基于復(fù)合納米材料生物芯片的制備方法及這種生物芯片的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種基于復(fù)合納米材料生物芯片的制備方法及這種生物芯片的應(yīng)用，涉及生物芯片的制備及應(yīng)用，該方法包括將復(fù)合型納米材料進(jìn)行油相-水相之間的轉(zhuǎn)換；將金膜用活化液進(jìn)行處理，利用其強(qiáng)氧化性去除金膜表面的有機(jī)物；將修飾有巰基的復(fù)合型納米材料通入到金膜表面進(jìn)行組裝；將得到的金膜依次浸漬在磷酸鹽緩沖液超純水、巰基乙醇對(duì)其進(jìn)行固定；將得到的金膜通入帶有氨基的蛋白質(zhì)或者DNA作為生物探針，制成生物芯片。本發(fā)明提供的方法易于在基底上進(jìn)行多種蛋白質(zhì)和DNA組裝，可用作生物芯片，并可進(jìn)行高靈敏度的生物檢測(cè)。
【專利說明】基于復(fù)合納米材料生物芯片的制備方法及這種生物芯片的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料制造【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及生物芯片的制備及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物芯片(biochip或bioarray)是根據(jù)生物分子間特異相互作用的原理,將生化分析過程集成于芯片表面,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)以及其他生物成分的高通量快速檢測(cè)。狹義的生物芯片概念是指通過不同方法將生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomicDNA、多肽、抗體、抗原等)固著于玻璃片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的生物分子點(diǎn)陣。因此生物芯片技術(shù)又稱微陳列(miCToarray)技術(shù)，含有大量生物信息的固相基質(zhì)稱為微陣列，又稱生物芯片。
[0003]納米顆粒是指尺寸在I~100 nm之間的粒子，它是由數(shù)目極少的原子或分子組成的原子群或分子群，介于宏觀物質(zhì)和微觀原子與分子中間的領(lǐng)域，是一種典型的介觀系統(tǒng)。其特殊的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它具有許多獨(dú)特的性質(zhì)，如表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等。
[0004]現(xiàn)在的生物芯片大多都是在以硅或玻璃為基底的情況鍍上一層金納米薄膜后直接對(duì)整體進(jìn)行蛋白質(zhì)或者DNA的組裝，這種做法雖然可以節(jié)省生物芯片的制作時(shí)間，但是由于在制作過程中對(duì)金納 米薄膜沒有進(jìn)行任何官能團(tuán)的修飾，從而會(huì)導(dǎo)致制作出的生物芯片蛋白質(zhì)或者DNA的附著率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于復(fù)合納米材料生物芯片的制備方法。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開這種生物芯片在醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的應(yīng)用。
[0007]—、本發(fā)明提供的一種基于復(fù)合型納米顆粒生物芯片，首先制備出生物芯片所需要的復(fù)合型納米顆粒，該方法為首先利用油相合成法制備出Au-Cu2S作為內(nèi)核，外殼為ZnS。然后應(yīng)用巰基聚乙二醇對(duì)所得到的復(fù)合型納米材料進(jìn)行油-水相之間的轉(zhuǎn)換，并且使材料表面攜帶巰基然后通入到附著有金膜的玻璃基底上進(jìn)行組裝，最后應(yīng)用巰基乙醇進(jìn)行固定和量子點(diǎn)的表面活化以備后續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)和DNA的組裝。
[0008]在本發(fā)明中我們選擇一種新型的復(fù)合型納米材料Au_Cu2S/ZnS作為載體來制作我們的生物芯片探針。其原因在于相對(duì)于單一的Cu2S量子點(diǎn)而言納米Au更易于與各種官能團(tuán)結(jié)合，而Cu2S的穩(wěn)定性又強(qiáng)于納米Au，這樣在保證了穩(wěn)定性的同時(shí)我們更增強(qiáng)了復(fù)合型納米材料整體的生物兼容性，而后我們又在Au-Cu2S表面修飾ZnS以此來降低復(fù)合型納米材料的生物毒性。再對(duì)其進(jìn)行油-水相的轉(zhuǎn)換之后使其攜帶上易于生物兼容的巰基，從而使生物芯片可以更容易的與蛋白質(zhì)或者DNA進(jìn)行組裝。
[0009]本發(fā)明提供的一種基于復(fù)合型納米顆粒生物芯片的制作方法如下:
(I)首先制備出制作生物芯片所需要的復(fù)合型納米材料，該方法利用油相合成法制備出Au-Cu2S作為內(nèi)核，內(nèi)核直徑為10±0.6nm，外殼為ZnS，殼層厚度為2±0.6nm，然后將3(T50mg的巰基聚乙二醇溶于3~5ml的氯仿當(dāng)中攪拌3飛分鐘，并將制得的復(fù)合型納米顆粒與氯仿和巰基聚乙二醇的混合溶液按摩爾比為1:1的比例混合攪拌: 8分鐘，最后將溶液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中出去氯仿得到水相的復(fù)合型納米材料，此時(shí)的納米材料表面已修飾上巰基;
(2)用濃硫酸和雙氧水按照體積比為3:1的比例配制出活化液，并將活化液以50-150ul/s的速度勻速通過40-80nm厚的金納米薄膜表面8~15分鐘，利用活化液的強(qiáng)氧化性除去金膜表面的有機(jī)物以及其它雜質(zhì)并且擴(kuò)大其表面張力以及減小靜電力，然后用超純水進(jìn)行沖洗，通入氮?dú)膺M(jìn)行干燥處理；
(3)將修飾有巰基的復(fù)合型納米材料同樣以50-150ul/s的速度勻速通過金膜，在常溫下進(jìn)行為時(shí)21小時(shí)的循環(huán)流動(dòng)，由于步驟(2)中已經(jīng)擴(kuò)大了金膜的表面張力，使得帶有巰基的復(fù)合型納米材料更容易附著于金膜表面進(jìn)行組裝，將復(fù)合型納米材料固定于金膜表面，最后通入PH為7的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗10-15分鐘然后再用超純水進(jìn)行清洗；
(4)最后用濃度為lmmol/L的巰基乙醇溶液對(duì)帶有復(fù)合型納米材料的金膜以50-150ul/s的速度進(jìn)行循環(huán)流動(dòng)，使復(fù)合型納米材料固定于金膜表面，然后用超純水進(jìn)行清洗以洗掉生物芯片表面所殘留的巰基乙醇溶液； (5)將帶有氨基的蛋白質(zhì)或者DNA在常溫下勻速通過金膜表面2~4小時(shí)，進(jìn)行生物芯片最后的組裝，然后用超純水進(jìn)行清洗，制得生物芯片。
[0010]其中，步驟2、3和4中流過金膜表面的最佳流速為100ul/S。
[0011]金納米薄膜的最佳厚度為50nm。
[0012]三、本發(fā)明的基于復(fù)合型納米材料生物芯片的應(yīng)用:本發(fā)明的基于復(fù)合型納米顆粒生物芯片可應(yīng)用于基因分辨及腫瘤診斷
(I)本發(fā)明的基于復(fù)合型納米顆粒生物芯片用于基因分辨的用法如下:由于復(fù)合型納米顆粒的強(qiáng)兼容性，應(yīng)用化學(xué)修飾的方法，將需要進(jìn)行分辨的基因所對(duì)應(yīng)的RNA首先用氨基進(jìn)行修飾，然后將基因溶液通入復(fù)合型納米材料表面進(jìn)行組裝，最后將需要進(jìn)行分辨的基因雜交液通入生物芯片，2小時(shí)后用不同濃度的PBS溶液進(jìn)行沖洗。通過比色法或電化學(xué)法對(duì)生物芯片進(jìn)行檢測(cè)，得出待測(cè)樣品是否帶有需要的基因。
[0013]2)本發(fā)明的基于復(fù)合型納米顆粒生物芯片用于腫瘤診斷用法如下:應(yīng)用化學(xué)修飾的方法，將腫瘤細(xì)胞所攜帶的特有的DNA首先用氨基進(jìn)行修飾，然后基因溶液通入復(fù)合型納米材料表面進(jìn)行組裝，最后將需要進(jìn)行診斷的腫瘤細(xì)胞溶液通入生物芯片進(jìn)行雜交2小時(shí)后用不同濃度的PBS溶液進(jìn)行沖洗，再通過比色法和電化學(xué)法對(duì)生物芯片進(jìn)行檢測(cè)，得出待測(cè)樣品是否患有該種腫瘤病癥。
[0014]本發(fā)明生物芯片技術(shù)為基礎(chǔ)，以復(fù)合型納米材料作為生物探針，應(yīng)用于生物芯片技術(shù)上。本發(fā)明所選用的復(fù)合型納米材料Au-Cu2S/ZnS為一種低毒性納米材料。本發(fā)明所制得的生物芯片尺寸較小，便于攜帶。
[0015]本發(fā)明由于在復(fù)合型納米材料固定于金膜表面后應(yīng)用巰基乙醇進(jìn)行兩者間的固定，同時(shí)也利用巰基乙醇使量子點(diǎn)表面得到一定活化，更易于與帶有氨基的蛋白質(zhì)或者DNA進(jìn)行結(jié)合。
[0016]本發(fā)明結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)巧妙，簡(jiǎn)單適用。本發(fā)明可應(yīng)用于生物、化學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的物質(zhì)檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為油-水相轉(zhuǎn)化之后的復(fù)合型納米材料；
圖2為附著了復(fù)合型納米材料后的金膜；
圖3為所制出的附著有復(fù)合型納米材料的生物芯片。
[0018]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1
(I)首先制備出制作生物芯片所需要的復(fù)合型納米材料，該方法利用油相合成法制備出Au-Cu2S作為內(nèi)核，內(nèi)核直徑為10nm，外殼為ZnS，殼層厚度為2nm，然后將40mg的巰基聚乙二醇溶于4ml的氯仿當(dāng)中攪拌4分鐘，并將制得的復(fù)合型納米顆粒與氯仿和巰基聚乙二醇的混合溶液按摩爾比為1:1的比例混合攪拌5分鐘，最后將溶液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中出去氯仿得到水相的復(fù)合型納米材料，此時(shí)的納米材料表面已修飾上巰基。
[0019](2)用濃硫酸和雙氧水按照體積比為3:1的比例配制出活化液，并將活化液以lOOul/s的速度勻速通過50nm厚的金納米薄膜表面10分鐘，利用活化液的強(qiáng)氧化性除去金膜表面的有機(jī)物以及其它雜質(zhì)并且擴(kuò)大其表面張力以及減小靜電力，然后用超純水進(jìn)行沖洗，通入氮?dú)膺M(jìn)行干燥處理。
[0020](3)將修飾有巰 基的復(fù)合型納米材料同樣以lOOul/s的速度勻速通過金膜，在常溫下進(jìn)行為時(shí)3小時(shí)的循環(huán)流動(dòng)，由于步驟(2)中已經(jīng)擴(kuò)大了金膜的表面張力，使得帶有巰基的復(fù)合型納米材料更容易附著于金膜表面進(jìn)行組裝，將復(fù)合型納米材料固定于金膜表面。最后通入PH為7的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗12分鐘然后再用超純水進(jìn)行清洗。
[0021](4)最后用濃度為lmmol/L的巰基乙醇溶液對(duì)帶有復(fù)合型納米材料的金膜以lOOul/s的速度進(jìn)行循環(huán)流動(dòng)，使復(fù)合型納米材料固定于金膜表面，然后用超純水進(jìn)行清洗以洗掉生物芯片表面所殘留的巰基乙醇溶液。
[0022](5)將帶有氨基的蛋白質(zhì)或者DNA在常溫下勻速通過金膜表面3小時(shí)，進(jìn)行生物芯片最后的組裝，然后用超純水進(jìn)行清洗，制得生物芯片。
[0023]實(shí)施例2
(1)首先制備出制作生物芯片所需要的復(fù)合型納米材料，該方法利用油相合成法制備出Au-Cu2S作為內(nèi)核，內(nèi)核直徑為10.6nm，外殼為ZnS，殼層厚度為1.6nm，然后將30mg的巰基聚乙二醇溶于5ml的氯仿當(dāng)中攪拌5分鐘，并將制得的復(fù)合型納米顆粒與氯仿和巰基聚乙二醇的混合溶液按摩爾比為1:1的比例混合攪拌3分鐘，最后將溶液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中出去氯仿得到水相的復(fù)合型納米材料，此時(shí)的納米材料表面已修飾上巰基；
(2)用濃硫酸和雙氧水按照體積比為3:1的比例配制出活化液，并將活化液以50ul/s的速度勻速通過40nm厚的金納米薄膜表面8分鐘，利用活化液的強(qiáng)氧化性除去金膜表面的有機(jī)物以及其它雜質(zhì)并且擴(kuò)大其表面張力以及減小靜電力，然后用超純水進(jìn)行沖洗，通入氮?dú)膺M(jìn)行干燥處理；
(3)將修飾有巰基的復(fù)合型納米材料同樣以50ul/s的速度勻速通過金膜，在常溫下進(jìn)行為時(shí)2小時(shí)的循環(huán)流動(dòng)，由于步驟(2)中已經(jīng)擴(kuò)大了金膜的表面張力，使得帶有巰基的復(fù)合型納米材料更容易附著于金膜表面進(jìn)行組裝，將復(fù)合型納米材料固定于金膜表面。最后通入PH為7的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗15分鐘然后再用超純水進(jìn)行清洗；
(4)最后用濃度為lmmol/L的巰基乙醇溶液對(duì)帶有復(fù)合型納米材料的金膜以50ul/s的速度進(jìn)行循環(huán)流動(dòng)，使復(fù)合型納米材料固定于金膜表面，然后用超純水進(jìn)行清洗以洗掉生物芯片表面所殘留的巰基乙醇溶液。
[0024](5)將帶有氨基的蛋白質(zhì)或者DNA在常溫下勻速通過金膜表面2小時(shí)，進(jìn)行生物芯片最后的組裝，然后用超純水進(jìn)行清洗，制得生物芯片。
[0025]實(shí)施例3
(1)首先制備出制作生物芯片所需要的復(fù)合型納米材料，該方法利用油相合成法制備出Au-Cu2S作為內(nèi)核，內(nèi)核直徑為9.4nm，外殼為ZnS，殼層厚度為1.6nm，然后將50mg的巰基聚乙二醇溶于3ml的氯仿當(dāng)中攪拌3分鐘，并將制得的復(fù)合型納米顆粒與氯仿和巰基聚乙二醇的混合溶液按摩爾比為1:1的比例混合攪拌8分鐘，最后將溶液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中出去氯仿得到水相的復(fù)合型納米材料，此時(shí)的納米材料表面已修飾上巰基；
(2)用濃硫酸和雙氧水按照體積比為3:1的比例配制出活化液，并將活化液以150ul/s的速度勻速通過50nm厚的金納米薄膜表面15分鐘，利用活化液的強(qiáng)氧化性除去金膜表面的有機(jī)物以及其它雜質(zhì)并且擴(kuò)大其表面張力以及減小靜電力，然后用超純水進(jìn)行沖洗，通入氮?dú)膺M(jìn)行干燥處理；
(3)將修飾有巰基的復(fù)合型納米材料同樣以150ul/s的速度勻速通過金膜，在常溫下進(jìn)行為時(shí)4小時(shí)的循環(huán)流動(dòng)，由于步驟(2)中已經(jīng)擴(kuò)大了金膜的表面張力，使得帶有巰基的復(fù)合型納米材料更容易附著于金膜表面進(jìn)行組裝，將復(fù)合型納米材料固定于金膜表面。最后通入PH為7的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗8分鐘然后再用超純水進(jìn)行清洗；
(4)最后用濃度為lmmol/L的巰基乙醇溶液對(duì)帶有復(fù)合型納米材料的金膜以150ul/s的速度進(jìn)行循環(huán)流動(dòng)，使復(fù)合型納米材料固定于金膜表面，然后用超純水進(jìn)行清洗以洗掉生物芯片表面所殘留的巰基乙醇溶液。
[0026](5)將帶有氨基的蛋白質(zhì)或者DNA在常溫下勻速通過金膜表面4小時(shí)，進(jìn)行生物芯片最后的組裝，然后用超純水進(jìn)行清洗，制得生物芯片。
[0027]基于復(fù)合型納米顆粒生物芯片用于基因分辨的用法:
由于復(fù)合型納米顆粒的強(qiáng)兼容性，應(yīng)用化學(xué)修飾的方法，將需要進(jìn)行分辨的基因所對(duì)應(yīng)的RNA首先用氨基進(jìn)行修飾，然后將基因溶液通入復(fù)合型納米材料表面進(jìn)行組裝，最后將需要進(jìn)行分辨的基因雜交液通入生物芯片，3小時(shí)后用PH值為7的PBS溶液進(jìn)行沖洗。通過比色法或電化學(xué)法對(duì)生物芯片進(jìn)行檢測(cè)，得出待測(cè)樣品是否帶有需要的基因。
[0028]基于復(fù)合型納米顆粒生物芯片用于腫瘤診斷用法:
應(yīng)用化學(xué)修飾的方法，將腫瘤細(xì)胞所攜帶的特有的DNA首先用氨基進(jìn)行修飾，然后基因溶液通入復(fù)合型納米材料表面進(jìn)行組裝，最后將需要進(jìn)行診斷的腫瘤細(xì)胞溶液通入生物芯片進(jìn)行雜交4小時(shí)后用PH值為7的PBS溶液進(jìn)行沖洗，再通過比色法和電化學(xué)法對(duì)生物芯片進(jìn)行檢測(cè)，得出待測(cè)樣品是否患有該種腫瘤病癥。
【權(quán)利要求】
1.一種于復(fù)合納米材料生物芯片的制備方法，其特征在于由以下步驟完成: (1)利用油相合成法制備出Au-Cu2S作為內(nèi)核，內(nèi)核直徑為10±0.6nm，外殼為ZnS，殼層厚度為2±0.6nm,然后將3(T50mg的巰基聚乙二醇溶于3~5ml的氯仿當(dāng)中攪拌3、分鐘，并將制得的復(fù)合型納米顆粒與氯仿和巰基聚乙二醇的混合溶液按摩爾比為1:1的比例混合攪拌31分鐘，將溶液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中出去氯仿得到水相的復(fù)合型納米材料； (2)用濃硫酸和雙氧水按照體積比為3:1的比例配制出活化液，并將活化液以50-150ul/s的速度勻速通過40-80nm厚的金納米薄膜表面8~15分鐘，然后用超純水進(jìn)行沖洗，通入氮?dú)膺M(jìn)行干燥處理； (3)將修飾有巰基的復(fù)合型納米材料同樣以50-150ul/s的速度勻速通過金納米薄膜，在常溫下進(jìn)行為時(shí)2~4小時(shí)的循環(huán)流動(dòng)，將復(fù)合型納米材料固定于金膜表面，然后通入PH為7的磷酸鹽緩沖液清洗10-15分鐘，再用超純水進(jìn)行清洗； (4)用濃度為lmmol/L的巰基乙醇溶液對(duì)帶有復(fù)合型納米材料的金納米薄膜以50-150ul/s的速度進(jìn)行循環(huán)流動(dòng)，使復(fù)合型納米材料固定于金膜表面，然后用超純水進(jìn)行清洗以洗掉生物芯片表面所殘留的巰基乙醇溶液； (5)將帶有氨基的蛋白質(zhì)或者DNA在常溫下勻速通過金膜表面2~4小時(shí)，進(jìn)行生物芯片最后的組裝，然后用超純水進(jìn)行清洗，制得生物芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:流過金納米薄膜表面的最佳流速為100ul/s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:金納米薄膜的最佳厚度為50nm。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法得到的基于復(fù)合納米材料生物芯片在基因分辨及腫瘤診斷中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】B82Y5/00GK103981268SQ201410224306
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】劉麗煒, 王玥, 胡思怡, 張佳奇, 黃晨 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春理工大學(xué)