孔都與金屬地線相接。向管應用-10kV的電 壓。結果，通過用熒光顯微鏡觀察到每個孔中顯示出綠色熒光的細胞 驗證了基因的轉移。
比較實施例I-l
以與實施例I-l相同的方式來進行實驗，區(qū)別在于在混合質粒 之后不進行電噴霧。培養(yǎng)之后，用熒光顯微鏡觀察細胞，但是細胞沒有顯示出任何熒光，即，基因轉移失敗。
實施例II-l 1.實驗裝置
用于本實驗的裝置如圖6所示。高壓電源1與管2通過高壓電纜 相連，再進一步與地相接。管2由不銹鋼制成，其是luer lock類型 的，外徑為O. 36mm，內徑是O. 18mm。其與樣品注射端口6相連。待 噴霧的液體3從該樣品注射端口轉移。泵5是供給空氣的管泵。通過 該氣壓將待被電荷化的液體3推至管。此時，經由纖維素乙酸鹽制成 的過濾器8提供空氣。待使用的高壓電源l被提供有斷路器并且具有 1 mA的電流上限。細胞和待轉移進細胞的物質4倍放置到60 mm的聚 苯乙烯培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)皿被設置到支柱10上。該支柱與地相接。培養(yǎng) 皿的內部通過不銹鋼帶9與支柱相連，使得內部與地相接。待噴霧的 部分被設置于帶鋁框的丙烯酸容器中，該容器具有272 x 260 x W0譲 的內部尺寸，HEPA清潔單元7被設置在容器的頂部，其能以大約0. 25 m/s的速度以0.5 mV分鐘的量噴發(fā)(blast out)。清潔的空氣從頂 部流下，在容器底部提供了出口。
2..將物質轉移進細胞的實驗
將1. 5。/。的瓊脂糖-B培養(yǎng)基放在直徑為6 cm的聚苯乙烯培養(yǎng)皿中， 應Vf霧HB101菌林被接種到整個培養(yǎng)皿上，在25。C培養(yǎng)兩天， 以使得菌落長滿培養(yǎng)皿。
向培養(yǎng)基中加入IOO ^L質粒pUC19 (具有氨芐青霉素抗性基因) 的TE緩沖液(105 ng/ mL)。然后通過不銹鋼帶，將培養(yǎng)皿中的瓊 脂糖培養(yǎng)基與地相接，將100 水從2.5 cm的高度噴霧到 ^ c力eWc力/a co7i'菌落上。向管應用-7 kV。
噴霧后，刮下培養(yǎng)皿中的菌落細胞，加入LB培養(yǎng)基，并離心。獲 得的細菌細胞沉淀物被接種到含有氨千青霉素的1. 5。/。瓊脂糖-LB培養(yǎng) 基上，在30。C培養(yǎng)兩天。結果，菌落生長，顯示^c力er/c力/a coh' 獲得了氨芐青霉素抗性。實施例n-2
重復與實施例n-1中所示相同的流程，區(qū)別在于，在噴霧期間應
用-18 kV的電壓。獲得的經離心細菌細胞被接種到含有氨千青霉素的 1. 5%瓊脂糖-LB培養(yǎng)基上，在30。C培養(yǎng)兩天。結果，菌落生長，顯示 ^c力e/"/c力/a co7/獲得了氨爺青霉素抗性。
實施例II-3 電泳實驗
使用QIAGEN制造的質粒純化試劑盒，從實施例II-1和II-2獲得 的抗氨芐青霉素^ c力er/c力2'a co/Z和經歷了噴霧的HB101菌抹收集質 粒，然后在瓊脂糖凝膠上進行電泳。
結果，實施例II-l和II-2中獲得的抗氨爺青霉素菌林的質粒移 動到了與用于基因轉移的PUC19相同的電泳位置，這表明，通過使用 本發(fā)明的方法，待轉移進細胞的物質已經轉移進細胞。在HB101菌林 中沒有觀察到質粒(圖8)。
實施例II-4
裝備有用于移動噴霧位置的機械的小尺寸配送器機器人的噴嘴部 分被電噴霧管替換。該機器人具有可以在X軸方向改變噴嘴位置并且 在Y軸方向改變臺的位置的機械，使得噴霧進行的同時可以對位置加 以二維控制。具有四個孔的芯片狀板通過金屬線與地相連，進行噴霧。 通過移動噴霧管對所有四個孔都進行噴霧。
比較實施例II-l
童復與實施例II-l中所示相同的流程，區(qū)別在于，不進行噴霧。 獲得的經離心細菌細胞被接種到含有氨芐青霉素的1. 5%瓊脂糖-LB培 養(yǎng)基上，在30。C培養(yǎng)兩天。結果沒有菌落生長。比較實施例II-2
重復與實施例n-i中所示相同的流程，區(qū)別在于，噴霧期間不應
用電壓。獲得的經離心細菌細胞被接種到含有氨節(jié)青霉素的1.5%瓊脂 糖-LB培養(yǎng)基上，在30。C培養(yǎng)兩天。結果沒有菌落生長。
實施例ni-i (將基因轉移進雞胚的例子)
1. 實驗裝置
用于該實驗的電噴霧裝置如圖9所示。在圖9的裝置中，干電池 被用作為電源13，以提供3 V。該3 V被升壓電路11轉化為+10 kV， 以與槽12相連。槽12由導電塑料制成，其被絕緣塑料覆蓋，除了接 觸高電壓的部分。槽的容量大約10mL。內部提供了氣缸17，當軸18 通過馬達19旋轉時，槽中的液體被轉移至不銹鋼管16，所述不銹鋼 管具有O.lmm的內徑，并且具有與luer lock型的接合點15相連的 luer lock。待噴霧液體從管中的供應速度是120 ^L/分鐘。在該裝置 中，升壓電路ll、槽12、電源13、氣缸17、軸18和馬達19被裝納 于裝置箱14中，通過裝置箱14外側表面上提供的開關20來操作噴霧。
2. 將基因轉移進雞胚的實驗
用于本實驗中的磷酸鹽緩沖液(PBS)是由8 g/L NaCl、 0. 2 g/L KC1、 2.9 g/L NaHP(V12H20和0. 2 g/L 0^04組成的pH 7. 3的溶液。
蛋孵化(37. 8°C)其實后一天半，移出雞胚，將其放到蛋白和瓊 脂的混合培養(yǎng)基上。向靶向區(qū)域逐滴加入0.1 pL濃度為4.3 pg/nL 的質粒(4.7 kba)溶液，其中摻有綠色熒光蛋白(GFP)基因(通過 上述PBS中2% Fast Green令其發(fā)色)。30秒后，使用上述電噴霧裝 置從10 cm的高度對上述PBS進行電噴霧15秒，同時通過顯微鏡加以 監(jiān)測。在37.8。C孵育細胞，第二天用熒光立體顯微鏡觀察。結果顯示 于圖10中。在圖10中，在全長6-7 mm的1 mm區(qū)域中觀察到了 GFP 的表達，這驗證了基因已被轉移。
21符號描述
材料A:待轉移進細胞的物質。
材料B:不含待轉移進細胞的物質的液體。
細胞中的材料A:待轉移進細胞的物質已經轉移進去的細胞。
1:高壓電源。
2:管。
3. 不含待轉移進細胞的物質的液體(材料B)。
4. 細胞(細胞)和待轉移進細胞的物質(材料A)。
5. 管泵。
6. 液體(材料B)注射端口。
7. 清潔單元。
8. 纖維素乙酸鹽過濾器。
9. 用于接地的不銹鋼帶。
10. 支柱。
11. 升壓電路。
12. 槽。
13. 電源。
14. 裝置箱。
15. luer lock型接合點。
16. 管。
17. 氣缸。
18. 軸。
19. 馬達。
20. 開關。
A:其中導電材料用于管的情況。
B:其中使用絕緣體(例如玻璃)的情況。
C:其中電極內部涂布有導電材料的情況。
D:其中裝置具有使得所述臺以XY方向移動的機械的情況。
E:其中裝置具有使得所述管以XY方向移動的機械的情況。F:其中裝置具有使得所述管以X方向移動以及所述臺以Y方向移 動的機械的情況。
道a: 大小標記。 道b: pUC19。 道c: HB101菌林。 道d:實施例II-l。 道e:實施例II-2。
權利要求
1. 將物質轉移進細胞的方法，所述方法包括電噴霧不含待轉移進細胞的物質的液體，使得液滴產生，并與細胞相接觸，以將所述物質轉移進所述細胞。
2. 根據權利要求1的將物質轉移進細胞的方法，其中所述液滴與 和所述待轉移進細胞的物質共存的細胞相接觸。
3. 根據權利要求1的將物質轉移進細胞的方法，其中所述液滴首 先與所述細胞接觸，然后所述細胞與所述待轉移進細胞的物質接觸。
4. 根據權利要求3的將物質轉移進細胞的方法，其中所述細胞與 所述待轉移進細胞的物質在所述液滴與所述細胞接觸后的30分鐘或更 少的時間內相接觸。
5. 根據權利要求1的將物質轉移進細胞的方法，其中所述液體和 所述細胞之間的電勢差為0. 1 kV至100 kV。
6. 根據權利要求1的將物質轉移進細胞的方法，其中被電噴霧的 所述液體是不含所述待轉移進細胞的物質的水或不含所述待轉移進細 胞的物質的水性溶液。
7. 根據權利要求1的將物質轉移進細胞的方法，其中所述待轉移 進細胞的物質是基因。
8. 細胞，其中，待轉移進細胞的物質已經通過權利要求1至7中 任一項所述的方法轉移進去。
9. 用于通過權利要求1至7中任一項所述的方法將物質轉移進細胞 的裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種方法，通過該方法，可以通過方便的流程將多種類型的、想要轉移進細胞的物質連續(xù)轉移進多種類型的細胞，本發(fā)明還提供了細胞，其已經通過該方法吸納了想要轉移進細胞的物質，本發(fā)明還提供了用于通過該方法將物質轉移進細胞的裝置。前述目標可通過下述過程實現用不含待轉移進細胞的物質的液體對細胞進行電噴霧，同時細胞保持與待轉移進細胞的物質相接觸，或者首先用不含待轉移進細胞的物質的液體對細胞進行電噴霧，然后將細胞與所述待轉移進細胞的物質相接觸。
文檔編號C12N15/87GK101473033SQ20078002274
公開日2009年7月1日 申請日期2007年5月16日 優(yōu)先權日2006年5月16日
發(fā)明者坂井貴文, 坂田一郎, 大久保佑亮, 小池加奈子, 池本一人, 相澤清香 申請人:三菱瓦斯化學株式會社;國立大學法人埼玉大學