專利名稱：具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的nac轉(zhuǎn)錄因子受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物和用于產(chǎn)生該植物的方法
專利說(shuō)明具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的NAC轉(zhuǎn)錄因子受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物和用于產(chǎn)生該植物的方法 本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于在植物中增強(qiáng)多種經(jīng)濟(jì)上重要的產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。更具體地，本發(fā)明涉及在植物中通過(guò)調(diào)節(jié)編碼特定類型的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸在植物中表達(dá)而在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。
另外，本發(fā)明涉及在植物中通過(guò)調(diào)節(jié)編碼Apetala 2-2(AP2-2)多肽的核酸在植物中表達(dá)而增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼AP2-2多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明涉及在植物中通過(guò)調(diào)節(jié)編碼APETALA2-70-樣(AP2-70-樣)多肽的核酸在植物中表達(dá)而增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼AP2-70-樣多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還提供用于實(shí)施本發(fā)明方法的迄今未知的AP2-70-樣編碼核酸，和包含此核酸的構(gòu)建體。
持續(xù)增長(zhǎng)的世界人口和農(nóng)業(yè)用可耕地供應(yīng)萎縮刺激了有關(guān)增加農(nóng)業(yè)效率的研究。常規(guī)的作物及園藝學(xué)改良手段利用選擇育種技術(shù)以鑒定具有受歡迎特性的植物。然而，此類選擇育種技術(shù)具有幾個(gè)缺陷，即這些技術(shù)一般耗費(fèi)很多勞動(dòng)并且產(chǎn)生這樣的植物，其經(jīng)常含有異源性遺傳組分，其可能不總是導(dǎo)致從親代植物中傳遞的所希望性狀。分子生物學(xué)進(jìn)展已經(jīng)允許人類改良動(dòng)物及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(zhì)(一般以DNA或RNA的形式)并且隨后引入該遺傳物質(zhì)至植物中。此類技術(shù)具有產(chǎn)生具備多種經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)學(xué)和園藝學(xué)改良性狀的作物或植物的能力。
具有特殊經(jīng)濟(jì)意義的性狀是增加的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為來(lái)自作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可測(cè)量結(jié)果。該結(jié)果可以就數(shù)量和/或品質(zhì)方面進(jìn)行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個(gè)因素，例如器官的數(shù)目和大小、植物構(gòu)造(例如枝條的數(shù)目)、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、養(yǎng)分?jǐn)z入量、脅迫耐受性和早期生長(zhǎng)勢(shì)(early vigor)也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化前述因素因而可以對(duì)增加作物產(chǎn)量有貢獻(xiàn)。
種子產(chǎn)量是特別重要的性狀，因?yàn)樵S多植物的種子對(duì)于人和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)是非常重要的。無(wú)論是通過(guò)直接的種子本身的消費(fèi)還是通過(guò)建立在加工的種子上的肉產(chǎn)品的消費(fèi)，農(nóng)作物例如玉米、稻、小麥、卡諾拉油菜(canola)和大豆占據(jù)了總的人熱量攝入的一半以上。它們還是糖、油和許多種類的用于工業(yè)加工的代謝產(chǎn)物的來(lái)源。種子包含胚(新的芽和根的來(lái)源)和胚乳(在萌發(fā)和幼苗的早期生長(zhǎng)中用于胚生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源)。種子的發(fā)育牽涉許多基因，且需要將代謝產(chǎn)物從根、葉和莖轉(zhuǎn)移入生長(zhǎng)的種子。胚乳，特別可以同化糖類、油和蛋白質(zhì)的代謝前體，將其合成為貯藏大分子充填種子。
對(duì)于眾多作物的另一個(gè)經(jīng)濟(jì)上重要的性狀是早期生長(zhǎng)勢(shì)。改進(jìn)早期生長(zhǎng)勢(shì)是現(xiàn)代稻育種計(jì)劃在溫帶和熱帶稻品種上的重要目標(biāo)。長(zhǎng)根在水栽稻中對(duì)于正確土壤固定是重要的。在將稻直接播種至被淹沒(méi)田地的情況下，以及在植物必須從水中迅速出苗的情況下，較長(zhǎng)的苗與生長(zhǎng)勢(shì)相關(guān)。在實(shí)施條播的情況下，較長(zhǎng)的中胚軸和胚芽鞘對(duì)于良好出苗是重要的。早期生長(zhǎng)勢(shì)也可由增加的植物適應(yīng)性而導(dǎo)致，所述植物適應(yīng)性的增加可以歸因于例如植物對(duì)其環(huán)境的更好適應(yīng)化(即更能夠應(yīng)對(duì)各種非生物或生物的脅迫因素)。具有早期生長(zhǎng)勢(shì)的植物還顯示更好的作物齊苗(establishment of thecrop)(農(nóng)作物以更均一的方式生長(zhǎng)，即大部分植物在基本上相同的時(shí)間達(dá)到發(fā)育的各階段)，和顯示更好的生長(zhǎng)和通常更高的產(chǎn)量。
又一個(gè)重要性狀是改進(jìn)的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是世界范圍作物損失的主要原因，對(duì)于大多數(shù)主要作物植物而言降低平均產(chǎn)量超過(guò)50％(Wang等人，Planta(2003)2181-14)。非生物脅迫可以由干旱、鹽、極端溫度、化學(xué)毒性和氧化脅迫引起。對(duì)于世界范圍的農(nóng)民，提高植物耐受非生物脅迫的能力具有巨大的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，其使得可在不利的條件下和在原本可能不能栽培農(nóng)作物的地區(qū)栽培農(nóng)作物。
在植物中操縱非生物脅迫耐受性或早期生長(zhǎng)勢(shì)的能力將對(duì)農(nóng)業(yè)非常重要，其將成為增加植物種子產(chǎn)量的能力(無(wú)論是否通過(guò)種子數(shù)、種子生物量、種子發(fā)育、種子飽滿(seed filling)或其他任何種子相關(guān)性狀)。除了在諸如觀賞植物的生產(chǎn)、樹木栽培(aboriculture)、園藝學(xué)和林業(yè)中的多種農(nóng)業(yè)用途之外，增加的產(chǎn)量還具有多種非農(nóng)業(yè)用途，例如用于在生物反應(yīng)器中使用的藻類生產(chǎn)(用于諸如藥物、抗體或疫苗的物質(zhì)的生物技術(shù)生產(chǎn)，或用于有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化)及其他這類領(lǐng)域。
轉(zhuǎn)錄因子通常定義為顯示序列特異性DNA結(jié)合，和能夠激活和/或抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。擬南芥基因組編碼至少1533個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，這占其估計(jì)的基因總數(shù)的～5.9％。報(bào)導(dǎo)大約45％的這些轉(zhuǎn)錄因子來(lái)自植物特異性家族(Riechmann等人，2000(Science Vol.290，2105-2109)). 本發(fā)明涉及特定類型的NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的用途。
NAC是取自首次描述為包含NAC結(jié)構(gòu)域的三個(gè)基因的首字母的縮寫詞，所述三個(gè)基因即NAM(無(wú)頂端分生組織)、ATAF1，2和CUC2(杯狀子葉)。NAC蛋白質(zhì)似乎在植物中廣泛分布，估計(jì)擬南芥基因組至少含有100個(gè)NAC-編碼基因，但是至今沒(méi)有在其他真核生物中發(fā)現(xiàn)任何實(shí)例(Riechmann等人，2000). NAC蛋白質(zhì)家族包含多個(gè)植物蛋白質(zhì)，它們通過(guò)存在高度保守的N-末端NAC結(jié)構(gòu)域以及不同的C-末端結(jié)構(gòu)域鑒定。NAC蛋白質(zhì)的DNA-結(jié)合能力通常定位在NAC結(jié)構(gòu)域，C-末端區(qū)組成轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。已發(fā)現(xiàn)幾個(gè)NAC基因是激素誘導(dǎo)的。已提示NAC結(jié)構(gòu)域與其他蛋白質(zhì)相互作用，所述蛋白質(zhì)例如病毒蛋白質(zhì)和環(huán)指蛋白(RING finger protein)。還已提示NAC蛋白質(zhì)在多種植物過(guò)程的轉(zhuǎn)錄控制(中起作用)，所述植物過(guò)程包括莖端分生組織和花器官的發(fā)育，以及側(cè)根的形成。還已提示NAC蛋白質(zhì)響應(yīng)脅迫和病毒感染，Ernst等人，2004(EMBO Reports 5，3，297-303)。
US專利6,844,486描述了分離自擬南芥的NAC家族成員、NACI。據(jù)報(bào)道NACl涉及子葉和側(cè)生根的發(fā)育調(diào)控。據(jù)報(bào)導(dǎo)nacI基因的超表達(dá)產(chǎn)生相對(duì)于野生型植物的更大的植物，其具有更大的根和更多的側(cè)生根。
令人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在植物中調(diào)節(jié)編碼特定類型的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的表達(dá)產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物，具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。適合于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的特定類型的NAC轉(zhuǎn)錄因子詳述于下。
本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)照植物，在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中調(diào)節(jié)編碼特定類型的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的表達(dá)。
另外，本發(fā)明涉及Apetala型轉(zhuǎn)錄因子AP2-2用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的用途。
AP2(APETALA2)和EREBP(乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白，或ERF，乙烯響應(yīng)因子)是植物獨(dú)有的轉(zhuǎn)錄因子家族的原型成員(prototypic member)，其區(qū)別性特征是其含有所謂的AP2DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。AP2/EREBP基因來(lái)自大的多基因家族(AP2/ERF超家族)，且在植物的生命周期中發(fā)揮多種作用從幾個(gè)發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物(例如花器官識(shí)別鑒定(floral organidentity determination)或控制葉表皮細(xì)胞識(shí)別)，至成為植物響應(yīng)多種類型的生物和環(huán)境脅迫中使用的機(jī)制的部分。在AP2/ERF超家族中，區(qū)分了3個(gè)大的家族具有兩個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的AP2家族、具有單個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的ERF家族和包含B3-型DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAV家族。Nakano等人(Plant Physiology 140，411-432，2006)在擬南芥和稻中研究了ERF基因家族，并將擬南芥ERF基因家族劃分為12個(gè)組(命名為I組至X組，和VI-樣組和Xb-樣組)，而在稻中區(qū)分為15個(gè)組。擬南芥VII組蛋白質(zhì)特征在于保守的N-末端基序，稱為保守基序VII-1(CMVII-1)。在稻中，VII組包含的蛋白質(zhì)超過(guò)擬南芥的VII組中的蛋白質(zhì)，并且雖然在稻和擬南芥的VII組中共有許多保守基序，對(duì)于缺乏這種典型的CMVII-1基序的序列產(chǎn)生單獨(dú)的稻的VIIb組。功能上的，VII組的成員被描述為參與滲透脅迫和疾病響應(yīng)(例如在WO 2003007699中)。番茄JERF3在煙草中的異位超表達(dá)增加轉(zhuǎn)基因物(transgenics)的鹽耐受(Wang等人，Plant Molecular Biology 58，183-192，2004)，以及胡椒轉(zhuǎn)錄因子CaPF1的超表達(dá)導(dǎo)致松樹中滲透耐受的增加(Tang等人，Plant Cell Rep.26，115-124，2007)，但是也增加擬南芥中的病原體抗性(Yi等人，Plant Physiol.136，2862-2874，2004)。大麥HvRAF具有相似的觀察結(jié)果(Jung等人，PlantaEpub 26，2006年8月)。此外，VII組型ERF蛋白質(zhì)可用于制備甲硫氨酸的方法中(EP2005003297)。
令人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在植物中調(diào)節(jié)編碼VII組ERF蛋白質(zhì)(此后稱為AP2-2多肽)的核酸的表達(dá)產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物，具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。這些增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀不是增加的脅迫抗性的結(jié)果。
ERF(乙烯響應(yīng)因子)家族是轉(zhuǎn)錄因子的大的基因家族，并且是AP2/ERF超家族(還含有AP2和RAV家族)的部分。AP2/ERF超家族通過(guò)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域定義，所述AP2/ERF結(jié)構(gòu)域由60-70個(gè)氨基酸組成，并參與DNA結(jié)合。已定義了下面的三個(gè)家族。AP2家族的蛋白質(zhì)包含兩個(gè)重復(fù)的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域、ERF家族的蛋白質(zhì)包含單個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，且RAV家族的蛋白質(zhì)包含B3結(jié)構(gòu)域，所述B3結(jié)構(gòu)域是除了單個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域外在其他植物特異性轉(zhuǎn)錄因子中保守的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括VP1/ABI3。ERF家族有時(shí)還可以劃分為兩個(gè)主要的亞家族，ERF亞家族和CBF/DREB亞家族。已在擬南芥基因組的AP2/ERF超家族中鑒定了147個(gè)基因，包括ERF家族中的122個(gè)基因。AP2結(jié)構(gòu)域首次鑒定為擬南芥AP2蛋白質(zhì)中的重復(fù)基序，所述AP2蛋白質(zhì)參與花的發(fā)育。Nakano等人，2006(Plant Physiol.，140卷，411-432頁(yè)). Nakano等人，2006還報(bào)導(dǎo)AP2家族中的基因已顯示參與發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)，所述發(fā)育過(guò)程例如花的發(fā)育、小穗分生組織確定、葉表皮細(xì)胞識(shí)別和胚的發(fā)育。已經(jīng)鑒定ERF家族中的幾個(gè)蛋白質(zhì)，它們涉及細(xì)胞過(guò)程中的一些不同功能，例如激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、響應(yīng)生物和非生物脅迫，以及調(diào)節(jié)代謝，并且涉及多種植物物種的發(fā)育過(guò)程。
令人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在植物中調(diào)節(jié)編碼AP2-70-多肽的核酸的表達(dá)產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物，具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。
文中所述的可用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的AP2-70-多肽根據(jù)Nakano等人，2006的分類系統(tǒng)，屬于Ib組(A-6)。Nakano報(bào)導(dǎo)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的玉米胼胝體中來(lái)自玉米(玉蜀黍)的DBF1——Ib組的成員，顯示激活A(yù)BA-響應(yīng)rab17的干旱響應(yīng)元件2(DRE2)-依賴性轉(zhuǎn)錄。據(jù)報(bào)導(dǎo)Ib組的另一成員，蒺藜苜蓿WXP1的超表達(dá)激活wax在轉(zhuǎn)基因苜蓿中的產(chǎn)生。
定義 多肽/蛋白質(zhì) 術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”在文中可互換使用并且指處于任意長(zhǎng)度聚合形式，以肽鍵連接的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列 術(shù)語(yǔ)＂多核苷酸＂、＂核酸序列＂、＂核苷酸序列＂、“核酸”、“核酸分子”在文中可互換使用并且指處于任意長(zhǎng)度聚合、無(wú)分支形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二者組合。
對(duì)照植物 選擇合適的對(duì)照植物是實(shí)驗(yàn)設(shè)置的常規(guī)部分，并且可以包括對(duì)應(yīng)的野生型植物或無(wú)目的基因的對(duì)應(yīng)植物。對(duì)照植物一般是與待評(píng)估植物相同的植物物種或甚至是相同的變種。對(duì)照植物也可以是待評(píng)估植物的失效合子。失效合子是由于分離丟失轉(zhuǎn)基因的個(gè)體。如文中所用的“對(duì)照植物”不僅指整株植物，還指植物部分，包括種子及種子部分。
同源物 蛋白質(zhì)的“同源物”包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶，它們相對(duì)于非修飾的上述蛋白質(zhì)具有氨基酸置換、缺失和/或插入并且與所述肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶來(lái)源的非修飾蛋白質(zhì)具有相似生物學(xué)活性和功能活性。
缺失指從蛋白質(zhì)中移除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
插入指一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)中預(yù)定位點(diǎn)內(nèi)的引入。插入可以包含單個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列內(nèi)插入。通常，在氨基酸序列內(nèi)部的插入會(huì)比氨基端融合或羧基端融合更小，約1-10個(gè)殘基級(jí)別。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的實(shí)例包括如酵母雙雜交系統(tǒng)中所用轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG

-表位、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
置換指以具有相似特性(如相似疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-折疊結(jié)構(gòu)的傾向)的其他氨基酸替換蛋白質(zhì)的氨基酸。氨基酸置換一般是單個(gè)殘基的，不過(guò)可以是簇集性的，這取決于置于多肽的功能性約束；插入通常會(huì)是約1-10個(gè)氨基酸殘基級(jí)別。氨基酸置換優(yōu)選地是保守性氨基酸置換。保守性置換表是本領(lǐng)域眾所周知的(見(jiàn)例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(編著)和下表1)。
表1保守性氨基酸置換的實(shí)例 氨基酸置換、缺失和/或插入可以使用本領(lǐng)域眾所周知的肽合成技術(shù)如固相肽合成法等或通過(guò)重組DNA操作而輕易地進(jìn)行。用于操作DNA序列以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的置換、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，用于在DNA中的預(yù)定位點(diǎn)處產(chǎn)生置換突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且包括M13誘變法、T7-Gen體外誘變法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位點(diǎn)定向誘變法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導(dǎo)的位點(diǎn)定向誘變或其他位點(diǎn)定向誘變法。
衍生物 “衍生物”包括這樣的肽、寡肽、多肽，其中與天然存在形式的蛋白質(zhì)(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它們包含以非天然存在的氨基酸殘基對(duì)氨基酸的置換或非天然存在的氨基酸殘基的添加。蛋白質(zhì)的“衍生物”也包含這樣的肽、寡肽、多肽，其中與多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它們包含天然存在的改變(糖基化、?；?、異戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻?；⒘蛩猁}化等)氨基酸殘基或非天然的改變氨基酸殘基。與衍生物所來(lái)源的氨基酸序列相比，該衍生物可以也包含與所述氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)非氨基酸取代基或添加(例如報(bào)道分子或其他配體)，如為促進(jìn)檢測(cè)該衍生物而結(jié)合的報(bào)道分子，和與天然存在的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相對(duì)比的非天然存在的氨基酸殘基。另外，“衍生物”也包括天然發(fā)生的蛋白質(zhì)形式和諸如FLAG、HIS6或硫氧還蛋白(標(biāo)簽肽的綜述參見(jiàn)Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的標(biāo)簽肽的融合物。
直向同源物/旁系同源物 直向同源物和旁系同源物包含用來(lái)描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是相同物種內(nèi)起源于先祖基因復(fù)制的基因；直向同源物是通過(guò)物種起源來(lái)自不同生物的基因，也源自相同的先祖基因。
結(jié)構(gòu)域 術(shù)語(yǔ)”結(jié)構(gòu)域＂指沿進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)的序列比對(duì)結(jié)果而在特定位置處保守的一組氨基酸。盡管在其他位置處的氨基酸可以在同源物之間變動(dòng)，然而在特定位置處的高度保守的氨基酸指示在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或功能方面可能是必需的氨基酸。結(jié)構(gòu)域因通過(guò)在蛋白質(zhì)同源物家族的比對(duì)序列中的高保守程度而被鑒定，它們可以用作鑒定物以確定任意的所討論多肽是否屬于先前已鑒定的多肽家族。
基序/共有序列/標(biāo)簽 術(shù)語(yǔ)”基序”或“共有序列”或“標(biāo)簽”指在進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)的序列中的短保守區(qū)。基序往往是結(jié)構(gòu)域的高度保守部分，不過(guò)也可以僅包括結(jié)構(gòu)域的部分，或可以位于保守結(jié)構(gòu)域之外(若基序的全部氨基酸位于定義的結(jié)構(gòu)域之外)。
雜交 如文中所定義的術(shù)語(yǔ)”雜交＂是其中基本上同源的互補(bǔ)核苷酸序列相互復(fù)性的過(guò)程。雜交過(guò)程可以完全在溶液中進(jìn)行，即兩種互補(bǔ)性核酸均處于溶液中。雜交過(guò)程也可以在互補(bǔ)性核酸之一固定到基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖(Sepharose)珠或任何其他樹脂的情況下發(fā)生。雜交過(guò)程也可以在互補(bǔ)性核酸之一固定至固相支持體如硝酸纖維素膜或尼龍膜上或通過(guò)例如照相平版印刷術(shù)固定至例如硅酸玻璃支持物(后者稱作核酸陣列或微陣列或稱作核酸芯片)上的情況下進(jìn)行。為使雜交發(fā)生，通常將核酸分子熱變性或化學(xué)變性以使雙鏈解鏈成為兩條單鏈和/或去除來(lái)自單鏈核酸的發(fā)夾或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)。
術(shù)語(yǔ)”嚴(yán)格性”指在其中發(fā)生雜交的條件。雜交的嚴(yán)格性受條件如溫度、鹽濃度、離子強(qiáng)度和雜交緩沖液組成影響。通常，將低嚴(yán)格性條件選擇為在確定的離子強(qiáng)度及pH時(shí)低于特定序列熱解鏈溫度(Tm)約30℃。中等嚴(yán)格性條件是此時(shí)溫度低于Tm約20℃并且高嚴(yán)格性條件是此時(shí)溫度低于Tm約10℃。高嚴(yán)格性雜交條件一般用于分離與靶核酸序列具有高序列相似性的雜交序列。然而，核酸可以在序列上偏離并且因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而依舊編碼基本上相同的多肽。因而有時(shí)候可能需要中等嚴(yán)格性雜交條件以鑒定此類核酸分子。
Tm是在確定的離子強(qiáng)度及pH時(shí)的溫度，在所述溫度下50％的靶序列與完全匹配的探針雜交。Tm取決于溶液條件和探針的堿基組成及長(zhǎng)度。例如，較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性地雜交。從低于Tm約16℃直至32℃獲得最大雜交速率。一價(jià)陽(yáng)離子在溶液中的存在降低了兩條核酸鏈間的靜電排斥，因而促進(jìn)雜交分子形成；這種作用對(duì)于高達(dá)0.4M的鈉濃度是明顯的(對(duì)于更高濃度，這種效應(yīng)可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分?jǐn)?shù)甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允許在30-45℃進(jìn)行雜交，雖然雜交速率會(huì)降低。堿基對(duì)錯(cuò)配降低了雜交速率及雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言并且對(duì)于大的探針來(lái)說(shuō)，每％堿基錯(cuò)配Tm下降約1℃。取決于雜交分子的類型，Tm可以使用下列等式計(jì)算 1)DNA-DNA雜交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138267-284，1984) Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61x％甲酰胺 2)DNA-RNA或RNA-RNA雜交分子 Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cbb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc 3)寡DNA或寡RNAd雜交分子 對(duì)于<20個(gè)核苷酸Tm＝2(ln) 對(duì)于20-35個(gè)核苷酸Tm＝22+1.46(ln) a或?qū)τ谄渌粌r(jià)陽(yáng)離子，但是僅在0.01-0.4M范圍內(nèi)是精確的。
b僅對(duì)于％GC在30％-75％范圍內(nèi)是精確的。
cL＝雙鏈體的長(zhǎng)度(以堿基對(duì)計(jì))。
doligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效長(zhǎng)度＝2×(G/C數(shù))+(A/T數(shù))。
可以眾多已知技術(shù)的任何一種控制非特異性結(jié)合，例如用含蛋白質(zhì)的溶液封閉薄膜、添加異源性RNA、異源性DNA及SDS至雜交緩沖液并且用RNA酶處理。對(duì)于非同源性探針，一系列雜交可以通過(guò)改變以下條件之一進(jìn)行(i)漸進(jìn)地降低復(fù)性溫度(例如從68℃至42℃)或(ii)漸進(jìn)地降低甲酰胺濃度(例如從50％至0％)。技術(shù)人員了解雜交期間可以加以改變和將維持或改變嚴(yán)格性條件的多種參數(shù)。
除雜交條件之外，雜交特異性一般還取決于雜交后洗滌的功能。為除去因非特異性雜交所致的背景，樣品用稀釋的鹽溶液洗滌。此類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度及溫度鹽濃度越低并且洗滌溫度越高，則洗滌的嚴(yán)格性越高。洗滌條件一般在雜交嚴(yán)格性上或低于雜交嚴(yán)格性而進(jìn)行。陽(yáng)性雜交產(chǎn)生至少兩倍于背景信號(hào)的信號(hào)。通常，用于核酸雜交分析法或基因擴(kuò)增檢測(cè)方法的合適嚴(yán)格性條件如上所述。也可以選擇更嚴(yán)格或更不嚴(yán)格的條件。技術(shù)人員了解洗滌期間可以加以改變和將維持或改變嚴(yán)格性條件的多種參數(shù)。
例如，用于長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸的DNA雜交分子的常見(jiàn)高嚴(yán)格性雜交條件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中雜交，隨后在65℃于0.3×SSC中洗滌。用于長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸的DNA雜交分子的中等嚴(yán)格性雜交條件的實(shí)例包括在55℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中雜交，隨后在50℃于2×SSC中洗滌。雜交分子的長(zhǎng)度是雜交核酸的預(yù)期長(zhǎng)度。當(dāng)序列已知的核酸雜交時(shí)，可以通過(guò)比對(duì)序列并鑒定文中所述的保守區(qū)而確定雜交分子長(zhǎng)度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉；雜交溶液和洗滌溶液可以額外地包含5×Denhardt試劑、0.5-1.0％SDS、100μg/ml變性的片段化鮭精DNA、0.5％焦磷酸鈉。
為了定義嚴(yán)格性水平的目的，可以參考Sambrook等人(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第三版Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York或參考Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。
剪接變體 如文中所用的術(shù)語(yǔ)”剪接變體”包含其中已經(jīng)切除、替換、移位或添加所選內(nèi)含子和/或外顯子或其中內(nèi)含子已經(jīng)縮短或加長(zhǎng)的核酸序列的變體。此類變體將是其中基本上保留了蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的一種變體；這可以通過(guò)選擇性保留蛋白質(zhì)的功能性片段而實(shí)現(xiàn)。此類剪接變體可以在自然界中找到或可以人工制造。用于預(yù)測(cè)和分離此類剪接變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(見(jiàn)例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics，625)。
等位變體 等位基因或等位變體是給定基因的取代形式，位于相同染色體位置內(nèi)。等位變體包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)和小插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多態(tài)性株系中序列變體的最大集合。
基因改組/定向進(jìn)化 基因改組或定向進(jìn)化的組成為反復(fù)DNA改組，隨后適當(dāng)篩選和/或選擇以產(chǎn)生編碼具有改良生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的核酸或其部分的變體(Castle等人，(2004)Science 304(5674)1151-4；美國(guó)專利5,811,238和6,395,547)。
調(diào)節(jié)元件/調(diào)控序列/啟動(dòng)子 術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”、“調(diào)控序列”和“啟動(dòng)子”均在文中可互換使用并且在廣義上意指能夠?qū)崿F(xiàn)與之連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)性核酸序列。術(shù)語(yǔ)”啟動(dòng)子”一般指位于基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游并參與識(shí)別及結(jié)合RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)，因而指導(dǎo)有效連接的核酸轉(zhuǎn)錄的核酸調(diào)控序列。前述術(shù)語(yǔ)包括從典型的真核基因組基因(包括對(duì)于精確轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)所需的TATA盒，具有或沒(méi)有CCAAT盒序列)中衍生的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和應(yīng)答發(fā)育刺激和/或外部刺激或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的額外調(diào)節(jié)元件(如，上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)。本術(shù)語(yǔ)還包括典型的原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在此情況下它可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”也包含賦予、激活或增強(qiáng)核酸分子在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)的合成的融合分子或衍生物。
“植物啟動(dòng)子”包含介導(dǎo)編碼序列區(qū)段在植物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。因此，植物啟動(dòng)子不需要是植物來(lái)源的，而是可以源自病毒或微生物，例如來(lái)自侵襲植物細(xì)胞的病毒。“植物啟動(dòng)子”也可以源自植物細(xì)胞，例如來(lái)自用待于本發(fā)明方法中表達(dá)及在文中描述的核酸序列所轉(zhuǎn)化的植物。這也適用于其他“植物”調(diào)節(jié)性信號(hào)，如“植物”終止子。用于本發(fā)明方法中的核苷酸序列的啟動(dòng)子上游可以由一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、插入和/或缺失而受到修飾，但不干擾啟動(dòng)子、可讀框(ORF)或3′調(diào)節(jié)區(qū)如終止子或遠(yuǎn)離ORF的其他3′調(diào)節(jié)區(qū)的功能性或活性。啟動(dòng)子的活性還有可能因修飾該啟動(dòng)子的序列或由更活躍的啟動(dòng)子、甚至來(lái)自異源生物的啟動(dòng)子徹底替換該啟動(dòng)子而增加。為在植物中表達(dá)，如上所述，核酸分子必須有效連接至或包含合適的啟動(dòng)子，其中所述的啟動(dòng)子在正確時(shí)間點(diǎn)上并以所需要的空間表達(dá)模式表達(dá)基因。
為鑒定功能性等效啟動(dòng)子，候選啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式可以通過(guò)將該啟動(dòng)子與報(bào)道基因有效連接并分析該報(bào)道基因在植物多種組織的表達(dá)水平和模式而進(jìn)行分析。合適的公知報(bào)道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。啟動(dòng)子活性通過(guò)測(cè)量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性進(jìn)行分析。啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式隨后可以與參考啟動(dòng)子(如本發(fā)明方法中所用的一種啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式比較。備選地，啟動(dòng)子強(qiáng)度可以使用本領(lǐng)域已知方法如Northern印跡法及放射自顯影圖的密度計(jì)分析法、定量實(shí)時(shí)PCR或RT-PCR(Heid等人，1996Genome Methods 6986-994)，通過(guò)定量mRNA水平或通過(guò)將本發(fā)明方法中所用核酸的mRNA水平與持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比較而分析。通?！叭鯁?dòng)子”意指驅(qū)動(dòng)編碼序列在低水平上表達(dá)的啟動(dòng)子?！暗退健币庵冈诿總€(gè)細(xì)胞約1/10,000轉(zhuǎn)錄物至約1/100,000轉(zhuǎn)錄物、至約1/500,0000轉(zhuǎn)錄物的水平上。相反，“強(qiáng)啟動(dòng)子”驅(qū)動(dòng)編碼序列在高水平、或在每個(gè)細(xì)胞約1/10轉(zhuǎn)錄物至約1/100轉(zhuǎn)錄物、至約1/1,000轉(zhuǎn)錄物上表達(dá)。
有效連接 如文中所用的術(shù)語(yǔ)”有效連接”指啟動(dòng)子序列與目的基因之間功能性地連接，以至于啟動(dòng)子序列能夠啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄。
組成型啟動(dòng)子 “組成型啟動(dòng)子”指在生長(zhǎng)和發(fā)育的大部分、但不必全部階段期間和在大部分環(huán)境條件下在至少一個(gè)細(xì)胞、組織或器官內(nèi)有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。下表2a給出組成型啟動(dòng)子的實(shí)例。
表2a組成型啟動(dòng)子的實(shí)例 遍在啟動(dòng)子 遍在啟動(dòng)子在生物基本上所有組織或細(xì)胞內(nèi)有活性。
發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子 發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子在某個(gè)發(fā)育期期間或在經(jīng)歷發(fā)育變化的植物部分內(nèi)有活性。
誘導(dǎo)性啟動(dòng)子 誘導(dǎo)性啟動(dòng)子在應(yīng)答化學(xué)品(綜述見(jiàn)Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，4889-108)、環(huán)境刺激或物理刺激時(shí)具有受誘導(dǎo)或增加的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，或可以是“脅迫誘導(dǎo)性的”，即當(dāng)植物暴露于多種脅迫條件時(shí)受到激活，或是“病原體誘導(dǎo)性的”，即當(dāng)植物暴露于多種病原體時(shí)受到激活。
器官特異性/組織特異性啟動(dòng)子 器官特異性或組織特異性啟動(dòng)子是能夠優(yōu)先在某些器官官或組織如葉、根、種子組織等內(nèi)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。例如，“根特異性啟動(dòng)子”是在植物根中優(yōu)勢(shì)地具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，在植物的任何其他部分內(nèi)基本上無(wú)活性，盡管在植物的這些其他部分內(nèi)允許任何滲漏表達(dá)。能夠僅在某些細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子在文中稱作“細(xì)胞特異的”。
根特異性啟動(dòng)子列于下表2b 表2b根特異性啟動(dòng)子的實(shí)例 種子特異性啟動(dòng)子主要在種子組織中轉(zhuǎn)錄激活，但不必僅在種子組織中激活(滲漏表達(dá)的情況下)。種子特異性啟動(dòng)可以在種子發(fā)育和/或萌發(fā)期間激活。
如文中所定義的綠色組織特異性啟動(dòng)子是主要在綠色組織中具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，在植物的任何其他部分內(nèi)基本上無(wú)活性，盡管在植物的這些其他部分內(nèi)允許任何滲漏表達(dá)。
可以用來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法的綠色組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例在下表2c中顯示。
表2c綠色組織特異性啟動(dòng)的實(shí)例 組織特異性啟動(dòng)子的另一個(gè)實(shí)例是分生組織特異性啟動(dòng)子，其主要在分生性組織中具有轉(zhuǎn)錄活性，在植物的任何其他部分內(nèi)基本上無(wú)活性，盡管在植物的這些其他部分內(nèi)允許任何滲漏表達(dá)。
終止子 術(shù)語(yǔ)”終止子”包括這樣的調(diào)控序列，其是在轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，發(fā)出對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行3’加工并多聚腺苷化以及終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)。終止子可以衍生自天然基因、來(lái)自多種其他植物基因或來(lái)自T-DNA。待添加的終止子可以來(lái)自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因或備選地來(lái)自其他植物基因或較不優(yōu)選地來(lái)自任何其他真核基因。
調(diào)節(jié) 術(shù)語(yǔ)”調(diào)節(jié)”就表達(dá)或基因表達(dá)而言意指這樣的過(guò)程，其中表達(dá)水平與對(duì)照植物相比因所述基因的表達(dá)而改變，優(yōu)選地，表達(dá)水平增加。原先未受調(diào)節(jié)的表達(dá)可以是結(jié)構(gòu)RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何類型表達(dá)，隨后是翻譯。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)活性”應(yīng)當(dāng)意指本發(fā)明核酸序列或所編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)的任何變化，這導(dǎo)致植物增加的產(chǎn)量和/或增加的生長(zhǎng)。
表達(dá) 術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”或“基因表達(dá)”意指因特定一種或多種基因，或特定基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”或“基因表達(dá)”尤其意指一種或多種基因，或特定基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄成結(jié)構(gòu)RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，(可有可無(wú)的)隨后mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。此過(guò)程包括DNA轉(zhuǎn)錄、加工得到的mRNA產(chǎn)物。
增加的表達(dá)/過(guò)量表達(dá) 如文中所用的術(shù)語(yǔ)“增加的表達(dá)”或“過(guò)量表達(dá)”意指對(duì)于原有野生型表達(dá)水平是額外的任何形式表達(dá)。
在本領(lǐng)域內(nèi)詳細(xì)記載了用于增加基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法并且它們包括例如，由適宜啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)、使用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子?？梢栽诜钱愒葱问降亩嗪塑账岬倪m宜位置(一般是上游)內(nèi)引入作為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離核酸，以便上調(diào)編碼目的多肽的核酸的表達(dá)。例如，內(nèi)源性啟動(dòng)子可以通過(guò)突變、缺失和/或置換而在體內(nèi)改變(見(jiàn)Kmiec，美US5,565,350；Zarling等人，WO9322443)，或可以將分離的啟動(dòng)子以相對(duì)于本發(fā)明基因的正確方向及距離引入植物細(xì)胞，以便控制基因表達(dá)。
若需要多肽表達(dá)，通常希望在多核苷酸編碼區(qū)的3’末端包括多聚腺苷化區(qū)。多聚腺苷化區(qū)可以來(lái)自天然基因、來(lái)自多種其他植物基因或來(lái)自T-DNA。待添加的3’末端序列可以來(lái)自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因或備選地來(lái)自另一植物基因或更不優(yōu)選來(lái)自任何其他真核基因。
內(nèi)含子序列也可以添加至5′非翻譯區(qū)(UTR)或部分編碼性序列的編碼序列上，以增加在胞漿內(nèi)積累的成熟信息的量。已經(jīng)證實(shí)可剪接內(nèi)含子在植物表達(dá)構(gòu)建體和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體中轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的包含在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平上增加基因表達(dá)至多達(dá)1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.84395-4405；Callis等人(1987)Gens Dev 11183-1200)。基因表達(dá)的此類內(nèi)含子增強(qiáng)作用一般在位于轉(zhuǎn)錄單位5′末端附近時(shí)最強(qiáng)烈。使用玉米內(nèi)含子Adh1-S內(nèi)含子1、2和6、Bronze-1內(nèi)含子是本領(lǐng)域已知的。對(duì)于一般信息，見(jiàn)《玉米手冊(cè)》，第116章，編者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
任選地，一種或多種終止子序列可以在引入植物的構(gòu)建體中使用。額外的調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。其他調(diào)控序列(除啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3’UTR和/或5’UTR區(qū)之外)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道或可以輕易地獲得此類序列。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括需要用于在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制的復(fù)制序列起點(diǎn)。一個(gè)實(shí)例是當(dāng)需要將遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中維持為附加型遺傳元件(例如質(zhì)粒或粘粒分子)時(shí)。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于f1-ori和colE1。
內(nèi)源基因 文中提及的“內(nèi)源”基因不僅僅指如在植物中以其天然形式(即沒(méi)有任何人類干預(yù))存在的所討論基因，還指處于分離形式的隨后(再)引入植物(轉(zhuǎn)基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有這種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物可以遭遇轉(zhuǎn)基因表達(dá)大幅降低和/或內(nèi)源基因表達(dá)的大幅降低。分離的基因可分離自生物體或?yàn)槿嗽斓?，例如通過(guò)化學(xué)合成。
降低的表達(dá) 文中提及的“降低的表達(dá)”或表達(dá)的降低或基本去除意指內(nèi)源基因表達(dá)和/或多肽水平和/或多肽活性相對(duì)于對(duì)照植物的降低。與對(duì)照植物相比，降低或基本去除以遞增優(yōu)選順序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％，或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。表達(dá)的降低或基本去除可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)工具和技術(shù)完成。
選擇標(biāo)記(基因)/報(bào)道基因 “選擇標(biāo)記”、“選擇標(biāo)記基因”或“報(bào)道基因”包括向細(xì)胞賦予表型的任何基因，其中在所述的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述基因以促進(jìn)鑒定和/或選擇用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體所轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這些標(biāo)記基因能夠通過(guò)一系列不同原理鑒定核酸分子的成功轉(zhuǎn)移。合適的標(biāo)記可以選自賦予抗生素耐藥性或除草劑抗性、引入新代謝性狀或允許目視選擇的標(biāo)記。選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括賦予抗生素耐藥性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或賦予對(duì)例如博來(lái)霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、遺傳霉素(Geneticin)(G418)、壯觀霉素或殺稻瘟素的抗性的基因)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供

抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或賦予對(duì)例如咪唑啉酮、膦絲菌素或磺脲類的抗性的基因)或提供代謝性狀的基因(如允許植物使用甘露糖作為唯一碳源的manA或利用木糖的木糖異構(gòu)酶或抗?fàn)I養(yǎng)標(biāo)記如2-脫氧葡萄糖抗性)。目視標(biāo)記基因的表達(dá)導(dǎo)致形成顏色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶與其有色底物例如X-Gal)、發(fā)光(如螢光素/螢光素酶系統(tǒng))或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。這個(gè)名單僅代表少數(shù)的可能標(biāo)記。技術(shù)人員熟悉此類標(biāo)記。取決于生物和選擇方法，優(yōu)選不同的標(biāo)記。
已知當(dāng)核酸穩(wěn)定或瞬時(shí)整合至植物細(xì)胞時(shí)，僅小部分的細(xì)胞攝取外來(lái)DNA并且根據(jù)需要將其整合至細(xì)胞基因組，這取決于所用表達(dá)載體和使用的轉(zhuǎn)染技術(shù)。為鑒定并選擇這些整合子，通常將編碼選擇標(biāo)記(如上文所述之一)的基因連同目的基因一起引入宿主細(xì)胞。這些標(biāo)記可以在其中這些基因因例如常規(guī)方法所致的缺失而無(wú)功能的突變體中使用。此外，編碼選擇標(biāo)記的核酸分子可以引入宿主細(xì)胞中，與在包含編碼本發(fā)明多肽或本發(fā)明方法中所用多肽的序列在同一載體上，或在單獨(dú)的載體上。已經(jīng)用引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以通過(guò)選擇進(jìn)行鑒定(例如具有整合的選擇標(biāo)記的細(xì)胞存活而其他細(xì)胞死亡)。
因?yàn)橐坏┮呀?jīng)成功引入了核酸，則轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中不再需要或不希望有標(biāo)記基因，尤其抗生素耐藥性基因和除草劑抗性基因，因此用于引入核酸的本發(fā)明方法有利地使用能夠去掉或切除這些標(biāo)記基因的技術(shù)。一種如此方法稱作共轉(zhuǎn)化法。共轉(zhuǎn)化法使用同時(shí)用于轉(zhuǎn)化的兩種載體，一種載體攜帶本發(fā)明的核酸而另一種載體攜帶標(biāo)記基因。高比例的轉(zhuǎn)化體接受，或在植物的情況下，包含(高達(dá)40％或更多的轉(zhuǎn)化體)這兩種載體。在用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化的情況下，轉(zhuǎn)化體通常僅接受載體的一部分，即側(cè)翼有T-DNA的序列，它通常代表表達(dá)盒。標(biāo)記基因隨后可以通過(guò)進(jìn)行雜交而從轉(zhuǎn)化的植物中去掉。在另一種方法中，整合至轉(zhuǎn)座子的標(biāo)記基因用來(lái)與想要的核酸一起進(jìn)行轉(zhuǎn)化(稱作Ac/Ds技術(shù))。轉(zhuǎn)化體可以與轉(zhuǎn)座酶來(lái)源植物雜交或轉(zhuǎn)化體用導(dǎo)致轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的核酸構(gòu)建體瞬時(shí)或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。在一些情況下(大約10％)，轉(zhuǎn)座子在已經(jīng)成功發(fā)生轉(zhuǎn)化時(shí)跳出宿主細(xì)胞的基因組并丟失。在其他更多情況下，轉(zhuǎn)座子跳至不同位置。在這些情況下，標(biāo)記基因必須通過(guò)進(jìn)行雜交而去除。在微生物學(xué)中，開(kāi)發(fā)了實(shí)現(xiàn)或促進(jìn)檢測(cè)這類事件的技術(shù)。又一個(gè)有利的方法依賴于重組系統(tǒng)；此方法的優(yōu)勢(shì)在于不必通過(guò)雜交去除。該類型的最知名系統(tǒng)稱作Cre/lox系統(tǒng)。Cre1是去掉位于loxP序列之間序列的重組酶。若標(biāo)記基因整合于loxP序列之間，則通過(guò)重組酶表達(dá)已經(jīng)成功發(fā)生轉(zhuǎn)化時(shí)，標(biāo)記基因被去除。其他重組系統(tǒng)是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系統(tǒng)(Tribble等人，J.Biol.Chem.，275，200022255-22267；Velmurugan等人，J.Cell Biol.，149，2000553-566)。有可能將本發(fā)明核酸序列以位點(diǎn)特異性方式整合至植物基因組。這些方法自然也可以應(yīng)用至微生物如酵母、真菌或細(xì)菌。
轉(zhuǎn)基因的/轉(zhuǎn)基因/重組 為本發(fā)明目的，＂轉(zhuǎn)基因的＂、”轉(zhuǎn)基因”或＂重組＂就核酸序列而言意指包含此核酸序列的表達(dá)盒、基因構(gòu)建體或載體或用本發(fā)明的核酸序列、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的生物，這些構(gòu)建均通過(guò)重組方法產(chǎn)生，其中 a)編碼用于本發(fā)明方法中的蛋白質(zhì)的核酸序列，或 b)與本發(fā)明核酸序列有效連接的遺傳調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子，或 c)a)和b) 不處于其天然遺傳環(huán)境中或已經(jīng)通過(guò)遺傳操作方法修飾，修飾有可能采用例如置換、添加、缺失、倒位或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的形式。天然遺傳環(huán)境理解為意指來(lái)源植物中的天然基因組基因座或染色體基因座或在基因組文庫(kù)中存在。在基因組文庫(kù)的情況下，核酸序列的天然遺傳環(huán)境優(yōu)選地得到保留，至少部分地得以保留。該環(huán)境分布在核酸序列的至少一側(cè)并且具有至少50bp，優(yōu)選至少500bp，特別優(yōu)選至少1000bp，最優(yōu)選至少5000bp的序列長(zhǎng)度。天然存在的表達(dá)盒-例如核酸序列的天然啟動(dòng)子與編碼本發(fā)明方法中所用多肽的對(duì)應(yīng)核酸序列的天然存在的組合，如上文所定義-在這種表達(dá)盒通過(guò)非天然的合成(“人工”)方法(如誘變處理)而受到修飾時(shí)，變成轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。合適方法例如在US 5,565,350或WO00/15815中描述。
為本發(fā)明目的，轉(zhuǎn)基因植物因此如上理解為意指本發(fā)明方法中所用的核酸不位于所述植物基因組中該核酸的天然基因座內(nèi)，所述核酸有可能同源或異源地表達(dá)。然而如所提及，轉(zhuǎn)基因還意指盡管本發(fā)明核酸或在本發(fā)明方法中所用核酸處于植物基因組中該核酸的天然位置內(nèi)，然而其序列相對(duì)于天然序列而言已經(jīng)受到修飾，和/或所述天然序列的調(diào)節(jié)序列已經(jīng)受到修飾。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選地理解為意指本發(fā)明核酸在基因組中的非天然基因座內(nèi)表達(dá)，即發(fā)生核酸的同源表達(dá)或優(yōu)選異源表達(dá)。在文中提到了優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物。
轉(zhuǎn)化 如文中所提及的術(shù)語(yǔ)“引入”或“轉(zhuǎn)化”包括外源性多核苷酸轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞內(nèi)，無(wú)論用于轉(zhuǎn)化的方法是什么。能夠后續(xù)克隆性增殖(無(wú)論通過(guò)器官發(fā)生或胚胎發(fā)生)的植物組織可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化并且可以從中再生整株植物。選擇的具體組織將取決于可用于并且最適于正進(jìn)行轉(zhuǎn)化的具體物種的克隆性增殖系統(tǒng)。示例性組織靶包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組織、現(xiàn)存分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和誘導(dǎo)的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時(shí)或穩(wěn)定地引入宿主細(xì)胞并且可以非整合地維持，例如作為質(zhì)粒。備選地，多核苷酸可以整合至宿主基因組內(nèi)。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞隨后可以用來(lái)以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式再生出轉(zhuǎn)化植物。
外來(lái)基因轉(zhuǎn)化至植物基因組內(nèi)稱作轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在是相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，幾種轉(zhuǎn)化方法中的任一方法可以用來(lái)將目的基因引入合適的祖先細(xì)胞。用于從植物組織或植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)化并再生出植物所述的方法可以用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔法、增加游離DNA攝入的化學(xué)品、DNA直接注射至植物、粒子槍轟擊法、使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化法和顯微投射法(microprojection)。轉(zhuǎn)化方法可以選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇法(Krens，F(xiàn).A.等人，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等人(1987)Plant Mol Biol 8363-373)；原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.等人(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；對(duì)植物材料的微量注射法(Crossway A等人，(1986)Mol.Gen Genet 202179-185)；DNA或RNA涂布的粒子轟擊法(Klein TM等人，(1987)Nature 32770)、(非整合性)病毒感染法等。轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因作物植物，優(yōu)選地通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法產(chǎn)生。有利的轉(zhuǎn)化方法是在植物中(in planta)的轉(zhuǎn)化法。為此目的，例如有可能使農(nóng)桿菌作用于植物種子或有可能用農(nóng)桿菌接種植物的分生組織。根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)證明使轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌混懸液作用于完整植物或至少作用于花原基是特別有利的。植物隨后繼續(xù)培育直至獲得所處理植物的種子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化的方法包括用于稻轉(zhuǎn)化的公知方法，如在任一以下文獻(xiàn)中描述的那些方法歐洲專利申請(qǐng)EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta 199612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol Biol 22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J 6(2)271-282，1994)，其公開(kāi)內(nèi)容在文中引入作為參考，如同完全給出那樣。在玉米轉(zhuǎn)化的情況下，優(yōu)選的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol 14(6)745-50，1996)或Frame等人(PlantPhysiol 129(1)13-22，2002)描述，其公開(kāi)內(nèi)容在文中如充分所述那樣引入作為參考。所述方法通過(guò)舉例方式進(jìn)一步由B.Jenes等人，Techniquesfor Gene Transfer，在Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，S.D.Kung和R.Wu編著，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表達(dá)的核酸或構(gòu)建體優(yōu)選地克隆至適于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的載體，例如pBin19(Bevan等人，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。由這種載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌隨后可以按照已知方式用于轉(zhuǎn)化植物，例如作為模型使用的植物，如擬南芥(擬南芥屬于本發(fā)明的范圍，不視為作物植物)或作物植物，例如煙草植物，通過(guò)在農(nóng)桿菌溶液中浸泡擦傷的葉或切碎的葉并隨后將它們?cè)诤线m的培養(yǎng)基內(nèi)培育。植物通過(guò)根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化例如由

和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其從F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu編著，Academic Press，1993，第15-38頁(yè)中獲知。
除了轉(zhuǎn)化體細(xì)胞(其隨后必須再生成完整植物)之外，還有可能轉(zhuǎn)化植物分生組織的細(xì)胞及特別轉(zhuǎn)化發(fā)育成配子的那些細(xì)胞。在這種情況下，轉(zhuǎn)化的配子遵循天然的植物發(fā)育過(guò)程，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，例如擬南芥種子用農(nóng)桿菌處理并且從發(fā)育植物中獲得種子，其中一定比例的所述植物受到轉(zhuǎn)化并且因此是轉(zhuǎn)基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol GenGenet 208274-289；Feldmann K(1992)。在C Koncz編著，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289頁(yè)]。替代性方法基于反復(fù)去掉花序并使蓮座葉叢中心中的切除部位與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌溫育，因而轉(zhuǎn)化的種子同樣可以在較晚的時(shí)間點(diǎn)獲得(Chang(1994)Plant J.5551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空滲入法，如“花浸染”法。在擬南芥真空滲入法的情況下，完整植物在減壓下用農(nóng)桿菌混懸液處理[Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，3161194-1199]，而在“花浸染法”的情況下，正在發(fā)育的花組織與表面活性劑處理的農(nóng)桿菌混懸液短暫溫育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在兩種情況下收獲了一定比例的轉(zhuǎn)基因種子，并且這些種子可以通過(guò)在如上所述的選擇條件下培育而與非轉(zhuǎn)基因種子區(qū)分。此外，質(zhì)體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是有利的，因?yàn)橘|(zhì)體在大部分作物中以母體方式遺傳，降低或消除了轉(zhuǎn)基因經(jīng)花粉流動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)。葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化一般通過(guò)已在Klaus等人，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)而言之，待轉(zhuǎn)化的序列連同選擇標(biāo)記基因一起克隆至與葉綠體基因組同源的側(cè)翼序列之間。這些同源的側(cè)翼序列指導(dǎo)位點(diǎn)特異性整合至原質(zhì)體系內(nèi)。已經(jīng)對(duì)眾多不同植物物種描述了質(zhì)體轉(zhuǎn)化并且綜述可以出自Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)425-38或Maliga，P(2003)Progress towardscommercialization of plastid transformation technology.Trends Biotechnol.21，20-28。進(jìn)一步生物技術(shù)進(jìn)展最近已經(jīng)以無(wú)標(biāo)記質(zhì)體轉(zhuǎn)化體的形式作了報(bào)道，所述無(wú)標(biāo)記質(zhì)體轉(zhuǎn)化體可以通過(guò)瞬時(shí)共整合的標(biāo)記基因產(chǎn)生(Klaus等人，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。
T-DNA激活標(biāo)簽化 T-DNA激活標(biāo)簽化(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因組區(qū)域內(nèi)或基因編碼區(qū)上游或下游10kb處以如此結(jié)構(gòu)插入T-DNA(通常含有啟動(dòng)子(也可以是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子))，使得啟動(dòng)子指導(dǎo)被靶定基因的表達(dá)。通常，由靶定基因的天然啟動(dòng)子對(duì)所述靶定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用遭到破壞并且該基因處在新引入的啟動(dòng)子控制下。啟動(dòng)子一般嵌入在T-DNA中。這種T-DNA隨機(jī)地插入植物基因組，例如通過(guò)農(nóng)桿菌感染，并導(dǎo)致在所插入T-DNA附近的基因的改良表達(dá)。因靠近所引入啟動(dòng)子的基因的改良表達(dá)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)顯性表型。
TILLING 術(shù)語(yǔ)“TILLING”是“基因組內(nèi)定向誘導(dǎo)的局部損傷”的縮寫詞，意指用于產(chǎn)生和/或鑒定核酸的誘變技術(shù)，其中所述的核酸編碼具有修飾表達(dá)和/或活性的蛋白質(zhì)。TILLING還允許選擇攜帶此類突變變體的植物。這些突變變體可以顯示在強(qiáng)度方面或在位置方面或在時(shí)間方面改良的表達(dá)(例如若突變影響啟動(dòng)子)。這些突變變體可以顯示比由處于其天然形式的基因所顯出活性更高的活性。TILLING將高密度誘變與高通量篩選方法組合。一般在TILLING中遵循的步驟是(a)EMS誘變(Redei GP和KonczC(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，SchellJ，Singapore編著，World Scientific Publishing Co，第16-82頁(yè)；Feldmann等人，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR編著，Arabidopsis.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172頁(yè)；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas編者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104頁(yè))；(b)個(gè)體的DNA制備和匯集；(c)PCR擴(kuò)增目的區(qū)；(d)變性和復(fù)性以允許形成異源雙鏈體；(e)DHPLC，其中將異源雙鏈體是否在匯集物中的存在檢測(cè)為色譜圖中的一個(gè)額外峰；(f)鑒定突變個(gè)體；和(g)對(duì)突變PCR產(chǎn)物測(cè)序。用于TILLING的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(McCallum等人，(2000)Nat Biotechnol 18455-457；綜述見(jiàn)Stemple(2004)Nat Rev Genet5(2)145-50)。
同源重組 同源重組允許選擇的核酸在基因組中于確定的所選擇位置內(nèi)引入。同源重組是在生物科學(xué)中常規(guī)地用于低等生物如酵母或苔蘚劍葉蘚(Physcomitrella)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。用于在植物中開(kāi)展同源重組的方法已經(jīng)不僅對(duì)模式植物(Offringa等人(1990)EMBO J 9(10)3077-84)而且對(duì)作物植物例如稻(Terada等人(2002)Nat Biotech 20(10)1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)132-8)進(jìn)行了描述。
產(chǎn)量 術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量”通常意指經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可測(cè)量結(jié)果，一般與指定作物、與面積并與時(shí)間段有關(guān)。單個(gè)植物部分基于它們的數(shù)目、大小和/或重量而直接對(duì)產(chǎn)量有貢獻(xiàn)，或?qū)嶋H產(chǎn)量是對(duì)于某作物和一年的每英畝產(chǎn)量，這通過(guò)總產(chǎn)量(包括收獲的和評(píng)估的產(chǎn)量)除以種植的英畝數(shù)而確定。術(shù)語(yǔ)植物的“產(chǎn)量”涉及所述植物的營(yíng)養(yǎng)性生物量(根和/或莖干生物量)、生殖器官和/或繁殖體(例如種子)。
以谷物(corn)為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為如下一個(gè)或多個(gè)方面每公頃或每英畝植物數(shù)量的增加、每株植物谷穗數(shù)量的增加、行數(shù)、行粒數(shù)、粒重、千粒重、谷穗長(zhǎng)度/直徑的增加，種子飽滿率(為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)的增加，等等。以稻為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為如下一個(gè)或多個(gè)方面的增加每公頃或每英畝的植物數(shù)量、每株植物的圓錐花序數(shù)、每個(gè)圓錐花序的小穗數(shù)、每個(gè)圓錐花序的花(小花)數(shù)(表達(dá)為飽滿種子數(shù)占初期圓錐花序的比率)、種子飽滿率(為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。
早期生長(zhǎng)勢(shì) “早期生長(zhǎng)勢(shì)”意指尤其在植物生長(zhǎng)早期期間活躍、健康、良好平衡的生長(zhǎng)，并可以因植物適應(yīng)性增加而產(chǎn)生，其原因在于例如植物更好地適應(yīng)其環(huán)境(即優(yōu)化能源的使用和苗與根之間的分配)。具有早期生長(zhǎng)勢(shì)的植物也顯示增加的幼苗存活和更好的作物建立，這往往導(dǎo)致高度均勻的田塊(作物整齊地生長(zhǎng)，即大多數(shù)植物在基本上相同的時(shí)間上達(dá)到發(fā)育的各階段)和往往更好及更高的產(chǎn)量。因而，早期生長(zhǎng)勢(shì)可以通過(guò)多種因子如千粒重、萌發(fā)百分?jǐn)?shù)、出苗百分?jǐn)?shù)、幼苗生長(zhǎng)、幼苗高度、根長(zhǎng)度、根及苗生物量和眾多其他因素而確定。
增加/改善/增強(qiáng) 術(shù)語(yǔ)“增加”，”改善”或“增強(qiáng)”是可互換的并且應(yīng)當(dāng)在本申請(qǐng)含義上指與如文中定義的對(duì)照植物相比至少3％、、4％、、5％、6％、7％、8％、9％或10％、優(yōu)選至少15％或20％、更優(yōu)選地25％、30％、35％或40％更多的產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)。
綠度指數(shù) 文中所用的“綠度指數(shù)”計(jì)算自植物的數(shù)字圖像。對(duì)于屬于圖像上對(duì)應(yīng)的植物目標(biāo)的每一像素，計(jì)算綠度值與紅度值的比值(在編碼顏色的RGB模式中)。綠度指數(shù)表示為綠與紅的比值超過(guò)給定閾值的像素百分比。在正常生長(zhǎng)條件下、在鹽脅迫生長(zhǎng)條件下以及在可獲得營(yíng)養(yǎng)物減少的生長(zhǎng)條件下，植物的綠度指數(shù)在開(kāi)花前的末次取像時(shí)測(cè)量。與之相反，在干旱脅迫生長(zhǎng)條件下，植物的綠度指數(shù)在干旱前的初次取像時(shí)測(cè)量。
種子產(chǎn)量 增加的種子產(chǎn)量本身可以表現(xiàn)為下列一種或多種指標(biāo)a)種子生物量(種子總重量)增加，這可以基于單粒種子和/或每株植物和/或每公頃或每英畝；b)每株植物增加的花數(shù)；c)增加的(飽滿)種子數(shù)；d)增加的種子飽滿率(其表述為飽滿種子數(shù)與種子總數(shù)之間的比率)；e)增加的收獲指數(shù)，其表述為可收獲部分(如種子)產(chǎn)量與總生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW)，這從計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)及其總重量外推而來(lái)。增加的TKW可以因增加的種子大小和/或種子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。
種子產(chǎn)量的增加也可以表現(xiàn)為種子大小和/或種子體積的增加。此外，種子產(chǎn)量的增加本身也可以自我表現(xiàn)為種子面積和/或種子長(zhǎng)度和/或種子寬度和/或種子周長(zhǎng)的增加。增加的產(chǎn)量也可以產(chǎn)生改良的結(jié)構(gòu)，或可以因改良的結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)。
增加的生長(zhǎng)速率 由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)量，因而相對(duì)于對(duì)照植物的生長(zhǎng)速率，這些植物有可能在其生活周期中的對(duì)應(yīng)階段上(在其生活周期的至少部分期間)表現(xiàn)增加的生長(zhǎng)速率。除了增加產(chǎn)量的能力，增加的營(yíng)養(yǎng)攝取效率也有助于產(chǎn)量增加。據(jù)觀察本發(fā)明的植物顯示更高的營(yíng)養(yǎng)攝取效率。增加的營(yíng)養(yǎng)攝取效率使得植物生長(zhǎng)更好，無(wú)論植物是否處于脅迫條件下。
增加的生長(zhǎng)速率可以對(duì)于植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)是特異性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生長(zhǎng)速率的植物甚至可以顯示提早開(kāi)花。生長(zhǎng)速率的增加可以在植物生活周期中的一個(gè)或多個(gè)階段上或在基本上整個(gè)植物生活周期期間發(fā)生。在植物生活周期中的早期期間增加的生長(zhǎng)速率可以反映增強(qiáng)的生長(zhǎng)勢(shì)(萌發(fā)時(shí)增加的幼苗勢(shì))。生長(zhǎng)速率的增加可以改變植物的收獲周期，允許植物較晚播種和/或較早收獲，否則這將不可能。若生長(zhǎng)速率充分地增加，可以允許進(jìn)一步播種相同植物物種的種子(例如播種并收獲稻植物，隨后播種并收獲其他稻植物，全部稻植物均在一個(gè)常規(guī)生長(zhǎng)時(shí)段內(nèi))。類似地，若生長(zhǎng)速率足夠地增加，可以允許進(jìn)一步播種不同植物物種的種子(例如播種并收獲稻植物，隨后例如播種并任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他合適植物)。從相同的根莖中收獲額外次數(shù)在一些作物植物的情況中也是可能的。改變植物的收獲周期可以導(dǎo)致每英畝的年生物量產(chǎn)量的增加(因任何特定植物可以生長(zhǎng)并收獲的次數(shù)(如在一年中)增加)。生長(zhǎng)速率的增加也可以允許比其野生型對(duì)應(yīng)物在更廣泛的地理區(qū)域內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)閷?duì)培育作物的區(qū)域限制往往由栽種時(shí)節(jié)(早季)或在收獲時(shí)期(晚季)的不利環(huán)境條件所決定。若縮短收獲周期，則可以避開(kāi)這類不利條件。生長(zhǎng)速率可以通過(guò)從生長(zhǎng)曲線中得到多種參數(shù)而確定，此類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其50％最大尺寸所花費(fèi)的時(shí)間)和T-90(植物達(dá)到其50％最大尺寸所花費(fèi)的時(shí)間)，等等。
與對(duì)照植物相比，無(wú)論植物處于非脅迫條件下還是植物暴露于多種脅迫下，都發(fā)生產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)速率的增加。植物一般通過(guò)生長(zhǎng)得更慢而對(duì)暴露于脅迫作出應(yīng)答。在嚴(yán)重脅迫條件下，植物甚至可以完全停止生長(zhǎng)。另一方面，輕微脅迫在文中定義為植物對(duì)其暴露的任何脅迫，其中所述的脅迫未導(dǎo)致植物完全停止生長(zhǎng)而沒(méi)有恢復(fù)生長(zhǎng)的能力。與非脅迫條件下的對(duì)照植物相比，輕微脅迫在本發(fā)明意義中導(dǎo)致受脅迫植物生長(zhǎng)降低小于40％、35％或30％，優(yōu)選小于25％、20％或15％，更優(yōu)選小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)上的進(jìn)步，在栽培作物植物中并不經(jīng)常遇到嚴(yán)重脅迫。因此，由輕微脅迫誘導(dǎo)的受損生長(zhǎng)往往是農(nóng)業(yè)上不希望的特征。輕微脅迫是植物暴露的常見(jiàn)生物性和/或非生物性(環(huán)境)脅迫。非生物性脅迫可以因干旱或水澇、厭氧脅迫、鹽脅迫、化學(xué)毒性、氧化脅迫和熱、寒冷或冰凍溫度所致。非生物性脅迫可以是由水脅迫(尤其因?yàn)楦珊?、鹽脅迫、氧化脅迫或離子脅迫引起的滲透脅迫。生物脅迫一般是由病原體如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的那些脅迫。
尤其，本發(fā)明的方法可以在非脅迫條件下實(shí)施以產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物而具有增加的產(chǎn)量的植物。如在Wang等人(Planta(2003)2181-14)中報(bào)道，非生物性脅迫導(dǎo)致不利地影響植物生長(zhǎng)及生產(chǎn)力的一系列形態(tài)學(xué)變化、生理學(xué)變化、生物化學(xué)變化和分子變化。已知干旱、鹽、極端溫度和氧化脅迫是相互聯(lián)系的并可以通過(guò)相似機(jī)制而誘導(dǎo)生長(zhǎng)損害及細(xì)胞損害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)1331755-1767)描述了干旱脅迫與高鹽脅迫間極高程度的“串話”。例如，干旱和/或鹽化作用主要表現(xiàn)為滲透脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和離子分布的破壞。經(jīng)常伴隨高溫或低溫、鹽或干旱脅迫的氧化脅迫可以造成功能性蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白變性。因此，這些多樣的環(huán)境脅迫常常激活相似的細(xì)胞信號(hào)途徑和細(xì)胞應(yīng)答，如產(chǎn)生脅迫蛋白質(zhì)、上調(diào)抗氧化物質(zhì)、積累相容性溶質(zhì)和生長(zhǎng)抑制。如文中所用的術(shù)語(yǔ)”非脅迫”條件是允許植物最佳生長(zhǎng)的環(huán)境條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚對(duì)于給定地點(diǎn)的正常土壤條件和氣候條件。
植物 如文中所用的術(shù)語(yǔ)”植物”包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花和組織及器官，其中每種所提及對(duì)象包含目的基因/核酸。術(shù)語(yǔ)”植物”也包含植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣每種提及的對(duì)象包含目的基因/核酸。
特別用于本發(fā)明方法中的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其單子葉植物和雙子葉植物，包括選自以下的飼用或飼料豆類、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木金合歡屬物種(Acacia spp.)、槭樹屬物種(Acer spp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、七葉樹屬物種(Aesculus spp.)、新西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albizia amara、三色桫欏(Alsophila tricolor)、須芒草屬物種(Andropogon spp.)、落花生屬物種(Arachis spp)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、黃芪(Astragaluscicer)、秋葵屬物種(Abelmoschus spp.)、劍麻(Agave sisalana)、冰草屬物種(Agropyron spp.)、匍匐剪股穎(Agrostis stolonifera)、蔥屬物種(Alliumspp.)、莧屬物種(Amaranthus spp.)、歐洲海濱草(Ammophila arenaria)、鳳梨(Ananas comosus)、番荔枝屬物種(Annona spp.)、芹菜(Apiumgraveolens)、木波羅屬物種(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麥屬物種(Avena spp.)(例如燕麥(Avena sativa)、野燕麥(Avena fatua)、比贊燕麥(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、雜種燕麥(Avena hybrida)、陽(yáng)桃(Averrhoa carambola)、Baikiaea plurijuga、樺木屬物種(Betula spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫鉚(Butea frondosa)、箣竹屬(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、蕓苔屬物種(Brassicaspp.)(例如歐洲油菜(Brassica napus)、蕪青物種(Brassica rapa ssp.)[卡諾拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、朱纓花屬物種(Calliandra spp)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、決明屬物種(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroemapubescens)、木瓜屬物種(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、變異小冠花(Coronillia varia)、枸子(Cotoneaster serotina)、山楂屬物種(Crataegusspp.)、香瓜屬物種(Cucumis spp.)、柏木屬物種(Cupressus spp.)、Cyatheadealbata、木梨(Cydonia oblonga)、圓球柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅屬物種(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、木梨(Cydonia oblonga)、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃屬物種(Carya spp.)、紅花(Carthamustinctorius)、栗屬物種(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟屬物種(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑桔屬物種(Citrus spp.)、椰子屬物種(Cocos spp.)、咖啡屬物種(Coffea spp.)、芋頭(Colocasia esculenta)、非洲梧桐屬物種(Cola spp.)、黃麻屬(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛屬物種(Corylus spp.)、山楂屬物種(Crataegus spp.)、番紅花(Crocus sativus)、南瓜屬物種(Cucurbita spp.)、菜薊屬(Cynara spp.物種)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(bǔ)(Davallia divaricata)、山馬蝗屬物種(Desmodium spp.)、迪卡蘭(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、鐮扁豆屬物種(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、野胡蘿卜(Daucus carota)、龍眼(Dimocarpus longan)、薯蕷屬物種(Dioscorea spp.)、柿樹屬物種(Diospyros spp.)、錐穗稗(Echinochloa pyramidalis)、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺桐屬物種(Erythrina spp.)、桉屬物種(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、金茅(Eulalia villosa)、油棕屬(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕Elaeis(oleifera))、蔗茅屬(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、紅仔果(Eugenia uniflora)、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、費(fèi)約羅(Feijoa sellowiana)、草雷屬物種(Fragaria spp.)、千斤拔屬物種(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、水青岡屬物種(Fagus spp.)、葦狀羊茅(Festuca arundinacea)、無(wú)花果(Ficuscarica)、金桔屬物種(Fortunella spp.)、草莓屬物種(Fragaria spp.)、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、大豆屬(Glycine spp.)(例如大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、Glycine javanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺屬物種(Grevillea spp.)、Guibourtiacoleosperma、陸地棉(Gossypium hirstum)、向日葵屬(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、長(zhǎng)管萱草(Hemerocallis fulva)、巖黃芪屬物種(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogoncontortus)、木槿屬物種(Hibiscus spp.)、大麥屬(Hordeum spp.)(例如大麥(Hordeum vulgare))、Hyparrhenia rufa、小連翅(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭藍(lán)(Indigo incarnata)、鳶尾屬物種(Iris spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃屬物種(Juglans spp.)、Leptarrhenapyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespediza spp.)、萵苣屬物種(Lettuca spp.)、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、Lotonus bainesii、百脈根屬物種(Lotus spp.)、萵苣(Lactuca sativa)、山黧豆屬物種(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亞麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、棱角絲瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆屬物種(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄屬(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆屬物種(Macrotyloma spp.)、硬皮豆(Macrotyloma axillare)、蘋果屬物種(Malusspp.)、蘋果屬物種(Malus spp.)、凹緣金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯屬物種(Manihotspp.)、Manihot esculenta、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicago sativa)、草木樨屬物種(Melilotus spp.)、薄荷屬物種(Mentha spp.)、芒(Miscanthussinensis)、苦瓜屬物種(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉屬物種(Musa spp.)、大蕉(Musa sapientum)、煙草屬物種(Nicotianum spp.)、驢食草屬物種(Onobrychis spp.)、鳥足豆屬物種(Ornithopus spp.)、非洲雙翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草屬物種(Pennisetum spp.)、木犀欖屬物種(Olea spp.)、仙人掌屬物種(Opuntia spp.)、稻屬(Oryza spp.)(例如稻、闊葉稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、雞蛋果(Passiflora edulis)、歐防風(fēng)(Pastinaca sativa)、狼尾草屬物種(Pennisetum sp.)、鱷梨屬物種(Persea spp.)、鱷梨(Persea gratissima)、碧冬茄屬物種(Petunia spp.)、菜豆屬物種(Phaseolus spp.)、檳榔竹(Phoenixcanariensis)、Phormium cookianum、石楠屬物種(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松屬物種(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆屬物種(Phaseolus spp.)、貓尾草(Phleum pratense)、刺葵屬物種(Phoenix spp.)、南方蘆葦(Phragmites australis)、酸漿屬物種(Physalis spp.)、松屬物種(Pinus spp.)、阿月渾子(Pistacia vera)、豌豆屬物種(Pisum spp.)、早熟禾屬物種(Poa spp.)、楊屬物種(Populus spp.)、牧豆草屬物種(Prosopis spp.)、牧豆樹(Prosopis cineraria)、李屬物種(Prunus spp.)、番石榴屬物種(Psidiumspp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylissapida)、Rhus natalensis、歐洲醋粟(Ribes grossularia)、茶子屬物種(Ribesspp.)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp.)、蘿卜(Raphanus sativus)、波葉大黃(Rheum rhabarbarum)、蓖麻(Ricinuscommunis)、懸鉤子屬物種(Rubus spp.)、柳屬物種(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、甘蔗屬物種(Saccharum spp.)、接骨木屬物種(Sambucus spp.)、黑麥(Secale cereale)、胡麻屬物種(Sesamum spp.)、白芥屬物種(Sinapis sp.)、茄屬(Solanumspp.)(例如馬鈴薯(Solanum tuberosum)、紅茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、蒲桃屬物種(Syzygium spp.)、葫蘆茶屬物種(Tadehagispp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車軸草屬物種(Trifolium spp.)、小麥屬(Triticum spp.)(例如普通小麥(Triticum aestivum)、硬粒小麥(Triticum durum)、圓柱小麥(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、馬卡小麥(Triticum macha)、普通小麥(Triticum sativum)或普通小麥(Triticum vulgare))、萬(wàn)壽菊屬物種(Tagetesspp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可樹(Theobroma cacao)、Triticosecalerimpaui、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、小金蓮花(Tropaeolum minus)、金蓮花(Tropaeolum majus)、越桔屬物種(Vaccinium spp.)、野碗豆屬物種(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、豇豆屬物種(Vigna spp.)、香堇(Violaodorata)、葡萄屬物種(Vitis spp.)、錐穗沃森花(Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、沼生菰(Zizaniapalustris)、棗屬物種(Ziziphus spp.)、莧屬植物(amaranth)、洋薊(artichoke)、天門冬屬(asparagus)、椰菜(broccoli)、孢子甘藍(lán)(Brusselssprouts)、甘藍(lán)、蕓苔(canola)、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)(collardgreens)、亞麻、無(wú)頭甘藍(lán)(kale)、兵豆屬(lentil)、油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜(squash)、茶和藻類等等。
序列比對(duì) 為比較而進(jìn)行序列比對(duì)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48443-453)來(lái)尋找兩序列之間匹配數(shù)最大化且空位數(shù)最小化的總體(即跨越整個(gè)序列)比對(duì)。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215403-10)計(jì)算序列同一性百分比，并對(duì)兩序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公開(kāi)地獲得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比對(duì)算法(1.83版)，采用默認(rèn)的雙比對(duì)參數(shù)以及百分比的記分方法而容易地鑒定。利用可獲自MatGAT軟件包(Campanella等BMCBioinformatics.2003年7月10日4:29.MatGATan application thatgenerates similarity/identitymatrices using protein or DNA sequences)的方法之一，也可以確定總體相似性和同一性百分比?？梢赃M(jìn)行微小的人工編輯以優(yōu)化保守基序之間的比對(duì)，這對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的。此外，除了利用全長(zhǎng)序列進(jìn)行同源物鑒定以外，還可以利用特定結(jié)構(gòu)域。如下文實(shí)施例3所示，序列同一性值為百分比，是通過(guò)上述程序使用默認(rèn)參數(shù)針對(duì)完整核酸或氨基酸序列，和/或選擇的結(jié)構(gòu)域或保守基序確定的。
交互blast搜索 交互BLAST通常包括以查詢序列(例如，利用實(shí)施例9的表1、表2、表14和實(shí)施例18的表18中所列的任一序列)針對(duì)任何序列數(shù)據(jù)庫(kù)如可公共可獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST的一次BLAST。當(dāng)從核苷酸序列開(kāi)始時(shí)，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)，而當(dāng)從蛋白質(zhì)序列開(kāi)始時(shí)，則使用BLASTP或TBLASTN(利用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)。BLAST結(jié)果可以任選地過(guò)濾。接著使用過(guò)濾的結(jié)果或者未過(guò)濾的結(jié)果中的全長(zhǎng)序列針對(duì)查詢序列來(lái)源生物的序列進(jìn)行反向BLAST(二次BLAST)(在查詢序列為SEQID NO1或SEQ ID NO2、SEQ ID NO50至SEQ ID NO59、SEQID NO131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO257或SEQ ID NO258中任一個(gè)的情況下，二次BLAST將會(huì)針對(duì)稻序列)。然后比較一次和二次BLAST的結(jié)果。如果一次BLAST中分值靠前的命中事件來(lái)自查詢序列源自的相同物種，則找到了旁系同源物，反向BLAST結(jié)果隨即理想地以查詢序列作為最高命中事件；如果一次BLAST中分值靠前的命中事件不是來(lái)自查詢序列源自的相同物種，則找到了直系同源物，且優(yōu)選反向BLAST后的結(jié)果是查詢序列處于最高命中事件之列。
分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有顯著性(或者換句話說(shuō)，偶然發(fā)現(xiàn)此命中事件的幾率越低)。E值的計(jì)算是本領(lǐng)域眾所周知的。除了E值之外，還對(duì)比較進(jìn)行同一性百分比記分。同一性百分比是指兩比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度上的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)。在大家族的情況下可以使用ClustalW，繼之以鄰近連接樹來(lái)輔助相關(guān)基因的聚類可視化，以鑒定直系同源物和旁系同源物。
擴(kuò)增 用于遺傳和物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸進(jìn)行。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med1195-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS；Sheffield等人，(1993)Genomics16325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人，(1988)Science 2411077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射雜交作圖(Walter等人，(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作圖(Dear和Cook，(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核酸序列設(shè)計(jì)和產(chǎn)生用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)的引物對(duì)。這類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。使用基于PCR的遺傳作圖的方法，可能需要鑒定跨越相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列區(qū)域作圖的親本之間DNA序列的差異。然而，這對(duì)作圖方法通常不是必要的。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)照植物在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中調(diào)節(jié)NAC轉(zhuǎn)錄因子的編碼核酸的表達(dá)。調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)NAC轉(zhuǎn)錄因子的編碼核酸表達(dá)的優(yōu)選方法是通過(guò)在植物中引入和表達(dá)如下進(jìn)一步定義的特定類型NAC轉(zhuǎn)錄因子的編碼核酸。
另外，本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)照植物在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中調(diào)節(jié)AP2-2多肽的編碼核酸的表達(dá)。本發(fā)明還提供相對(duì)于對(duì)照植物在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中調(diào)節(jié)AP2-70-樣多肽的編碼核酸的表達(dá)。
關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子，待引入植物(并因此用于實(shí)施本發(fā)明的方法)的核酸是編碼文中所述類型的NAC轉(zhuǎn)錄因子的任意核酸。文中定義的“NAC轉(zhuǎn)錄因子”意指任何氨基酸序列，當(dāng)其用于構(gòu)建NAC系統(tǒng)樹(例如

圖1所示的)時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO51、SEQID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57或SEQ ID NO59中任一個(gè)所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地利用制作此類系統(tǒng)樹的已知技術(shù)和軟件，例如GCG、EBI或CLUSTAL軟件包，利用默認(rèn)參數(shù)來(lái)確定任何所研究的氨基酸序列是否落入“NAC轉(zhuǎn)錄因子”的定義中。圖1的系統(tǒng)樹來(lái)自O(shè)oka等人，2003(DNA Research 10，239-247，2003)。建立此類系統(tǒng)樹的方法由Ooka等人，2003描述。在圖1的系統(tǒng)樹中，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO2位于從下往上的第3組中，標(biāo)記為“OsNAC7”，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO51、SEQ IDNO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57和SEQ ID NO59在始于(包括)該頁(yè)右手側(cè)標(biāo)記為“ONAC022”的組，止于(包括)該頁(yè)右手側(cè)標(biāo)記為“OsNAC3”的組的范圍中。任何聚簇于這些范圍中的序列(一方面包括SEQID NO2，另一方面包括SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57和SEQ ID NO59)將被認(rèn)為落入上述NAC轉(zhuǎn)錄因子的定義并適用于本發(fā)明的方法中。
或者，文中定義的“NAC轉(zhuǎn)錄因子”包含任意一個(gè)或多個(gè)下述基序。
基序IKIDLDIIQELD，或與基序I的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序I優(yōu)選是K/P/R/G I/S/M D/A/E/Q L/I/V D I/V/F I Q/V/R/K E/DL/I/V D。
基序IICKYGXGHGGDEQTEW，或與基序II的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％，其中“X”是任意氨基酸或空位。
基序II優(yōu)選是C K/R Y/L/I G XXX G/Y/N D/E E Q/R T/N/S EW，其中“X”是任意氨基酸或空位。
基序IIIGWVVCRAFQKP，或與基序III的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序III優(yōu)選是GWVVCR A/V F X1K X2，其中“X1”和“X2”可以是任意氨基酸，優(yōu)選X1是Q/R/K，優(yōu)選X2是P/R/K。
基序I至III見(jiàn)于SEQ ID NO2所示的NAC中，并一般也見(jiàn)于聚簇于包含SEQ ID NO2的NAC組(在NAC系統(tǒng)樹中)而不聚簇于任何其他NAC組的NAC中。
基序IVPVPIIA，或與基序IV的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序IV優(yōu)選是A/P/S/N V/L/I/A P/S/D/V/Q V/I I A/T/G。
基序VNGSRPN，或與基序V的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序V優(yōu)選是N G/S S/Q/A/V RP N/S。
基序VICRLYNKK，或與基序VI的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序VI優(yōu)選是C/Y R/K L/I Y/H/F N/K K K/N/C/S/T。
基序III至VI一般見(jiàn)于SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ IDNO55、SEQ ID NO57和SEQ ID NO59的NAC中，且見(jiàn)于聚簇于上述SEQ ID NO所代表的NAC組(在NAC系統(tǒng)樹中)而不聚簇于任何其他NAC組的NAC中。
基序VIINEWEKMQ，或與基序VII的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序VII優(yōu)選是N E/Q/T WEK M/V Q/R/K。
基序VIIIWGETRTPESE，或與基序VIII的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序VIII優(yōu)選是WGE T/A RTPES E/D。
基序IXVPKKESMDDA，或與基序IX的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序IX優(yōu)選是V/L PK K/E E S/R/A/V M/V/A/Q/R D/E D/E/L A/G/D。
基序XSYDDIQGMYS，或與基序X的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序X優(yōu)選是S L/Y DD L/I Q G/S L/M/P G/Y S/N。
基序VII、VIII、IX和X一般見(jiàn)于SEQ ID NO51的NAC中，且見(jiàn)于聚簇于SEQ ID NO51的NAC組(在NAC系統(tǒng)樹中)而不聚簇于任何其他NAC組的NAC中。
基序XIDSMPRLHADSSCSE，或與基序XI的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
基序XI優(yōu)選是DS M/V/I P R/K L/I/A H T/A/S D/E SS C/G SE。
基序XI一般見(jiàn)于SEQ ID NO53和SEQ ID NO55的NAC中，且見(jiàn)于聚簇于上述SEQ ID NO所代表的NAC組(在NAC系統(tǒng)樹中)而不聚簇于任何其他NAC組的NAC中。
基序I至XI中的任一個(gè)在任何位置均可包含一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸的取代。
文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子(即，任意氨基酸序列，當(dāng)其用于用于構(gòu)建NAC系統(tǒng)樹(例如圖1所示的)時(shí)，趨向聚簇于SEQ ID NO2、SEQID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57或SEQ IDNO59中任一個(gè)所示的NAC的組，而不是聚簇于任何其他NAC組)的實(shí)例示于下表3和4中。
表3(在系統(tǒng)樹中)聚簇于SEQ ID NO2所示的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組的NAC轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)例 表4(在系統(tǒng)樹中)聚簇于SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQID NO55、SEQ ID NO57或SEQ ID NO59中任一個(gè)所示的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組的NAC轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)例 本發(fā)明通過(guò)用由SEQ ID NO1代表的編碼多肽序列SEQ ID NO2的稻序列、由SEQ ID NO50代表的編碼多肽序列SEQ ID NO51的稻序列、由SEQ ID NO52代表的編碼多肽序列SEQ ID NO53的稻序列、由SEQID NO54代表的編碼多肽序列SEQ ID NO55的稻序列、由SEQ ID NO56代表的編碼多肽序列SEQ ID NO57的稻序列，和由SEQ ID NO58代表的編碼多肽序列SEQ ID NO59的稻序列轉(zhuǎn)化的植物加以說(shuō)明，然而，本發(fā)明的實(shí)施不限于這些序列。本發(fā)明方法可以使用編碼如文中所定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的任何核酸進(jìn)行，例如表3和4中給出的任何核酸序列。
在表3中給出的NAC氨基酸序列可以視為由SEQ ID NO2代表的NAC的直向同源物和旁系同源物。在表4中給出的NAC氨基酸序列可以視為由SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57和SEQ ID NO59中任一個(gè)代表的NAC的直向同源物和旁系同源物。
直向同源物和旁系同源物可以通過(guò)開(kāi)展所謂交互性blast搜索(如文中“定義”部分所述)而容易地找到。其中查詢序列是SEQ ID NO1、SEQID NO2，或SEQ ID NO50至SEQ ID NO59中的任意序列，因此第二次BLAST將針對(duì)稻序列。
表3給出SEQ ID NO2代表的NAC的直向同源物和旁系同源物。表4中給出SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57和SEQ ID NO59代表的NAC的直向同源物和旁系同源物。其他直向同源物和旁系同源物可使用上述BLAST方法和實(shí)施例部分給出的以下方法容易地鑒定。
NAC蛋白質(zhì)由于存在高度保守的N-末端NAC結(jié)構(gòu)域(示于表5)以及不同的C-末端結(jié)構(gòu)域，是可以鑒定的。
也存在用于鑒定結(jié)構(gòu)域的特定數(shù)據(jù)庫(kù)。NAC轉(zhuǎn)錄因子中的NAC結(jié)構(gòu)域可如“定義”部分解釋的鑒定。
NAC結(jié)構(gòu)域也可使用常規(guī)技術(shù)鑒定，例如文中“定義”部分解釋的序列比對(duì)。
本發(fā)明也提供迄今未知的NAC-編碼核酸和NAC多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，因此提供分離的核酸分子，其包含 (i)SEQ ID NO347、SEQ ID NO349、SEQ ID NO351、SEQ IDNO353、SEQ ID NO355、SEQ ID NO357、SEQ ID NO359、SEQ IDNO361或SEQ ID NO363中的一個(gè)所示的核酸； (ii)SEQ ID NO347、SEQ ID NO349、SEQ ID NO351、SEQ IDNO353、SEQ ID NO355、SEQ ID NO357、SEQ ID NO359、SEQ IDNO361或SEQ ID NO363中的一個(gè)所示的核酸的互補(bǔ)物； (iii)核酸，其編碼與SEQ ID NO348、SEQ ID NO350、SEQ ID NO352、SEQ ID NO354、SEQ ID NO356、SEQ ID NO358、SEQ ID NO360、SEQ ID NO362或SEQ ID NO364中的一個(gè)所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的NAC多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，也提供分離的多肽，其包含 (i)SEQ ID NO348、SEQ ID NO350、SEQ ID NO352、SEQ IDNO354、SEQ ID NO356、SEQ ID NO358、SEQ ID NO360、SEQ IDNO362或SEQ ID NO364中的一個(gè)所示的氨基酸序列； (ii)與SEQ ID NO348、SEQ ID NO350、SEQ ID NO352、SEQ IDNO354、SEQ ID NO356、SEQ ID NO358、SEQ ID NO360、SEQ IDNO362或SEQ ID NO364中的一個(gè)所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高； (iii)如上(i)或(ii)中給出的氨基酸序列的衍生物。
編碼文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸不需要是全長(zhǎng)核酸，因?yàn)楸景l(fā)明方法的實(shí)施不依賴于全長(zhǎng)核酸序列的使用。適用于實(shí)施本發(fā)明的方法的核酸的實(shí)例包括表3和4中給出的核酸序列，但并不限于這些序列。核酸變體也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。此類核酸變體的實(shí)例包括編碼文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的部分、編碼文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的剪接變體、編碼文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的等位變體，以及通過(guò)基因改組獲得的編碼文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的變體。術(shù)語(yǔ)部分、剪接變體、等位變體和基因改組現(xiàn)將描述。
本發(fā)明提供在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)表3和4中給出的核酸序列中任一個(gè)的部分，或表3和4中給出的氨基酸序列中任一個(gè)的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的部分。
用于本發(fā)明方法中的部分編碼屬于文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的定義范圍的多肽，所述多肽具有與表3和4中給出的任意氨基酸序列所代表的NAC轉(zhuǎn)錄因子基本相同的生物學(xué)活性。該部分一般具有至少600個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度、優(yōu)選至少700個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度、更優(yōu)選至少800個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度并且最優(yōu)選至少900個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度，其中所述的連續(xù)核苷酸是在表3和4中給出的任何一種核酸序列。優(yōu)選地，此部分是在表3和4中給出的任何一種核酸的部分。最優(yōu)選地，該部分是核酸SEQ ID NO1、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56或SEQ ID NO58的部分。優(yōu)選地，該部分編碼包含如文中所定義的基序I至XI中的一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列。
編碼如文中所定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的部分可以例如通過(guò)對(duì)該核酸產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)缺失而制備。所述的部分可以以分離的形式加以使用或它們可以與其他編碼性(或非編碼性)序列融合，以便例如產(chǎn)生組合幾種活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其他編碼序列融合時(shí)，翻譯時(shí)產(chǎn)生的所得多肽可以比對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子部分所預(yù)測(cè)的產(chǎn)物更大。
用于本發(fā)明方法中的另一核酸變體是能夠在降低的嚴(yán)格條件下、優(yōu)選在嚴(yán)格條件下與編碼如文中所定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸雜交，或與如文中所定義的部分雜交的核酸。
用于本發(fā)明方法中的雜交序列編碼具有NAC結(jié)構(gòu)域(如上所述)并且具有與表3和4中給出的任意氨基酸序列所代表的NAC轉(zhuǎn)錄因子的基本相同的生物學(xué)活性的多肽。該雜交序列一般具有至少600個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度、優(yōu)選至少700個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度、更優(yōu)選至少800個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度并且最優(yōu)選至少900個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度。優(yōu)選地，雜交序列是能夠與表3和4中給出的任意核酸雜交或與任意這些序列的部分雜交的序列，其中所述的部分如上文所定義。最優(yōu)選地，雜交序列能夠與如SEQ ID NO1、SEQID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56或SEQ IDNO58所代表的核酸或與其部分雜交。優(yōu)選地，能夠雜交的序列編碼包含任何一種或多種如文中所定義的基序I至XI的多肽。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)能夠與表3和4中給出的任何一種核酸雜交的核酸，或包括在植物中引入并表達(dá)如此核酸，其能夠與表3和4中給出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸雜交。
用于本發(fā)明方法中的另一核酸變體是編碼如上文所定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的剪接變體。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)表3和4中給出的任何一種核酸的剪接變體，或表3和4中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的剪接變體。
優(yōu)選的剪接變體是由SEQ ID NO1、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56或SEQ ID NO58代表的核酸的剪接變體，或編碼表3和4中給出的任意氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的剪接變體。優(yōu)選地，由所述剪接變體編碼的多肽包含任何一種或多種如文中所定義的基序I至XI。
用于實(shí)施本發(fā)明方法的另一種核酸變體是編碼如上文所定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的等位變體。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)表3和4中給出的任何一種核酸的等位變體，或包括在植物中引入并表達(dá)如此核酸的等位變體，其中所述的核酸編碼表3和4中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。
優(yōu)選的等位變體是SEQ ID NO1、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56或SEQ ID NO58的等位變體，或編碼SEQ ID NO1、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQID NO56或SEQ ID NO58的任意直向同源物或旁系同源物的等位變體。優(yōu)選地，由所述等位變體編碼的多肽包含任何一種或多種如文中所定義的基序I至XI。
用于本發(fā)明方法中的又一核酸變體是通過(guò)基因改組而獲得的核酸變體?；蚋慕M或定向進(jìn)化也可以用來(lái)產(chǎn)生編碼如上文定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的變體。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)表3和4中給出的任何一種核酸的變體，或包括在植物中引入并表達(dá)如此核酸的變體，其中所述的核酸編碼表3和4中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，所述變體核酸通過(guò)基因改組獲得。優(yōu)選地，通過(guò)基因改組獲得的變體核酸編碼的多肽包含任何一種或多種如文中所定義的基序I至XI。
另外，核酸變體也可以通過(guò)位點(diǎn)定向誘變獲得。幾種方法可用于實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定向誘變，最常見(jiàn)的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley編著)。
同樣可用于本發(fā)明方法中的是表3和4中給出的任何一種氨基酸序列的同源物的編碼核酸。
同樣可用于本發(fā)明方法中的是表3中給出的任何一種氨基酸序列的衍生物，或前述任意SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的編碼核酸。優(yōu)選的衍生物是SEQ ID NO2、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQID NO55、SEQ ID NO57或SEQ ID NO59所代表的蛋白質(zhì)的衍生物。
另外，NAC轉(zhuǎn)錄因子(至少以其天然形式)一般具有DNA結(jié)合活性和激活結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)工具和技術(shù)容易地確定激活結(jié)構(gòu)域和DNA-結(jié)合活性的存在。
編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸可以來(lái)自任何自然來(lái)源或人工來(lái)源。核酸可以從其天然形式就組成和/或基因組環(huán)境方面通過(guò)人類有意操作而加以修飾。編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸優(yōu)選地來(lái)自植物，還優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自禾本科，該核酸最優(yōu)選來(lái)自稻。
因此文中對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子的任一引用意指如上文定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子。編碼如此NAC轉(zhuǎn)錄因子的任何核酸適用于實(shí)施本發(fā)明的方法。
本發(fā)明還包含通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的植物或植物部分(包括種子)。此植物或植物部分包含編碼文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體以促進(jìn)在植物中引入和/或表達(dá)用于本發(fā)明方法中的核酸序列。
因而，提供基因構(gòu)建體，其包含 i.編碼如上文所定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸； ii.與(i)的核酸有效連接的一種或多種調(diào)控序列。
本發(fā)明方法中所用的構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建。該基因構(gòu)建體可以插入適于轉(zhuǎn)化至植物內(nèi)并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的市售的載體。本發(fā)明因而提供如上文所定義的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。
植物用包含目的序列(即編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸)的載體轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常了解為成功轉(zhuǎn)化、選擇和增殖含有目的序列的宿主細(xì)胞而必須于載體上存在的遺傳元件。目的序列與一種或多種調(diào)控序列(至少與啟動(dòng)子)有效連接。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征，編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸與組成型啟動(dòng)子有效連接。組成型啟動(dòng)子在生長(zhǎng)和發(fā)育的大部分、但實(shí)際上并非全部階段期間有轉(zhuǎn)錄活性，并且基本上遍在地表達(dá)。該組成型啟動(dòng)子優(yōu)選地是GOS2啟動(dòng)子，更優(yōu)選地，該組成型啟動(dòng)子是稻GOS2啟動(dòng)子，該組成型啟動(dòng)子還優(yōu)選地由基本上與SEQ ID NO39或SEQ ID NO339相似的核酸序列代表，該組成型啟動(dòng)子最優(yōu)選地如SEQ ID NO39或SEQ ID NO339所代表。
應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的適用性不限于由SEQ ID NO1、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56或SEQ ID NO58代表的編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸，同時(shí)本發(fā)明的適用性也不限于由GOS2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的這類核酸的表達(dá)。也可以用來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法的其他組成型啟動(dòng)子的實(shí)例在文中“定義”部分中的表2a中顯示。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選特征，編碼NAC-型轉(zhuǎn)錄因子的核酸與幼綠組織(young green tissue)特異性啟動(dòng)子有效連接。文中定義的幼綠組織特異性啟動(dòng)子主要在幼綠組織中有轉(zhuǎn)錄活性，基本在任何其他植物部分沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)仍然允許在這些其他植物部分的任何滲漏表達(dá)。幼綠組織特異性啟動(dòng)子優(yōu)選是原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子，更優(yōu)選是由基本上與SEQ ID NO40相似的核酸序列代表的原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子，最優(yōu)選是如SEQ ID NO40所代表的啟動(dòng)子。
應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的適用性不限于由SEQ ID NO1代表的編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸，同時(shí)本發(fā)明的適用性也不限于由原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的這類核酸的表達(dá)。
也可以用來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法的其他原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子的實(shí)例在上面的表2c中顯示。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選特征，編碼NAC-型轉(zhuǎn)錄因子的核酸與根特異性啟動(dòng)子(內(nèi)參pro0110)有效連接。文中定義的根特異性啟動(dòng)子主要在植物的根中有轉(zhuǎn)錄活性，基本在任何其他植物部分沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)仍然允許在這些其他植物部分的任何滲漏表達(dá)。根特異性啟動(dòng)子優(yōu)選是RCc3啟動(dòng)子(Plant Mol Biol.1995年1月；27(2)237-48)，更優(yōu)選是來(lái)自稻的RCc3啟動(dòng)子，進(jìn)一步優(yōu)選是由基本上與SEQ ID NO110相似的核酸序列代表的RCc3啟動(dòng)子，最優(yōu)選是如SEQ ID NO110所代表的啟動(dòng)子。
應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的適用性不限于由SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56或SEQ ID NO58代表的編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸，同時(shí)本發(fā)明的適用性也不限于由RCc3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的這類核酸的表達(dá)。
也可用于實(shí)施本發(fā)明方法的其他根特異性啟動(dòng)子的實(shí)例示于上表2b。
任選地，一種或多種終止子序列可以在引入植物的構(gòu)建體中使用。額外的調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道適用于實(shí)施本發(fā)明的終止子序列和增強(qiáng)子序列。內(nèi)含子序列也可以添加至5′非翻譯區(qū)(UTR)或編碼序列內(nèi)，以增加在胞漿內(nèi)積累的成熟信息的量，如定義部分所述。其他調(diào)控序列(除啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3’UTR和/或5’UTR區(qū)之外)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定化元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道或可以輕易地獲得此類序列。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括需要用于在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制的復(fù)制序列起點(diǎn)。一個(gè)實(shí)例是當(dāng)需要將遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中維持為附加型遺傳元件(例如質(zhì)?；蛘沉７肿?時(shí)。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于f1-ori和colE1。遺傳構(gòu)建體可任選包含選擇標(biāo)記基因。文中的“定義”部分更加詳細(xì)的描述了選擇標(biāo)記。該標(biāo)記基因當(dāng)其不再需要時(shí)，可從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移除或切除。移除標(biāo)記的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，有用的技術(shù)描述于上面的“定義”部分。
本發(fā)明也提供制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，其包括在植物中引入和表達(dá)任意編碼如文中所定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸。
更具體地，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括 i.在植物細(xì)胞中引入和表達(dá)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子(如文中所定義)的核酸；和 ii.在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。
核酸可以直接引入植物細(xì)胞或引入植物本身(包括引入組織、器官或植物的任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，核酸優(yōu)選地通過(guò)轉(zhuǎn)化引入植物。
遺傳修飾的植物細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的所有方法再生。合適的方法可見(jiàn)于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或

和Willmitzer的上述出版物。
通常在轉(zhuǎn)化后，選擇一種或多種標(biāo)記存在的植物細(xì)胞或細(xì)胞群體，其中所述的標(biāo)記由與目的基因一起共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)的基因編碼，隨后將轉(zhuǎn)化的材料再生成整株植物。為了選擇轉(zhuǎn)化的植物，在轉(zhuǎn)化中獲得的植物材料原則上接受選擇條件處理，以至于轉(zhuǎn)化的植物可以與未轉(zhuǎn)化的植物區(qū)分。例如，以上文所述方式獲得的種子可以播種，在初始培育時(shí)期后，通過(guò)噴霧進(jìn)行合適的選擇。又一種可能性包括在使用合適選擇劑的瓊脂平板上生長(zhǎng)種子(根據(jù)需要在消毒之后)，使得僅轉(zhuǎn)化的種子可以生長(zhǎng)成植物?；蛘?，轉(zhuǎn)化的植物通過(guò)上述那些選擇標(biāo)記的存在篩選。
在DNA轉(zhuǎn)移和再生后，推測(cè)的轉(zhuǎn)化植物可以例如使用Southern分析對(duì)目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)造進(jìn)行評(píng)價(jià)。備選或額外地，新引入DNA的表達(dá)水平可以使用Northern和/或Western分析進(jìn)行監(jiān)測(cè)，這兩種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過(guò)多種方法加以增殖，如通過(guò)克隆增殖法或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以進(jìn)行自交，選擇純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并且T2植物通過(guò)經(jīng)典育種技術(shù)進(jìn)一步增殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以采取多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒的全部細(xì)胞)；轉(zhuǎn)化組織和未轉(zhuǎn)化組織的移植體(例如在植物中，與未轉(zhuǎn)化嫩枝嫁接的轉(zhuǎn)化的根狀莖)。
本發(fā)明明確地?cái)U(kuò)展至通過(guò)文中所述的任意方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，并擴(kuò)展至全部植物部分及其繁殖體。本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展至包含已經(jīng)通過(guò)任意前述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表現(xiàn)與通過(guò)本發(fā)明方法中的親代所產(chǎn)生的那些后代相同的一種或多種基因型特征和/或表型特征。
本發(fā)明也包括宿主細(xì)胞，其含有編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的分離的核酸。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
本發(fā)明也擴(kuò)展至植物的可收獲部分如，但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖、根莖、塊莖和球莖。本發(fā)明進(jìn)一步涉及衍生自、優(yōu)選直接衍生自此類植物的可收獲部分中的產(chǎn)物，如干燥顆?；蚍勰⒂?、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，調(diào)節(jié)的表達(dá)是增加的表達(dá)。增加核酸、基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法在本領(lǐng)域充分記載。增加表達(dá)的方法的實(shí)施在文中“定義”部分給出。
如上所述，用于調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中引入并表達(dá)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸；但是實(shí)施該方法的效果(即增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)的性狀)還可使用其他熟知的技術(shù)達(dá)到，例如T-DNA活化、TILLING、同源重組或定向進(jìn)化。這些技術(shù)中的一些的描述在文中“定義”部分給出。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生的這樣的植物，其相對(duì)于對(duì)照植物而具有增加生長(zhǎng)速率，導(dǎo)致早期生長(zhǎng)勢(shì)，尤其在植物發(fā)育早期(在稻和玉米的情況下一般在萌發(fā)后3周，但是這將依物種而不同)。因而，本發(fā)明提供用于增加植物生長(zhǎng)速率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)編碼文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸在植物中的表達(dá)，優(yōu)選增加表達(dá)。本發(fā)明也提供相對(duì)于對(duì)照植物用于獲得具有早期生長(zhǎng)勢(shì)的植物的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)、優(yōu)選增加編碼文中定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸在植物中的表達(dá)。
早期生長(zhǎng)勢(shì)也可以因相對(duì)于對(duì)照植物增加的植物適應(yīng)性引起或表現(xiàn)為相對(duì)于對(duì)照植物增加的植物適應(yīng)性，其原因在于例如植物更好地適應(yīng)其環(huán)境(即更能夠?qū)Ω抖喾N非生物性或生物性脅迫因素)。具有早期生長(zhǎng)勢(shì)的植物也顯示出作物更好的建立(作物整齊地生長(zhǎng)，即大多數(shù)植物在基本上相同的時(shí)間上達(dá)到發(fā)育各階段)，并顯示更好的生長(zhǎng)和往往更好的產(chǎn)量。因而，早期生長(zhǎng)勢(shì)可以通過(guò)測(cè)定多種因子如幼苗生長(zhǎng)速率、千粒重、萌發(fā)百分?jǐn)?shù)、出苗百分?jǐn)?shù)、幼苗高度、根長(zhǎng)度和苗生物量以及眾多其他因素而確定。
本發(fā)明方法的實(shí)施相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物，賦予在非脅迫條件下或在輕微干旱條件下生長(zhǎng)的植物增加的產(chǎn)量。因而根據(jù)本發(fā)明，提供用于增加在非脅迫條件下或在輕微干旱條件下生長(zhǎng)的植物中產(chǎn)量的方法，所述方法包括增加編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸在植物中的表達(dá)。
本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物，在營(yíng)養(yǎng)物缺乏條件下、尤其在氮缺乏條件下生長(zhǎng)的具有增加產(chǎn)量的植物。因而根據(jù)本發(fā)明，提供用于在營(yíng)養(yǎng)物缺乏條件下生長(zhǎng)的植物中增加產(chǎn)量的方法，所述方法包括增加編碼POI多肽的核酸在植物中的表達(dá)。營(yíng)養(yǎng)物缺乏可以因營(yíng)養(yǎng)物的缺乏所致，如氮、磷酸鹽及其他含磷化合物、鉀、鈣、鎘、鎂、錳、鐵和硼等。
在本發(fā)明方法中使用編碼NAC4轉(zhuǎn)錄因子的核酸(例如，SEQ ID NO52)和NAC4轉(zhuǎn)錄因子自身(例如，SEQ ID NO53)的情況下，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照植物相比，在基本沒(méi)有脅迫的條件下和脅迫條件下，植物中出現(xiàn)產(chǎn)量和/或種子產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)速率的增加。
文中定義的“NAC4轉(zhuǎn)錄因子”意指任意氨基酸序列，當(dāng)其用于構(gòu)建構(gòu)建NAC系統(tǒng)樹(例如圖1所示的)時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO53所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
NAC4轉(zhuǎn)錄因子也包含基序XIDSMPRLHADSSCSE，或與基序XI的序列具有一定同一性的基序，所述同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％序列同一性。
Motif XI優(yōu)選是DS M/V/I P R/K L/I/A H T/A/S D/E SS C/G SE。
Motif XI一般見(jiàn)于SEQ ID NO53和SEQ ID NO55的NAC，以及(在系統(tǒng)樹中)聚簇于前述SEQ ID NO所代表的NAC，而不是聚簇于任何其他NAC組的NAC。Motif XI可在任何位置包含一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸的取代。
通常植物通過(guò)更加緩慢的生長(zhǎng)來(lái)應(yīng)答脅迫接觸。在重度脅迫條件下，植物甚至可以完全停止生長(zhǎng)。另一方面，輕度脅迫在文中定義為當(dāng)植物接觸時(shí)不導(dǎo)致植物完全停止與生長(zhǎng)喪失重新開(kāi)始生長(zhǎng)能力的任何脅迫。本發(fā)明意義上的輕度脅迫導(dǎo)致脅迫植物的生長(zhǎng)與非脅迫條件下的對(duì)照植物相比，下降不到40％、35％或30％，優(yōu)選不到25％、20％或15％，更優(yōu)選不到14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于耕作方法(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的發(fā)展，栽培的作物植物常常不會(huì)遇到重度脅迫。因此，由輕度脅迫誘導(dǎo)的受損的生長(zhǎng)通常成為農(nóng)業(yè)中不期望的因素。輕度脅迫是植物可能接觸的典型脅迫。這些脅迫可以是植物接觸的日常的生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。典型的非生物或環(huán)境脅迫包括由反常的熱或冷/冰凍溫度產(chǎn)生的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過(guò)量的水)；無(wú)氧脅迫；化學(xué)毒性和氧化脅迫。非生物性脅迫可以是由水脅迫(尤其因?yàn)楦珊?、鹽脅迫、氧化脅迫或離子脅迫引起的滲透脅迫?；瘜W(xué)物質(zhì)(例如礦物質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)高或過(guò)低濃度)也可以引起非生物脅迫。生物脅迫一般是由病原如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的那些脅迫。文中所用的術(shù)語(yǔ)“非脅迫條件”為植物可能遇到的那些允許植物最佳生長(zhǎng)的、不顯著背離正常氣候的條件及其他非生物脅迫條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉給定地理位置的正常土壤條件和氣候條件。
非生物性脅迫導(dǎo)致不利地影響植物生長(zhǎng)及生產(chǎn)力的一系列形態(tài)學(xué)變化、生理學(xué)變化、生物化學(xué)變化和分子變化(Wang等人，(Planta(2003)2181-14)。已知干旱、鹽、極端溫度和氧化脅迫是相互聯(lián)系的并可以通過(guò)相似機(jī)制而誘導(dǎo)生長(zhǎng)損害及細(xì)胞損害。例如，干旱和/或鹽化作用主要表現(xiàn)為滲透脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和離子分布的破壞。經(jīng)常伴隨高溫或低溫、鹽或干旱脅迫的氧化脅迫可以造成功能性蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白變性。因此，這些多樣的環(huán)境脅迫常常激活相似的細(xì)胞信號(hào)途徑和細(xì)胞應(yīng)答，如產(chǎn)生脅迫蛋白質(zhì)、上調(diào)抗氧化物質(zhì)、積累相容性溶質(zhì)和生長(zhǎng)抑制。
既然多種多樣的環(huán)境脅迫激活相似的路徑，本發(fā)明關(guān)于干旱脅迫的舉例說(shuō)明(編碼NAC4轉(zhuǎn)錄因子的核酸和NAC4轉(zhuǎn)錄因子本身在本發(fā)明方法中的用途的情況下)不應(yīng)視為局限于干旱脅迫，而更應(yīng)視為表明NAC4編碼核酸和NAC4轉(zhuǎn)錄因子總體而言參與非生物脅迫的屏顯信息(screen)。此外，本發(fā)明的方法可以在非脅迫條件下或者輕度干旱條件下實(shí)施，以提供相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)特性(特別是增加的產(chǎn)量和種子產(chǎn)量)的植物。
據(jù)報(bào)道在干旱脅迫和高鹽脅迫之間存在特別高程度的“對(duì)話”(Rabbani等人(2003)Plant Physiol 1331755-1767)。例如，證實(shí)干旱和/或鹽堿化主要是滲透脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞中的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和離子分布的破壞。因此，很明顯NAC4轉(zhuǎn)錄因子的編碼核酸以及NAC4轉(zhuǎn)錄因子自身以及其在賦予植物干旱抗性中的用途，也同樣可以用于保護(hù)植物免受多種其他滲透脅迫。與之相似，很明顯NAC4轉(zhuǎn)錄因子的編碼核酸以及NAC4轉(zhuǎn)錄因子自身以及其在賦予植物鹽耐受中的用途也可以用于保護(hù)植物免受多種其他非生物脅迫的侵害。另外，經(jīng)常伴隨高溫或低溫、鹽或干旱脅迫的氧化脅迫可以造成功能性蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白變性。因此，這些多樣的環(huán)境脅迫常常激活相似的細(xì)胞信號(hào)途徑和細(xì)胞應(yīng)答，如產(chǎn)生脅迫蛋白質(zhì)、上調(diào)抗氧化物質(zhì)、積累相容性溶質(zhì)和生長(zhǎng)抑制。此外，Rabbani等人(2003，Plant Physiol 1331755-1767)報(bào)導(dǎo)在雙子葉植物和單子葉植物之間存在相似的脅迫耐受和應(yīng)答的分子機(jī)制。因此，本發(fā)明的方法有利地可用于任何植物。
文中定義的術(shù)語(yǔ)“非生物脅迫”用于指水脅迫(由于干旱或過(guò)多的水引起的)、缺氧脅迫、鹽脅迫、營(yíng)養(yǎng)物脅迫、溫度脅迫(由于熱、冷或冰冷溫度引起的)、化學(xué)毒性脅迫和氧化脅迫中的任一種或多種脅迫。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，非生物脅迫是滲透脅迫，選自水脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫和離子脅迫。優(yōu)選，水脅迫是干旱脅迫。術(shù)語(yǔ)鹽脅迫不限于普通的鹽(NaCl)，還可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2、亞磷酸鹽等等中的任一種或多種鹽。營(yíng)養(yǎng)物脅迫可由營(yíng)養(yǎng)物缺乏或過(guò)剩導(dǎo)致，所述營(yíng)養(yǎng)物例如氮、磷酸鹽和含有磷的其他化合物、鉀、鈣、鎘、鎂、錳、鐵和硼等。
增加的對(duì)非生物脅迫的耐受表現(xiàn)于在如上定義的非生物脅迫條件下增加的植物產(chǎn)量。在本發(fā)明涉及NAC4轉(zhuǎn)錄因子和其編碼核酸的用途的范圍內(nèi)，這類增加的產(chǎn)量可包括一個(gè)或多個(gè)下列方面(每一方面均與對(duì)照植物相比而言)增加的種子尺寸、增加的種子重量、增加的地上部分生物量、增加的植物高度、增加的根生物量、增加的每圓錐花序的花的數(shù)目和增加的第一圓錐花序(first panicle)的數(shù)目。
根據(jù)本發(fā)明，提供了相對(duì)于對(duì)照植物，在非生物脅迫條件下生長(zhǎng)的植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，該方法包括在植物中調(diào)節(jié)編碼NAC4轉(zhuǎn)錄因子的核酸的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，非生物脅迫是選自水脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫、營(yíng)養(yǎng)物脅迫和離子脅迫中的一種或多種的滲透脅迫。優(yōu)選，水脅迫是干旱脅迫。
本發(fā)明的方法有利地應(yīng)用于任意植物。
特別用于本發(fā)明方法中的植物包括屬于植物界超家族的全部植物，尤其單子葉植物和雙子葉植物，包括飼用或飼料豆類、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物是作物植物。作物植物的實(shí)例包括大豆、向日葵、卡諾拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。還優(yōu)選地，植物是單子葉植物。單子葉植物的實(shí)例包括甘蔗。更優(yōu)選地，植物是谷物。谷物的實(shí)例包括稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑小麥、黑麥、高粱和燕麥。早期生長(zhǎng)勢(shì)是尤其優(yōu)選的性狀的植物包括稻、玉米、小麥、向日葵、高粱。
本發(fā)明也包括編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的用途和NAC轉(zhuǎn)錄因子多肽的用途，用于增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀。
編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸或NAC轉(zhuǎn)錄因子本身可以用于育種程序中，其中鑒定到可以遺傳地與編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的基因連接的DNA標(biāo)記。所述的核酸/基因或NAC轉(zhuǎn)錄因子本身可以用來(lái)定義分子標(biāo)記。這種DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記隨后可以在育種程序中用來(lái)選擇具有本發(fā)明方法中如上文所定義的增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。
編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸/基因的等位變體也可以用于標(biāo)記輔助的育種程序中。這類育種程序有時(shí)需要通過(guò)使用例如EMS誘變法對(duì)植物作誘變處理而引入等位基因變異；備選地，該程序可以從非人為引起的所謂“自然”起源的一組等位變體開(kāi)始。隨后進(jìn)行等位變體的鑒定，例如通過(guò)PCR法。此后是用于選擇所討論及導(dǎo)致增加產(chǎn)量的序列的優(yōu)異等位變體的步驟。一般通過(guò)監(jiān)測(cè)含有所討論序列的不同等位變體的植物的生長(zhǎng)性能而實(shí)施選擇?？梢栽跍厥抑谢蛱镩g監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)性能。其他任選步驟包括將鑒定了優(yōu)異等位變體的植物與另一種植物雜交。這可以用來(lái)例如產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合。
編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸也可以用作探針以便對(duì)基因進(jìn)行遺傳作圖或物理作圖，所述探針作為所述基因的一部分及與這些基因關(guān)聯(lián)的性狀的標(biāo)記。此類信息可以用于植物育種中，以便開(kāi)發(fā)具有想要表型的株系。編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的這類用途僅需要具有至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核酸序列。編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸可以用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸探測(cè)。產(chǎn)生的結(jié)合圖式隨后可以使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1174-181)進(jìn)行遺傳分析以構(gòu)建遺傳圖。此外，該核酸可以用來(lái)探測(cè)含有經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶處理的一組個(gè)體的基因組DNA的Southern印跡，其中所述的一組個(gè)體代表具有確定的遺傳雜交的親代和后代。DNA多態(tài)性的分離被標(biāo)出并用來(lái)計(jì)算編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸在使用這個(gè)群體先前所獲得的遺傳圖中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中描述了植物基因衍生的探針的產(chǎn)生和其在遺傳作圖中的用途。眾多出版物描述了使用以上所提及的方法學(xué)或其改良方法對(duì)特定cDNA克隆的遺傳作圖。例如，F(xiàn)2互交群、回交群、隨機(jī)交配群、鄰近純合系和其他個(gè)體群體可以用于作圖。此類方法學(xué)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
所述核酸探針也可以用于物理作圖(即序列在物理圖上的排列；見(jiàn)Hoheisel等在Non-mammalian Genomic AnalyasisA Practical Guide，Academic press 1996，第319-346頁(yè)及其中引用的參考文獻(xiàn))。
在另一實(shí)施方案中，核酸探針可以在直接熒光原位雜交(FISH)作圖法(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)中使用。盡管當(dāng)前的FISH作圖法支持使用大型克隆(幾個(gè)kb至幾百個(gè)kb；見(jiàn)Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，然而靈敏度的改善可以允許使用更短探針進(jìn)行FISH作圖。
本發(fā)明還提供相對(duì)于對(duì)照植物在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中調(diào)節(jié)編碼AP2-2多肽的核酸的表達(dá)。
用于調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)編碼AP2-2多肽的核酸的表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中引入并表達(dá)編碼AP2-2多肽的核酸。
根據(jù)Nakano等人(2006)的定義，文中定義的術(shù)語(yǔ)“AP2-2多肽”意指分類為ERF蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子，更具體地是分類為ERF蛋白質(zhì)VII組的成員。ERF蛋白質(zhì)VII組除了存在單個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域(是所有ERF蛋白質(zhì)的部分)，還由其他基序表征，例如CMVII-1至CMVII-8(Nakano等人，2006)。這些CMVII基序基于擬南芥和稻序列的分析描述，是擬南芥和/或稻序列的部分(圖2)，但也存在于其他物種的ERF蛋白質(zhì)VII組。
可用于本發(fā)明方法中的AP2-2多肽包含保守序列基序XII(SEQ IDNO133) (R/I/V/L/K)(R/K/Q/D/E/A)(I/L)(R/Y/H)G(A/S/R/K/T/D/G/H/L/N)(K/T/R/N/G)A(K/R/E)(V/L/P/T)NF(P/V)。
優(yōu)選地，基序XII是 (R/I/K)(R/K/Q/D/A)(I/L)(R/Y/H)G(A/S/R/K/T/D/E/G/H/L/N)(K/T/R/N/G)A(K/R/E)(V/L/P/T)NF(P/V/A)。
優(yōu)選地，可用于本發(fā)明方法中的AP2-2多肽還包含一個(gè)或多個(gè)以下基序 基序XIII(SEQ ID NO134) MCGG(A/S)(I/V/L)(I/L)(S/H/A/Y/G/P/E)(D/G/H/Y/E/Q/N)。
優(yōu)選地，基序XIII是MCGG(A/S)I(I/L)(S/H/A/Y)(D/G/H/Y/E)。
更優(yōu)選基序XIII是MCGG(A/S)I(I/L)(S/H)(D/G/H/E)。
基序XIV(SEQ ID NO135) (K/N/R/S/H/M/Q/P/A/E)(R/K/H/A/G/E/V/P/M)(E/K/A/R/S/Q/T/V/G/H/P)(R/K/Q/S/G)(K/G/P/S/R/T/A/N)(T/N/R/S/A/Y/H/G)(L/Q/H/V/R/K/A/P/G)(Y/F)(R/W/K/L/M)G(I/V)(R/Q/H)(R/Q/W/K)R(P/K/T)。
優(yōu)選地，基序XIV是 (K/N/R/S/H/M)(R/K/H/A/G/E/V/P)(E/K/A/R/S/Q)(R/K/Q/S)(K/G/P/S/R/T)(T/N/R/S/A/Y/H/G)(L/Q/H/V/R/K/A/P/G/F/I)(Y/F/L)(R/W/K/L/M/H)G(I/V)(R/Q/H)(R/Q/W/K)R(P/K/T)。
更優(yōu)選地，基序XIV是 (K/N/R/S)(R/K/H)(E/K/A/R)(R/K/Q)(K/G/P/S)(T/N/R/S/A)(L/Q/H/V/R/K)(Y/F)(R/W/K)G(I/V)R(R/Q)RP。
最優(yōu)選地，基序XIV是(K/N)(R/H)KRKNQ(Y/F)RGIRQRP。
基序XV(SEQ ID NO136) SD(Q/T/E/V)(G/S)SNSF(G/D/E/S/N)(C/S)S(D/E)(F/Y/L)(G/S)(W/Q/L)(E/G/S)(N/E/D)。
優(yōu)選地，基序XV是 SD(Q/T)(G/S/A)SNS(F/I)(G/D)(C/S)S(D/E)F(G/S)(W/Q/L)(E/S)(N/D)。
基序XVI(SEQ ID NO137) (L/I/F/M)W(S/T/N/M)(F/Y/L/I)(D/E/Q/G)(N/D/H/E)(I/Y/F/S/M/L/V/D/H/N/E/G)。
優(yōu)選地，基序XVI是 (L/I/M)W(S/T/M)(F/Y/L/I)(D/E/Q/G)(N/D/E)(I/Y/F/S/M/L/V/D)。
更優(yōu)選地，基序XVI是(L/I/M)W(S/M)(F/L/I)D(D/E)(I/M/L/V)。
基序XVII(SEQ ID NO138) (D/E/S)(F/A/W/D)(E/A)(A/D/L)(D/A/G/E)(F/G/L)(N/E/R/G/Q/W)(E/G/V/D/R)F(E/K/V/Y/G/D/L/I)(V/R/D/S/N/A/E)(D/G/T/E/R/A/Y/L/F)。
優(yōu)選地，基序XVII是 (D/E/S)(F/A/W/D)(E/A)(A/D)(D/A)(F/G)(E/R/Q/W)(E/G/D/R)F(E/K/Y/G/D/L/I)(V/R/D/S/N/A/E)(D/G/T/E/R)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，基序XVII是 (D/E/S)(F/A)(E/A)(A/D)(D/A)F(E/R/Q/W)(E/G/D/R)F(E/K/Y/G/D)(V/R/D/S/N)(D/G/T/E)。
更優(yōu)選地，基序XVII是 (D/E/S)(F/A)(E/A)(A/D)DF(E/R/Q/W)(E/G)F(E/K/Y)(V/R/D/S)(D/G/T)。
最優(yōu)選地，基序XVII是(D/E)FEADF(E/R/Q)EF(E/K)(V/R/D)(D/G)。
這些基序主要來(lái)自擬南芥和稻序列，因此允許在來(lái)自其他植物物種的AP2-2序列的這些基序中有一個(gè)或多個(gè)保守取代。
此外，AP2-2多肽(至少以它們天然的形式)可具有DNA-結(jié)合活性。測(cè)定DNA-結(jié)合活性的工具和技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”和“基序”定義在文中的“定義”部分。存在鑒定結(jié)構(gòu)域的特定數(shù)據(jù)庫(kù)。實(shí)例在文中的“定義”部分給出。
在SMART數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)SEQ ID NO132多肽序列的分析表明存在AP2結(jié)構(gòu)域(SMART登錄號(hào)SM00380，圖2)。此結(jié)構(gòu)域是植物特有的，且已知發(fā)揮蛋白質(zhì)-DNA相互作用的作用(結(jié)合GCC-盒，主要響應(yīng)乙烯)。
本發(fā)明通過(guò)用由SEQ ID NO131代表的編碼多肽序列SEQ IDNO132的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物加以說(shuō)明，然而，本發(fā)明的實(shí)施不限于這些序列；本發(fā)明的方法可以使用如文中所定義的任意AP2-2-編碼核酸或AP2-2多肽有利地進(jìn)行。
編碼AP2-2多肽的核酸的實(shí)例在文中實(shí)施例9的表14中給出。這類核酸用于實(shí)施本發(fā)明的方法。實(shí)施例9的表14中給出的氨基酸序列是SEQID NO132所代表的AP2-2多肽的直向同源物和旁系同源物的實(shí)例序列，術(shù)語(yǔ)“直向同源物”和“旁系同源物”如文中所定義。其他直向同源物和旁系同源物通過(guò)開(kāi)展所謂交互性blast搜索而容易地鑒定。
本發(fā)明還提供迄今未知的AP2-2編碼核酸和AP2-2多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，因此提供分離的核酸分子，其包含 (i)SEQ ID NO341、SEQ ID NO343或SEQ ID NO345中的一個(gè)所示的核酸； (ii)SEQ ID NO341、SEQ ID NO343或SEQ ID NO345中的一個(gè)所示的核酸的互補(bǔ)物； (iii)核酸，其編碼與SEQ ID NO341、SEQ ID NO343或SEQ IDNO3454中的一個(gè)所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的POI多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，也提供分離的多肽，其包含 (i)SEQ ID NO342、SEQ ID NO344或SEQ ID NO346中的一個(gè)所示的氨基酸序列； (ii)與SEQ ID NO342、SEQ ID NO344或SEQ ID NO346中的一個(gè)所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高； (iii)如上(i)或(ii)中給出的氨基酸序列的衍生物。
核酸變體也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。此類核酸變體的實(shí)例包括編碼實(shí)施例9的表14中給出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，術(shù)語(yǔ)“同源物”和“衍生物”如文中所定義。也可用于本發(fā)明方法中的是編碼實(shí)施例9的表14中給出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。用于本發(fā)明方法中的同源物和衍生物與它們衍生自的未修飾的蛋白質(zhì)具有基本相同的生物和功能活性。
用于實(shí)施本發(fā)明方法的其他核酸變體包括編碼AP2-2多肽的核酸的部分、與編碼AP2-2多肽的核酸雜交的核酸、編碼AP2-2多肽的核酸的剪接變體、編碼AP2-2多肽的核酸的等位變體，以及通過(guò)基因改組獲得的編碼AP2-2多肽的核酸的變體。術(shù)語(yǔ)雜交序列、剪接變體、等位變體和基因改組如文中所述。
編碼AP2-2多肽的核酸不需要是全長(zhǎng)核酸，因?yàn)楸景l(fā)明方法的實(shí)施不依賴使用全長(zhǎng)核酸序列的使用。本發(fā)明提供在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)實(shí)施例9表14中給出的核酸序列中任一個(gè)的部分，或?qū)嵤├?表14中給出的氨基酸序列中任一個(gè)的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的部分。
核酸的部分可以例如通過(guò)對(duì)該核酸產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)缺失而制備。所述的部分可以以分離的形式加以使用或它們可以與其他編碼性(或非編碼性)序列融合，以便例如產(chǎn)生組合幾種活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其他編碼序列融合時(shí)，翻譯時(shí)產(chǎn)生的所得多肽可以比對(duì)該蛋白質(zhì)部分所預(yù)測(cè)的多肽更大。
用于本發(fā)明方法中的部分編碼文中定義的AP2-2多肽，且具有與實(shí)施例9表14中給出的氨基酸序列基本相同的生物學(xué)活性。優(yōu)選地，此部分是在實(shí)施例9表14中給出的任何一種核酸的部分，或?qū)嵤├?表14中給出的氨基酸序列中任一個(gè)的直向同源物或旁系同源物的編碼核酸的部分。此部分的長(zhǎng)度按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?00、800、900或1000個(gè)連續(xù)核苷酸，其中所述的連續(xù)核苷酸是實(shí)施例9表14中給出的任何一種核酸序列，或是實(shí)施例9表14中給出的氨基酸序列中任一個(gè)的直向同源物或旁系同源物的編碼核酸。最優(yōu)選地，此部分是核酸SEQ ID NO131的部分。優(yōu)選地，此部分編碼包含如文中所定義一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域或基序的氨基酸序列。優(yōu)選地，此部分編碼氨基酸序列，所述氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO132所示的氨基酸序列的AP2-2多肽組，而不是聚類于任何其他組。
用于本發(fā)明方法中的另一核酸變體是能夠在降低的嚴(yán)格條件下、優(yōu)選在嚴(yán)格條件下與編碼如文中所定義的AP2-2多肽的核酸雜交，或與如文中所定義的部分雜交的核酸。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)能夠與實(shí)施例9表14中給出的任何一種核酸雜交的核酸，或包括在植物中引入并表達(dá)如此核酸，其能夠與實(shí)施例9表14中給出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸雜交的核酸。
用于本發(fā)明方法中的雜交序列編碼文中定義的AP2-2多肽，且具有與實(shí)施例9表14中給出的氨基酸序列的基本相同的生物學(xué)活性。優(yōu)選地，雜交序列能夠與實(shí)施例9表14中給出的任一核酸雜交或與任一這些序列的部分雜交，其中所述的部分如上文所定義，或者其中雜交序列能夠與實(shí)施例9表14中給出的任意氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的編碼核酸雜交。最優(yōu)選地，雜交序列能夠與如SEQ ID NO131所代表的核酸或與其部分雜交。優(yōu)選地，雜交序列編碼包含任何一種或多種如文中所定義的基序或結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。優(yōu)選地，雜交序列編碼氨基酸序列，所述氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO132所示的氨基酸序列的AP2-2多肽組，而不是聚類于任何其他組。
用于本發(fā)明方法中的另一種核酸變體是編碼如上文所定義的AP2-2多肽的剪接變體，剪接變體如文中所定義。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例9表14中給出的任何一種核酸的剪接變體，或?qū)嵤├?表14中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的剪接變體。
優(yōu)選的剪接變體是由SEQ ID NO131代表的核酸的剪接變體，或編碼SEQ ID NO132的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接變體。優(yōu)選地，由所述剪接變體編碼的氨基酸序列包含任何一種或多種如文中所定義的基序或結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，剪接變體編碼的氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO132所示的氨基酸序列的AP2-2多肽組，而不是聚類于任何其他組。
用于實(shí)施本發(fā)明方法的另一種核酸變體是編碼如上文所定義的AP2-2多肽的核酸的等位變體，等位變體如文中所定義。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例9表14中給出的任何一種核酸的等位變體，或包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例9表14中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的等位變體。
用于本發(fā)明方法中的等位變體具有與AP2-2多肽SEQ ID NO132和實(shí)施例9表14中所示的任意氨基酸基本相同的生物學(xué)活性。等位變體天然存在，且包含在本發(fā)明方法中的是這些天然等位基因的用途。優(yōu)選地，等位變體是等位變體SEQ ID NO131或編碼SEQ ID NO132的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位變體。優(yōu)選地，由所述等位變體編碼的氨基酸包含任何一種或多種如文中所定義的基序或結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，等位變體編碼的氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO132所示的氨基酸序列的AP2-2多肽組，而不是聚類于任何其他組。
基因改組或定向進(jìn)化也可以用來(lái)產(chǎn)生編碼如上文定義的AP2-2多肽的核酸的變體；術(shù)語(yǔ)“基因改組”如文中所定義。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例9表14中給出的任何一種核酸的變體，或包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例9表14中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的變體，所述變體核酸通過(guò)基因改組獲得。
優(yōu)選地，通過(guò)基因改組獲得的變體核酸編碼的氨基酸包含任何一種或多種如文中所定義的基序或結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，編碼通過(guò)基因改組獲得的變體核酸的氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO132所示的氨基酸序列的AP2-2多肽組，而不是聚類于任何其他組。
另外，核酸變體也可以通過(guò)位點(diǎn)定向誘變獲得。幾種方法可用于實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定向誘變，最常見(jiàn)的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley編著)。
編碼AP2-2多肽的核酸可以來(lái)自任何自然來(lái)源或人工來(lái)源。核酸可以從其天然形式就組成和/或基因組環(huán)境方面通過(guò)人類有意操作而加以修飾。編碼AP2-2多肽的核酸優(yōu)選地來(lái)自植物，還優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自禾本科，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自稻屬，最優(yōu)選來(lái)自稻。
本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。尤其本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物而具有增加的產(chǎn)量、尤其增加的種子產(chǎn)量的植物。在文中的“定義”部分中更詳細(xì)地描述了術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量”和“種子產(chǎn)量”。但是，應(yīng)當(dāng)注意的是術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量相關(guān)性狀”不包含植物細(xì)胞的代謝物，增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀不是增加的脅迫抗性的結(jié)果。
本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)照植物增加植物的產(chǎn)量、尤其增加植物的種子產(chǎn)量的方法，所述方法包括在植物中調(diào)節(jié)編碼文中定義的AP2-2多肽的核酸的表達(dá)，優(yōu)選增加其表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征，本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物而具有增加的生長(zhǎng)速率的植物。因而根據(jù)本發(fā)明，提供用于增加植物生長(zhǎng)速率的方法，所述方法包括在植物中調(diào)節(jié)編碼文中定義的AP2-2多肽的核酸的表達(dá)，優(yōu)選增加其表達(dá)。
本發(fā)明方法的實(shí)施相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的合適對(duì)照植物，賦予在非脅迫條件下或在輕微干旱條件下生長(zhǎng)的植物增加的產(chǎn)量。因而根據(jù)本發(fā)明，提供用于增加在非脅迫條件下生長(zhǎng)的植物中產(chǎn)量的方法，所述方法包括增加編碼AP2-2多肽的核酸在植物中的表達(dá)。
本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物，在營(yíng)養(yǎng)物缺乏條件下、尤其在氮缺乏條件下生長(zhǎng)的植物增加的產(chǎn)量。因而根據(jù)本發(fā)明，提供用于在營(yíng)養(yǎng)物缺乏條件下生長(zhǎng)的植物中增加產(chǎn)量的方法，所述方法包括增加編碼POI多肽的核酸在植物中的表達(dá)。營(yíng)養(yǎng)物缺乏可以因營(yíng)養(yǎng)物的缺乏所致，如氮、磷酸鹽及其他含磷化合物、鉀、鈣、鎘、鎂、錳、鐵和硼等。
本發(fā)明包含通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的植物或植物部分(包括種子)。此植物或植物部分包含編碼文中定義的AP2-2多肽的核酸轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體以促進(jìn)在植物中引入和/或表達(dá)編碼AP2-2多肽的核酸。該基因構(gòu)建體可以插入適于轉(zhuǎn)化至植物內(nèi)并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的市售載體。本發(fā)明也提供文中定義的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。
更具體地本發(fā)明提供了構(gòu)建體，其包含 (a)編碼如上定義的AP2-2多肽的核酸； (b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地 (c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)照序列”和“終止序列”如中所定義。用包含上述任意核酸的載體轉(zhuǎn)化植物。技術(shù)人員非常了解為成功轉(zhuǎn)化、選擇和增殖含有目的序列的宿主細(xì)胞而必須于載體上存在的遺傳元件。目的序列有效地與一種或多種調(diào)控序列(至少與啟動(dòng)子)連接。
有利地，任何類型的啟動(dòng)子可以用來(lái)驅(qū)動(dòng)核酸序列的表達(dá)。組成型啟動(dòng)子尤其可用于本發(fā)明的方法，組成型啟動(dòng)子優(yōu)選是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的適用性不限于由SEQ ID NO131所代表的AP2-2多肽的編碼核酸，同時(shí)本發(fā)明的適用性也不限于由組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)編碼AP2-2多肽的核酸的表達(dá)。
該組成型啟動(dòng)子優(yōu)選地是GOS2啟動(dòng)子，更優(yōu)選地，該組成型啟動(dòng)子是稻GOS2啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子的其他實(shí)例參見(jiàn)文中“定義”部分的表2a。
其他調(diào)控序列(除啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3’UTR和/或5’UTR區(qū)之外)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定化元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道或可以輕易地獲得此類序列。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括需要用于在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)序列。一個(gè)實(shí)例是當(dāng)需要將遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中維持為附加型遺傳元件(例如質(zhì)粒或粘粒分子)時(shí)。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括，但不限于f1-ori和colE1。
為檢測(cè)本發(fā)明方法中所用核酸序列的成功轉(zhuǎn)移和/或選擇含有這些核酸的轉(zhuǎn)基因植物，最好使用標(biāo)記基因(或報(bào)道基因)。因此，遺傳構(gòu)建體可以任選地包含選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記在文中的“定義”部分進(jìn)一步詳述。一旦不再需要標(biāo)記基因，它們可從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中除去或切除。標(biāo)記(基因)除去或切除的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，可用的技術(shù)描述于上面的定義部分。
本發(fā)明也提供相對(duì)于對(duì)照植物產(chǎn)生具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)編碼如上定義的AP2-2多肽的任意核酸。
更具體地，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括 (i)在植物或植物細(xì)胞中引入并表達(dá)編碼AP2-2多肽的核酸；和 (ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。
核酸可以直接引入植物細(xì)胞或引入植物本身(包括引入組織、器官或植物的任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，核酸優(yōu)選地通過(guò)轉(zhuǎn)化而引入植物。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”在文中的“定義”部分進(jìn)一步詳述。
遺傳修飾的植物細(xì)胞可以通過(guò)技術(shù)人員熟悉的所有方法加以再生。合適的方法可以在S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或

和Willmitzer的前述出版物中找到。
通常在轉(zhuǎn)化后，對(duì)植物細(xì)胞或細(xì)胞群體選擇一種或多種標(biāo)記的存在，其中所述的標(biāo)記由與目的基因一起共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼，隨后將轉(zhuǎn)化的材料再生成整株植物。為選擇轉(zhuǎn)化的植物，在轉(zhuǎn)化中獲得的植物材料原則上接受選擇條件處理，以至于轉(zhuǎn)化的植物可以與未轉(zhuǎn)化的植物區(qū)分。例如。以上文所述方式獲得的種子可以播種，在初始培育時(shí)期后，通過(guò)噴霧進(jìn)行合適的選擇處理。又一種可能性包括在使用合適選擇劑的瓊脂平板上培育種子(根據(jù)需要在消毒之后)，以至于僅轉(zhuǎn)化的種子可以生長(zhǎng)成植物。備選地，對(duì)轉(zhuǎn)化的植物篩選選擇標(biāo)記(如上文所述的那些選擇標(biāo)記)的存在。
在DNA轉(zhuǎn)移和再生后，推測(cè)的轉(zhuǎn)化植物可以例如使用Southern分析對(duì)目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)造進(jìn)行評(píng)價(jià)。備選或額外地，新引入DNA的表達(dá)水平可以使用Northern和/或Western分析監(jiān)測(cè)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過(guò)多種方法加以增殖，如通過(guò)克隆性增殖法或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)的轉(zhuǎn)化植物可以進(jìn)行自交并選擇純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并且T2植物隨后可以通過(guò)經(jīng)典育種技術(shù)進(jìn)一步繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以采取多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆性轉(zhuǎn)化體(例如受轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒的全部細(xì)胞)；轉(zhuǎn)化組織和未轉(zhuǎn)化組織的移植體(例如在植物中，與未轉(zhuǎn)化嫩枝嫁接的轉(zhuǎn)化的根莖)。
本發(fā)明明確地?cái)U(kuò)展至通過(guò)文中所述的任一方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，并擴(kuò)展至全部植物部分及其繁殖體。本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展至包含已經(jīng)通過(guò)任一前述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表現(xiàn)與通過(guò)本發(fā)明方法中的親代所產(chǎn)生的那些后代相同的基因型特征和/或表型特征。
本發(fā)明也包括宿主細(xì)胞，其含有編碼如上文所定義的AP2-2多肽的分離核酸。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。宿主植物對(duì)于本發(fā)明方法中所用核酸或載體、表達(dá)盒或構(gòu)建體或載體而言原則上有利地是能夠合成本發(fā)明方法中所用多肽的全部植物。
本發(fā)明方法有利地適用于任何植物。特別用于本發(fā)明方法中的植物包括屬于植物界超家族的全部植物，尤其單子葉植物和雙子葉植物，包括飼用或飼料豆類、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物是作物植物。作物植物的實(shí)例包括大豆、向日葵、卡諾拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。還優(yōu)選地，植物是單子葉植物。單子葉植物的實(shí)例包括甘蔗。更優(yōu)選地，植物是谷物。谷物的實(shí)例包括稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥。
本發(fā)明也擴(kuò)展至植物的可收獲部分如，但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖、根狀莖、塊莖和球莖。本發(fā)明進(jìn)一步涉及來(lái)自自、優(yōu)選直接來(lái)自這種植物的可收獲部分中的產(chǎn)物，如干燥顆?；蚍勰⒂?、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，受調(diào)節(jié)的表達(dá)是增加的表達(dá)。增加核酸、基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法在現(xiàn)有技術(shù)中充分記載。增加表達(dá)的方法的實(shí)例在文中“定義”部分給出。
如上文提及，用于調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)編碼AP2-2多肽的核酸表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中引入并表達(dá)編碼AP2-2多肽的核酸；然而實(shí)施所述方法的作用即增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀也可以使用眾所周知的其他技術(shù)實(shí)現(xiàn)。下文是對(duì)這些技術(shù)中某些的描述。
本發(fā)明的作用也可以使用T-DNA激活或TILLING(基因組內(nèi)定向誘導(dǎo)的局部損傷)再現(xiàn)，其描述同樣參見(jiàn)“定義”部分。
本發(fā)明的作用也可以使用同源重組再現(xiàn)，其描述同樣參見(jiàn)“定義”部分。
本發(fā)明也包括編碼文中所述AP2-2多肽的核酸的用途和這些AP2-2多肽的用途，其用于增強(qiáng)植物中的任意上述產(chǎn)量相關(guān)性狀。
編碼文中所述AP2-2多肽的核酸或AP2-2多肽本身可以用于育種程序中，其中鑒定到可以遺傳地與編碼AP2-2多肽的基因連接的DNA標(biāo)記。所述的核酸/基因或AP2-2多肽本身可以用來(lái)定義分子標(biāo)記。這種DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記隨后可以在育種程序中用來(lái)選擇具有本發(fā)明方法中如上文所定義的增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。
編碼AP2-2多肽的核酸/基因的等位變體也可以用于標(biāo)記輔助的育種程序中。這種育種程序有時(shí)需要通過(guò)使用例如EMS誘變法對(duì)植物進(jìn)行誘變處理而引入等位基因變異；備選地，該程序可以從非人為引起的所謂“自然”起源的一組等位變體開(kāi)始。隨后進(jìn)行等位變體的鑒定，例如通過(guò)PCR法。此后是用于選擇所討論及導(dǎo)致增加產(chǎn)量的序列的優(yōu)異等位變體的步驟。一般通過(guò)監(jiān)測(cè)含有所討論序列的不同等位變體的植物的生長(zhǎng)性能而實(shí)施選擇?？梢栽跍厥抑谢蛱镩g監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)性能。其他任選步驟包括將鑒定了優(yōu)異等位變體的植物與另一種植物雜交。這可以用來(lái)例如產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合。
編碼AP2-2多肽的核酸也可以用作探針以便對(duì)基因進(jìn)行遺傳作圖或物理作圖，所述探針作為所述基因的一部分及與這些基因關(guān)聯(lián)的性狀的標(biāo)記。此類信息可以用于植物育種中，以便開(kāi)發(fā)具有想要表型的株系。編碼AP2-2多肽的核酸的這種用途僅需要具有至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核酸序列。編碼AP2-2多肽的核酸可以用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用編碼AP2-2多肽的核酸探測(cè)。產(chǎn)生的結(jié)合圖式隨后可以使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1174-181)進(jìn)行遺傳分析以構(gòu)建遺傳圖。此外，該核酸可以用來(lái)探測(cè)含有經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶處理的一組個(gè)體的基因組DNA的Southern印跡，其中所述的一組個(gè)體代表具有確定的遺傳雜交的親代和后代。DNA多態(tài)性的分離被標(biāo)出并用來(lái)計(jì)算編碼AP2-2多肽的核酸在使用這個(gè)群體先前所獲得的遺傳圖中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中描述了植物基因衍生的探針的產(chǎn)生和其在遺傳作圖中的用途。眾多出版物描述了使用以上所提及的方法學(xué)或其改良方法對(duì)特定cDNA克隆的遺傳作圖。例如，F(xiàn)2互交群、回交群、隨機(jī)交配群、鄰近純合系和其他個(gè)體群體可以用于作圖。此類方法學(xué)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
所述核酸探針也可以用于物理作圖(即序列在物理圖上的排列；見(jiàn)Hoheisel等在Non-mammalian Genomic AnalyasisA Practical Guide，Academic press 1996，第319-346頁(yè)及其中引用的參考文獻(xiàn))。
在另一實(shí)施方案中，核酸探針可以在直接熒光原位雜交(FISH)作圖法(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)中使用。盡管當(dāng)前的FISH作圖法支持使用大型克隆(幾個(gè)kb至幾百個(gè)kb；見(jiàn)Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，然而靈敏度的改善可以允許使用更短探針進(jìn)行FISH作圖。
用于遺傳作圖及物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸而實(shí)施。實(shí)例可見(jiàn)于文中的“定義”部分。
本發(fā)明還提供相對(duì)于對(duì)照植物在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中調(diào)節(jié)編碼AP2-70-樣多肽的核酸的表達(dá)。
本發(fā)明還提供迄今未知的AP2-70-樣編碼核酸和AP2-70-樣多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，因此提供分離的核酸分子，其包含 (i)SEQ ID NO257所示的核酸； (ii)SEQ ID NO257所示的核酸的互補(bǔ)物； (iii)核酸，其編碼與SEQ ID NO258所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的AP2-70-樣多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；以及其編碼與SEQ ID NO331PFLMQWLNLLPLPVLDSSSWCPEHFHNSESDALP(其代表SEQ IDNO258的C末端區(qū))所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的AP2-70-樣多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，也提供分離的多肽，其包含 (i)SEQ ID NO258所示的氨基酸序列； (ii)與SEQ ID NO258所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；以及與SEQ ID NO331PFLMQWLNLLPLPVLDSSSWCPEHFHNSESDALP(其代表SEQ ID NO258的C末端區(qū))所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
(iii)如上(i)或(ii)中給出的氨基酸序列的衍生物。
用于調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)編碼AP2-70-樣多肽的核酸的表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中引入并表達(dá)編碼AP2-70-樣多肽的核酸。
下文中“本發(fā)明方法中所用的蛋白質(zhì)”的任何引用意指文中定義的AP2-70-樣多肽。下文中“本發(fā)明方法中所用的核酸”的任何引用意指能夠編碼此類AP2-70-樣多肽的核酸。待引入植物(并且因而用于實(shí)施本發(fā)明方法中)的核酸是編碼現(xiàn)在所述類型蛋白質(zhì)的任意核酸，下文又稱作“AP2-70-樣核酸”或“AP2-70-樣基因”。
根據(jù)Nakano等人，2006的分類，下文定義的AP2-70-樣多肽落入Ib組(A-6)的范圍。
下文定義的“AP2-70-樣多肽”意指包含下列的任意多肽 (i)SEQ ID NO332YRGVRQRHWGKWVAEIRLPRNRTRLWLGTFDTAEEAALAYDSAAFRLRGESARLNF所示的AP2DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或與SEQ ID NO332所示的結(jié)構(gòu)域具有一定序列同一性的結(jié)構(gòu)域，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高；和 (ii)與SEQ ID NO258所示的(稻)多肽序列具有一定序列同一性的多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高；和 (iii)包含SEQ ID NO333RLPXNX1RXRXWLGT F/YD/E T/S所示基序XVIII的多肽，其中X是任意氨基酸，且X1是0、1或更多，最多至30、空位；和 (iv)包含SEQ ID NO334RG D/E所示基序XIX的多肽。
上面(i)項(xiàng)描述的AP2DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的YRG和LAYD(如下突出顯示)是優(yōu)選的特定DNA-結(jié)合盒。
SEQ ID NO332YRGVRQRHWGKWVAEIRLPRNRTRLWLGTFDTAEEAALAYDSAAFRLRGESARLNF。
優(yōu)選地，上面(i)項(xiàng)描述的AP2DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少包含殘基LPRNRTRLWLGTFDT。
基序XVIII(SEQ ID NO333)優(yōu)選是RLP K/R/Q NX1R T/V/M RL/V WLGT F/Y D/E T/S，其中X1是0、1或更多，最多至30、空位。
更優(yōu)選地，基序XVIII(SEQ ID NO333)是RLPRNX1RTRLWLGTFDT，其中X1是0、1或更多，最多至30、空位。
文中定義的AP2-70多肽還可以包含一個(gè)或多個(gè)以下基序 基序XX/SEQ ID NO335WDESESFLLHKYPSLEIDWDAILS，或與基序XX具有一定的序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。改編自Nakano等人，2006(CMI-1)。
基序XXI/SEQ ID NO336GPPLHAAVDAKLHAICH，或與基序XXI具有一定的序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。改編自Nakano等人，2006(CMI-2)。
基序XXII/SEQ ID NO337GANYLTPAQVLHVQAQLQRLRRP，或與基序XXII具有一定的序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。改編自Nakano等人，2006(CMI-3)。
基序XXIII/SEQ ID NO338VDSKELMGALAPSMVSFSYPCSEQSASS，或與基序XXIII具有一定的序列同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。改編自Nakano等人，2006(CMI-4)。
上述任意基序XVIII，和XX至XXIII可在任意位置包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)保守和/或非保守改變和/或缺失。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”和“基序”定義在文中的“定義”部分。存在鑒定結(jié)構(gòu)域的特定數(shù)據(jù)庫(kù)。實(shí)例在文中的“定義”部分給出。
另外，AP2-70-樣多肽(至少以其天然形式)一般具有DNA結(jié)合活性。測(cè)定DNA結(jié)合活性的工具和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明通過(guò)用由SEQ ID NO257代表的編碼多肽序列SEQ IDNO258的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物加以說(shuō)明，然而，本發(fā)明的實(shí)施不限于這些序列。本發(fā)明方法可以使用如文中所定義的任意AP2-70-樣編碼核酸或AP2-70-樣多肽有利地進(jìn)行。
編碼AP2-70-樣多肽的核酸序列的實(shí)例在文中實(shí)施例18的表18中給出。這類核酸可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。實(shí)施例18的表18中給出的氨基酸序列是SEQ ID NO258所代表的AP2-70-樣多肽的直向同源物和旁系同源物的實(shí)例序列，術(shù)語(yǔ)“直向同源物”和“旁系同源物”如文中所定義。
核酸變體也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。此類核酸變體的實(shí)例包括編碼實(shí)施例18的表18中給出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，術(shù)語(yǔ)“同源物”和“衍生物”如文中所定義。也可用于本發(fā)明方法中的是編碼實(shí)施例18的表18中給出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。用于本發(fā)明方法中的同源物和衍生物與它們衍生自的未修飾的蛋白質(zhì)具有基本相同的生物和功能活性。
用于實(shí)施本發(fā)明方法的其他核酸變體包括編碼AP2-70-樣多肽的核酸的部分、與編碼AP2-70-樣多肽的核酸雜交的核酸、編碼AP2-70-樣多肽的核酸的剪接變體、編碼AP2-70-樣多肽的核酸的等位變體，以及通過(guò)基因改組獲得的編碼AP2-70-樣多肽的核酸的變體。術(shù)語(yǔ)雜交序列、剪接變體、等位變體和基因改組如文中所述。
編碼AP2-70-樣多肽的核酸不需要是全長(zhǎng)核酸，因?yàn)楸景l(fā)明方法的實(shí)施不依賴使用全長(zhǎng)核酸序列的使用。本發(fā)明提供在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)實(shí)施例18表18中給出的核酸序列中任一個(gè)的部分，或?qū)嵤├?8表18中給出的氨基酸序列中任一個(gè)的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的部分。
核酸的部分可以例如通過(guò)對(duì)該核酸產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)缺失而制備。所述的部分可以以分離的形式加以使用或它們可以與其他編碼性(或非編碼性)序列融合，以便例如產(chǎn)生組合幾種活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其他編碼序列融合時(shí)，翻譯時(shí)產(chǎn)生的所得多肽可以比對(duì)該蛋白質(zhì)部分所預(yù)測(cè)的多肽更大。
用于本發(fā)明方法中的部分編碼文中定義的AP2-70-樣多肽，所述多肽具有與實(shí)施例18表18中給出的氨基酸序列基本相同的生物學(xué)活性。優(yōu)選地，此部分是在實(shí)施例18表18中給出的任何一種核酸的部分，或?qū)嵤├?8表18中給出的氨基酸序列中任一個(gè)的直向同源物或旁系同源物的編碼核酸的部分。此部分的長(zhǎng)度按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?00、650、700、750個(gè)連續(xù)核苷酸，其中所述的連續(xù)核苷酸是實(shí)施例18表18中給出的任何一種核酸序列，或是實(shí)施例18表18中給出的氨基酸序列中任一個(gè)的直向同源物或旁系同源物的編碼核酸。最優(yōu)選地，此部分是核酸SEQ ID NO257的部分。優(yōu)選地，此部分編碼氨基酸序列，所述氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹(例如圖3和4所示)時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO258所示的氨基酸序列的AP2-70-樣多肽(I組(A-6)，尤其是Ib組參見(jiàn)Nakanao等人，2006的分類)組，而不是聚類于任何其他組。
用于本發(fā)明方法中的另一核酸變體是能夠在降低的嚴(yán)格條件下、優(yōu)選在嚴(yán)格條件下與編碼如文中所定義的AP2-70-樣多肽的核酸雜交的核酸，或與如文中所定義的部分雜交的核酸。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)能夠與實(shí)施例18表18中給出的任何一種核酸雜交的核酸，或包括在植物中引入并表達(dá)如此核酸，其能夠與實(shí)施例18表18中給出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸雜交。
用于本發(fā)明方法中的雜交序列編碼文中定義的AP2-70-樣多肽，且具有與實(shí)施例18表18中給出的氨基酸序列的基本相同的生物學(xué)活性。優(yōu)選地，雜交序列是能夠與實(shí)施例18表18中給出的任一核酸雜交或與任一這些序列的部分雜交的序列，其中所述的部分如上文所定義，或者其中雜交序列能夠與實(shí)施例18表18中給出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的編碼核酸雜交。最優(yōu)選地，雜交序列能夠與如SEQ ID NO257所代表的核酸或與其部分雜交。
優(yōu)選地，雜交序列編碼氨基酸序列，所述氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹(例如圖3和4所示)時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO258所示的氨基酸序列的AP2-70-樣多肽(I組(A-6)，尤其是Ib組參見(jiàn)Nakanao等人，2006的分類)組，而不是聚類于任何其他組。
用于本發(fā)明方法中的另一種核酸變體是編碼如上文所定義的AP2-70-樣多肽的剪接變體，剪接變體如文中所定義。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例18表18中給出的任何一種核酸的剪接變體，或?qū)嵤├?8表18中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的剪接變體。
優(yōu)選的剪接變體是由SEQ ID NO257代表的核酸的剪接變體，或編碼SEQ ID NO258的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接變體。優(yōu)選地，剪接變體編碼的氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹(例如圖3和4所示)時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO258所示的氨基酸序列的AP2-70-樣多肽(I組(A-6)，尤其是Ib組參見(jiàn)Nakanao等人，2006的分類)組，而不是聚類于任何其他組。
用于實(shí)施本發(fā)明方法的另一種核酸變體是編碼如上文所定義的AP2-70-樣多肽的核酸的等位變體，等位變體如文中所定義。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例18表18中給出的任何一種核酸的等位變體，或包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例18表18中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的等位變體。
用于本發(fā)明方法中的等位變體具有與AP2-70-樣多肽SEQ ID NO258和實(shí)施例18表18中所示的任意氨基酸基本相同的生物學(xué)活性。等位變體天然存在，且包含在本發(fā)明方法中的是這些天然等位基因的用途。優(yōu)選地，等位變體是等位變體SEQ ID NO257或編碼SEQ ID NO258的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位變體。優(yōu)選地，等位變體編碼的氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹(例如圖3和4所示)時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO258所示的氨基酸序列的AP2-70-樣多肽(I組(A-6)，尤其是Ib組參見(jiàn)Nakanao等人，2006的分類)組，而不是聚類于任何其他組。
基因改組或定向進(jìn)化也可以用來(lái)產(chǎn)生編碼如上文定義的AP2-70-樣多肽的核酸的變體；術(shù)語(yǔ)“基因改組”如文中所定義。
本發(fā)明提供用于在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例18表18中給出的任何一種核酸的變體，或包括在植物中引入并表達(dá)實(shí)施例18表18中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的變體，所述變體核酸通過(guò)基因改組獲得。
優(yōu)選地，編碼通過(guò)基因改組獲得的變體核酸的氨基酸序列當(dāng)其用于構(gòu)建系統(tǒng)樹(例如圖3和4所示)時(shí)，趨向聚類于包含SEQ ID NO258所示的氨基酸序列的AP2-70-樣多肽(I組(A-6)，尤其是Ib組參見(jiàn)Nakanao等人，2006的分類)組，而不是聚類于任何其他組。
另外，核酸變體也可以通過(guò)位點(diǎn)定向誘變獲得。幾種方法可用于實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定向誘變，最常見(jiàn)的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley編著)。
編碼AP2-70-樣多肽的核酸可以來(lái)自任何自然來(lái)源或人工來(lái)源。核酸可以從其天然形式就組成和/或基因組環(huán)境方面通過(guò)人類有意操作而加以修飾。編碼AP2-70-樣多肽的核酸優(yōu)選地來(lái)自植物，還優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自禾本科，最優(yōu)選是來(lái)自稻的核酸。
本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。尤其本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物而具有增加的產(chǎn)量、尤其增加的種子產(chǎn)量的植物。在文中的“定義”部分中更詳細(xì)地描述了術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量”和“種子產(chǎn)量”。
本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)照植物增加植物的產(chǎn)量、尤其增加植物的種子產(chǎn)量的方法，所述方法包括在植物中調(diào)節(jié)編碼文中定義的AP2-70-樣多肽的核酸的表達(dá)，優(yōu)選增加其表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征，本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物而具有增加的生長(zhǎng)速率的植物。因而根據(jù)本發(fā)明，提供用于增加植物生長(zhǎng)速率的方法，所述方法包括在植物中調(diào)節(jié)編碼文中定義的AP2-70-樣多肽的核酸的表達(dá)，優(yōu)選增加其表達(dá)。
本發(fā)明方法的實(shí)施相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的合適對(duì)照植物，賦予在非脅迫條件下或在輕微干旱條件下生長(zhǎng)的植物增加的產(chǎn)量。因而根據(jù)本發(fā)明，提供用于增加在非脅迫條件下或在輕微干旱條件下生長(zhǎng)的植物中產(chǎn)量的方法，所述方法包括增加編碼AP2-70-樣多肽的核酸在植物中的表達(dá)。
本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物，在營(yíng)養(yǎng)物缺乏條件下、尤其在氮缺乏條件下生長(zhǎng)的具有增加產(chǎn)量的植物。因而根據(jù)本發(fā)明，提供用于在營(yíng)養(yǎng)物缺乏條件下生長(zhǎng)的植物中增加產(chǎn)量的方法，所述方法包括增加編碼AP2-70-樣多肽的核酸在植物中的表達(dá)。營(yíng)養(yǎng)物缺乏可以因營(yíng)養(yǎng)物的缺乏或過(guò)剩所致，如氮、磷酸鹽及其他含磷化合物、鉀、鈣、鎘、鎂、錳、鐵和硼等。
本發(fā)明包含通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的植物或植物部分(包括種子)。此植物或植物部分包含編碼文中定義的AP2-70-樣多肽的核酸轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體以促進(jìn)在植物中引入和/或表達(dá)編碼AP2-70-樣多肽的核酸。該基因構(gòu)建體可以插入適于轉(zhuǎn)化至植物內(nèi)并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的市售載體。本發(fā)明也提供文中定義的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。
更具體地本發(fā)明提供了構(gòu)建體，其包含 (a)編碼如上定義的AP2-70-樣多肽的核酸； (b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地 (c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
優(yōu)選地，編碼AP2-70-樣多肽的核酸是 (i)SEQ ID NO257所示的核酸； (ii)SEQ ID NO257所示的核酸的互補(bǔ)物； (iii)核酸，其編碼與SEQ ID NO258所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的AP2-70-樣多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；以及與SEQ ID NO331PFLMQWLNLLPLPVLDSSSWCPEHFHNSESDALP(其代表SEQ ID NO258的C末端區(qū))所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的AP2-70-樣多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)照序列”和“終止序列”如中所定義。
用包含上述任意核酸的載體轉(zhuǎn)化植物。技術(shù)人員非常了解為成功轉(zhuǎn)化、選擇和增殖含有目的序列的宿主細(xì)胞而必須于載體上存在的遺傳元件。目的序列有效地與一種或多種調(diào)控序列(至少與啟動(dòng)子)連接。
有利地，任何類型的啟動(dòng)子(天然的或合成的)可以用來(lái)驅(qū)動(dòng)核酸序列的表達(dá)。組成型啟動(dòng)子尤其可用于本發(fā)明的方法。參見(jiàn)文中“定義”部分中各種啟動(dòng)子類型的定義。也可用于本發(fā)明方法中的是根特異性啟動(dòng)子。
應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的適用性不限于由SEQ ID NO257所代表的AP2-70-樣多肽的編碼核酸，同時(shí)本發(fā)明的適用性也不限于由組成型啟動(dòng)子或根特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)編碼AP2-70-樣多肽的核酸的表達(dá)。
該組成型啟動(dòng)子優(yōu)選地是GOS2啟動(dòng)子，更優(yōu)選地，GOS2啟動(dòng)子來(lái)自稻。更優(yōu)選該組成型啟動(dòng)子由基本上與SEQ ID NO39或SEQ ID NO339相似的核酸序列代表，最優(yōu)選該組成型啟動(dòng)子由SEQ ID NO39或SEQ ID NO339代表。組成型啟動(dòng)子的其他實(shí)例參見(jiàn)文中定義部分的表2a。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征，編碼AP2-70-樣多肽的核酸與根特異性啟動(dòng)子有效連接。根特異性啟動(dòng)子優(yōu)選是RCc3啟動(dòng)子(Plant Mol Biol.1995年1月；27(2)237-48)，更優(yōu)選是來(lái)自稻的RCc3啟動(dòng)子，進(jìn)一步優(yōu)選是由基本上與SEQ ID NO110或SEQ ID NO340相似的核酸序列代表的RCc3啟動(dòng)子，最優(yōu)選是如SEQ ID NO110所代表的啟動(dòng)子。也可用于實(shí)施本發(fā)明方法的其他根特異性啟動(dòng)子的實(shí)例參見(jiàn)文中的表2b。
為檢測(cè)本發(fā)明方法中所用核酸序列的成功轉(zhuǎn)移和/或選擇含有這些核酸的轉(zhuǎn)基因植物，最好使用標(biāo)記基因(或報(bào)道基因)。因此，遺傳構(gòu)建體可以任選地包含選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記在文中的“定義”部分進(jìn)一步詳述。
本發(fā)明也提供相對(duì)于對(duì)照植物產(chǎn)生具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在植物中引入并表達(dá)編碼定義的如上的AP2-70-樣多肽的任意核酸。
更具體地，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，尤其是增加的(種子)產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括 (i)在植物或植物細(xì)胞中引入并表達(dá)編碼AP2-70-樣多肽的核酸；和 (ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下生長(zhǎng)植物細(xì)胞。
(i)中的核酸可以是能夠編碼文中定義的AP2-70-樣多肽的任意核酸。優(yōu)選地，該核酸是 (i)SEQ ID NO257所示的核酸； (ii)SEQ ID NO257所示的核酸的互補(bǔ)物； (iii)核酸，其編碼與SEQ ID NO258所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的AP2-70-樣多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；并且與SEQ ID NO331PFLMQWLNLLPLPVLDSSSWCPEHFHNSESDALP(其代表SEQ IDNO258的C末端區(qū))所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的AP2-70-樣多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
核酸可以直接引入植物細(xì)胞或引入植物本身(包括引入組織、器官或植物的任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，核酸優(yōu)選地通過(guò)轉(zhuǎn)化而引入植物。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”在文中的“定義”部分進(jìn)一步詳述。
遺傳修飾的植物細(xì)胞可以通過(guò)技術(shù)人員熟悉的所有方法加以再生。合適的方法可以在S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或

和Willmitzer的前述出版物中找到。
通常在轉(zhuǎn)化后，對(duì)植物細(xì)胞或細(xì)胞群體選擇一種或多種標(biāo)記的存在，其中所述的標(biāo)記由與目的基因一起共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼，隨后將轉(zhuǎn)化的材料再生成整株植物。為選擇轉(zhuǎn)化的植物，在轉(zhuǎn)化中獲得的植物材料原則上接受選擇條件處理，以至于轉(zhuǎn)化的植物可以與未轉(zhuǎn)化的植物區(qū)分。例如。以上文所述方式獲得的種子可以播種，在初始培育時(shí)期后，通過(guò)噴霧進(jìn)行合適的選擇處理。又一種可能性包括在使用合適選擇劑的瓊脂平板上培育種子(根據(jù)需要在消毒之后)，以至于僅轉(zhuǎn)化的種子可以生長(zhǎng)成植物。備選地，對(duì)轉(zhuǎn)化的植物篩選選擇標(biāo)記(如上文所述的那些選擇標(biāo)記)的存在。
在DNA轉(zhuǎn)移和再生后，推測(cè)的轉(zhuǎn)化植物可以例如使用Southern分析對(duì)目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)造進(jìn)行評(píng)價(jià)。備選或額外地，新引入DNA的表達(dá)水平可以使用Northern和/或Western分析監(jiān)測(cè)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過(guò)多種方法加以增殖，如通過(guò)克隆性增殖法或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)的轉(zhuǎn)化植物可以進(jìn)行自交并選擇純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并且T2植物隨后可以通過(guò)經(jīng)典育種技術(shù)進(jìn)一步繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以采取多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆性轉(zhuǎn)化體(例如受轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒的全部細(xì)胞)；轉(zhuǎn)化組織和未轉(zhuǎn)化組織的移植體(例如在植物中，與未轉(zhuǎn)化嫩枝嫁接的轉(zhuǎn)化的根莖)。
本發(fā)明明確地?cái)U(kuò)展至通過(guò)文中所述的任一方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，并擴(kuò)展至全部植物部分及其繁殖體。本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展至包含已經(jīng)通過(guò)任一前述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表現(xiàn)與通過(guò)本發(fā)明方法中的親代所產(chǎn)生的那些后代相同的基因型特征和/或表型特征。
本發(fā)明也包括宿主細(xì)胞，其含有編碼如上文所定義的AP2-70-樣多肽的分離核酸。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。宿主植物對(duì)于本發(fā)明方法中所用核酸或載體、表達(dá)盒或構(gòu)建體或載體而言原則上有利地是能夠合成本發(fā)明方法中所用多肽的全部植物。
本發(fā)明方法有利地適用于任何植物。特別用于本發(fā)明方法中的植物包括屬于植物界超家族的全部植物，尤其單子葉植物和雙子葉植物，包括飼用或飼料豆類、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物是作物植物。作物植物的實(shí)例包括大豆、向日葵、卡諾拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。還優(yōu)選地，植物是單子葉植物。單子葉植物的實(shí)例包括甘蔗。更優(yōu)選地，植物是谷物。谷物的實(shí)例包括稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥。
本發(fā)明也擴(kuò)展至植物的可收獲部分如，但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖、根狀莖、塊莖和球莖。本發(fā)明進(jìn)一步涉及來(lái)自自、優(yōu)選直接來(lái)自這種植物的可收獲部分中的產(chǎn)物，如干燥顆粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，受調(diào)節(jié)的表達(dá)是增加的表達(dá)。增加核酸、基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法在現(xiàn)有技術(shù)中充分記載。實(shí)例在文中“定義”部分給出。
如上文提及，用于調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)編碼AP2-70-樣多肽的核酸表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中引入并表達(dá)編碼AP2-70-樣多肽的核酸；然而實(shí)施所述方法的作用即增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀也可以使用眾所周知的其他技術(shù)實(shí)現(xiàn)。對(duì)這些技術(shù)中某些的描述可見(jiàn)于“定義”部分。
本發(fā)明的作用也可以使用T-DNA激活或TILLING(基因組內(nèi)定向誘導(dǎo)的局部損傷)再現(xiàn)，其描述參見(jiàn)“定義”部分。
本發(fā)明的作用也可以使用同源重組再現(xiàn)，其描述參見(jiàn)“定義”部分。
本發(fā)明也包括編碼文中所述AP2-70-樣多肽的核酸的用途和這些AP2-70-樣多肽的用途，其用于增強(qiáng)植物中的任意上述產(chǎn)量相關(guān)性狀。
編碼文中所述AP2-70-樣多肽的核酸AP2-70-樣多肽本身可以用于育種程序中，其中鑒定到可以遺傳地與編碼AP2-70-樣多肽的基因連接的DNA標(biāo)記。所述的核酸/基因或AP2-70-樣多肽本身可以用來(lái)定義分子標(biāo)記。這種DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記隨后可以在育種程序中用來(lái)選擇具有本發(fā)明方法中如上文所定義的增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。
編碼AP2-70-樣多肽的核酸/基因的等位變體也可以用于標(biāo)記輔助的育種程序中。這種育種程序有時(shí)需要通過(guò)使用例如EMS誘變法對(duì)植物進(jìn)行誘變處理而引入等位基因變異；備選地，該程序可以從非人為引起的所謂“自然”起源的一組等位變體開(kāi)始。隨后進(jìn)行等位變體的鑒定，例如通過(guò)PCR法。此后是用于選擇所討論及導(dǎo)致增加產(chǎn)量的序列的優(yōu)異等位變體的步驟。一般通過(guò)監(jiān)測(cè)含有所討論序列的不同等位變體的植物的生長(zhǎng)性能而實(shí)施選擇?？梢栽跍厥抑谢蛱镩g監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)性能。其他任選步驟包括將鑒定了優(yōu)異等位變體的植物與另一種植物雜交。這可以用來(lái)例如產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合。
編碼AP2-70-樣多肽的核酸也可以用作探針以便對(duì)基因進(jìn)行遺傳作圖或物理作圖，所述探針作為所述基因的一部分及與這些基因關(guān)聯(lián)的性狀的標(biāo)記。此類信息可以用于植物育種中，以便開(kāi)發(fā)具有想要表型的株系。編碼AP2-70-樣多肽的核酸的這種用途僅需要具有至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核酸序列。編碼AP2-70-樣多肽的核酸可以用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用編碼AP2-70-樣多肽的核酸探測(cè)。產(chǎn)生的結(jié)合圖式隨后可以使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1174-181)進(jìn)行遺傳分析以構(gòu)建遺傳圖。此外，該核酸可以用來(lái)探測(cè)含有經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶處理的一組個(gè)體的基因組DNA的Southern印跡，其中所述的一組個(gè)體代表具有確定的遺傳雜交的親代和后代。DNA多態(tài)性的分離被標(biāo)出并用來(lái)計(jì)算編碼AP2-70-樣多肽的核酸在使用這個(gè)群體先前所獲得的遺傳圖中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中描述了植物基因衍生的探針的產(chǎn)生和其在遺傳作圖中的用途。眾多出版物描述了使用以上所提及的方法學(xué)或其改良方法對(duì)特定cDNA克隆的遺傳作圖。例如，F(xiàn)2互交群、回交群、隨機(jī)交配群、鄰近純合系和其他個(gè)體群體可以用于作圖。此類方法學(xué)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
所述核酸探針也可以用于物理作圖(即序列在物理圖上的排列；見(jiàn)Hoheisel等人在Non-mammalian Genomic AnalyasisA Practical Guide，Academic press 1996，第319-346頁(yè)及其中引用的參考文獻(xiàn))。
在另一實(shí)施方案中，核酸探針可以在直接熒光原位雜交(FISH)作圖法(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)中使用。盡管當(dāng)前的FISH作圖法支持使用大型克隆(幾個(gè)kb至幾百個(gè)kb；見(jiàn)Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，然而靈敏度的改善可以允許使用更短探針進(jìn)行FISH作圖。
本發(fā)明方法產(chǎn)生具有如前文所述的增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。這些性狀也可以與經(jīng)濟(jì)上有利的其他性狀組合，如其他的產(chǎn)量增加性狀，對(duì)其他非生物性脅迫和生物性脅迫的耐受性，調(diào)節(jié)多種構(gòu)造性特征和/或生物化學(xué)特征和/或生理學(xué)特征的性狀。
附圖描述 本發(fā)明現(xiàn)在將參考下列附圖進(jìn)行描述，其中 圖1顯示來(lái)自O(shè)oka等人，2003(DNA Research 10，239-247)的系統(tǒng)樹。倒數(shù)第三個(gè)，標(biāo)記為“OsNAC7”的虛線框是包含序列SEQ ID NO2的組。始于ONAC022終于OsNAC3的NAC的簇代表包含序列SEQ IDNO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57和SEQ ID NO59的簇。認(rèn)為聚類在這些組中的氨基酸序列(例如表3和4中給出的氨基酸序列)可用于本發(fā)明的方法中。
圖2顯示序列SEQ ID NO132，其具有(A)推定的核定位信號(hào)、(B)AP2/ERF DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、(1)CMVII-1基序、(3)CMVII-3基序、(4)CMVII-4基序、(5)CMVII-5基序、(6)CMVII-6基序、(7)CMVII-7基序、(8)CMVII-8基序。The CMVII基序根據(jù)Nakano等人(2006)鑒定。
圖3顯示來(lái)自Nakano等人(Plant Physiol.第140卷，2006)的系統(tǒng)樹，其中示為I(A-6)的組包括文中定義的AP2-70-樣多肽的組。
圖4顯示包含文中定義的AP2-70-樣多肽序列，且延伸至Nakano等人中示為組I(A-6)的組的系統(tǒng)樹的部分。該系統(tǒng)樹使用來(lái)自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供的鄰近連接聚類算法構(gòu)建。
圖5顯示文中如上定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的比對(duì)。序列使用來(lái)自VectorNTI軟件包(InforMax，Bethesda，MD)的AlignX程序進(jìn)行比對(duì)。多重比對(duì)用空位開(kāi)口罰分10和空位延伸0.01進(jìn)行。需要時(shí)，實(shí)施細(xì)微手工編輯以便更好地定位一些保守區(qū)。示出NAC結(jié)構(gòu)域以及基序I至III。
圖6顯示文中如上定義的NAC轉(zhuǎn)錄因子的比對(duì)。序列使用來(lái)自Vector NTI軟件包(InforMax，Bethesda，MD)的AlignX程序進(jìn)行比對(duì)。多重比對(duì)用空位開(kāi)口罰分10和空位延伸0.01進(jìn)行。需要時(shí)，實(shí)施細(xì)微手工編輯以便更好地定位一些保守區(qū)。示出NAC結(jié)構(gòu)域以及基序IV至XI。
圖7顯示了來(lái)自擬南芥和稻的AP2-2多肽的CLUSTAL W多重序列比對(duì)。SEQ ID NO132(Os06g09390)以黑體示出，且保守區(qū)(基序XII至XVII，SEQ ID NO133至SEQ ID NO138)以下劃線示出。
圖8顯示AP2-70-樣多肽與基序XVIII和XIX的比對(duì)，其中指出基序XVIII和XIX，以及AP2DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
圖9顯示雙元載體p163，其用于增加在GOS2啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO0129)控制下的稻NAC轉(zhuǎn)錄因子編碼核酸在稻中的表達(dá)。
圖10顯示雙元載體p164，其用于增加在GOS2啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO0129)控制下的稻NAC1轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO50)編碼核酸在稻中的組成型表達(dá)。
圖11顯示雙元載體p165，其用于增加在GOS2啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO0129)控制下的稻NAC4轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO52)編碼核酸在稻中的組成型表達(dá)。
圖12顯示雙元載體p166，其用于增加在RCc3啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO0110)控制下的稻NAC4轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO52)編碼核酸在稻中的根特異性表達(dá)。
圖13顯示雙元載體p167，其用于增加在原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO0123)控制下的稻NAC轉(zhuǎn)錄因子編碼核酸在稻中的表達(dá)。
圖14顯示雙元載體p167，其用于增加在RCc3啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO0110)控制下的稻NAC6轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO54)編碼核酸在稻中的根特異性表達(dá)。
圖15顯示雙元載體p168，其用于增加在GOS2啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO0129)控制下的稻NAC7轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO56)編碼核酸在稻中的組成型表達(dá)。
圖16顯示雙元載體p169，其用于增加在RCc3啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO0110)控制下的稻NAC3轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO58)編碼核酸在稻中的根特異性表達(dá)。
圖17顯示雙元載體pGOS2::NAC1，其用于增加在GOS2啟動(dòng)子控制下的稻NAC1轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO50)編碼核酸在稻中的組成型表達(dá)。
圖18顯示雙元載體pGOS2::NAC4，其用于增加在GOS2啟動(dòng)子控制下的稻NAC4轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO52)編碼核酸在稻中的組成型表達(dá)。
圖19顯示雙元載體pRCc3::NAC4，其用于增加在RCc3啟動(dòng)子控制下的稻NAC4轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO52)編碼核酸在稻中的根特異性表達(dá)。
圖20顯示雙元載體pRCc3::NAC6，其用于增加在RCc3啟動(dòng)子控制下的稻NAC6轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO54)編碼核酸在稻中的根特異性表達(dá)。
圖21顯示雙元載體pGOS2::NAC7，其用于增加在GOS2啟動(dòng)子控制下的稻NAC7轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO56)編碼核酸在稻中的組成型表達(dá)。
圖22顯示雙元載體pRCc3::NAC3，其用于增加在RCc3啟動(dòng)子控制下的稻NAC3轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO58)編碼核酸在稻中的根特異性表達(dá)。
圖23顯示用于增加稻中在GOS2啟動(dòng)子控制下的稻AP2-2蛋白質(zhì)編碼核酸表達(dá)的雙元載體。
圖24顯示用于增加稻中在稻RCC3啟動(dòng)子(pRCC3)控制下的稻AP2-70-樣蛋白質(zhì)編碼核酸表達(dá)的雙元載體。
圖25顯示用于增加稻中在稻GOS2啟動(dòng)子(pGOS2)控制下的稻AP2-70-樣蛋白質(zhì)編碼核酸表達(dá)的雙元載體。
圖26至29詳述用于實(shí)施本發(fā)明方法的序列的實(shí)例。
實(shí)施例 本發(fā)明現(xiàn)在將參考僅作為說(shuō)明的下列實(shí)施例加以描述。下列實(shí)施例不意圖徹底定義或限制本發(fā)明范圍。
A)OsNAM2 實(shí)施例1克隆OsNAM2 cDNA 使用來(lái)自2周齡稻幼苗的總細(xì)胞RNA來(lái)克隆OsNAM2 cDNA。使用RNeasy試劑盒(Qiagen，德國(guó))來(lái)提取RNA。從5’UTR(非翻譯區(qū))至終止密碼子，OsNAM2 cDNA長(zhǎng)度為1292bp。將兩個(gè)重疊cDNA加入該OsNAM2 cDNA克隆。使用接頭引物(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′)和OsNAM2特異引物(OsNAM2-2)(5’-CTC TCCAGA GGC GGC ATC ATG TCG GA-3’)由5’RACE-PCR獲得1025bp的5’cDNA。用BD SMARTTM RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，美國(guó))進(jìn)行5’RACE-PCR。制造商提供接頭引物(SMART II A寡核苷酸)。使用兩個(gè)OsNAM2-特異引物(NAM2-1(5’-TGA TCG GGA TGA GGA AGAC-3’)和NAM2-3(5’-GAT CAG TCT CGG TCA TCG ATG-3’))的PCR獲得620bp的3’cDNA。用Oligotex mRNA試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)合成作為PCR模板的第一條cDNA。候選PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化、亞克隆進(jìn)入pGEM-T Easy(Promega，美國(guó))，并通過(guò)測(cè)序確定。攜帶5’cDNA的載體用HindIII切割，并與3’cDNA載體的HindIII片段連接。產(chǎn)物是1292bp的OsNAM2 cDNA。
實(shí)施例2載體構(gòu)建 2.1 GOS2啟動(dòng)子控制下的OsNAM2 進(jìn)入克隆隨后在LR反應(yīng)中與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起使用。這種載體在T-DNA邊界內(nèi)含有作為功能性元件的植物選擇標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒，和旨在與已經(jīng)克隆于所述進(jìn)入克隆中的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于組成型表達(dá)的稻GOS2啟動(dòng)子(SEQ ID NO39或SEQ ID NO339，內(nèi)參PRO0129)位于該Gateway盒的上游。
在LR重組步驟后，將產(chǎn)生的表達(dá)載體p163(圖9)轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4044并隨后轉(zhuǎn)化至稻植物內(nèi)。使轉(zhuǎn)化的稻植物生長(zhǎng)，然后檢測(cè)下述參數(shù)。
2.2原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子控制下的OsNAM2 進(jìn)入克隆隨后在LR反應(yīng)中與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起使用。這種載體在T-DNA邊界內(nèi)含有作為功能性元件的植物選擇標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒，和旨在與已經(jīng)克隆于所述進(jìn)入克隆中的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于綠色組織特異性表達(dá)的原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子(SEQ ID NO40，內(nèi)參PRO0123)位于該Gateway盒的上游。
在LR重組步驟后，將產(chǎn)生的表達(dá)載體p167(圖13)轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4044并隨后轉(zhuǎn)化至稻植物內(nèi)。使轉(zhuǎn)化的稻植物生長(zhǎng)，然后檢測(cè)下述參數(shù)。
實(shí)施例3評(píng)價(jià)方法 3.1 評(píng)價(jià)準(zhǔn)備 產(chǎn)生大約30個(gè)獨(dú)立的T0稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室用于生長(zhǎng)和收獲T1種子。留下7個(gè)事件，其中所述事件的T1后代對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在/不存在以3:1比例分離。對(duì)于這些事件中的每一事件，通過(guò)監(jiān)測(cè)目視標(biāo)記表達(dá)而選擇含有轉(zhuǎn)基因的大約10株T1幼苗(雜合子和純合子)和缺少轉(zhuǎn)基因的大約10株T1幼苗(失效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排培育。溫室條件是短日照(12小時(shí)光照)，在光線下28℃和在黑暗中22℃以及相對(duì)濕度70％。使植物從播種期直至成熟期通過(guò)數(shù)字成像箱數(shù)次。在每一時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)每株植物從至少6個(gè)不同角度拍攝數(shù)字圖像(2048 x 1536像素，1600萬(wàn)顏色)。
3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn) 使用雙因子ANOVA(方差分析)作為統(tǒng)計(jì)模型用于植物表型特征的整體評(píng)價(jià)。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的全部事件的全部植物的所有測(cè)量參數(shù)實(shí)施F檢驗(yàn)。實(shí)施F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)τ谌哭D(zhuǎn)化事件的作用并驗(yàn)證基因的整體作用(又稱作全局基因作用)。用于真實(shí)全局基因作用的顯著性的閾值對(duì)于F檢驗(yàn)設(shè)置在5％概率水平上。顯著性F檢驗(yàn)值標(biāo)示基因作用，意味著不僅僅基因的存在或位置才造成表型上的差異。
為檢查基因在事件中的作用，即株系特異性作用，使用來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的無(wú)效植物的數(shù)據(jù)集在每個(gè)事件內(nèi)進(jìn)行t檢驗(yàn)?！睙o(wú)效植物”或“無(wú)效分離子”或“失效合子”是以與轉(zhuǎn)基因植物相同的方式受到處理，但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)從中發(fā)生分離的植物。無(wú)效植物也可以描述為純合陰性轉(zhuǎn)化植物。用于t檢驗(yàn)的顯著性的閾值設(shè)置在10％概率水平上。一些事件的結(jié)果可以高于或低于這個(gè)閾值。這基于如此假設(shè)，即基因可能僅在基因組中某些位置內(nèi)具有作用，并且這種位置依賴性作用的出現(xiàn)并非罕見(jiàn)。這種基因作用在文中又稱作“基因的株系作用”。p-值通過(guò)t-值與t-分布比較或備選地通過(guò)F-值與F-分布比較而獲得。該p-值隨后給出無(wú)效假設(shè)(即轉(zhuǎn)基因的作用不存在)是正確的概率。
實(shí)施例4評(píng)價(jià)結(jié)果 4.1 GOS2啟動(dòng)子控制下的OsNAM2 相對(duì)失效合子，在GOS2啟動(dòng)子控制下表達(dá)OsNAM2基因的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的地上部分面積、圓錐花序數(shù)、每圓錐花序的花數(shù)和種子總數(shù)。相對(duì)失效合子，轉(zhuǎn)基因植物具有顯著增加的每圓錐花序的花數(shù)和種子總數(shù)。相對(duì)失效合子，轉(zhuǎn)基因植物的每圓錐花序的花數(shù)增加>12％(4個(gè)事件的平均值)，來(lái)自F-檢驗(yàn)的p-值<0.0014(顯著)。另外，相對(duì)失效合子，轉(zhuǎn)基因植物的種子總數(shù)增加35％，來(lái)自F-檢驗(yàn)的p-值<0.0045(顯著)。
4.2 原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子控制下的OsNAM2 相對(duì)失效合子，在原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子控制下表達(dá)OsNAM2基因的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的地上部分面積、圓錐花序數(shù)和種子總數(shù)。相對(duì)失效合子，轉(zhuǎn)基因植物的地上部分面積增加>16％(2個(gè)事件的平均值)，來(lái)自F-檢驗(yàn)的p-值<0.0014(顯著)。相對(duì)失效合子，轉(zhuǎn)基因植物的圓錐花序數(shù)增加16％，且相對(duì)失效合子，轉(zhuǎn)基因植物的種子總數(shù)增加18％。
B)OsNAC1、3、4、6和7 實(shí)施例5克隆OsNAC1、3、4、6和7 包含NAC結(jié)構(gòu)域、OsNAC1(Gene bank登錄號(hào)AK067690)、OsNAC3(AK069257)、OsNAC4(AK068392)、OsNAC6(AK102475)和OsNAC7(AK107330)的稻基因由60K稻完整基因組微陣列(GreenGene BiotechInc.，韓國(guó))進(jìn)行的表達(dá)譜鑒定為在稻中為脅迫誘導(dǎo)的。該微陣列含有70-mer寡核苷酸探針，其序列對(duì)應(yīng)已知的或預(yù)測(cè)的覆蓋全部稻基因組(Oh等人，2005 Plant Physiology 138341-351)的58,417個(gè)ORF。OsNAC1和OsNAC3的全長(zhǎng)cDNA獲自GreenGene Biotech Inc制備的稻EST儲(chǔ)備物。這些cDNA插入Bluescript SKII(Stratagene)的EcoR1和Xho1位點(diǎn)。使用稻幼苗cDNA文庫(kù)(GreenGene Biotech，韓國(guó))作為模板，用PCR擴(kuò)增OsNAC4、OsNAC6和OsNAC7的全長(zhǎng)cDNA。反向轉(zhuǎn)錄提取自用400mMNaCl處理6小時(shí)的14天齡幼苗的RNA后，該cDNA克隆進(jìn)入U(xiǎn)ni-ZAP XR(Stratagene)。文庫(kù)的平均插入大小為1.5kb，且噬斑的初始數(shù)目為1.106pfu數(shù)量級(jí)。第一次擴(kuò)增2.106pfu/ml后的原始滴度為2.109pfu/ml。每50μlPCR混合物中使用0.1μg cDNA文庫(kù)。用于擴(kuò)增OsNAC基因的PCR引物列于表7。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同樣使用標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和純化DNA片段。PCR產(chǎn)物連接入pBluescript SKII的EcoR1位點(diǎn)，并測(cè)序。
表7.用于分離OsNAC的引物列表
實(shí)施例6表達(dá)載體的構(gòu)建 6.1 GOS2的構(gòu)建 進(jìn)入克隆隨后在LR反應(yīng)中與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起使用。這種載體在T-DNA邊界內(nèi)含有作為功能性元件的植物選擇標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒，和旨在與已經(jīng)克隆于所述進(jìn)入克隆中的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于組成型表達(dá)的稻GOS2啟動(dòng)子(SEQ ID NO39，內(nèi)參PRO0129)位于該Gateway盒的上游。
在LR重組步驟后，將產(chǎn)生的表達(dá)載體p164(圖10)、p165(圖11)和p168(圖15)中的每一個(gè)轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4044并隨后轉(zhuǎn)化至稻植物內(nèi)。使轉(zhuǎn)化的稻植物生長(zhǎng)，然后檢測(cè)下述參數(shù)。
6.2 RCc3的構(gòu)建 進(jìn)入克隆隨后在LR反應(yīng)中與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起使用。這種載體在T-DNA邊界內(nèi)含有作為功能性元件的植物選擇標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒，和旨在與已經(jīng)克隆于所述進(jìn)入克隆中的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于根特異性表達(dá)的稻RCc3啟動(dòng)子(SEQ ID NO110，內(nèi)參PRO0110)位于該Gateway盒的上游。
在LR重組步驟后，將產(chǎn)生的表達(dá)載體p166(圖12)、表達(dá)載體p167(圖14)和表達(dá)載體p169(圖16)中的每一個(gè)轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4044并隨后轉(zhuǎn)化至稻植物內(nèi)。使轉(zhuǎn)化的稻植物生長(zhǎng)，然后檢測(cè)下述參數(shù)。
實(shí)施例7評(píng)價(jià)方法 7.1 評(píng)價(jià)準(zhǔn)備 產(chǎn)生大約30個(gè)獨(dú)立的T0稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室用于生長(zhǎng)和收獲T1種子。留下7個(gè)事件，其中所述事件的T1后代對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在/不存在以3:1比例分離。對(duì)于這些事件中的每一事件，通過(guò)監(jiān)測(cè)目視標(biāo)記表達(dá)而選擇含有轉(zhuǎn)基因的大約10株T1幼苗(雜合子和純合子)和缺少轉(zhuǎn)基因的大約10株T1幼苗(失效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排培育。溫室條件是短日照(12小時(shí)光照)，在光線下28℃和在黑暗中22℃以及相對(duì)濕度70％。使植物從播種期直至成熟期通過(guò)數(shù)字成像箱數(shù)次。在每一時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)每株植物從至少6個(gè)不同角度拍攝數(shù)字圖像(2048 x 1536像素，1600萬(wàn)顏色)。
干旱篩選 在正常條件下在花盆土中培養(yǎng)來(lái)自5個(gè)事件(T2種子)的植物，直到進(jìn)入抽穗期。然后將其轉(zhuǎn)移到“干燥”區(qū)域，停止灌溉。向隨機(jī)選擇的花盆中插入濕度探測(cè)儀，以監(jiān)測(cè)土壤水含量(SWC)。當(dāng)SWC低于一定的閾值時(shí)，自動(dòng)向植物持續(xù)補(bǔ)水，直到再次達(dá)到正常水平。然后將植物再次重新轉(zhuǎn)移到正常條件下。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。用在正常條件下培養(yǎng)的植物收獲的T2種子重復(fù)篩選進(jìn)行一輪驗(yàn)證，而不用從首次干旱篩選的植物收獲的T2種子。
測(cè)量的參數(shù) 植物地上部分面積(或葉生物量)通過(guò)計(jì)數(shù)在來(lái)自植物地上部分的數(shù)字圖像上區(qū)別于背景的像素的總數(shù)而測(cè)定。該值對(duì)在相同時(shí)間點(diǎn)上從不同角度拍攝的畫面進(jìn)行平均化并且通過(guò)校正轉(zhuǎn)化成以平方mm表達(dá)的物理表面值。實(shí)驗(yàn)證實(shí)以這種方式測(cè)量的地上部分植物面積與地上植物部分的生物量相關(guān)。地上部分面積是在植物已經(jīng)達(dá)到其最大葉生物量的時(shí)間點(diǎn)上所測(cè)量的面積。
將成熟的主要圓錐花序收獲、計(jì)數(shù)、裝袋、加條形碼標(biāo)記并且隨后在干燥箱內(nèi)在37℃干燥3日。隨后將圓錐花序脫粒并且收集全部種子。使用吹氣裝置分開(kāi)飽滿粒與空粒。在分離后，隨后使用市售計(jì)數(shù)機(jī)對(duì)兩個(gè)種子批次計(jì)數(shù)。棄去空粒。飽滿粒在分析天平上稱重并且種子的橫截面積使用數(shù)字成像法測(cè)量。這種方法產(chǎn)生以下的種子相關(guān)參數(shù)集合 每個(gè)圓錐花序的花數(shù)估計(jì)植物上每個(gè)圓錐花序小花的平均數(shù)目，來(lái)自種子總數(shù)除以第一個(gè)圓錐花序數(shù)。最高圓錐花序以及垂直排列時(shí)與最高圓錐花序重疊的全部圓錐花序被視為第一圓錐花序并以手工方式計(jì)數(shù)。飽滿種子數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)分離步驟后的飽滿粒數(shù)而確定。種子總產(chǎn)量(種子總重量)通過(guò)稱量從植物中收獲的全部飽滿粒而測(cè)量。每株植物種子總數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)從植物中收獲的殼粒數(shù)目而測(cè)量并且對(duì)應(yīng)于每株植物的小花數(shù)目。從計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)及其總重量外推出千粒重(TKW)。收獲指數(shù)定義為種子總產(chǎn)量與地上部分面積(mm2)之間的比，乘以系數(shù)106。參數(shù)EmerVigor(萌發(fā)勢(shì))指示幼苗生長(zhǎng)勢(shì)。根據(jù)第一次成像中由葉生物量覆蓋的面積(以mm2表示)來(lái)計(jì)算。種子飽滿率(fillrate)指示種子的飽滿度。其表示為飽滿種子的數(shù)目占小花數(shù)目(種子總數(shù))的比例(以％表示)。
使用圖像分析軟件，這些參數(shù)以自動(dòng)化方式來(lái)自數(shù)字圖像并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用由兩個(gè)主要部分(稱量裝置和成像裝置及與之連接的用于圖像分析的軟件)構(gòu)成的定制儀器測(cè)量各個(gè)種子參數(shù)(包括寬度、長(zhǎng)度、面積、重量)。
7.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn) 使用雙因子ANOVA(方差分析)作為統(tǒng)計(jì)模型用于植物表型特征的整體評(píng)價(jià)。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的全部事件的全部植物的所有測(cè)量參數(shù)實(shí)施F檢驗(yàn)。實(shí)施F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)τ谌哭D(zhuǎn)化事件的作用并驗(yàn)證基因的整體作用(又稱作全局基因作用)。用于真實(shí)全局基因作用的顯著性的閾值對(duì)于F檢驗(yàn)設(shè)置在5％概率水平上。顯著性F檢驗(yàn)值標(biāo)示基因作用，意味著不僅僅基因的存在或位置才造成表型上的差異。
為檢查基因在事件中的作用，即株系特異性作用，使用來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的無(wú)效植物的數(shù)據(jù)集在每個(gè)事件內(nèi)進(jìn)行t檢驗(yàn)。“無(wú)效植物”或“無(wú)效分離子”或“失效合子”是以與轉(zhuǎn)基因植物相同的方式受到處理，但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)從中發(fā)生分離的植物。無(wú)效植物也可以描述為純合陰性轉(zhuǎn)化植物。用于t檢驗(yàn)的顯著性的閾值設(shè)置在10％概率水平上。一些事件的結(jié)果可以高于或低于這個(gè)閾值。這基于如此假設(shè)，即基因可能僅在基因組中某些位置內(nèi)具有作用，并且這種位置依賴性作用的出現(xiàn)并非罕見(jiàn)。這種基因作用在文中又稱作“基因的株系作用”。p-值通過(guò)t-值與t-分布比較或備選地通過(guò)F-值與F-分布比較而獲得。該p-值隨后給出無(wú)效假設(shè)(即轉(zhuǎn)基因的作用不存在)是正確的概率。
實(shí)施例8評(píng)價(jià)結(jié)果 8.1 GOS2啟動(dòng)子控制下的NAC1 觀察到在GOS2啟動(dòng)子控制下超表達(dá)NAC1的轉(zhuǎn)基因植物具有以下增加的產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)。除非另行說(shuō)明，所示p-值來(lái)自t檢驗(yàn)。差異百分比是轉(zhuǎn)基因植物與失效合子的差異百分比。還觀察到根生物量的增加(雖然未顯示在表8中)，與失效合子相比，最佳事件給出7％的增加。
表8GOS2啟動(dòng)子控制下的NAC1的結(jié)果 8.2 GOS2啟動(dòng)子控制下的NAC4 觀察到在GOS2啟動(dòng)子控制下超表達(dá)NAC4的轉(zhuǎn)基因植物具有以下增加的產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)。除非另行說(shuō)明，所示p-值來(lái)自t檢驗(yàn)。差異百分比是轉(zhuǎn)基因植物與失效合子的差異百分比。還觀察到種子重量的增加(雖然未顯示在表9a中)，與失效合子相比，最佳事件給出30％的增加。表9a顯示無(wú)脅迫條件下獲得的結(jié)果，表9b顯示脅迫條件下獲得的結(jié)果。
表9aGOS2啟動(dòng)子控制下的NAC4的結(jié)果 表9bGOS2啟動(dòng)子控制下的NAC4的結(jié)果(干旱篩選) 8.3 RCc3啟動(dòng)子控制下的NAC4 觀察到在RCc3啟動(dòng)子控制下超表達(dá)NAC4的轉(zhuǎn)基因植物具有以下增加的產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)。除非另行說(shuō)明，所示p-值來(lái)自t檢驗(yàn)。差異百分比是轉(zhuǎn)基因植物與失效合子的差異百分比。還觀察到千粒重的增加(雖然未顯示在表10a中)，與失效合子相比，最佳事件給出4％的增加。
表10aRCc3啟動(dòng)子控制下的NAC4的結(jié)果 表10bRCc3啟動(dòng)子控制下的NAC4的結(jié)果(干旱篩選) 8.4 RCc3啟動(dòng)子控制下的NAC6 觀察到在RCc3啟動(dòng)子控制下超表達(dá)NAC6的轉(zhuǎn)基因植物具有以下增加的產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)。除非另行說(shuō)明，所示p-值來(lái)自t檢驗(yàn)。差異百分比是轉(zhuǎn)基因植物與失效合子的差異百分比。還觀察到每圓錐花序的花數(shù)的增加(雖然未顯示在表11中)，與失效合子相比，最佳事件給出20％的增加。另外，還觀察到圓錐花序數(shù)的增加(雖然未顯示在表中)，與失效合子相比，最佳事件給出28％的增加。
表11RCc3啟動(dòng)子控制下的NAC6的結(jié)果 8.5 GOS2啟動(dòng)子控制下的NAC7 觀察到在GOS2啟動(dòng)子控制下超表達(dá)NAC7的轉(zhuǎn)基因植物具有以下增加的產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)。除非另行說(shuō)明，所示p-值來(lái)自t檢驗(yàn)。差異百分比是轉(zhuǎn)基因植物與失效合子的差異百分比。
表12GOS2啟動(dòng)子控制下的NAC7的結(jié)果 8.6 RCc3啟動(dòng)子控制下的NAC3 觀察到在RCc3啟動(dòng)子控制下超表達(dá)NAC3的轉(zhuǎn)基因植物具有以下增加的產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)。除非另行說(shuō)明，所示p-值來(lái)自t檢驗(yàn)。差異百分比是轉(zhuǎn)基因植物與失效合子的差異百分比。雖然未顯示在表13中，還觀察到地上部分面積的增加(最佳事件給出19％的增加)、早期生長(zhǎng)勢(shì)的增加(最佳事件給出20％的增加)、根生物量的增加(最佳事件給出15％的增加)、千粒重的增加、收獲指數(shù)的增加(最佳事件給出26％的增加)、圓錐花序數(shù)的增加(最佳事件給出33％的增加)。
表13RCc3啟動(dòng)子控制下的NAC3的結(jié)果 C)AP2-2多肽 實(shí)施例9SEQ ID NO131和SEQ ID NO132相關(guān)序列的鑒定 使用數(shù)據(jù)庫(kù)序列搜索工具，如基本局部比對(duì)工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.253389-3402)在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中所維護(hù)的那些序列內(nèi)鑒定到與SEQ ID NO131相關(guān)的(全長(zhǎng)cDNA、EST或基因組)序列和/或SEQ ID NO132相關(guān)的蛋白質(zhì)序列。該程序用來(lái)通過(guò)核酸序列或多肽序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較并通過(guò)計(jì)算匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性而找到序列間具有局部相似性的區(qū)域。對(duì)SEQ ID NO131編碼的多肽使用TBLASTN算法，采用默認(rèn)設(shè)置和過(guò)濾以忽略低復(fù)雜性序列抵消。分析的結(jié)果通過(guò)配對(duì)性比較顯示，并根據(jù)幾率評(píng)分(E-值)排序，其中該評(píng)分反映特定比對(duì)結(jié)果因偶然而發(fā)生的概率(E-值越低，命中的顯著性越高)。除了E-值外，比較還通過(guò)同一性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行記分。同一性百分?jǐn)?shù)指兩個(gè)所比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)目。在一些情況下，可以調(diào)整默認(rèn)參數(shù)以調(diào)節(jié)搜索法的嚴(yán)格性。
表14提供與SEQ ID NO131所示核酸序列和SEQ ID NO132所示蛋白質(zhì)序列相關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)序列列表。
表14AP2-2多肽的編碼核酸序列和AP2-2多肽 實(shí)施例10AP2-2多肽序列的比對(duì) 使用來(lái)自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX基于進(jìn)行性比對(duì)的流行Clustal算法(Thompson等人(1997)，Nucleic Acids Res 254876-4882；Chenna等人(2003)，Nucleic Acids Res 313497-3500)進(jìn)行多肽序列的比對(duì)。默認(rèn)值是空位開(kāi)口罰分10，空位延伸罰分0.1并且選擇的權(quán)重矩陣是Blosum62(若比對(duì)多肽)。在圖7中顯示AP2-2多肽具有高度序列保守區(qū)。下劃線示出Os06g09390(SEQ ID NO132)的基序XII至XVII。
實(shí)施例11用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列之間全局同一性百分?jǐn)?shù)的計(jì)算 使用本領(lǐng)域可獲得的方法之一MatGAT(矩陣總體比對(duì)工具)軟件(BMC Bioinformatics.2003 429.MatGAT使用蛋白質(zhì)序列或DNA序列產(chǎn)生相似性/同一性矩陣的應(yīng)用.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；軟件由Ledion Bitincka所有)確定用于實(shí)施本發(fā)明方法的全長(zhǎng)多肽序列之間總體相似性百分?jǐn)?shù)和同一性百分?jǐn)?shù)。MatGAT軟件為DNA序列或蛋白質(zhì)序列產(chǎn)生相似性/同一性矩陣，無(wú)需數(shù)據(jù)的預(yù)比對(duì)。該程序使用Myers和Miller總體比對(duì)算法(空位開(kāi)口罰分12和空位延伸罰分2)執(zhí)行一系列逐對(duì)比對(duì)，使用例如Blosum 62(對(duì)于多肽)計(jì)算相似性和同一性并且隨后將結(jié)果置于距離矩陣中。序列相似性在分界線的下半部分中顯示，序列同一性在對(duì)角分界線的上半部分中顯示。
比較中所用的參數(shù)是 記分矩陣Blosum62 第一空位12 延伸空位2 多肽序列(排除部分多肽序列)全長(zhǎng)上的總體相似性和同一性軟件分析結(jié)果在表15中顯示。同一性百分?jǐn)?shù)在對(duì)角線之上給出并且相似性百分?jǐn)?shù)在對(duì)角線之下給出。
與SEQ ID NO132相比，用于實(shí)施本發(fā)明方法的全長(zhǎng)多肽序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)可以低到20％氨基酸同一性。當(dāng)比較特定結(jié)構(gòu)域，例如AP2結(jié)構(gòu)域時(shí)，序列特異性將更高。
表15多肽序列全長(zhǎng)上的全局相似性和同一性的MatGAT結(jié)果 實(shí)施例12鑒定在用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列內(nèi)包含的結(jié)構(gòu)域 蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和位點(diǎn)集成資源(Integrated Resouce of ProteinFamilies，結(jié)構(gòu)域and Site，InterPro)數(shù)據(jù)庫(kù)是基于文本和序列的搜索的通常所用標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)的集成界面。InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)組合了這些數(shù)據(jù)庫(kù)，所述的數(shù)據(jù)庫(kù)使用不同方法學(xué)和不同程度的有關(guān)已充分表征蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息以得到蛋白質(zhì)標(biāo)簽。合作數(shù)據(jù)庫(kù)包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Interpro駐留于英國(guó)的歐洲生物信息研究所。
InterPro掃描SEQ ID NO132所代表的多肽序列的結(jié)果在表16中。
表16SEQ ID NO132所代表的多肽序列的InterPro掃描結(jié)果 實(shí)施例13用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列的拓?fù)鋵W(xué)預(yù)測(cè)(亞細(xì)胞定位，跨膜...) TargetP 1.1預(yù)測(cè)真核蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。位置分配是基于任何氨基端前序列的預(yù)測(cè)的存在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP)、線粒體靶向肽(mTP)或分泌途徑信號(hào)肽(SP)。作為最終預(yù)測(cè)基礎(chǔ)的記分并不實(shí)際是概率，并且它們未必合為一體。然而，具有最高記分的位置根據(jù)TargetP是最有可能的，并且記分之間的關(guān)系(可靠性類別)可以是預(yù)測(cè)的肯定性的一個(gè)指標(biāo)?？煽啃灶悇e(RC)是1-5，其中1表示最強(qiáng)預(yù)測(cè)。TargetP在丹麥技術(shù)大學(xué)的服務(wù)器上維護(hù)。
對(duì)于預(yù)測(cè)含有N-末端前序列的序列，也可以預(yù)測(cè)潛在的切割位點(diǎn)。
選擇了眾多參數(shù)，如生物組(非植物或植物)、臨界設(shè)置(無(wú)、臨界的預(yù)定義設(shè)置或臨界的用戶指定設(shè)置)和對(duì)切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)的計(jì)算(是或否)。
如SEQ ID NO132所代表的多肽序列的TargetP 1.1分析的結(jié)果在表17中顯示。已經(jīng)選擇“植物”生物組，未定義臨界值并且需要轉(zhuǎn)運(yùn)肽的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度。如SEQ ID NO132所代表的多肽序列的亞細(xì)胞定位可以是細(xì)胞質(zhì)或核，未預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
表17如SEQ ID NO132所代表的多肽序列的TargetP 1.1分析 眾多其他算法可以用來(lái)執(zhí)行此類分析，包括 在丹麥技術(shù)大學(xué)(Technical University of Denmar)服務(wù)器上駐留的ChloroP 1.1； 在澳大利亞布里斯班昆士蘭大學(xué)分子生物科學(xué)研究所(Institute forMolecular Bioscience，University of Queensland，Brisbane，Australia)的服務(wù)器上駐留的蛋白質(zhì)Prowler亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)程序(Protein ProwlerSubcellular Localisation Predictor)第1.2版； 在加拿大阿爾伯塔省埃德蒙頓市阿爾伯塔大學(xué)(University of Alberta，Edmonton，Alberta，Canada)的服務(wù)器上駐留的PENCE Proteme AnalystPA-GOSUB 2.5； 在丹麥技術(shù)大學(xué)服務(wù)器上駐留的TMHMM。
實(shí)施例14使用SEQ ID NO131所示核酸序列構(gòu)建表達(dá)載體 除非另外聲明，重組DNA技術(shù)根據(jù)(Sambrook(2001)MolecularCloninga laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York)中或Ausubel等人(1994)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols第1和2卷中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
通過(guò)PCR從稻cDNA文庫(kù)擴(kuò)增稻AP2-2基因。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化期望長(zhǎng)度的PCR片段，并將其隨后克隆進(jìn)入

載體。包含SEQ IDNO131的進(jìn)入克隆隨后在LR反應(yīng)中與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起使用。這種載體在T-DNA邊界內(nèi)含有作為功能性元件的植物選擇標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒，和旨在與已經(jīng)克隆于所述進(jìn)入克隆中的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于根特異性表達(dá)的稻GOS2啟動(dòng)子(SEQ IDNO39)位于該Gateway盒的上游。
在LR重組步驟后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法將產(chǎn)生的表達(dá)載體pGOS2::AP2-2(圖23)轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4044。
實(shí)施例15植物轉(zhuǎn)化 稻轉(zhuǎn)化 含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌用來(lái)轉(zhuǎn)化稻植物。將稻的日本栽培品種Nipponbare的成熟干燥種子脫殼。通過(guò)在70％乙醇中溫育一分鐘，隨后在2％HgCl2中30分鐘，隨后用無(wú)菌蒸餾水洗滌6次15分鐘而實(shí)施消毒。消毒的種子隨后在含有2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上萌發(fā)。在黑暗中溫育4周后，將來(lái)自小盾片的愈傷組織切下并在同一種培養(yǎng)基上增殖。2周后，愈傷組織通過(guò)在同一種培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)另外2周而繁殖或增殖。胚發(fā)生性愈傷組織片在新鮮培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)3日，之后共培育(以增強(qiáng)細(xì)胞分裂活性)。
含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株LBA4404用于共培育。農(nóng)桿菌接種在含有適宜抗生素的AB培養(yǎng)基上并在28℃培養(yǎng)3日。隨后將細(xì)菌收集并重懸在液體共培育培養(yǎng)基中至密度(OD600)約1。將混懸液隨后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿并將愈傷組織在該混懸液內(nèi)浸泡15分鐘。愈傷組織組織隨后在濾紙上吸干并轉(zhuǎn)移至固化的共培育培養(yǎng)基上并且在黑暗中于25℃溫育3日。共培育的愈傷組織在黑暗中于28℃在選擇劑存在下于含有2，4-D的培養(yǎng)基上培育4周。在此時(shí)段期間，形成迅速生長(zhǎng)的抗性愈傷組織島。在這種材料轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基并在光線下溫育后，胚發(fā)生潛力釋放并且苗在隨后4-5周發(fā)育。將苗從愈傷組織中切下并且在含有植物生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上溫育2-3周，其中將苗從所述的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移至土壤。硬化的苗在高濕度和短日照下于溫室中培育。
對(duì)于一個(gè)構(gòu)建體，產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立T0稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室。在定量PCR分析以驗(yàn)證T-DNA插入物的拷貝數(shù)后，僅保留表現(xiàn)選擇劑耐受性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于收獲T1種子。種子隨后在移植后3-5月收獲。本方法以超過(guò)50％的比率產(chǎn)生單一基因座轉(zhuǎn)化體(Aldemita和Hodges1996，Chan等人，1993，Hiei等人，1994)。
玉米(corn)轉(zhuǎn)化 玉米的轉(zhuǎn)化根據(jù)對(duì)Ishida等人(1996.Nature Biotech 14745-50)描述方法的改良方法進(jìn)行。在玉米中的轉(zhuǎn)化是基因型依賴的并且僅特定的基因型可操作用于轉(zhuǎn)化和再生。近交系A(chǔ)188(明尼蘇達(dá)大學(xué))或以A188作為親本的雜種是用于轉(zhuǎn)化的供體材料的良好來(lái)源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗從玉米植物中在授粉后大約11日(DAP)收獲，此時(shí)不成熟胚的長(zhǎng)度是大約1至1.2mm。不成熟胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)器官發(fā)生而恢復(fù)。切下的胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在玉米再生培養(yǎng)基上培育，其中所述的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)板在25℃于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至玉米生根培養(yǎng)基并在25℃培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
小麥轉(zhuǎn)化 小麥的轉(zhuǎn)化用Ishida等Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)745-50描述的方法進(jìn)行。通常在轉(zhuǎn)化中使用(可從墨西哥CIMMYT獲得的)栽培品種Bobwhite。不成熟胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)器官發(fā)生而恢復(fù)。在與農(nóng)桿菌溫育后，胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在再生培養(yǎng)基上體外培育，其中所述的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)平板在25℃于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基并在25℃培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
大豆轉(zhuǎn)化 根據(jù)對(duì)Texas A&M美國(guó)專利5,164,310中所述方法的改良方法轉(zhuǎn)化大豆。幾個(gè)商業(yè)大豆品種對(duì)于通過(guò)這種方法的轉(zhuǎn)化是可行的。栽培品種Jack(從Illinois種子基金會(huì)可獲得)通常用于轉(zhuǎn)化。對(duì)大豆種子消毒以便體外播種。從7日齡幼苗中切下下胚軸、胚根和一片子葉。進(jìn)一步培育上胚軸和余下的子葉以發(fā)育腋生節(jié)。將這些腋生節(jié)切下并與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌溫育。在共培育處理之后，將外植體洗滌并轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。將再生的苗切下并置于苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上。將長(zhǎng)度不超過(guò)1cm的苗置于生根培養(yǎng)基上直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
油菜籽/卡諾拉油菜轉(zhuǎn)化 使用5-6日齡幼苗的子葉柄和下胚軸作為用于組織培養(yǎng)的外植體并且根據(jù)Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17183-188)轉(zhuǎn)化。商業(yè)栽培品種Westar(Agriculture Canada)是用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)品種，但是也可以使用其他品種。對(duì)卡諾拉油菜種子作表面消毒以便體外播種。從體外幼苗中切下具有附著子葉的子葉柄外植體，并以(含有表達(dá)載體的)農(nóng)桿菌通過(guò)葉柄外植體的切口端浸入細(xì)菌混懸液而接種。外植體隨后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物瓊脂(Phytagar)的MSBAP-3培養(yǎng)基上在23℃，16小時(shí)光照下培養(yǎng)2天。在與農(nóng)桿菌共培育2日后，將葉柄外植體轉(zhuǎn)移至含有的3mg/l BAP、頭孢噻肟、羧芐青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基上持續(xù)7日，并且隨后在含頭孢噻肟、羧芐青霉素或特美汀和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至苗再生。當(dāng)苗具有5-10mm長(zhǎng)度時(shí)，將苗切下并轉(zhuǎn)移至苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。將長(zhǎng)度大約2cm的苗轉(zhuǎn)移至用于根誘導(dǎo)的生根培養(yǎng)基(MS0)。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
苜蓿轉(zhuǎn)化 苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等人，1999 Plant Physiol119839-847)的方法加以轉(zhuǎn)化。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的并且因而需要再生植物。已經(jīng)描述了獲得再生性植物的方法。例如，這些再生性植物可以選自栽培品種Rangelander(Agriculture Canada)或如BrownDCW與A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4111-112)描述的任何其他商業(yè)苜蓿品種。備選地，RA3品種(威斯康星大學(xué))已經(jīng)被選擇用于組織培養(yǎng)中(Walker等人，1978 Am J Bot 65654-659)。將葉柄外植體與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌C58C1 pMP90(McKersie等人，1999 PlantPhysiol 119839-847)或LBA4404的過(guò)夜培養(yǎng)物共培育。外植體在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培育3天.外植體在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中洗滌并平板接種在不含乙酰丁香酮而含有合適選擇劑和合適抗生素以抑止農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的相同SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在數(shù)周后，將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y發(fā)育培養(yǎng)基中。體細(xì)胞胚隨后在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基上萌發(fā)。將生根的幼苗移植至花缽內(nèi)并且在溫室中培育。從表現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
實(shí)施例16表型評(píng)價(jià)方法 16.1 評(píng)價(jià)準(zhǔn)備 產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立的T0稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室用于生長(zhǎng)和收獲T1種子。留下6個(gè)事件，其中所述事件的T1后代對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在/不存在以3:1比例分離。對(duì)于這些事件中的每一事件，通過(guò)監(jiān)測(cè)目視標(biāo)記表達(dá)而選擇含有轉(zhuǎn)基因的大約10株T1幼苗(雜合子和純合子)和缺少轉(zhuǎn)基因的大約10株T1幼苗(失效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排培育。溫室條件是短日照(12小時(shí)光照)，在光線下28℃和在黑暗中22℃以及相對(duì)濕度70％。
4個(gè)T1事件在T2世代中按照如用于T1世代的相同評(píng)價(jià)方法作進(jìn)一步評(píng)估，但每個(gè)事件采用更多的個(gè)體。使植物從播種期直至成熟期通過(guò)數(shù)字成像箱數(shù)次。在每一時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)每株植物從至少6個(gè)不同角度拍攝數(shù)字圖像(2048 x 1536像素，1600萬(wàn)顏色)。
16.2 統(tǒng)計(jì)分析F-檢驗(yàn) 使用雙因子ANOVA(方差分析)作為統(tǒng)計(jì)模型用于植物表型特征的整體評(píng)價(jià)。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的全部事件的全部植物的所有測(cè)量參數(shù)實(shí)施F檢驗(yàn)。實(shí)施F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)τ谌哭D(zhuǎn)化事件的作用并驗(yàn)證基因的整體作用(又稱作總體基因作用)。用于真實(shí)總體基因作用的顯著性的閾值對(duì)于F檢驗(yàn)設(shè)置在5％概率水平上。顯著性F檢驗(yàn)值標(biāo)示基因作用，意味著不僅僅基因的存在或位置才造成表型上的差異。
16.3 測(cè)量的參數(shù) 生物量相關(guān)參數(shù)的測(cè)量 從播種期直至成熟期，使植物通過(guò)數(shù)字成像箱數(shù)次。在每一時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)每株植物從至少6個(gè)不同角度拍攝數(shù)字圖像(2048 x 1536像素，1600萬(wàn)顏色)。
植物地上部分面積(或葉生物量)通過(guò)計(jì)數(shù)在來(lái)自植物地上部分的數(shù)字圖像上區(qū)別于背景的像素的總數(shù)而測(cè)定。該值對(duì)在相同時(shí)間點(diǎn)上從不同角度拍攝的畫面進(jìn)行平均化并且通過(guò)校正轉(zhuǎn)化成以平方mm表達(dá)的物理表面值。實(shí)驗(yàn)證實(shí)以這種方式測(cè)量的地上部分植物面積與地上植物部分的生物量相關(guān)。地上部分面積是在植物已經(jīng)達(dá)到其最大葉生物量的時(shí)間點(diǎn)上所測(cè)量的面積。早期生長(zhǎng)勢(shì)是萌發(fā)后3周的植物(幼苗)地上部分面積。根生物量的增加表述為根總生物量(測(cè)量為在植物壽命期間所觀察到的根的最大生物量)的增加；或表述為根/冠指數(shù)(root/shoot index)(測(cè)量為在根和莖干的活躍生長(zhǎng)時(shí)期中根的量與莖干的量之間的比率)的增加。
種子相關(guān)參數(shù)的測(cè)量 將成熟的主圓錐花序收獲、計(jì)數(shù)、裝袋、加條形碼標(biāo)記并且隨后在干燥箱內(nèi)在37℃干燥3日。隨后將圓錐花序脫粒并且收集及計(jì)數(shù)全部種子。使用吹氣裝置分開(kāi)飽滿粒與空粒。棄去空粒并再次對(duì)剩余部分計(jì)數(shù)。飽滿粒在分析天平上稱重。飽滿種子數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)分離步驟后的飽滿粒數(shù)而確定。種子總產(chǎn)量通過(guò)稱量從植物中收獲的全部飽滿粒而測(cè)量。每株植物種子總數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)從植物中收獲的殼粒數(shù)目而測(cè)量。從計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)及其總重量外推出千粒重(TKW)。收獲指數(shù)(HI)在本發(fā)明中定義為種子總產(chǎn)量與地上部分面積(mm2)之間的比，乘以系數(shù)106。如本發(fā)明中定義的每圓錐花序的總花數(shù)是種子總數(shù)與成熟主圓錐花序的數(shù)目之間的比率。如本發(fā)明中定義的種子飽滿率是飽滿種子數(shù)對(duì)種子(或小花)總數(shù)的比例(表述為％)。
實(shí)施例17轉(zhuǎn)基因植物的表型評(píng)價(jià)結(jié)果 表達(dá)AP2-2核酸的轉(zhuǎn)基因稻植物的評(píng)價(jià)結(jié)果如下。
與對(duì)應(yīng)的失效合子(對(duì)照)相比，具有增加的產(chǎn)量，與對(duì)照植物相比，尤其是表示為千粒重和收獲指數(shù)的種子產(chǎn)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加。對(duì)于TKW，與對(duì)照植物相比，T1總體增加2％，T2總體增加3.4％。對(duì)于收獲指數(shù)的情況，與對(duì)照植物相比，總體分別增加9.2％(T1)和36.2％(T2)。
D)APETELA2-70-樣(AP2-70-樣)多肽 實(shí)施例18鑒定AP2-70-樣序列 使用數(shù)據(jù)庫(kù)序列搜索工具，如基本局部比對(duì)工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.253389-3402)在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中所維護(hù)的那些序列內(nèi)鑒定到與SEQ ID NO257相關(guān)的(全長(zhǎng)cDNA、EST或基因組)序列和/或SEQ ID NO258相關(guān)的蛋白質(zhì)序列。該程序用來(lái)通過(guò)核酸序列或多肽序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較并通過(guò)計(jì)算匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性而找到序列間具有局部相似性的區(qū)域。對(duì)SEQ ID NO257編碼的多肽使用TBLASTN算法，采用默認(rèn)設(shè)置和過(guò)濾以忽略低復(fù)雜性序列抵消。分析的結(jié)果通過(guò)配對(duì)性比較顯示，并根據(jù)幾率評(píng)分(E-值)排序，其中該評(píng)分反映特定比對(duì)結(jié)果因偶然而發(fā)生的概率(E-值越低，命中的顯著性越高)。除了E-值外，比較還通過(guò)同一性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行記分。同一性百分?jǐn)?shù)指兩個(gè)所比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)目。在一些情況下，可以調(diào)整默認(rèn)參數(shù)以調(diào)節(jié)搜索法的嚴(yán)格性。
表18提供與SEQ ID NO257所示核酸序列和SEQ ID NO258所示蛋白質(zhì)序列相關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)序列列表。
表18可用于本發(fā)明方法中的AP2-70-編碼核酸序列和AP2-70多肽 實(shí)施例19AP2-70-樣多肽序列的比對(duì) 使用來(lái)自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX基于進(jìn)行性比對(duì)的流行Clustal算法(Thompson等人(1997)，Nucleic Acids Res 254876-4882；Chenna等人(2003)，Nucleic Acids Res 313497-3500)進(jìn)行多肽序列的比對(duì)。默認(rèn)值是空位開(kāi)口罰分10，空位延伸罰分0.1并且選擇的權(quán)重矩陣是Blosum 62(若比對(duì)多肽)。
可以使用來(lái)自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX中提供的鄰接聚類算法構(gòu)建AP2-70-樣多肽的系統(tǒng)發(fā)生樹。
實(shí)施例20克隆和載體構(gòu)建 除非另外聲明，重組DNA技術(shù)根據(jù)(Sambrook(2001)MolecularCloninga laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York)中或Ausubel等人(1994)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols第1和2卷中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
通過(guò)PCR從稻cDNA文庫(kù)擴(kuò)增稻AP2-70基因。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化期望長(zhǎng)度的PCR片段，并將其隨后克隆進(jìn)入

載體。包含SEQ IDNO257的進(jìn)入克隆隨后在LR反應(yīng)中與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起使用。這種載體在T-DNA邊界內(nèi)含有作為功能性元件的植物選擇標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒，和旨在與已經(jīng)克隆于所述進(jìn)入克隆中的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于組成型表達(dá)的稻GOS2啟動(dòng)子(SEQ IDNO39)位于該Gateway盒的上游。
在LR重組步驟后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法將產(chǎn)生的表達(dá)載體pGOS2::AP2-70(圖25)轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4044。
也制備第二載體，其除了包含用于根特異性表達(dá)的RCc3啟動(dòng)子(SEQ ID NO110)之外與上述載體相同。同樣，在LR重組步驟后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法將產(chǎn)生的表達(dá)載體pRCc3::AP2-70(圖24)轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4044。
實(shí)施例21植物轉(zhuǎn)化 稻轉(zhuǎn)化 含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌用來(lái)轉(zhuǎn)化稻植物。將稻的日本栽培品種Nipponbare的成熟干燥種子脫殼。通過(guò)在70％乙醇中溫育一分鐘，隨后在2％HgCl2中30分鐘，隨后用無(wú)菌蒸餾水洗滌6次15分鐘而實(shí)施消毒。消毒的種子隨后在含有2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上萌發(fā)。在黑暗中溫育4周后，將來(lái)自小盾片的愈傷組織切下并在同一種培養(yǎng)基上增殖。2周后，愈傷組織通過(guò)在同一種培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)另外2周而繁殖或增殖。胚發(fā)生性愈傷組織片在新鮮培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)3日，之后共培育(以增強(qiáng)細(xì)胞分裂活性)。
含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株LBA4404用于共培育。農(nóng)桿菌接種在含有適宜抗生素的AB培養(yǎng)基上并在28℃培養(yǎng)3日。隨后將細(xì)菌收集并重懸在液體共培育培養(yǎng)基中至密度(OD600)約1。將混懸液隨后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿并將愈傷組織在該混懸液內(nèi)浸泡15分鐘。愈傷組織組織隨后在濾紙上吸干并轉(zhuǎn)移至固化的共培育培養(yǎng)基上并且在黑暗中于25℃溫育3日。共培育的愈傷組織在黑暗中于28℃在選擇劑存在下于含有2，4-D的培養(yǎng)基上培育4周。在此時(shí)段期間，形成迅速生長(zhǎng)的抗性愈傷組織島。在這種材料轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基并在光線下溫育后，胚發(fā)生潛力釋放并且苗在隨后4-5周發(fā)育。將苗從愈傷組織中切下并且在含有植物生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上溫育2-3周，其中將苗從所述的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移至土壤。硬化的苗在高濕度和短日照下于溫室中培育。
對(duì)于一個(gè)構(gòu)建體，產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立T0稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室。在定量PCR分析以驗(yàn)證T-DNA插入物的拷貝數(shù)后，僅保留表現(xiàn)選擇劑耐受性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于收獲T1種子。種子隨后在移植后3-5月收獲。本方法以超過(guò)50％的比率產(chǎn)生單一基因座轉(zhuǎn)化體(Aldemita和Hodges1996，Chan等人，1993，Hiei等人，1994)。
玉米轉(zhuǎn)化 玉米的轉(zhuǎn)化根據(jù)對(duì)Ishida等人(1996.Nature Biotech 14745-50)描述方法的改良方法進(jìn)行。在玉米中的轉(zhuǎn)化是基因型依賴的并且僅特定的基因型可操作用于轉(zhuǎn)化和再生。近交系A(chǔ)188(明尼蘇達(dá)大學(xué))或以A188作為親本的雜種是用于轉(zhuǎn)化的供體材料的良好來(lái)源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗從玉米植物中在授粉后大約11日(DAP)收獲，此時(shí)不成熟胚的長(zhǎng)度是大約1至1.2mm。不成熟胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)器官發(fā)生而恢復(fù)。切下的胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在玉米再生培養(yǎng)基上培育，其中所述的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)板在25℃于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至玉米生根培養(yǎng)基并在25℃培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
小麥轉(zhuǎn)化 小麥的轉(zhuǎn)化用Ishida等Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)745-50描述的方法進(jìn)行。通常在轉(zhuǎn)化中使用(可從墨西哥CIMMYT獲得的)栽培品種Bobwhite。不成熟胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)器官發(fā)生而恢復(fù)。在與農(nóng)桿菌溫育后，胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在再生培養(yǎng)基上體外培育，其中所述的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)平板在25℃于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基并在25℃培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
大豆轉(zhuǎn)化 根據(jù)對(duì)Texas A&M美國(guó)專利5,164,310中所述方法的改良方法轉(zhuǎn)化大豆。幾個(gè)商業(yè)大豆品種對(duì)于通過(guò)這種方法的轉(zhuǎn)化是可行的。栽培品種Jack(從Illinois種子基金會(huì)可獲得)通常用于轉(zhuǎn)化。對(duì)大豆種子消毒以便體外播種。從7日齡幼苗中切下下胚軸、胚根和一片子葉。進(jìn)一步培育上胚軸和余下的子葉以發(fā)育腋生節(jié)。將這些腋生節(jié)切下并與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌溫育。在共培育處理之后，將外植體洗滌并轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。將再生的苗切下并置于苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上。將長(zhǎng)度不超過(guò)1cm的苗置于生根培養(yǎng)基上直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
油菜籽/卡諾拉油菜轉(zhuǎn)化 使用5-6日齡幼苗的子葉柄和下胚軸作為用于組織培養(yǎng)的外植體并且根據(jù)Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17183-188)轉(zhuǎn)化。商業(yè)栽培品種Westar(Agriculture Canada)是用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)品種，但是也可以使用其他品種。對(duì)卡諾拉油菜種子作表面消毒以便體外播種。從體外幼苗中切下具有附著子葉的子葉柄外植體，并以(含有表達(dá)載體的)農(nóng)桿菌通過(guò)葉柄外植體的切口端浸入細(xì)菌混懸液而接種。外植體隨后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物瓊脂(Phytagar)的MSBAP-3培養(yǎng)基上在23℃，16小時(shí)光照下培養(yǎng)2天。在與農(nóng)桿菌共培育2日后，將葉柄外植體轉(zhuǎn)移至含有的3mg/l BAP、頭孢噻肟、羧芐青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基上持續(xù)7日，并且隨后在含頭孢噻肟、羧芐青霉素或特美汀和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至苗再生。當(dāng)苗具有5-10mm長(zhǎng)度時(shí)，將苗切下并轉(zhuǎn)移至苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。將長(zhǎng)度大約2cm的苗轉(zhuǎn)移至用于根誘導(dǎo)的生根培養(yǎng)基(MS0)。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
苜蓿轉(zhuǎn)化 苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等人，1999 Plant Physiol119839-847)的方法加以轉(zhuǎn)化。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的并且因而需要再生植物。已經(jīng)描述了獲得再生性植物的方法。例如，這些再生性植物可以選自栽培品種Rangelander(Agriculture Canada)或如BrownDCW與A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4111-112)描述的任何其他商業(yè)苜蓿品種。備選地，RA3品種(威斯康星大學(xué))已經(jīng)被選擇用于組織培養(yǎng)中(Walker等人，1978 Am J Bot 65654-659)。將葉柄外植體與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌C58C1 pMP90(McKersie等人，1999 PlantPhysiol 119839-847)或LBA4404的過(guò)夜培養(yǎng)物共培育。外植體在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培育3天.外植體在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中洗滌并平板接種在不含乙酰丁香酮而含有合適選擇劑和合適抗生素以抑止農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的相同SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在數(shù)周后，將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y發(fā)育培養(yǎng)基中。體細(xì)胞胚隨后在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基上萌發(fā)。將生根的幼苗移植至花缽內(nèi)并且在溫室中培育。從表現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。
實(shí)施例22表型評(píng)價(jià)方法 22.1 評(píng)價(jià)準(zhǔn)備 產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立的T0稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室用于生長(zhǎng)和收獲T1種子。留下6個(gè)事件，其中所述事件的T1后代對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在/不存在以3:1比例分離。對(duì)于這些事件中的每一事件，通過(guò)監(jiān)測(cè)目視標(biāo)記表達(dá)而選擇含有轉(zhuǎn)基因的大約10株T1幼苗(雜合子和純合子)和缺少轉(zhuǎn)基因的大約10株T1幼苗(失效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排培育。溫室條件是短日照(12小時(shí)光照)，在光線下28℃和在黑暗中22℃以及相對(duì)濕度70％。
4個(gè)T1事件在T2世代中按照如用于T1世代的相同評(píng)價(jià)方法作進(jìn)一步評(píng)估，但每個(gè)事件采用更多的個(gè)體。使植物從播種期直至成熟期通過(guò)數(shù)字成像箱數(shù)次。在每一時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)每株植物從至少6個(gè)不同角度拍攝數(shù)字圖像(2048 x 1536像素，1600萬(wàn)顏色)。
22.2 統(tǒng)計(jì)分析F-檢驗(yàn) 使用雙因子ANOVA(方差分析)作為統(tǒng)計(jì)模型用于植物表型特征的整體評(píng)價(jià)。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的全部事件的全部植物的所有測(cè)量參數(shù)實(shí)施F檢驗(yàn)。實(shí)施F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)τ谌哭D(zhuǎn)化事件的作用并驗(yàn)證基因的整體作用(又稱作總體基因作用)。用于真實(shí)總體基因作用的顯著性的閾值對(duì)于F檢驗(yàn)設(shè)置在5％概率水平上。顯著性F檢驗(yàn)值標(biāo)示基因作用，意味著不僅僅基因的存在或位置才造成表型上的差異。
22.3 測(cè)量的參數(shù) 生物量相關(guān)參數(shù)測(cè)量 從播種期直至成熟期，使植物通過(guò)數(shù)字成像箱數(shù)次。在每一時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)每株植物從至少6個(gè)不同角度拍攝數(shù)字圖像(2048 x 1536像素，1600萬(wàn)顏色)。
植物地上部分面積(或葉生物量)通過(guò)計(jì)數(shù)在來(lái)自植物地上部分的數(shù)字圖像上區(qū)別于背景的像素的總數(shù)而測(cè)定。該值對(duì)在相同時(shí)間點(diǎn)上從不同角度拍攝的畫面進(jìn)行平均化并且通過(guò)校正轉(zhuǎn)化成以平方mm表達(dá)的物理表面值。實(shí)驗(yàn)證實(shí)以這種方式測(cè)量的地上部分植物面積與地上植物部分的生物量相關(guān)。地上部分面積是在植物已經(jīng)達(dá)到其最大葉生物量的時(shí)間點(diǎn)上所測(cè)量的面積。早期生長(zhǎng)勢(shì)是萌發(fā)后3周的植物(幼苗)地上部分面積。根生物量的增加表述為根總生物量(測(cè)量為在植物壽命期間所觀察到的根的最大生物量)的增加；或表述為根/苗指數(shù)(測(cè)量為在根和苗的活躍生長(zhǎng)時(shí)期中根質(zhì)量與苗質(zhì)量之間的比率)的增加。
種子相關(guān)的參數(shù)測(cè)量 將成熟的主圓錐花序收獲、計(jì)數(shù)、裝袋、加條形碼標(biāo)記并且隨后在干燥箱內(nèi)在37℃干燥3日。隨后將圓錐花序脫粒并且收集及計(jì)數(shù)全部種子。使用吹氣裝置分開(kāi)飽滿粒與空粒。棄去空粒并再次對(duì)剩余部分計(jì)數(shù)。飽滿粒在分析天平上稱重。飽滿種子數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)分離步驟后的飽滿粒數(shù)而確定。種子總產(chǎn)量通過(guò)稱量從植物中收獲的全部飽滿粒而測(cè)量。每株植物種子總數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)從植物中收獲的殼粒數(shù)目而測(cè)量。從計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)及其總重量外推出千粒重(TKW)。收獲指數(shù)(HI)在本發(fā)明中定義為種子總產(chǎn)量與地上部分面積(mm2)之間的比，乘以系數(shù)106。如本發(fā)明中定義的每圓錐花序的總花數(shù)是種子總數(shù)與成熟主圓錐花序的數(shù)目之間的比率。如本發(fā)明中定義的種子飽滿率是飽滿種子數(shù)對(duì)種子(或小花)總數(shù)的比例(表述為％)。
實(shí)施例23轉(zhuǎn)基因植物的表型評(píng)價(jià)結(jié)果 表達(dá)AP2-70核酸的轉(zhuǎn)基因稻植物的評(píng)價(jià)結(jié)果如下所示。同樣顯示轉(zhuǎn)基因物和對(duì)應(yīng)的失效合子之間的差異百分比。
表19a pGOS2::AP2-70表達(dá)的結(jié)果 表19b pRCc3::AP2-70表達(dá)的結(jié)果
權(quán)利要求
1.增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸在植物中的表達(dá)，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述NAC轉(zhuǎn)錄因子包含任意一個(gè)或多個(gè)以下基序
基序IKIDLDIIQELD，或與基序I的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％；
基序IICKYGXGHGGDEQTEW，或與基序II的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％，其中“X”是任意氨基酸或空位；
基序IIIGWVVCRAFQKP，或與基序III的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸是表3中給出的任一SEQ ID NO的核酸或其部分，或能夠與表3中給出的任一SEQ ID NO的核酸雜交的序列。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達(dá)通過(guò)T-DNA激活標(biāo)簽化、TILLING和同源重組中的任何一種或多種方法實(shí)現(xiàn)。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達(dá)通過(guò)在植物中引入并表達(dá)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸實(shí)現(xiàn)，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQID NO2所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是增加的地上部分面積。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是增加的種子產(chǎn)量。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸與綠色組織特異性啟動(dòng)子有效連接，優(yōu)選與原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子有效連接。
9.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸與組成型啟動(dòng)子有效連接，優(yōu)選與GOS2啟動(dòng)子有效連接。
10.增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸在植物中的表達(dá)，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57或SEQ ID NO59所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
11.增強(qiáng)生長(zhǎng)在非生物脅迫條件下的植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸在植物中的表達(dá)，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO53所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述NAC轉(zhuǎn)錄因子包含任意一個(gè)或多個(gè)以下基序
基序IVPVPIIA，或與基序IV的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％；
基序VNGSRPN，或與基序V的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％；
基序VICRLYNKK，或與基序VI的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％；
基序VIINEWEKMQ，或與基序VII的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％；
基序VIIIWGETRTPESE，或與基序VIII的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％；
基序IXVPKKESMDDA，或與基序IX的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％；
基序XSYDDIQGMYS，或與基序X的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％；以及
基序XIDSMPRLHADSSCSE，或與基序XI的序列具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、60％、70％、80％或90％。
13.權(quán)利要求10或12的方法，其中所述編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸是表4中給出的任一SEQ ID NO的核酸或其部分，或能夠與表4中給出的任一SEQ ID NO的核酸雜交的序列。
14.權(quán)利要求10-13的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達(dá)通過(guò)T-DNA激活標(biāo)簽化、TILLING和同源重組中的任何一種或多種方法實(shí)現(xiàn)。
15.權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達(dá)通過(guò)在植物中引入并表達(dá)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸實(shí)現(xiàn)，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57或SEQ IDNO59所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
16.權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是增加的地上部分面積。
17.權(quán)利要求10-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是增加的種子產(chǎn)量。
18.權(quán)利要求10-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是增加的早期生長(zhǎng)勢(shì)。
19.權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸與根特異性啟動(dòng)子有效連接，優(yōu)選與RCc3啟動(dòng)子有效連接。
20.權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸與組成型啟動(dòng)子有效連接，優(yōu)選與GOS2啟動(dòng)子有效連接。
21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸是植物來(lái)源，優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自禾本科，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自稻屬，最優(yōu)選來(lái)自稻。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法獲得的植物，或包括種子的植物部分，其中所述植物或植物部分包含編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸。
23.構(gòu)建體，其包含
(a)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組；
(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地
(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
24.權(quán)利要求23的構(gòu)建體，其中所述一種或多種調(diào)控序列至少是綠色組織特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選是原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子。
25.構(gòu)建體，其包含
(a)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57或SEQ ID NO59所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組；
(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地
(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
26.權(quán)利要求25的構(gòu)建體，其中所述一種或多種調(diào)控序列至少是根特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選是RCc3啟動(dòng)子。
27.權(quán)利要求23或25的構(gòu)建體，其中所述一種或多種調(diào)控序列至少是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選是GOS2啟動(dòng)子。
28.權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的構(gòu)建體在制備相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，尤其是增加的種子產(chǎn)量和/或增加的地上部分面積的植物中的用途。
29.植物、植物部分或植物細(xì)胞，其由權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。
30.用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括
(i)在植物中引入并表達(dá)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ IDNO55、SEQ ID NO57或SEQ ID NO59所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組；以及
(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。
31.相對(duì)于合適的對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，所述增加的產(chǎn)量來(lái)自編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的增加的表達(dá)，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57或SEQ ID NO59所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
32.權(quán)利要求22、29或30中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是作物植物、單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。
33.權(quán)利要求22、29、31或32中任一項(xiàng)的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。
34.產(chǎn)物，其來(lái)自權(quán)利要求32的植物和/或權(quán)利要求33的植物的可收獲部分。
35.編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸在增強(qiáng)植物產(chǎn)量相關(guān)性狀中的用途，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57或SEQ ID NO59所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
36.編碼NAC4轉(zhuǎn)錄因子的核酸在增強(qiáng)生長(zhǎng)在非生物脅迫條件下的植物的產(chǎn)量相關(guān)性狀中的用途，其中當(dāng)所述NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用于構(gòu)建諸如圖1所示的NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO53所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。
37.權(quán)利要求35或36的用途，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是相對(duì)于對(duì)照植物增加的種子產(chǎn)量和/或增加的地上部分面積和/或早期生長(zhǎng)勢(shì)。
38.相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼AP2-2多肽的核酸在植物中的表達(dá)，其中所述AP2-2多肽包含基序XII(SEQ ID NO133)，并優(yōu)選還包含以下一種或多種基序基序XIII(SEQID NO134)、基序XIV(SEQ ID NO135)、基序XV(SEQ ID NO136)、基序XVI(SEQ ID NO137)和基序XVII(SEQ ID NO138)。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述AP2-2多肽與SEQ ID NO132所示的AP2-2多肽具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。
40.權(quán)利要求38或39的方法，其中所述編碼AP2-2多肽的核酸是表14中給出的任一SEQ ID NO的核酸或其部分，或由能夠與表14中給出的任一SEQ ID NO的核酸雜交的序列。
41.權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸序列編碼表14中給出的任一SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
42.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達(dá)由在植物中引入并表達(dá)編碼AP2-2多肽的核酸實(shí)現(xiàn)。
43.權(quán)利要求38-42中任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是相對(duì)于對(duì)照植物的增加的產(chǎn)量，優(yōu)選是增加的種子產(chǎn)量。
44.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述核酸與組成型啟動(dòng)子有效連接，優(yōu)選與GOS2啟動(dòng)子有效連接。
45.權(quán)利要求38-44中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼AP2-2多肽的核酸是植物來(lái)源，優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自禾本科，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自稻屬，最優(yōu)選來(lái)自稻。
46.權(quán)利要求38-45中任一項(xiàng)的方法獲得的植物，或包括種子的植物部分，其中所述植物或植物部分包含編碼AP2-2多肽的重組核酸。
47.構(gòu)建體，其包含
(a)權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)定義的編碼AP2-2多肽的核酸；
(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地
(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
48.權(quán)利要求47的構(gòu)建體，其中所述一種或多種調(diào)控序列是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選是GOS2啟動(dòng)子。
49.權(quán)利要求47或48的構(gòu)建體在制備相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量，尤其是增加的種子產(chǎn)量的植物的方法中的用途。
50.植物、植物部分或植物細(xì)胞，其由權(quán)利要求47或48的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。
51.用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量，尤其是增加的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括
(i)在植物中引入并表達(dá)權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)定義的編碼AP2-2多肽的核酸；以及
(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。
52.相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量，尤其是增加的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述增加的產(chǎn)量，尤其是增加的種子產(chǎn)量來(lái)自權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)定義的編碼AP2-2多肽的核酸的增加的表達(dá)。
53.權(quán)利要求46、50或52中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物、單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。
54.權(quán)利要求53的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。
55.產(chǎn)物，其來(lái)自權(quán)利要求53的植物和/或權(quán)利要求54的植物的可收獲部分。
56.編碼權(quán)利要求41所定義的AP2-2多肽的核酸相對(duì)于對(duì)照植物，在植物中增加產(chǎn)量，尤其是增加種子產(chǎn)量中的用途。
57.相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括(i)調(diào)節(jié)編碼APETELA2-70-樣(AP2-70-樣)多肽的核酸在植物中的表達(dá)，其中所述APETELA2-70-樣(AP2-70-樣)多肽包含
(i)SEQ ID NO332YRGVRQRHWGKWVAEIRLPRNRTRLWLGTFDTAEEAALAYDSAAFRLRGESARLNF所示的AP2DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或與SEQ ID NO332所示的結(jié)構(gòu)域具有一定序列同一性的結(jié)構(gòu)域，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高；和
(ii)與SEQ ID NO258所示的稻多肽序列具有一定序列同一性的多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高；和
(iii)包含SEQ ID NO333RLPXNX1RXRXWLGT F/Y D/E T/S所示基序I的多肽，其中X是任意氨基酸，且X1是0、1或更多，最多至30、空位；和
(iv)包含SEQ ID NO334RG D/E所示基序XIX的多肽。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述AP2-70-樣多肽還包括一個(gè)或多個(gè)以下基序
(i)SEQ ID NO335/基序XXWDESESFLLHKYPSLEIDWDAILS，或與基序XX具有一定的序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高；和/或
(ii)SEQ ID NO336/基序XXIGPPLHAAVDAKLHAICH，或與基序XXI具有一定的序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高；和/或
(iii)SEQ ID NO337/基序XXIIGANYLTPAQVLHVQAQLQRLRRP，或與基序XXII具有一定的序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高；和/或
(iv)SEQ ID NO338/基序XXIIIVDSKELMGALAPSMVSFSYPCSEQSASS，或與基序XXIII具有一定的序列同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。
59.權(quán)利要求57或58的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達(dá)由在植物中引入并表達(dá)編碼AP2-70-樣多肽的核酸實(shí)現(xiàn)。
60.權(quán)利要求57-59中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼AP2-70-樣多肽的核酸是表18中給出的任一SEQ ID NO的核酸或其部分，或是能夠與表18中給出的任一SEQ ID NO的核酸雜交的序列。
61.權(quán)利要求57-60中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸序列編碼表18中給出的任意SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
62.權(quán)利要求57-61中任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是相對(duì)于對(duì)照植物的增加的產(chǎn)量，尤其是增加的種子產(chǎn)量。
63.權(quán)利要求57-62中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸與組成型啟動(dòng)子有效連接，優(yōu)選與GOS2啟動(dòng)子有效連接，最優(yōu)選與來(lái)自稻的GOS2啟動(dòng)子有效連接。
64.權(quán)利要求59-62中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸與根特異性啟動(dòng)子有效連接，優(yōu)選與RCC3啟動(dòng)子有效連接，最優(yōu)選與來(lái)自稻的RCC3啟動(dòng)子有效連接。
65.權(quán)利要求57-64中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼AP2-70-樣多肽的核酸是植物來(lái)源，優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自禾本科，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自稻屬，最優(yōu)選來(lái)自稻。
66.權(quán)利要求57-65中任一項(xiàng)的方法獲得的植物，或包括種子的植物部分，其中所述植物或植物部分包含編碼AP2-70-樣多肽的重組核酸。
67.分離的核酸分子，其包括
(a)SEQ ID NO257所示的核酸；
(b)SEQ ID NO257所示的核酸的互補(bǔ)物；
(c)核酸，其編碼與SEQ ID NO258所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的AP2-70-樣多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；以及其編碼與SEQ ID NO331PFLMQWLNLLPLPV LDSSSWCPEHFHNSESDALP所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的AP2-70-樣多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
68.分離的多肽，其包含
(a)SEQ ID NO258所示的氨基酸序列；
(b)氨基酸序列，其與SEQ ID NO258所示的氨基酸序列具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；以及其與SEQ ID NO331PFLMQWLNLLPLPVLDSSSWCPEHFHNSESDALP所示的氨基酸序列具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；
(c)上述(a)或(b)給出的氨基酸序列的衍生物。
69.構(gòu)建體，其包含
(a)權(quán)利要求57、58或67中任一項(xiàng)定義的AP2-70-樣多肽的編碼核酸；能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地
(b)轉(zhuǎn)錄終止序列。
70.權(quán)利要求69的構(gòu)建體，其中所述一種或多種調(diào)控序列選自
(i)組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選是GOS2啟動(dòng)子，最優(yōu)選是來(lái)自稻的GOS2啟動(dòng)子；或
(ii)根特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選是RCC3啟動(dòng)子，最優(yōu)選是來(lái)自稻的RCC3啟動(dòng)子。
71.權(quán)利要求69或70的構(gòu)建體在制備相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量，尤其是增加的種子產(chǎn)量的植物的方法中的用途。
72.植物、植物部分或植物細(xì)胞，其由權(quán)利要求69或70的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。
73.用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量，尤其是增加的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括
(i)在植物中引入并表達(dá)權(quán)利要求57、58或67所定義的AP2-70-樣多肽的編碼核酸；以及
(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。
74.相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量，尤其是增加的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述增加的產(chǎn)量，尤其是增加的種子產(chǎn)量來(lái)自權(quán)利要求57、58或67所定義的AP2-70-樣多肽的編碼核酸的增加的表達(dá)。
75.權(quán)利要求66、72或74中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物、單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。
76.權(quán)利要求75的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。
77.產(chǎn)物，其來(lái)自權(quán)利要求75的植物和/或權(quán)利要求76的植物的可收獲部分。
78.編碼AP2-70-樣多肽的核酸相對(duì)于對(duì)照植物，在增加產(chǎn)量，尤其是增加種子產(chǎn)量中的用途。
79.分離的核酸分子，其包含
(i)SEQ ID NO347、SEQ ID NO349、SEQ ID NO351、SEQ IDNO353、SEQ ID NO355、SEQ ID NO357、SEQ ID NO359、SEQ IDNO361或SEQ ID NO363中的一個(gè)所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO347、SEQ ID NO349、SEQ ID NO351、SEQ IDNO353、SEQ ID NO355、SEQ ID NO357、SEQ ID NO359、SEQ IDNO361或SEQ ID NO363中的一個(gè)所示的核酸的互補(bǔ)物；
(iii)核酸，其編碼與SEQ ID NO348、SEQ ID NO350、SEQ ID NO352、SEQ ID NO354、SEQ ID NO356、SEQ ID NO358、SEQ ID NO360、SEQ ID NO362或SEQ ID NO364中的一個(gè)所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的NAC多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
80.分離的多肽，其包含
(i)SEQ ID NO348、SEQ ID NO350、SEQ ID NO352、SEQ IDNO354、SEQ ID NO356、SEQ ID NO358、SEQ ID NO360、SEQ IDNO362或SEQ ID NO364中的一個(gè)所示的氨基酸序列；
(ii)與SEQ ID NO348、SEQ ID NO350、SEQ ID NO352、SEQ IDNO354、SEQ ID NO356、SEQ ID NO358、SEQ ID NO360、SEQ IDNO362或SEQ ID NO364中的一個(gè)所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；
(iii)如上(i)或(ii)中給出的氨基酸序列的衍生物。
81.分離的核酸分子，其包含
(i)SEQ ID NO341、SEQ ID NO343或SEQ ID NO345中的一個(gè)所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO341、SEQ ID NO343或SEQ ID NO345中的一個(gè)所示的核酸的互補(bǔ)物；
(iii)編碼POI多肽的核酸，所述POI多肽與SEQ ID NO342、SEQID NO344或SEQ ID NO346中的一個(gè)所示的氨基酸序列具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
82.分離的多肽，其包含
(i)SEQ ID NO342、SEQ ID NO344或SEQ ID NO346中的一個(gè)所示的氨基酸序列；
(ii)與SEQ ID NO342、SEQ ID NO344或SEQ ID NO346中的一個(gè)所示的氨基酸序列具有一定序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；
(iii)如上(i)或(ii)中給出的氨基酸序列的衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)特定類型的NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物中表達(dá)在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。特定類型的NAC轉(zhuǎn)錄因子是具有這樣的氨基酸序列的NAC轉(zhuǎn)錄因子，即當(dāng)其用于構(gòu)建NAC系統(tǒng)樹時(shí)，趨向聚簇于包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57或SEQ ID NO59所示的氨基酸序列的NAC組，而不是聚簇于任何其他NAC組。本發(fā)明還涉及具有編碼此類NAC轉(zhuǎn)錄因子的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還涉及通過(guò)調(diào)節(jié)編碼AP2-2多肽的核酸在植物中表達(dá)而在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼AP2-2多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還涉及通過(guò)調(diào)節(jié)編碼APETELA2-70-樣(AP2-70-樣)多肽的核酸在植物中表達(dá)而在植物中增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼AP2-70-樣多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還提供用于實(shí)施本發(fā)明方法的迄今未知的NAC、AP2-2多肽和AP2-70-樣多肽的編碼核酸和包含這些核酸的構(gòu)建體。本發(fā)明還提供用于本發(fā)明方法中的構(gòu)建體。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101473037SQ200780022208
公開(kāi)日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月15日
發(fā)明者崔良?jí)? 金周坤, 南伯熙, 鄭鎮(zhèn)瑞, 吳世俊, 韓昌德, 樸盛韓, 鄭弼中 申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司, 植物功能基因組中心