專利名稱：血管瘤集落形成細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及產(chǎn)生和擴增/ok管瘤集落形成細胞的方法。本發(fā)
明更特別涉及利用兩步處理法體外產(chǎn)生和擴增人血管瘤集落形成細胞的方法， 第一步，M在至少一種足夠?qū)JS胎干細胞誘導(dǎo)分化^狀體的量的生長因 子的情況下，在M清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所iai、胎衍生千細胞；第二步，在存在至 少一種足^fM^管瘤集落形成細M含胚狀體的培養(yǎng)基中擴增的量的生長因
子的情況下，在itjk清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所ii^狀體。本發(fā)明還涉;^Ajk管瘤集落 形成細胞的制備。本發(fā)明還涉及^Ajk管瘤集落形成^f立沿著itii細M內(nèi)皮 細胞諳系分化的方法，以及制4^分或完全分化自血管瘤集落形成細胞的細胞 類型的方法。血管瘤集落形成細胞及由其分化出的細胞具有M體內(nèi)外用途。 能夠在體外如此大批量地產(chǎn)生擴增的Ajfe管瘤集落形成細胞，首次揭示了可大 量衍^Ajk管瘤集落形成衍生細胞類型的潛力，所itAjk管瘤集落形成衍生細 胞類型例如Ait^干細胞、或內(nèi)皮細胞、分化的itit細胞(例如紅細^P血小 板)，它們將具有多種治療用途。jth^卜，可將通it^發(fā)明衍生出的大量Ajk管瘤 集落形成細胞以M的治療策略用于治療itit細^內(nèi)皮細胞紊舌L^用于血液 棘
背景技術(shù)：
itiL干細胞(HSC)能夠自我更新，并能產(chǎn)生4^血細胞鐠系。 這些細胞位于骨髓，構(gòu)成^Ait血系統(tǒng)的基礎(chǔ)。這些細胞的移植^J^現(xiàn)在臨 ^Ji最常見的基于細胞的治療。 HSC移植被用于治療患急'lt^慢性白血病，再生障礙性貧血和多 種免疫缺陷綜合癥，以及多種非血液惡性腫瘤和自身免疫紊亂的患者。對于患 血氣惡性腫瘤的患者，HSC移植可以拯救患者免于治療導(dǎo)致的發(fā)育不全(可以發(fā) 生在高劑量化學療法和/或》說療法后)。 盡管HSC移植被"M應(yīng)用于臨床，但HSC的三種主要來源(人骨 髓、外周#耕血)有P艮，因為需要成體HSC移植的患者中的三分^"缺乏良好匹配的供者。例如，對于^f^一個特定的患者，其兄弟M的人類白細胞
抗原(HLA)與其相匹配的枳會只有25%。HLAs是位于細^^面的蛋白，它幫助免疫系統(tǒng)識別哪些細M 自我的(屬于自身)，哪些細獄非我的(外源或來自于體外)，HU蛋白由基因 蔟編碼，所錄因簇形成位于人6號染色體的被稱為主要組織相容性復(fù)^(或 MHC)的區(qū)域，由顧C基因座編碼的這些蛋白^^多植排斥中發(fā)揮重辦用。因此，
HLA蛋白稱為MHC蛋白。雖然使移植物的MHC分子與受者的MHC分子匹配 肯^^提高臨絲植的成功率，但它不肯W說排斥，即使移^A在HLA相同 的兄弟M之間。這樣的排斥可能由次要組織相容性抗原之間的差異觸發(fā)。這 些多態(tài)性^^通常是與位于移^i且織細l&Ji的MHC ^結(jié)合的"非我"的肽，而 除非^^)免疫抑制藥物，即便細C^^、匹配，次要組織相容性^f、的差桃常 會導(dǎo)致移植受者的免疫系統(tǒng)最終排斥移植物。 M三種類型的I型HLA和II型HLA。將I型和II型HLA匹配 者(-^l兄弟:W)稱為相關(guān)供者。存活率升高與受^M^間I型HLA-A、 HLA-B、 HLA"C以及II型HLA-DRB1和HLA-DQB1的匹S^IJL相關(guān)(Morishi咖等， 2002 Blood (99 ): 4200-6 )。對于沒有相匹配的相關(guān)供者的患者而言，可通過
移植)的人數(shù)逸逸大于現(xiàn)存的適合于移植的細#纟射只供應(yīng)。在這種情況下， 常常不可育&^得受者MHC蛋白^f多植物的MHC蛋白之間的狄匹酉&f更不奇怪了 。 所以，許多移植受者必需等待MHC匹配的移植物可獲得，或者接受MHC不匹配 的移植物，忍受更大劑量的免疫抑制藥物，卻仍缺冒排斥的風險。因此能夠 產(chǎn)生^怍HSC，和/或誘導(dǎo)受者對移植物的耐受，#^大大利于人類疾病的治 療和處理。才^&在鳥胚胎，以;SJt^^fei^f乳動物中的研究工作，已證明 血#內(nèi)皮的發(fā)育禾1^緊密相關(guān)。例如內(nèi)皮細I^NtiL細胞同時形成，在卵黃 lbfc島中相J Emie。所述卵黃lbk島衍生自定居于卵黃囊的中胚層細胞的聚集 物。這些聚集物的中心生^J^t^細胞，而外周^M匕為內(nèi)皮細胞，它形成 圍繞內(nèi)部血細胞的血管系統(tǒng)。這些M^結(jié)果支持內(nèi)皮細J^iiiL細^fr有共同 祖先的，見泉，另外，在糾魚和小I^胎中，內(nèi)皮鐠系和itiz4普系共享某些基因的狄，例如FIkl、 Fltl、 Tiel、 Tie2、 CD34、 Scl和Runxl (Fina等,1990 Blood (75 ): 2417-2426; Millauer等，1993 Cell (72 ): 835-846; Yamaguchi 等，1993 Development ( 118 ): 489-498; Anagnostou等，1994 PMS USA (91): 3974-3978; Kallianpur等，1994 Blood( 83): 1200-12081; Young等，1995 Blood
(85 ): 96-105, Asahara等，1997 Science (275 ): 964-967; Kabrun等，1997 Development ( 124): 2039-2048 )。同樣，某些基因突變影響內(nèi)皮細齡壯細 胞的發(fā)育(Shalaby等，1995 Nature ( 376): 62—66; Robb等，1995 PMS USA
(92 ): 7075-7079; Shivdasani等，1995 Nature ( 373): 432-434， Stainier 等，1995 Development (121): 3141-3150; Bollerot等，2005 APMIS (113): 790-803 )。而且,Flkl或者FU1的缺失(它們兩個都是血管內(nèi)紐長因刊VEGF)
的受體)導(dǎo)致破壞小,胎的iti^內(nèi)n育. e^文獻報導(dǎo)從小鼠胚胎干細旨外生成小鼠^管細胞(Choi 等，1998 Development 125: 727-732 )。而且6v^人ES細J^t生出能產(chǎn)生itj6L 和內(nèi)皮兩種細胞的人前體細胞(Wang等，2004 Immunity (21): 31-41和Wang 等，J Exp Med (201 ): 1603-1614)，但是量少，最多數(shù)百個細胞。砂卜，尚無 體外擴增^jk管細胞前體細胞的方法或a。 因此需^—種方法產(chǎn)生和擴增大量AAiL管細胞以;5LWl管細 ^t生細胞類型(即itiL細胞和內(nèi)皮細胞)，還需要所有含有所述量的^管細 J!^^f生細胞類型的ii^/^^物。所述方法^t加細l^多植的有效性，也能 用于^4tB治療，例汷d秀導(dǎo)免疫耐受性。 另一個急需用it^J于輸血的血禮紅十字會及^Wa^供應(yīng)單 位^L5iA乎經(jīng)常i^i缺。這種情況^iUi型獨特的患者，Rh+患者，或者事私威 災(zāi)難導(dǎo)致的大量傷亡中尤甚。另外，戰(zhàn)時軍隊急需用于治療戰(zhàn)爭相關(guān)的創(chuàng)傷的 可用血液。本發(fā)明提供用于it^4和輸血的分化的iijk細胞。4^發(fā)明的細胞 和方法將更^^可靠，優(yōu)點在于無需傳統(tǒng)的對iR^的絲，并將有助預(yù)防 可用錄的嚴重短缺，
發(fā)明缺 本發(fā)明通過提^^外產(chǎn)生和擴增A^血管細M血管痛集落形 成細胞的方法來^JL了上述問題。才MH;^L公開的新方法擴增A^iL管細M 血管瘤集落形成細胞的能力允許產(chǎn)生可翻于各種治療用途的細胞。另外，本發(fā)明提供產(chǎn)生可用于治療用途的A^k管細^4血管瘤集落形成鐠系細胞(即， it^細^內(nèi)皮細胞)的方法。本發(fā)明的方法還凈M于產(chǎn)生大量可以商業(yè)M^莫 應(yīng)用的A^k管細M血管瘤集落形成細胞以^Jtj6L細胞和內(nèi)皮細胞，及其分
化細胞。 本發(fā)明提，外產(chǎn)生和擴增Aj6L管瘤集落形成細胞的方法，所述 方法包*驟
(a) ^在至少一種足夠?qū)^胎衍生細胞誘導(dǎo)^f匕，狀體的量的生長 因子的情況下，在^ir清培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含所it^胎衍生干細胞的細,養(yǎng)稱； 和
(b) 向所述含胚狀體的培絲中加A^少一種生長因子，并繼續(xù)在;^清 培養(yǎng)基中培養(yǎng)所i^養(yǎng)物，其中所述生長因子的量足^fMjfe管瘤集落形成細 瞎斤郝狀躲絲中擴增，
其中在所迷方法步驟(a)和(b)的整個過程中使所述干細胞、胚狀體和
血管瘤集落形成細郝肚'絲養(yǎng)基中生長。本發(fā)明HyC^^外產(chǎn)生和擴增Aii管瘤集落形成細胞的方法，所
ii^法包才紳驟
(a) ^L4在至少一種足夠?qū)B胎衍生細胞誘導(dǎo)分化^^體的量的生長 因子的情況下，在^ir清培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含所i^E月^t生細胞的細，養(yǎng)物；
(b) 向所述含胚狀體的培絲中加A:l少一種生長因子，并繼續(xù)在;^清 培養(yǎng)基中培養(yǎng)所ii^養(yǎng)物，其中所述生長因子的量足斷tAjk管瘤集落形成細 絲所鄉(xiāng)狀^^絲中擴增，
(c) 將所鄉(xiāng)狀體解聚為單細胞；
(d) 向所述含所述單細胞的培絲中加A^少-^t生長因子，并繼續(xù)在無
血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所,養(yǎng)物，其中所述生長因子的量足^^AJL管瘤集落形
成細#含所述單細胞的培#^中擴增，
其中在所述方法步驟(a) - (d)的整個過程中^^斤述干細胞、胚狀#
血管瘤集落形成細^^tir絲養(yǎng)基中生長。 在M明的某些實施方案中，所ii^l^f生細l&^胎干細胞。
在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增Ajk管瘤集落形成細胞的方法的某些實
施方案中，所處長因子是包含同源異型盒蛋白，或功能變體，或其活性片段的蛋白。在某些實施方案中，所述同源異型盒蛋白是^恥XB4，或其功能變體， 或活性片段的蛋白。HOXB4可以是哺乳動物HOXB4，包括小鼠和人H0XB4。所述 H0XB4蛋白可以是4H^H0XB4蛋白。再一個實施方案中，所述HOXB4包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 4的^iJ^序列。 在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增人血管瘤集落形成細胞的方法的某些實 施方案中，所述包括HOXB4的生長因子是包括HOXB4和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)的融 錯白。再一個實施方案中，通過接頭連接所述PTD和H0XB4。再一個實施方案 中，所述PTD是TAT蛋白，其功能變體或活性片段(包括TAT多肽)。在某些實 施方案中，所述TAT蛋白包括SEQ ID NO: 14的^J^序列。再一個實施方案 中，所述PTD包^ft口SEQ ID NO: 14所示的TAT多肽的一個或多個拷貝。在某 些實施方案中，所述PTD是SEQ ID NO: 15。 在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增AJt管瘤集落形成細胞的方法的某些實 施方案中，所^長因子選自血管內(nèi)U長因子(VEGF )、骨形態(tài)生成蛋白(BMP )、 干細胞因子(SCF )、 Fl t-3L( FL )促血小4^成素(TPO )和^細J^成素(EPO )。 再一個實施方案中，錄養(yǎng)含有hES細胞的細艦輛的0-48小時內(nèi)將血管 內(nèi)皮生長因子(VEGF)或骨形態(tài)生成蛋白(BMP),或兩者加Ai)j培養(yǎng)步驟(a )。 又一個實施方案中，從開始步驟(a )的48 - 72小時內(nèi)將所述干細胞因子(SCF )、 Flt-3L (FL)或促血小M成素(TPO)，或它們的但啊組合加AJ)J含有hES細 胞的細1&^#^中。 在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增AJL管瘤集落形成細胞的方法的某些實 施方案中，將包含HOXB4蛋白或其功能變M活性片段(或結(jié)構(gòu)域)的生長因 子加A5'J步驟(s)，其中加A^斤述蛋白數(shù)次，例j喊日一次或隔日一次。 在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增Ajk管瘤集落形成細胞的方法的某些實 施方案中，從，步驟(a)的48 -72小時內(nèi)將所述包含同源異型盒蛋白的生 長因子加A^步驟(b), ^M^發(fā)明的方法的某些實施方案中，從開始步驟(a) 的48 -72小時內(nèi)將所述H0XB4蛋白或絲能變^;活性片^PA^步驟(b)。 在某些實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增Ajk管瘤集落形成細胞 的方法還包^J步驟(b)中加入^3i細M成素(EPO)的步驟'在某些實施 絲中，在0016段描述的本發(fā)明的方法還包括向步驟(b)和(d)中加入做 細敝成素(EPO)的步驟，
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在某些實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增Ajk管瘤集落形成細胞 的方法還包^^M沐/或分離Ajk管瘤集落形成細胞的步驟(s )?？捎脦Э笴D71
抗體的免疫親和^^析純化所iiiL管瘤集落形成細胞?？砂创笮『?或形態(tài)分離 所iiik管瘤集落形成細胞。 在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增人血管瘤集落形成細胞的方法的某些實 施方案中，所述包含A^胎衍生細胞的細,養(yǎng)物來源于A^胎干細M庫， 其中所itA^胎千細麟包才計細胞，每個都是A^中至少一種MHC等錄因 的R子或純合子，其中所述干細J^隼的每個成員都是相對于所述庫中B 成員有不同的一套MHC等M因的半^"或純^。再一個實施方案中，所述 A^月纖細l&i^包^f細胞，所述干細^A^中所有MHC等^^因的R 子或純合子。這些方法產(chǎn)生Aj6L管瘤集落形成細^庫，每個都;IA群中至少 一種MHC等位基因的^^或^^，其中所述干細^^的每個成員豆是相 對于所錄中^W員不同的一套MHC等位基因的"f^或純^1。再一個實 施方案中，這些方法產(chǎn)生Ajfe管瘤集落形成細M庫，所iiAjk管瘤集落形成
細^A^中所有MHC等^4因的4^或純合子。因此，本發(fā)明A提皿過 這些方法產(chǎn)生的Ajk管瘤集落形成細^^庫?？扇缦隆組所ii^。 本發(fā)明提供方法處理需要治療的患者，涉及將Aitii干細l^人 內(nèi)皮細自用給所逸患者，包^#驟
(a) 選擇所述患者；
(b) 鑒定在所述患者細#面表達的MHC蛋白；
(c) 提供之前的0024段描述的AJi管瘤集落形成細^4;
(d) /yj斤iii^中篩選與所述患者細lfeJi的所述患者MHC蛋白匹配的Aj6l 管瘤集落形成細胞；
(e) 將步驟(d)中鑒定的所iiAjk管瘤集落形成細艦艮據(jù)需求分化^A iiit干細胞、內(nèi)皮細M兩者；
(f) 將從步驟(e)中得到的所ii/JijfiL干細胞、內(nèi)皮細絲兩者施用給
所述患者.可以在區(qū)域中心實施此方法，所述區(qū)域中心例如醫(yī)院或醫(yī)療中心， 在某些實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增Ajfe管瘤集落形成細胞 的方法還包:^^斤i^Ajk管瘤集落形成細^Eit于將所iiAiL管瘤集落形成細胞誘導(dǎo)^f匕^Ait^千細胞的條件下生長的步驟。 在某些實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生和擴增Ait管瘤集落形成細胞 的方法還包^^斤iiA血管瘤集落形成細^it于將所iiAjk管瘤集落形成細
胞誘導(dǎo)分化^A內(nèi)皮細胞的^ft下生長的步驟。再一個實施方案中，所iiit于 將所iiAjk管瘤集落形成細胞誘導(dǎo)^f匕^A內(nèi)皮細胞的a包M所iiAjk管
瘤集落形成細g平板接種纖維連接蛋白的培養(yǎng)平^LL生長。 本發(fā)明的某些實施方案中，所述產(chǎn)生和擴增Ajk管瘤集落形成細 胞的方法產(chǎn)生至少10， 000個AjfeL管瘤集落形成細胞，至少50， 000個AJl管瘤 集落形成細胞，至少100，000個人血管瘤集落形成細胞，至少500， 000個Aii 管瘤集落形成細胞，至少1 x 1()6個Ajk管瘤集落形成細胞，至少2 x 1()6個Ajk 管瘤集落形成細胞，至少3 x 1()6個Ajk管瘤集落形成細胞，或至少4 x 106個人 血管瘤集落形成細胞。這些方法產(chǎn)生可以包含10， 000到4百萬個Ajk管瘤集落 形成細胞的細l&^ 因此，本發(fā)明Ht^供包含至少10， 000個Aj6l管瘤集落形成細胞， 至少50， 000個AJoL管瘤集落形成細胞，至少100， 000個Ajk管瘤集落形成細胞， 至少500， 000個Ajk管瘤集落形成細胞，至少1 x 1()6個Ajk管瘤集落形成細胞， 至少2 x 1()6個Ajk管瘤集落形成細胞，至少3 x k)6個Ajk管瘤集落形成細胞， 或至少4 x 1()6個Ajk管瘤集落形成細胞的Ajk管瘤集落形成細胞(可在iLii清
培養(yǎng)基中生長)的M。可將這些溶液注射M試者。這些ii^可適用于冷凍。 這些溶液可以不含血清。這些絲中的Ajk管瘤集落形成細^少能夠^f匕成 ili6i細麵內(nèi)皮細胞，但Hk^有分化成雞細胞類型的更大的發(fā)育潛力。本發(fā) 明^Ui供這些溶液在制備用于治療可通ii^用血管瘤集落形成細胞、造血細胞
或內(nèi)皮細J!&^M臺療的疾病的藥物中的用途。 本發(fā)明Ht^供產(chǎn)生適于注射給患者的AJL管瘤集落形成細g
液的方法，包括分離如前所述的細^i^液的步驟，和將所述細胞置于適合注射 給患者的i^t的步驟。本發(fā)明也提供產(chǎn)生適于冷凍的AA管瘤集落形成細g 、液的方法，包4舌分離如前所述的細JJ&^t的步驟，和將所述細胞置于適合冷凍 的絲的步驟。 本發(fā)明也提WfAit)fii干細g用給有此需要的患者的方法，包 紗驟(a) 選擇有此需要的患者；
(b) 提供由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴增的Ajk管瘤集落形成細胞；
(c) 將所iMA管瘤集落形成細^^^/Jt^干細胞；和
(d) 將所有所i^AiiiL干細胞中的一些施用給患者。 本發(fā)明也提^^Aiiii干細l^用給有此需要的患者的方法，包 桫驟
(a) 選擇有此需要的患者；
(b) 以至少10, 000個細胞的數(shù)量提供Ajk管瘤集落形成細胞；
(c) 將所iMjfc管瘤集落形成細l^4b^Ait^干細胞；和
(d) 4^-些或所有所iiAitii干細l^用給所逸患者。本發(fā)明< ^€##人內(nèi)皮細自用給有此需要的患者的方法，包括
步驟
(a) 選擇有此需要的患者；
(b) 提供由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴增的AiL管瘤集落形成細胞；
(c) 將所iiAjk管瘤集落形成細J^^匕^A內(nèi)皮細胞；和
(d) #~"些或所有所^內(nèi)皮細皿用給所述患者。 本發(fā)明^^##人內(nèi)皮細艦用給有此需要的患者的方法，包括 步驟
U)選擇有此需要的患者；
(b) 以至少10， 000個細胞的數(shù)量提供Ajk管瘤集落形成細敗
(c) 將所iiAjk管瘤集落形成細^^匕^A內(nèi)皮細胞；和
(d) ^些或所有所iiA內(nèi)皮細J5fe^給所述患者。 在某些實施方案中，所iiAjk管瘤集落形成細胞的數(shù)量在10， 000 到4百萬個細Jf^間，4^L明^^供治療需要治療的患者的內(nèi)皮細胞^L的方法，包括
步驟
U)選擇有此需要的患者，
(b) 提供由Jii^r法產(chǎn)生和擴增的Ajk管瘤集落形成細胞，
(c) 將所iiAJL管瘤集落形成細^f械人內(nèi)皮細胞，和
(d) t些或所有所iiA內(nèi)皮細J!&^給所述患者'
本發(fā)明^^提供治療需要治療的患者的內(nèi)皮細胞彭L的方法，包括 步驟
(a) 選擇有此需要的患者；
(b) 以至少10， 000個細胞的數(shù)量提供Ajk管瘤集落形成細胞；
(c) 將所iiAj6r管瘤集落形成細l&^M匕^A內(nèi)皮細胞；和
(d) #-些或所有所^內(nèi)皮細自用給所述患者' 在某些實施方案中，所iiAjk管瘤集落形成細胞的數(shù)量在10， 000 到4百萬個細胞之間， 有待用這些方法治療的內(nèi)皮細胞彭L包括心M^E、中風、動脈 粥樣硬4b^^jk。所i^fejfe可^jt在腦、四肢、心臟、肺、M和眼。^^發(fā)明^C^外產(chǎn)^AitifiL干細胞的方法，包#驟
(a) 提供由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴增的Ajfc管瘤集落形成細胞；和
(b) 使所^Aj6t管瘤集落形成細^it于將所iiAiL管瘤集落形成細胞誘
導(dǎo)^f匕AAitiL干細胞的糾下生長。本發(fā)明提，外產(chǎn)^A內(nèi)皮細胞的方法，包^#驟
(a) 提供由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴增的Ajfc管瘤集落形成細胞；和
(b) 使所iiAjk管瘤集落形成細^Lit于將所^Ajk管瘤集落形成細胞誘 導(dǎo)^ft^A內(nèi)皮細胞的M下生長。
〖0041] 本發(fā)明^^供擴增血管瘤集落形成細胞的方法，包括^^在足夠 支持所iiii管瘤集落形成細胞增殖的量的包括同源異型盒蛋白(例如HOXB4 )或 其功能等效物或其活性片段的蛋白的情況下，使哺乳動物血管瘤集落形成細胞 在itifc清培養(yǎng)基中生長。所述待擴增的血管瘤集落形成細胞可以*帶血、外 周M骨髄富集、純化，或者分離。所迷血管瘤集落形成細胞可以是Ajk管瘤 集落形成細胞。所^法可以產(chǎn)生包含10， 000到4 x 106個，或者更多的Ajk管 瘤集落形成細胞的i^L本方';^M的H0XB4蛋白可以是適用于4^C明的產(chǎn)生 和擴增AiL管瘤集落形成細胞的方法的^^蛋白。 本&明也提^^利用由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴增，或擴增的AA管瘤 集落形成細胞誘導(dǎo)免疫耐受性的方法，篩選與同種^##植物共享組織相容性 才^i沐的耐受'ltAiL管瘤集落形成細胞，并可將所述耐受'I^Aj&l管瘤集落形成 細胞于同種^#賊細艦理(再生患者需要的細胞功能)前，或與同種異^^多^l細胞處理同時施用給人受者。產(chǎn)生的免疫耐受性隨即斷氐對同種*
移植物或細胞治療的急'h4il慢性排斥的風險。 由本文公開的方法產(chǎn)生的大量血管瘤集落形成細胞能夠除去耐
受方案中的毒性預(yù)處理步驟?？?/^多植物，或^x與供者血管瘤集落形成
細胞匹配的器官、組織或細胞前給人受者施用供者的Ajk管瘤集落形成細胞。 可從同一供者獲得所iiAik管瘤集落形成細l^移植物。所i^多植物可以來源 于分化的供者Ajk管瘤集落形成細胞。也可從不同M獲得所iiAjk管瘤集落 形成細#移植物，其中所述供者之間相匹配?？蓪⑺鵬iAjk管瘤集落形成細 皿用給人受者，以^T此需要的受者中誘導(dǎo)耐受性。 在某些實施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)人受者對供者同種^#植 物的耐受性的方法，其中所述方法包:^^驟(a) M者施用抑制T細l^"刺激 的制劑(b)將由本文描述的方法產(chǎn)生和擴增，或擴增的Ajk管瘤集落形成細胞 導(dǎo)A^斤述受者，和(c)將所述同種^^多植物移^i^:者。所iiAjfe管瘤集落 形成細胞(供者細胞)促i^斤述受者接受所述同種^M多植物。在某些實施方
的制劑。所ii^法還可包^^用抑制CD28-B7相互作用的制劑。所^法可包 括或不包括胸^y^/或T細^i^或滅活。上^法也可在沒有全身照射產(chǎn) 生的造血空間(hematopoietic space)的情況下產(chǎn)生混^i合現(xiàn)象。 本發(fā)明^y^^liiA受者對供者同種^^多植物的耐受性的方 法，其中所財法包樹驟(a )在所述受者中制i^l腺空間(thymic space); (b)在所述受者中耗盡或滅活供者反應(yīng)性T細胞；(c)將所述MAJl管瘤集 落形成細胞或與所述供者匹配的Ajk管瘤集落形成細l^^入受者；和(d)將所 述同種^^多植物移^^者，其中所述供者血管瘤集落形成細胞誘導(dǎo)對所述 同種^M多植物的耐受性。在某些實施方案中，所財法不包樹，Jititii空間 的照射。所財法可包^itit^t者施用至少一種選自胸^^射、類固醇、皮 質(zhì)激素、布喹那(brequinar)、 iL^疫抑制劑或藥物來制it^腺空間。
本發(fā)明^y^供產(chǎn)生朋于輸血的細胞的方法。例如械明提供產(chǎn)
生適用于輸血的紅細胞的方法。照這樣，本發(fā)明提供M，以幫助^)Sf^量 的長期不足。在某些實施方案中，本發(fā)明提^lfAjk管瘤集落形成細^^外分4匕^itii細胞的方法，所^法包M驟
(a) 44供AJtL管瘤集落形成細胞；和
(b) 將所a管瘤集落形成細^^化成^ft的iiii細胞。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供用體外分化自Ajk管瘤集落形成 細胞的itjfit細l&i^ff^血的方法，所i^r法包:^"驟
(a) 提供Ajk管瘤集落形成細胞；
(b) 將所^L管瘤集落形成細J^f匕成分化的itjk細胞；和
(c) 用所述^ft的itii細l&ii^^血。在某些實施方案中，所述血管瘤集落形成細胞恢復(fù)自冷凍培養(yǎng)物。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供用體外分化自Ajk管瘤集落形成 細胞的itik細Jfcii^^r血的方法，所^法包M驟
(a ) ^4在至少一種足夠?qū)^月針;t生細胞誘"^^化^狀體的量的生長 因子的情況下，培養(yǎng)包含所ii^月^f生細胞的細，養(yǎng)物；
(b) 向所述含胚狀體的培絲中加AjJ/'—種生長因子，其中所處長因 子的量足^ftAjfiL管瘤集落形成細M所^i、狀^^養(yǎng)物中擴增；
(c) 將所i^jk管瘤集落形成細l^f匕成分化的itir細胞；和
(d) 用所述^^的itik細l&^t^r血。在某些實施方案中，在所述方法步驟(a)的整個itf呈中^^斤述 胚月^f生細胞、胚狀^p血管瘤集落形成細Mibir^養(yǎng)基中生長。
在某些實;^r^中，所粗月^f生細^^針細胞。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供用體外刺t自Ajk管瘤集落形成 細胞的itiL細l&i^^r血的方法，所迷方法包*驟
(a) 在存在至少一種足夠?qū)^胎衍生細胞誘^f匕^狀體的量的生長 因子的情況下，培養(yǎng)包含所ii^胎衍生細胞的細l^養(yǎng)物；
(b) 向所述含胚狀體的培養(yǎng)物中加入至少-"^生長因子，其中所述生長因 子的量足^^AA管瘤集落形成細l^所i^狀,養(yǎng)物中擴增；
(c) 將所iiii管瘤集落形成細l^fM^f匕的itjk細胞；和
(d) 用所id^fb的it^細l&i^ft^r血。在某些實施方案中，在所述方法步驟(a)和(b)的整個過程中^^斤述干細胞、胚狀^(^p血管瘤集落形成細l^iLii清培養(yǎng)基中生長。 ^^發(fā)明的某些實施方案中，所ii^胎衍生細^^胎干細胞。
在某些實施方案中，所逸血管瘤集落形成細胞恢復(fù)自冷凍培養(yǎng)物。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供用體外刺匕自Ajk管瘤集落形成 細胞的itiL細^^fJ^r血的方法，所ii^T法包才t^驟
(a) M在至少一種足夠?qū)^胎衍生細胞誘^f匕^^浙體的量的生長 因子的情況下，培養(yǎng)包含所*胎衍生細胞的細艦械
(b) 向所述含胚狀體的培養(yǎng)物中加入至少一種生長因子，其中所述生長因 子的量足^^ii管瘤集落形成細^E所i^狀，養(yǎng)物中擴增；
(c) 將所軀舊解絲單細胞；
((1)向所述含所述單細胞的培#中加^1少-^生長因子，其中生長因 子的量足夠佳人血管瘤集落形成細胞在所述含所述單細胞的細,養(yǎng)物中擴 增；
(e)將血管瘤集落形成細^f匕成^^的itik細胞；和 (f )用所述分化的#細1&^^#血。 在某些實施方案中，在所i^法步驟(a) - (b)的整個過程中 ^/斤述干細胞、胚狀^^血管瘤集落形成細I^EXii清培養(yǎng)基中生長。 在本發(fā)明的某些實施方案中，所ii^月^t生細^l^胎干細胞。 在某些實施方案中，所處長因子是包括同源異型盒蛋白，或其 功能變體，或其活性片段的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，所迷同源異型盒蛋白 包括HOXB4蛋白，或其功能變體，或其活性變體。 在某些實施方案中，所述分化的ili6L細胞以單個細胞類型產(chǎn)生。 在某些實施方案中，所述單個細胞類型選自紅細胞、血小M吞謹細胞。在 某些實施方案中，所ii^喧細胞選自粒細胞嗜中性粒細胞、嗜堿l^i細胞、 嗜酸魁立細胞、淋巴細戯輛細胞，在某些實施方案中，其中所iiix細絲 itifai3:蛋白F。在某些實施方案中，以約等于見于M中的分化的細胞類型的比 例^^所迷單個細絲型,其中所g于jfa^L中的^f匕的細lfell:型的比例是96% 的紅細胞、1%的血小板和3%的吞嗟細胞。在某些實施方案中，在同一步驟中產(chǎn)生多種分化的iiiL細胞類型。在某些實施方案中，所述多種分化的#細胞類型選自紅細胞、血小板
iL^喧細胞。在某些實施方案中，所^^逸細胞選自粒細胞嗜中性粒細胞、 嗜減N(i細胞、嗜酸fi^立細胞、淋巴細賊單核細胞。在某些實施方案中，紅 細##紅蛋白F。在某些實施方案中，產(chǎn)生的以約等于見于m中的分化的 itjfc細胞類型的比例產(chǎn)生所述多種分化的itii細胞類型，其中所^L于血液中 的分化的細胞類型的比例是96y。的^iili6iitj6L細胞、1%的血小板和3%的名1，楚細 胞。在某些實施方案中，在輸血前向所述分化的造血細胞中加7vii漿. 在某些實施方案中，所粒管瘤集落形成細胞與患者匹配，以保 證能產(chǎn)生患者自身血型的分化的itit細胞。在某些實施方案中，所i^iL管瘤集 落形成細IW抗原因子A、 B、 Rh或它們的任意組合呈陰性。在某些實施方案中， 所述分化的ilii細^l:紅細胞，且其中^f匕所^it細胞的步驟包:^^ix細^t 成素(EP0)。 在某些實施方案中，本發(fā)明^k^供Ajk管瘤集落形成細胞，所述 細J^少能分化產(chǎn)生it^細^內(nèi)皮細胞類型，其中所iiAjk管瘤集落形成細 胞與^Ajk管瘤集落形成細^^fc^連。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供Ajk管瘤集落形成細胞，所述細 m少能^^產(chǎn)生itiL細脅內(nèi)皮細絲型，其中所^Aj6l管瘤集落形成細胞 與^Ajk管瘤集落形成細^h^占連，且其中所iiAjk管瘤集落形成細胞不 狄CD34蛋白。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供AJr管瘤集落形成細胞，所i^iw !^少能^f匕產(chǎn)生妙細J^內(nèi)皮細胞類型，其中所i^A^管瘤集落形成細胞 不^i下列^^T一種蛋白CD34、 CD31、 KDR和CD133。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含Ajfe管瘤集落形成細胞的細 鵬絲，所述細m少能分化產(chǎn)生壯細賊內(nèi)皮細胞類型，其中所iiAjk 管瘤集落形成細^目X^f^占連。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含AJi管瘤集落形成細胞的細 ，所述細HE少能分化產(chǎn)生iiiL細J^內(nèi)皮細胞類型，其中所iiAjk 管瘤集落形成細船目5^*^占連。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含！^化的Aj6L管瘤集落形 成細自的細皿#^，所述細1^少能分化產(chǎn)生^細#內(nèi)皮細胞類型， 其中所iiAjk管瘤集落形成細船目X^I^占連，并且其中所iiAir管瘤集落形 成細胞不4iiCD34蛋白。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含分化自胚月針汙生細胞的Aj6L 管瘤集落形成細胞的細l^養(yǎng)物，其中所iiAj6L管瘤集落形成細l^目X^^^占 連。 在某些實施方案中，所述細,#^包含至少1 x 106個Ajk管瘤 集落形成細胞。在某些實施方案中，所述細艦絲包含至少5xl()6個Ajk管 瘤集落形成細胞。 在某些實施方案中，所ii^^f生細l^lJS胎干細胞系。在某些 實施方案中，所ii^月^f生細胞&自胚胎、卵,、胚^^內(nèi)細胞團。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含Ajk管瘤集落形成細胞的藥 物制劑，所述細M少能^^匕產(chǎn)生itifc細J^內(nèi)皮細胞類型，其中所iiAjk管 瘤集落形成細船目X^f^占連。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含Ajk管瘤集落形成細胞的藥 物制劑，所述細l^少能分化產(chǎn)生itik細^內(nèi)皮細胞類型，其中所iiAJi管 瘤集落形成細^目_￡^^^占連。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含Ajk管瘤集落形成細胞的藥 物制劑，所述細l^少能分化產(chǎn)生itik細^內(nèi)皮細胞類型，其中所#管瘤 集落形成細胞不表達下列任何-~#蛋白CD34、 CD31、 KDR和CD133。 在某些實施方案中，所述藥物制劑包含至少1 x 1()6個Ajk管瘤集 落形成細胞。在某些實^案中，所述制劑包含至少5xl()6個Ajk管瘤集落形 成細胞。 在某些實施方案中，所述包含血管瘤集落形成細胞的藥物制劑分 化自胚月^f生細胞。在某些實施方案中，所ii^胎衍生細lM^胎干細胞，在 某些實施方案中，所i^^f生細胞&自胚胎、卵,、胚泡或內(nèi)細胞團。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供之前^^r一^^ijk管瘤集落形 成細胞的冷藏制劑。
-
在某些實施方案中，本發(fā)明提4^^至少1 x 1()6個Ajk管瘤集落形 成細胞的冷藏制劑，其中所itiL管瘤集落形成細胞不表達下列任何一種蛋白 畫、CD31、 KDR和CD133。 在某些實施方案中，所述冷藏制劑包含至少5 x 106個^管瘤集 落形成細胞。 在某些實施方案中，所述含有AJi管瘤集落形成細胞的冷藏制劑 不表達CD34蛋白。在某些實施方案中，所述含有Aj6i管瘤集落形成細胞的冷藏 制劑不表達CD34、 CD31、 CD133和KDR蛋白。在某些實施方案中，所述含有人 血管瘤集落形成細胞的冷藏制劑^i LM02和GATA2蛋白。 在某些實施方案中，本發(fā)明提^"有分化自前it^管瘤集落形成 細胞的itiL細胞的培絲。 在某些實施方案中，本發(fā)明提^^有分化自前iij6i管瘤集落形成 細胞的內(nèi)皮細胞的培#^。 在某些實施方案中，本發(fā)明提^^有分化自前#管瘤集落形成 細胞的平滑肌細胞的培絲。 在某些實施方案中，本發(fā)明提^"有分化自前iiii管瘤集落形成 細胞的心肌細胞的培#^。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供上idAik管瘤集落形成細胞在制 備用于治療有此需要的患者病況的藥物中的用途。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供上,皿#在制備用于治療 有此需要的患者病況的藥物中的用途。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供上述藥物制劑在制備用于治療有 此需要的患者病況的藥物中的用途。本發(fā)明涵蓋前ii^發(fā)明的a方面和實;^r案的組合。
附圖簡述

圖1顯示衍生自威A管細胞的itiL CFU，所 >管細胞產(chǎn)生自 H1-GFP ES細胞。 圖2顯示培養(yǎng)于iLiL清(干細胞系)培養(yǎng)基中的紅細胞系集落形^#^立(CFU-E)的細J&形態(tài)。 圖3顯示培養(yǎng)于itir清(干細胞系)培養(yǎng)基中的多能集落形解 位(CFU-GE謹/ Mix)的細胞形態(tài)。 圖4顯示培養(yǎng)于itii清(干細胞系)培養(yǎng)基中的多能集落形解 位(CFU-GE廳/ Mix)的細胞形態(tài)， 圖5顯示培養(yǎng)于肚清(干細胞系)培養(yǎng)基中的粒細胞集落形成 單位(CFU-G)和巨噬細胞集落形成^f立(CFU"M)的細胞形態(tài)。 圖6顯示培養(yǎng)于itik清(干細胞系)培養(yǎng)基中的粒細胞/巨噬細 胞集落形成^f立(CFU"GM)和巨核細胞巨噬細胞集落形成^W立(CFU"Mk)的細 胞形態(tài)。 圖7顯示通過#^"生自(a) H9 ES細# (b) ACT30 ES細胞的 ^管細胞重接種于基于M膠的培養(yǎng)基中而形成管-索結(jié)構(gòu)。 圖8顯示由如實施例2所it^養(yǎng)于包被有纖維連接蛋白的培養(yǎng) 皿中的EGM-2培養(yǎng)基中后，再培養(yǎng)于M膠培養(yǎng)基中的H1-GFP ES細胞產(chǎn)生的 ^管細胞管-索結(jié)構(gòu)。圖8 M示當如實施例2所述將細胞與Alexa f luor標 記的Ac-LDL溫育時對Ac-LDL的吸收。中圖上和右圖Ji^示相差圖。 圖9顯示由如實施例2所述培養(yǎng)于包被有纖維連接蛋白的培養(yǎng) 皿中的EGM-2培養(yǎng)基中的H1~GFP ES細胞產(chǎn)生的^管細胞中von Willebrand 因子(vWF)(淺灰色染色)的表達。 圖IO顯示如實施例4所述注射到SCID小鼠中的經(jīng)蘇;M^曙紅 (H & E)染色的M膠4^Nt切片中的血管形成。 圖11顯示如實施例4所述針對人特異核抗體的陽性染色(淺灰
色染色)表明，Jst膠4^Nt切片中的血管是衍生自AA^管細胞的細胞。 圖12顯示人HOXB4(登錄號NM—024015.4; GI: 85376187 ) (SEQ ID NO: 2)的raRNA序列。 圖14顯示人HOXB4(登錄號BC049204.1;GI: 29351567 ) (SEQID NO: 4)的mRNA序列。 圖16顯示如實施例1和2所述衍生自人ES細胞的肚管細胞
(BL-CFC)的表型特征(a) i^k管細胞集^il胚細胞集落(BL"CFC或BC， x400); (b )次級EB( x 400); (c )經(jīng)賴-吉染色的胚細胞(hES-BC細胞)(x 1000);
(d-f): GATA-1染色;(d)用GATA-1染色的胚細胞(x 600)和(e)用GATA-1和DAPI染色的胚細胞;(f )用GATA-1和DAPI染色的BM細胞(x 400 )。 ( g - i):LM02染色；(g)用LM02染色的胚細胞(x 600)和(h)用1M)2和DAPI染色的胚細胞(x 600 ); (i)用LM02和DAPI染色的K562細胞(xlOOO); (j-m):CD71染色(亮灰色或淺灰色)；(j)用CD71染色的胚細胞(x 600)和(k)用CD71和DAPI染色的胚細胞(x 600); (m)用CD71和DAPI染色的BM細胞(x1000); (n-p): CXCR-4染色(亮灰色或淺灰色)；(n)用CXCR-4染色的胚細胞
(x 600)和(o)用CXCR卡DAPI染色的胚細胞(x 600); (p)用CXCR-4和DAPI染色的BM細胞(x 600); (q - s )Epo受體染色(中灰色);(q)用Epo受體染色的胚細胞(x 600)和(r )用Epo受體和DAPI染色的胚細胞(x 600);
(s)用Epo受^DAPI染色的BM細胞(x 600); (t-v) Tpo受體染色(中灰色)；(t)用Tpo受體染色的胚細胞(x 600)和(u)用Tpo受體和DAPI染色的胚細胞(x 600); (v )用Tpo受體和DAPI染色的BM細胞(x 1000 )。注意將本圖(d)和(n)中的hES-BC (^>管細胞)細胞用GATA-1和CXCR-4脅進行雙重染色，但分別呈現(xiàn)；M本圖(q)和(t)中的hES-BC (^管細胞)細戯Epo-受^Tpo-受^^M^it行雙重染色，并分別呈現(xiàn)。 圖17顯示體外衍生自人ES細胞的^it管細胞(BL-CFC絲細胞)的功能特征(a-d)衍生自經(jīng)純化的齡管細胞的粒CFU: (a)CFU-紅細胞系(x 100); (b) CFU-粒細胞(x 100); (c) CFU-巨噬細胞;和(d) CFU-多鐠系(混合，xl00); (e-h)CFU-細胞的Wright"Giemsa染色:(e)紅細胞系(xl000 ); (f )粒細胞(xi000 ); (g)巨噬細胞(x 400 )和(h)，；給(x1000)。 (i-k): CFU細胞的免疫染色(i)用CD235a染色的CFU-紅細胞(箭標，xi000); (j)用CD13染色的CFU-粒細胞(箭標，x 1000)和(k)用CD45染色的CFIH給細胞(箭標，x 1000)。 (m-p和v-y)混合的CFU細胞的FACS分析:(m)小鼠IgG同種型對照;(n) CD45; (o) CD13和(p) CD235; (v)小鼠IgG同種型對照；(w) CD45和CD235a; (x) CD13和CD45;和(y) CD13和CD235a。 (q-u和z-cc)衍生自經(jīng)純化的脈管細胞的內(nèi)皮細胞，脅細戯hES-BC細胞(q)彬汙生自觸管細胞的粘連細胞平板樹后在絲肚形成的毛細管樣結(jié)構(gòu)(x 100); (r )衍生自^管細胞的內(nèi)皮細胞的Ac-LDL吸收(灰色)(x 200); ( s )衍生自^管細胞的內(nèi)皮細胞的vWF表達(箭標)，用DAPI染色核(x 600); (t)在衍生自^管細胞的內(nèi)皮細胞中定位PEC AMI (亮色染色)，用DAPI染色核(圖中的圓形)(x 200); (u)在衍生自^管細胞的內(nèi)皮細胞中定位VE-該粘蛋白(箭標)，用DAPI染色核(圓形)(x 200 )。 ( z )最新的Ac-LDL (箭頭)和vWF表達(箭標，x 600); aa) Ac-LDL吸收(箭頭)和VE 該粘蛋白的表達(箭標，x 600); (bb) vWF (箭標)和CD31 (箭頭，x600 )的表ii; (cc) VE-該津緣白(箭標)和CD31 (箭頭，x 600 )的表達。見實施例2。圖18顯示衍生自hES細胞的胚細胞集落的集落生成。(a-c):胚細胞集落的集落生成，(a)和(b)，在WA01"GFP和MA01EB的混合物中形成的兩個胚細胞集落，它們證明了所，細胞集落的克lt^源；(a)相位圖象(x100); (b)GFP圖像(xioo); (c )從單個細胞形成的胚細胞集落(x 400)。 (d)和(e):在液*養(yǎng)中擴增單個胚細胞集落,XJi^iiiL^內(nèi)皮兩種譜系(x 200 )。(d)， x 200 (e)， x 400; (f-h):衍生自單個BC的內(nèi)皮細胞(f )在M膠上平板接種衍生自單個BC的粘附細胞后形成的毛細管樣結(jié)構(gòu)(x 100); (g)衍生自單個BC的內(nèi)皮細自Ac-LDL的吸收(箭標)，用DAPI染色核(x 400);(h)在單個BC衍生內(nèi)皮細胞中vWF的表達(箭標)，用DAPI染色核(x 400)。(i-m):衍生自單個BC的iti^CFU: (i)CFU-紅細胞系(xi00); (j)CFU-粒細胞(xioo); (k)CFU-巨喧細胞(xi00);和(m)CFU-多i普系U給，x100 )。凝歐電泳圖顯示對衍生自WA01"GFP峰MA01"GFP細胞的平;^^種^^的GFP+和GFP-hES-BC(成血管細胞)中GFP序列的PCR分析，泳道WA01-GFP+，親本W(wǎng)AOl/GFP+hES細胞；MA01 GFP，親本MA01hES細胞；H20，水陰'I;iXt照；BC~GFP+，來自細胞〉V^^l^t物的GFP陽性BC; I-IO，來自細jl^m^^^物的GFP陰性BC。將肌形成蛋白基因用作PCR^I對照。見實施例2。 圖19提供tPTIHIOXB4融^f"白的特征。(A)融合了 6xHis的tPTIHMB4重組蛋白在;U^桿菌中狄，用鎳ProBand樹脂對其進^t^化。通過SDS-PAGE 電泳檢驗兩批(命名為(1)和(2))無鹽的tPTD-HOXB4蛋白的^tt和狄。(B)tPTD"H0XB4蛋白在含5% FBS的培養(yǎng)基中不穩(wěn)定，但是(C)在含活ES細胞的itiL'絲養(yǎng)基中保持完整(N喊StemlineII培養(yǎng)基h =小時)。 圖20顯示全身注射hES-衍生^A管細^^f見網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的穩(wěn)健修復(fù)。通辦小鼠眼前房 口 2小時流體靜壓來誘導(dǎo)視網(wǎng)膜壯。七天后玻^內(nèi)或^#脈內(nèi)注射經(jīng)熒>^科己的(GFP+) ^jk管細胞。一A^對動物實施安樂死。將目W出、解剖，并將視網(wǎng)^^平，用^y3描共聚焦i^C成像，或進^^刀片用于成像，(a)來自典型對照(未受傷害的)目艮的拼接圖象，顯示典型的視網(wǎng)膜血管解剖學沒有綠色熒光背景；格自顯示了 GFP+通道(下插圖)和GFP-通道(上插圖)；(b)來自同一動物的經(jīng)處理的眼的拼接圖象，顯示經(jīng)熒it^i己的(GFP+) ^管細l&^t生細胞(血管系統(tǒng)的明亮區(qū)域)摻入缺血的血管系統(tǒng)；也各自顯示了綠色細胞(GFP+^管細胞，下插圖)和未才科己細胞(上插圖)，如實施例5所述。(c)未受損傷的對照的拼接圖象(沒有GFP熒光(亮灰或淺灰))，(d)和(e)是全身注射^管細胞2天后(d)和7天后(e)缺血眼的拼接圖象(GFP+細胞顯示亮灰或淺灰)。(f， x 600，共聚焦)，熒M疫細I^匕學共定位^管細胞(hES-BC)細胞-衍生的內(nèi)皮細l&4在于經(jīng)
歷了 1/R損傷的小鼠限鏡切片的受損傷的血管系統(tǒng)中；相鄰內(nèi)界膜的神經(jīng)節(jié)細M中的血管腔的高倍放大視圖顯示所iiiL管腔被內(nèi)皮細胞(箭頭，CD31)和
衍生自雖管細胞(hES-BC)的成熟內(nèi)皮細胞圍繞(箭標，戲#^、)。上插圖和中插圖各自^來制造合成圖象的A^^f、和CD31通道。下插圖是同一區(qū)域的低M大視圖，其中方才I^示全圖(all panels )描,區(qū)域。V:玻郝；IPL :內(nèi)^M^; RPE ,網(wǎng)膜色素上皮細M; Ch -^^膜。見實施例5。 圖21顯示她管細胞、iU3S細胞或hES-BC細^^Ajt尿病大鼠的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，(a)和(b)顯示向玻絲內(nèi)施用^ii管細胞2^，糖尿病大鼠的融合的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)圖像，顯示威A管細胞大范圍摻入大小血管(明亮區(qū)g淺灰色區(qū)域)；(c)，施用^管細胞2天后，對照大鼠(非糖尿病大鼠)的融合，顯示^管細胞(或^管細^f生細胞)并為摻Ajk管系統(tǒng)而形成位于視網(wǎng)膜頂部的層(淺灰色層)。(d， x100)，向非糖尿病對照大鼠玻璃體內(nèi)注射胚細胞2 ^得到的切片，它對A^^f、染色呈P月性，^內(nèi)皮明顯呈陽性(CD31,箭標)。(e， xl00)和(f， x 600，共聚焦)是向糖尿病大鼠玻麟內(nèi)注射脈管細胞2 A^得到的大鼠眼切片，并用CD31和戲^f、脅進行染色，清楚tt示用CD31和人核^^的染色共定位^f見網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細l^的血管腔中內(nèi)村的細胞中，剛好位于將神經(jīng)視網(wǎng)膜^yj^^中分離的內(nèi)界^tt(箭標表示明亮區(qū)域)。見實施例6。 圖22顯示注射^管細J^^j6i^Mj/L肉和^S心臟中的內(nèi)皮分化。a、 b、 h和i:梗塞心臟中^管細胞或hES-BC細胞的分化。(a (200x )),用人特異性vWF^^免疫染色的對照小鼠的^心肌切片，顯示沒有人vWF著色；(b， 200x)和(i， x 600共聚焦)，注射齡管細胞4周后的用人特異性vWF ^^免疫染色((b)和(i)的淺灰色或明亮區(qū)域)的tt心肌切片；(h)經(jīng)^R手術(shù)(sham operation)、對照培養(yǎng)^p^管細l^t理的小鼠的存活曲線。c-g:在^jfir后^肉中的^管細胞分化，(c， 50x )，用人特異性vWF ^^免疫染色的對照小鼠的后^肉切片，顯示沒有人vWF著色；(d， 50x )和(e， 600x,共聚焦)，注射^管細胞4周后的用人特異性vWF^^免疫染色G缺色)的^ii后自肉切片；(f)通過手術(shù)誘導(dǎo)的g四肢中的血流M。將接受6 x 105個^>管細胞的小鼠和僅僅接受培養(yǎng)基的小鼠結(jié)41^的3-30天連續(xù)監(jiān)^J3iii流。通過^j&^和非缺jfiOi之間的流量比計算血流；(g ),就多普勒血流圖像。對照(培養(yǎng)基)圖^^注射BC細胞的#動物圖像(彰且n = 6)。見實施例7和8。 圖23顯示GFP (最淺或最亮的區(qū)域)和cTnl (中灰)在心皿塞(MI)小鼠的心tt織切片上的免疫染色(放大200x )。見實施例8 。箭標指出衍生自注射的^管細胞(hES-BC)的雙陽性著色細胞。 圖24顯示壯管細胞(hES-BC) ^fb成平滑肌細胞。對分離自^A管細胞(hES-BC)的RM進行PCR測定4f^p, ^jfc管細^^達平滑,異基因。壯管細胞(hES-BC)^M^外^ft成平滑肌細胞。鉀調(diào)理蛋白(calponin)和a-SMA的免疫染色顯示^f匕的細^Jiil兩種平滑肌細^H己物。
發(fā)明的詳細說明為有助于完全S^本發(fā)明，提供以下詳^i兌明。
除非另有定義，;M^斤用的全^I^M^f術(shù)語的含義與本發(fā)明所述領(lǐng)域技^A員通常所理解的一致。盡管可將與^L描述勤以或等同的方法和材料用于本發(fā)明或測^^L明，下面描iiit當?shù)姆椒ê筒牧?。僅將這些材料、方法和實施例用iH兌明，而非意在限制本發(fā)明的范圍。 將本文彬ij的所有出版物、專利、專利^Hf和申請及^f^艦過引用M并A^文'可^i兌明書中it^使用的術(shù)語"包f現(xiàn)醉為包^""定的^t或
^W的意思，但并不排fiH封可^^t或^W。 為了進一步定X^發(fā)明，提供下列術(shù)i沐定義。
^i:使用的術(shù)語"A^胎干細胞"(hES細胞)與本領(lǐng)域使用的一樣。所i^^語包括衍生自A^^il桑椹胚的內(nèi)細胞團的可以作為細胞系連續(xù)傳代的細胞。所述hES細胞可源于卵細胞與精子或DM的受精，核移植，單性生殖，或通過使HLA區(qū)域純合的方法產(chǎn)生hES細胞。人ES細胞也源于合子，卯裂球，或胚泡階段的哺乳動物胚胎，可通蹄子和卵細胞融合，核移植，單性生殖，或染色質(zhì)重編禾l^Jl^將所述重編程的染^t融合到質(zhì)膜而產(chǎn)生細^^產(chǎn)生所i^AES細胞。本發(fā)明的AJ5胎干細胞可以包括^;限于ACT-4、 No. 3、 Hl、H7、 H9、 H14和ACT30胚胎干細胞。 術(shù)語"蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域"("PTD")指可穿過細 進入細胞，或者可協(xié)調(diào)或增加例如有PTD附著的另一個W (例如蛋白結(jié)構(gòu)域)穿過細^Mi^細胞的:i^變的任^r^J^列。所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域可以;1^然存在的大蛋白的一部分(例如病*白(例如HIVTAT)的PTD)的結(jié)構(gòu)^^列，或者是合M 本發(fā)明提供產(chǎn)生和擴增源自A^胎衍生細胞的人血管瘤集落形成細胞的方法，含AA管瘤集落形成細胞的制劑和組合物，產(chǎn)生^iL管瘤集落形成細胞部分或終端分化的多種細胞類型的方法，治療性應(yīng)用血管瘤集落形成細胞的方法，和治療性應(yīng)用^ik管瘤集落形成細胞部分或終端分化的多種細胞類型的方法。術(shù)語"^管細胞"和"血管瘤集落形成細胞"在本申請中可互
M用。這些細胞可以基于多種結(jié)構(gòu)和功能特;^i行潘述，包括^ ;限于，一
種或多種標記物的表達(RM或蛋白)或不M (RNA或蛋白)。血管瘤集落形成細M少能夠分化^t^細M型或內(nèi)皮細M型，血管瘤集落形成細g選有雙重潛能，至少能夠分化^tit細胞類型和內(nèi)皮細胞類型。同樣地，本發(fā)明的血管瘤集落形成細J^少有一種潛能，^i^有雙重潛能。然而itW卜，血管瘤集落形成細胞可具有更大程度的發(fā)育潛力，并在某些實施方案中，可刺匕形成^J^fe傳系的細胞類型。在某些實施方案中，所*管瘤集落形成細胞能夠分
化形^y^中胚^f汙生物，如心臟細胞(例如"肌細胞)和/或平滑肌細胞。 本發(fā)明HU^供擴增從^^j"來源或通it4^頁域已知的^f^r其他方
法獲得的哺乳動物血管瘤集落形成細胞的方法，所述任何來源的哺乳動物血管瘤集落形成細胞包括es細胞，胚泡或卵，，胎盤iu^組織的,血，外周
血，骨髄，或其4ty且織。Ajk管瘤集落形成細J&^可以產(chǎn)生自AJ5胎衍生細胞。
ai5胎衍生細胞可以;I^^上同質(zhì)，的細胞，異質(zhì),細胞，或胚胎組織的
全部或部分。作為可用于本發(fā)明方法的胚胎衍生細胞的例子的AiL管瘤集落形成細胞可以產(chǎn)生自AJ^胎干細胞。這樣的胚胎千細胞包括胚胎干細胞，來源于或利用如無論是否由受精、體細皿移植(SCNT)、單性生殖、，發(fā)育、或其^性或無性方法產(chǎn)生的胚泡，平板培養(yǎng)的ICMs， 一個或多個卵,，或，前移植階段的胚胎維胎樣結(jié)構(gòu)部分。 在某些實施方案中，壯管細艦可^^^t^細胞，包括斜限于血小#紅細胞。這，樣的細l&可用于tr血。能夠產(chǎn)生大量用于輸血的細胞將W^國血庫和醫(yī)院的血液長^t不足。在某些實施方案中，本發(fā)明的方
';^f吏產(chǎn)生用于輸血的通用細胞。M可容易得到o型和Rh-型紅細胞，并可以將
它們作為輸血的通用j6L^Ujt源。 本發(fā)明的方法使體外大量擴增^管細胞,用于M商業(yè)和臨床應(yīng)用。^管細胞的體外擴增指^管細胞的增殖。當本發(fā)明的方法能將A^血管細胞細^T增到商業(yè)Ji^用的數(shù)量時，本發(fā)明也涉及大量的壯管細齡包含大量A^iL管細胞(例如至少10, 000、 100， 000或500， 000個細胞)的細胞制劑，在某些實;^T案中，所述細胞制劑包含至少lxl()6個細胞。在，實施方案中，所述細胞制劑包含至少2xl()6個A^A管細胞，p個實施方案中至少3 x 1()6個A^i6t管細胞。仍在其他的實施方案中，所述細胞制劑包含至少4 x lt)6個AAj6L管細胞。 本發(fā)明涉及包含10， 000到4百萬或更多哺乳動物(例如人)成血管細胞的溶液，制劑，以及組合物，在所iii^液、制劑和組^的中的^管細胞數(shù)目可以是10， 000到4百萬，或以上中的任意值'所述數(shù)目可以是，例如20,000、 50, 000、 100， 000、 500, 000、 1百萬等等。
類卄:^,本發(fā)明涉;s^A管細i^代細胞(例如Aitii細胞，
包括Aitir干細齡內(nèi)皮細胞)的制劑。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生、l&存和射己^ii
管細#/或#管細胞潛系細胞的方法。 本發(fā)明HtR供適于給人或動物患者輸血的方法和M。在特定實 施方案中，本發(fā)明提辦'J備紅細齡/或血小板，和/或雞用于輸血的itii細 胞類型的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明適用于向血庫和醫(yī)院提供用于在夕卜 傷或^斜目關(guān)疾病和病癥的治療中輸血的血液。在某些實施方案中，本發(fā)明 提供通用供血細敝細胞。在某些實施方案中，所iiix細lt^輸j6^L賄功能， 錄iiioL紅蛋白F。 本發(fā)明也提供Ajfe管瘤集落形成細胞，含^^^上純化的Aj6l管瘤 集落形成細胞群的細l^養(yǎng)物，含AiL管瘤集落形成細胞的藥物制劑和所a 管瘤集落形成細胞的冷藏制劑。在某些實施方案中，本發(fā)明提供所iiAJi管瘤 集落形成細胞在制備用于治療有此需要的患者病況的藥物中的用途。jtb^卜，本 發(fā)明也提供所述細1^##在制備用于治療有此需要的患者病況的藥物中的用 途。本發(fā)明也提供所述藥物制劑在制備用于治療有此需要的患者病況的藥物中 的用途。 可以才娥所逸血管瘤集落形成細胞的結(jié)構(gòu)特性對其進行識別和 表征。在某些實施方案中，這些細^M^是獨特的，因為它們相互之間衫^^占 連(與其他的血管瘤集落形成細^^f^占連)。因為這些細^5L似目x^碌粘連， 可以只利用WW離才i^ (而無需酶)S^支術(shù))即可將血管瘤集落形成細胞的培 養(yǎng)物或集落解離成單細胞。這些細船目互粘i^夠松歉，僅僅只需要才/l^解離 (而非酶解或者^^酶解結(jié)合)狄以將培絲或集落解聚，^^上iU員于 細胞活力。換句^h兌，相比用酶解細胞團始，Ji^到的實質(zhì)損傷和死亡，才械 解離不需要可導(dǎo)致細胞實質(zhì)損傷和死亡的力度。 w卜，可以通過4或多種椒彌的4^不狄(在基因或蛋 白水平上估計)識別或^k管瘤集落形成細胞。例如在某些實施方案中，可
以才Nt^種或多種下列細胞表面標己物的不^Ji (例如可以才Mt至少一種，至
少兩種，至少三種或四種下列才斜e^不^Jii^iE/斤述細胞)來識別或^EiL
管瘤集落形成細胞cd34、 kdr、 cd133或cd31。 jH^卜，也可以推據(jù)gata2和/或lm02的表iiiM尸^或^^管瘤集落形成細胞。jH^卜，也可以通過一種或多
種才射彌(分析于表2)的^iil不^M只別或a (在基因或蛋白水平上估
計)血管瘤集落形成細胞。 可以才娘這些結(jié)構(gòu)或功能特點中的一點或任意組合識別或4^ 本發(fā)明的血管瘤集落形成細胞。需知，雖然這些細胞可以有任意種來源，例如 胚胎組織、產(chǎn)前組織、圍產(chǎn)期組織，所i^M吾"血管瘤集落形成細胞"適用于至 少能夠分化形^t^細戯型和/或內(nèi)皮細胞類型，并且具有一種或多賄ii^ 構(gòu)或功能特點的無^f夯阿的來源的細胞。
體外分^^胎干細胞以獲得胚狀#壯管細胞 本發(fā)明提供產(chǎn)生和擴增衍生自AJI、月纖細胞，或A^^4卵， 的A^jk管細胞的方法?？杉?沐/或分離如此產(chǎn)生的所ii^jk管細胞。 AjfiL管瘤集落形成細l&ai可以產(chǎn)生自人胚胎衍生細胞。AB月斷 生細胞可以3Jj^上同質(zhì)，的細胞，異質(zhì)，細胞，或胚胎組織的4^P或部 分。作為可用于本發(fā)明方法的胚胎衍生細胞的例子的人血管瘤集落形成細胞可 以產(chǎn)生自A^J^f細胞。這樣的胚胎干細胞包括衍生自或利用無論是否由受精、 體細皿移植(SCNT)、單性生殖、，發(fā)育、或^f^性或無性方法產(chǎn)生的如 胚泡，培養(yǎng)ICMs， 一個或多個卵縣，或絲前移植階段的胚胎絲胎樣結(jié)構(gòu) 部分的胚胎干細胞。 jth^卜，血管瘤集落形成細^￡可以產(chǎn)生自其^^月^f生細胞。例 如，血管瘤集落形成細胞可以產(chǎn)生自(無需經(jīng)歷胚胎干細l^f化步驟)或利用 無論是否由受精、體細自移植(SCNT)、單性生殖、,發(fā)育、或^r性或 無性方法產(chǎn)生的平板培養(yǎng)的胚胎，ICMs，胚泡，滋養(yǎng)層/滋養(yǎng)外胚層細胞， 一個 或多個印,，滋養(yǎng)層干細胞，胚胎生殖細胞，或移植前階段的胚胎或胚胎樣 結(jié)構(gòu)的^^部分。血管瘤集落形成細^￡可以類似利用部分^^自胚胎衍生細 胞的細M細胞系產(chǎn)生。例4咖果將A^胎干細胞系用于產(chǎn)生tbj6L管瘤集落形 成細胞處于更早發(fā)育階段的的細胞，^L^^f力和可塑性，則可將這才羊的胚 ^f生細自于產(chǎn)^iL管瘤集落形成細胞。 jtUt，血管瘤集落形成細lfe^可產(chǎn)生自M產(chǎn)前或出生前后來 源，包括^ET、限于靜、麟血、羊7jC、羊膜干細^P胎盤。注意，當血管瘤集落形成細胞產(chǎn)生自A^胎la^只時，可能需要形i^狀體的步驟，然而，假i^狀體的形成至少部分有助于重演發(fā)育早期胚層 的三維空間相互作用，當胚胎衍生細胞已經(jīng)具有實現(xiàn)與胚狀體形成步驟實質(zhì)上 相同目的的結(jié)構(gòu)或組織時，這一步驟不是必需的。#^']來說，當血管瘤集落形 成細胞產(chǎn)生自平板培養(yǎng)的胚泡時，所述胚泡的細胞中間已經(jīng)存在三維空間組織
7K平。同樣地，無需胚狀體形成步驟4ta供細胞間的信號，誘導(dǎo)的線索，或三
維結(jié)構(gòu)。 可將本發(fā)明的方法和用途用于產(chǎn)生源于胚胎衍生細胞的血管瘤 集落形成細胞。在某些實施方案中，所ii^胎衍生細^l^胎干細胞。在某些 其他實施方案中，所艦胎衍生細l^i平板培養(yǎng)的胚胎，ICMs,胚泡，滋養(yǎng)層/ 滋養(yǎng)外胚層細胞， 一個或多個卵^，滋養(yǎng)層干細胞，或早期移^l前胚胎的其 他部分。對于^^T前述事項，所ii^胎衍生細胞可以來自由受精，體細艦移 植(SCNT),單性生殖，^N^發(fā)育，或^^'賦無性方i^生的胚胎， 在本申請中，當描述M涉;S^M5胎干細胞產(chǎn)生血管瘤集落形成 細胞的方法時，本發(fā)明類似預(yù)期產(chǎn)生來自或^JD^胚胎細胞的血管瘤集落形
成細胞，，以及利用產(chǎn)生的細胞實施^fsr相同的治療用途。 在>^發(fā)明的某些方面，所i^A^胎干細胞可以是本方法的勤臺材 料。可以用本領(lǐng)域已知的任何方法培養(yǎng)所ii^胎干細胞，例如^無飼養(yǎng)細胞 的情況下。 胚胎干細胞可以在含血'絲養(yǎng)基中形成懸浮的胚狀體("EB ") (Wang等，2005 JExpMed(201 ): 1603-1614; Wang等,2004 Immunity (21): 31-41; Chadwick等，2003 Blood (102 ): 906-915 )。然而血清的加入引入一些 挑戰(zhàn)，包括實^l可變性，絲，潛在感染物和有限的供應(yīng)，進一步，對于臨 ^某些商業(yè)應(yīng)用，血清的使用需要額外遵照美國iiU^國際社會的關(guān)于生物 制品的M。 本發(fā)明提供不使用血清從胚胎干細胞產(chǎn)生和擴增A^jk管細胞 的方法。相對于需要血清的條件，所U血清糾更有助于在好的生產(chǎn)工藝 (gmp)指導(dǎo)下進行M^^生產(chǎn)。jH^卜，itir清M延^aAJ，J培養(yǎng)基的某些因 子的半衰期(例如; tjk清培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)(^^生長因子、細胞因子和H0XB4) 的半衰，加).在某些實施方案中，在本發(fā)明的所有方法中佳月iLir清培養(yǎng)基
產(chǎn)生和擴增A^ifiL管細胞，
產(chǎn)生和擴增A^ir管細胞的方法的第一步中，^^A干細I^Utjk 清培養(yǎng)基中生長，并將其誘導(dǎo)分化雖狀體。為了誘導(dǎo)胚狀體形成，可將胚胎 干細l&^定并重懸浮在; Lir^養(yǎng)基(例如，在Stemline I或II培養(yǎng)基(Sigma
)，培養(yǎng)基中補^T一種或多種形態(tài)因子和細胞因子，然后平板接種于附著性 差(例如附著'f:i^差)的培^m上。形態(tài)因子和細胞因子可以包括但不P艮于， 骨形態(tài)生成蛋白(例如證2、 BMP-4、證-7，但非BMP-3)和VEGF、 SCF和FL。 可將骨形態(tài)生成蛋白和VEGF單獨使用，或與其他因子聯(lián)^f吏用?？稍诩?養(yǎng) 的0-48小時內(nèi)將形態(tài)因子和細胞因子加AJij培養(yǎng)基。于這些##下^#在早 ^t)fe擴增細胞因子(包括但不限于促血小M成素(TP0 )、 Fl t-3酉沐和干細 胞因子(SCF))的情況下進^^顯育，^^斤述平板培養(yǎng)的ES細胞形成EB。除TP0、 Flt-3酉C/^SCF夕卜，還可將VEGF、 BMP-4和HoxB4加AJ'J培養(yǎng)基。在一個實施 方案中，使人ES細胞首^BMP-4和VEGF恥(例如25 - 100 ng / ml)存在的 條件下生長，然后在BMP-4、 VEGF16S、 SCF、 TP0和FLT3酉沐(例如10-50ng / ml)和HoxB4 (例:ft口 1.5 — 5 y g / ml的^^Z/Hf"的三重蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)^rHoxB4 融合蛋白)存在的條件下生長?？梢栽谄桨錨t后48 - 72小時時加A^斤述額外 因子。 在本發(fā)明的方法中，A^A管細胞分離自早期胚狀體("EB，，)。 從早期EB分離^管細胞支持這些細胞的體外擴增。對于人細胞，可以M長 短于10天的EB中獲得^管細胞。^^發(fā)明的某些實施方案中，^管細胞 細胞出itt生長2 — 6天的人EB中。#4^個實施方案，可M長4 — 6天的人 EB中鑒定和分離威^ik管細胞。在其他的實施方案中，使人EB生長2 - 5天，然 后分離^管細胞。在某些實施方案中，使人EB生長3-4.5天，然后分離成 血管細胞。 在某些實施方案中，，艦并解離早期BB (例如，^^J胰蛋白酶 /EDTA或M^酶B).將i^t數(shù)量的細胞(例如2-5 x 105個細胞)隨后與伏化 ^tfAiL管細胞生長的itife清甲Jif維素培養(yǎng)基(例如BL~CFU培養(yǎng)基，i什 細I&^M^目錄H4436，或^管細胞細旨增培養(yǎng)基(HGM)，或含1. 0W甲^f 維素于畫，1-2%牛血清白蛋白，0. lmM2-絲乙醇，10 ng/ml rh-胰島素， 200 jug / ml ^fe^4sU4H失蛋白，20 ng / ml rh~GM~CSF， 20 ng / ml rh—IL一3， 20 ng / ml rh-IL-6， 20 ng / ml rh-G"CSF (" rh M緣"重組的人 ")的任何培養(yǎng)基)混合?？上蛩?養(yǎng)基補^"f期細胞因子(包括^T、限于，EPO、 TP0、 SCF、 FL、 FU-3、 VEGF、證(例如BMP2、 BMP4和BMP7， ^是BMP3))和H0XB4 (或另一個同源異型盒蛋白)。在某些實施方案中，4W]:細I^成素(EP0) 加AJiJ培養(yǎng)基。再一個實施方案中，將EPO、 SCF、 VEGF、 BMP-4和HoxB4加入 到培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，使所述細胞在EPO、 TPO和FL存在的條件下 生長。在某些H9;I^會人ES細胞系的實施方案中，將EPO、 TPO和FL加AJ'J 培養(yǎng)基。除EPO、 TPO和FL外，源于H9或其他ES細胞的細I^養(yǎng)JJ^可包含 VEGF、 BMP-4和HoxB4。 ^iii^斤i^r法獲得的細胞(細胞可能在BL-CFU培養(yǎng)基中)(包 括壯管細胞)平板接種于附著'|±^1的培#^上，并在C02恒溫箱中溫育直到 長出^管細胞集落。 一些細胞可能形成次級EB。大約3 - 6天(JL^一些情況 下是3 - 4. 5天)后M^到齡管細胞集落?？刹哦鸲枪芗毎痎#殊的葡萄 狀形態(tài)和/或小尺寸將其與，細胞如(如次級EB)區(qū)M。另夕卜，可通it^些 才射彌的表達(例如，早^itir細l^內(nèi)皮細J^科沐的表達)，以M少能分 化^jk細l^內(nèi)皮細胞的能力(見下文，衍生 >管細胞語系細胞)鑒定 ^管細胞。例如當^管細胞缺^熟內(nèi)皮細I^Utii細胞的某些特征時， 可通過某些才科己物的存在(例如CD71+)和^f^射己物的不存在(例如CD34-) 鑒定這些細胞。成血管細^^可表達GATA-l和GATA-2蛋白，CXCR-4和TP0和 EP0受體。另外，^管細胞可通過^f射己物(例如CD31、 CD34、 KDR或， 粘附襯)不表絲^4iiW^。而且，肚管細胞的可通過某些基因(例 如與^管細^P早期成^uk細l&^育相關(guān)的基因(如SCL、 LM02、 FLT-1、胚 胎胎^l^蛋白基因、NF-E2、 GATA-1、 EKLF、 ICAM-4、血型糖蛋白(glycophoriuns ) 和EP0受體)的^iiii行抓 因此，^ik管細胞可按大小分離(小于絲細胞)或用抗CD71十 脅亂例M狄疫親合絲析。j^jk管細胞細胞可以按大小和/或形態(tài)分離，過程如下。生長6 到7 ^，細胞^^包含EB (圓形JL1多細胞團)盒脈管細胞(葡萄狀， 小于EB， Jbi單細胞)。因此，齡管細胞可才娥它們的形態(tài)和大小進行分離。 ^管細胞可以AX^選，例如當在顯微鏡下XJ^細胞&^物的時候。所述細 M著可以生"MJ:落，每個集落具有100- 150個細胞。
可^it如上所述衍生的A^管細胞集落，并重平板糾于甲基 纖維素CFU培養(yǎng)"，以形^tikCFU。在某些實施方案中，CFU培養(yǎng)基包括 StemCell Technologies H4436。 #—個實施方案中，將脈管細胞平板糾于 補絲細胞因子及，因子的Stemline II培養(yǎng)JJi。例如可以AX杏lsit單個 BL-CFC集落，并將###到平板^#有纖^^^白的含Stemline II和重組 人SCF (例如20 ng / ml )、 TP0 (例如20ng/ml )、 FL (例如20 ng / ml )、 IL-3 (例如20 ng / ml )、 VEGF (例如20 ng / ml )、 G"CSF (例如20 ng / ml )、 酵-4 (例如15 ng / ml )、 IL-6 (例如10 ng / ml )、 IGF-1 (例如10 ng / ml )、 內(nèi)皮細l^t長補充因子(ECGS，例如lOOMg / ml )、 Epo (例如3 U / ml)的 培^m上。體外生長一周后，可通近顯和移液移走非粘連的itjk細胞，并直接 用于itiiCFU"^。移去非粘附細l^，可使粘附的細lfe^在EGM-2內(nèi)皮細胞 培養(yǎng)基(Cambrex )中再生長一周，然后檢驗vWF的表達。 iliL管細胞的體外擴增 本發(fā)明的某些方面涉^>管細胞的體外擴增。在某些實施^ 中，如上所述，通過本發(fā)明方法擴增的^管細胞獲自源于人胚胎干細胞的早 期胚狀體。 除了來自A^、胎干細胞(hES細胞)的衍生觸管細胞以外，待 擴增的^管細l&^可以分離自，哺乳動物來源，例Vf乳動物胚胎(Ogawa 等，2001 lnt Rev Immunol (20): 21-44，美國專利^^f號2004 / 0052771 )， 胎盤和靜組織的靜血(Pelosi等，2002 Blood (100): 3203-3208; Cogle 等，2004 Blood(103): 133-5 )，外周血和骨髓(Pelosi等，2002 Hematopoiesis (100): 3203-3208 )。在某些實施方案中，待擴增的非A^jk管細胞可產(chǎn)生自 非人(例如小鼠和非人靈長類)胚胎干細胞。在某些實施方案中，可通過例如 磁珠陽性篩i4i^/^支術(shù)(例如MACS柱)等方法Wf血(UCB)或骨髓獲得 ^jfc管細胞。細胞可基于它們的CD71+進行篩選，線過CD34-進行確認。而且 還可以測試分離的^管細胞產(chǎn)^itiL細^內(nèi)皮細胞i普系的潛力。在某些實
施方案中，分離或純4^L絲富集自胚胎、脈帶血、夕卜周血、骨賦^i且織 的肚管細艦的^1^過95%。 骨髄衍生細胞可獲自^個沐的任何發(fā)育階敬，包括出生以前的 (例如胚胎或胎兒)、嬰兒(例如人類從出生到大約三歲)，兒童(例如人類從大約三歲到大約13歲)，青少年(例如人類從大約13歲到大約18歲)，青年(例 如人類從大約18歲到大約35歲)，(人類從大約35歲到大約55歲)或老 年(例如人類從大約55歲及以上)。 例如，人骨髓可刮自手術(shù)中的患者的分裂的胸骨。然后將骨髄保 存在0.1到1咖3體積的組織塊中，并隨即使其在小鼠胚胎滋養(yǎng)層(例如經(jīng)絲裂 霉素C處賦照射過的滋養(yǎng)層)上生長。骨髄細JW附著在培^jni上，經(jīng)過1 -2周的培養(yǎng)，可#^態(tài)特#/或細1^彌鑒定及分離#管細胞(參見 美國專利
發(fā)明者R·蘭扎, 盧世江 申請人:先進細胞技術(shù)公司