基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器及制法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于納米結(jié)構(gòu)的熒光化學(xué)傳感器領(lǐng)域，特別涉及基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器及其制備方法，以及該熒光化學(xué)傳感器的應(yīng)用。所述的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器是表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線或硅納米線陣列熒光化學(xué)傳感器。所述的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器可用于含有堿性磷酸酶分子的溶液體系中的堿性磷酸酶分子的檢測；從硅納米線陣列上刮下來的單根硅納米線的熒光化學(xué)傳感器，在單細胞水平上堿性磷酸酶分子的檢測上有廣泛的應(yīng)用前景，為直接檢測細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性提供了一種新的傳感器。
【專利說明】基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器及制法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米結(jié)構(gòu)的熒光化學(xué)傳感器領(lǐng)域，特別涉及基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器及其制備方法，以及該熒光化學(xué)傳感器的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]堿性磷酸酶是一種磷酸水解酶，廣泛分布于人體各臟器器官中，其中在肝臟、骨骼和腎臟中含量較多。血清中堿性磷酸酶的含量異常與骨骼疾病、肝功能異常、糖尿病等眾多疾病有關(guān)。目前，用于堿性磷酸酶檢測的技術(shù)很多，包括熒光法、比色法、電化學(xué)方法和表面增強拉曼散射等。其中，熒光技術(shù)因為自身高的靈敏度和高的空間分辨率，使得它在細胞內(nèi)以及細胞外堿性磷酸酶檢測中顯示出了極大的優(yōu)勢。文獻中已經(jīng)報道了多種堿性磷酸酶的熒光探針，如 T.1.Kim, Chem.Commun.2011，47, 9825; Y.Liu, Anal.Chem.2008，80，8605 ;L.L.An, J.Mater.Chem.2007, 17，4147。然而在病理過程中堿性磷酸酶在單細胞水平上如何發(fā)揮調(diào)控作用的至今尚不清楚。因此，發(fā)展一種高靈敏度能夠用于檢測單細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性的探針對于生物和臨床研究是非常必要的。
[0003]近些年來的研究表明，利用納米材料作為基底構(gòu)筑傳感器，能夠有效的提高傳感器的靈敏度和選擇性。文獻中已經(jīng)報道了幾種基于零維納米材料的堿性磷酸酶熒光傳感器，如 R.Freeman, Nano Lett.2010, 10, 21192; L.Jia, Chem.Commun, 2010, 46, 7166。與零維納米材料相比，一維納米材料更適合于細胞內(nèi)生物物種的檢測。通過將對堿性磷酸酶具有特異性光響應(yīng)的有機分子固定在一維納米材料的表面，構(gòu)筑基于一維納米材料的堿性磷酸酶傳感器，借助微系統(tǒng)操作，將基于一維納米材料的堿性磷酸酶傳感器插入單細胞的特定位置，便能夠直接檢測單細胞內(nèi)的堿性磷酸酶的活性。在眾多的一維納米材料中，硅納米線由于具有無毒性、生物兼容性好以及利于集成等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于熒光傳感器的構(gòu)筑，并且這些傳感器都展現(xiàn)出了良好的檢測性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器。
[0005]本發(fā)明的目的之二是提供基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的之三是提供基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器，是結(jié)合硅納米線的長處和熒光技術(shù)在堿性磷酸酶活性檢測上的優(yōu)勢，通過將3- 丁烯-1-胺作為連接體，將熒光小分子醛基熒光素共價修飾到硅納米線的表面，再利用三氯氧磷對修飾到硅納米線表面的熒光素分子進行磷酸化，從而成功制備得到了基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器。本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器在直接檢測單細胞內(nèi)的堿性磷酸酶的活性方面有廣泛的應(yīng)用前景。
[0008] 本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器是表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線熒光化學(xué)傳感器或硅納米線陣列突光化學(xué)傳感器。
[0009]所述的硅納米線是由化學(xué)氣相沉積法制備得到的直徑為7~15nm的硅納米線。
[0010]所述的硅納米線陣列是由化學(xué)刻蝕法制備得到的由直徑為200~400nm，長度為15~35 μ m的娃納米線構(gòu)成的娃納米線陣列。
[0011]本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的制備方法包括以下步驟:
[0012]I)室溫下，將硅納米線或硅納米線陣列浸泡在質(zhì)量濃度為1%~10%的氫氟酸水溶液中(一般浸泡的時間為I~10分鐘)，取出硅納米線或硅納米線陣列并用去離子水洗干凈，真空干燥，得到表面具有S1-H鍵的硅納米線或硅納米線陣列；
[0013]2)將步驟I)得到的干燥的表面具有S1-H鍵的10~30mg的硅納米線，或?qū)⒏稍锏谋砻婢哂蠸1-H鍵的硅納米線陣列，與5~20mL的無水均三甲苯和0.1~0.4mL的3- 丁烯-1胺加入到反應(yīng)器中，在惰性氣體保護下加熱至90~180°C后，恒溫反應(yīng)2~6小時，冷卻至室溫，過濾收集硅納米線或取出硅納米線陣列，用有機溶劑超聲清洗除去未反應(yīng)的3- 丁烯-1-胺，得到表面修飾有氨基的娃納米線或娃納米線陣列；其中，娃納米線陣列的加入量，是以從硅納米線陣列上刮下來的硅納米線為10~30mg為基準；
[0014]3)將步驟2)得到的表面修飾有氨基的硅納米線或硅納米線陣列置于反應(yīng)器中，加入濃度為0.5~1.5mol /L的醛基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應(yīng)0.5~2小時，然后用有機溶劑反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的醛基熒光素，直至洗滌液無熒光，得到表面修飾有醛基熒光素分子的硅納米線或硅納米線陣列；再加入濃度為0.03~0.06mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為30~65°C下加熱反應(yīng)1.5~4小時，然后用有機溶劑反復(fù)超聲洗滌除去未反應(yīng)的三乙酰氧基硼氫化鈉，得到表面修飾有熒光素的硅納米線或硅納米線陣列；
[0015]4)將步驟3)得到的表面修飾有熒光素的硅納米線或硅納米線陣列置于反應(yīng)器中，加入5~IOmL的二氯甲烷，冷卻至(TC，加入1.2~1.5mmol的吡啶，0.5~Immol的三氯氧磷，在惰性氣體保護下反應(yīng)0.5~2小時，然后逐滴加入0.5~ImL的體積比為1:1的丙酮與水的混合溶液淬滅反應(yīng)，用去離子水和有機溶劑超聲清洗，真空干燥，硅納米線或硅納米線陣列表面的熒光素分子經(jīng)三氯氧磷磷酸化，得到表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線或硅納米線陣列的熒光化學(xué)傳感器。
[0016]所述的硅納米線是由化學(xué)氣相沉積法制備得到的直徑為7~15nm的硅納米線。
[0017]所述的硅納米線陣列是由化學(xué)刻蝕法制備得到的由直徑為200~400nm，長度為15~35 μ m的娃納米線構(gòu)成的娃納米線陣列。
[0018]所述的有機溶劑是甲醇、乙醇、二氯甲烷或丙酮。
[0019]所述的無水均三甲苯優(yōu)選是新蒸的無水均三甲苯。
[0020]本發(fā)明中所述的化學(xué)氣相沉積法制備硅納米線的方法可是:室溫下，將一氧化硅經(jīng)研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放在石英管的中部，系統(tǒng)先用機械泵和分子泵對石英管抽真空至10_3Pa,隨后以20~50sccm(mL/min)的流速通入IS氣(占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩(wěn)定在700~1000Pa時，系統(tǒng)開始升溫；系統(tǒng)以10~20°C /min升至300°C，再以10~20°C /min升溫至800°C，此時關(guān)閉氣閥和泵閘，保溫10~30分鐘后繼續(xù)升溫至1350°C，在1350°C下反應(yīng)(一般反應(yīng)時間為3~7小時)，反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，在瓷舟的兩側(cè)收集產(chǎn)物硅納米線。
[0021]本發(fā)明中所述的化學(xué)刻蝕法制備硅納米線陣列的方法可是:取不同尺寸的η(100)硅片，依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進行超聲清洗(一般超聲清洗的時間為10~30分鐘)，將清洗后的硅片置于含有濃度為3~8mmol/L的AgNO3和2~7mol/L的HF的混合水溶液中進行浸泡(一般浸泡的時間為5~10分鐘)，將硅片取出后浸入含有濃度為2~7mol/L的HF和0.05~0.4mol/L的H2O2的混合水溶液中，體系由溫度為40~60°C的水浴保溫，15~45分鐘后取出硅片，放入濃鹽酸(質(zhì)量濃度為36%):濃硝酸(質(zhì)量濃度為36% )的體積比為3: I的混合液中 ，浸泡0.5~2.5小時后取出硅片，用蒸餾水沖洗后自然晾干，得到由硅納米線構(gòu)成的硅納米線陣列。
[0022]本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器可用于含有堿性磷酸酶分子的溶液體系中的堿性磷酸酶分子的檢測，在檢測堿性磷酸酶分子時，以基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器中的硅納米線熒光化學(xué)傳感器，或以從硅納米線陣列上刮下來的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器作為熒光檢測的活性基底；聯(lián)用熒光光譜儀或聯(lián)用熒光顯微鏡，在有堿性磷酸酶存在的溶液體系中，所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器，或所述的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器會產(chǎn)生熒光增強，通過繪制已知堿性磷酸酶的濃度和熒光特征峰相對強度的定標曲線，由所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器，或由所述的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器檢測到的熒光特征峰的熒光增強確定溶液體系中的堿性磷酸酶的濃度，從而實現(xiàn)對溶液體系中的堿性磷酸酶的檢測。
[0023]本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器也可用于單細胞內(nèi)的堿性磷酸酶的活性的檢測，在檢測單細胞內(nèi)的堿性磷酸酶的活性時，如以從硅納米線陣列上刮下來的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器作為熒光檢測的活性基底；聯(lián)用熒光顯微鏡，在含有堿性磷酸酶的單細胞中，所述的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器會產(chǎn)生熒光增強，從而實現(xiàn)對含有堿性磷酸酶的單細胞中的堿性磷酸酶的活性檢測。
[0024]本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器在用于含有堿性磷酸酶分子的溶液體系中的堿性磷酸酶分子的檢測時，所述的有堿性磷酸酶存在的溶液體系，是將堿性磷酸酶的溶液直接加入到含有本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的溶液中，在37°C下作用，之后再進行熒光強度的測試，聯(lián)用熒光光譜儀或聯(lián)用熒光顯微鏡進行檢測。所用的激發(fā)光源為汞燈(激發(fā)波長為450~495nm)、氙燈(激發(fā)波長為450~495nm)或激發(fā)波長為488nm的激光器，本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的發(fā)射光為綠光。
[0025]本發(fā)明的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器可用于對溶液中堿性磷酸酶分子的檢測，并在單細胞水平上堿性磷酸酶分子的檢測上有廣泛的應(yīng)用前景，為直接檢測細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性提供了一種新的傳感器。
[0026]下面結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1.本發(fā)明實施例1的通過化學(xué)氣相沉積法制備得到的硅納米線的TEM照片，插圖為HRTEM照片。[0028]圖2.本發(fā)明實施例2的通過化學(xué)刻蝕法制備得到的硅納米線陣列的SEM照片:左為俯視圖，右為側(cè)視圖。
[0029]圖3a.本發(fā)明實施例1~5的基于硅納米線或硅納米線陣列的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的制備過程中硅納米線表面修飾的示意圖。
[0030]圖3b.本發(fā)明實施例1~5的基于硅納米線或硅納米線陣列的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器與堿性磷酸酶的作用機理示意圖。
[0031]圖4.本發(fā)明實施例1的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的熒光隨基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器與堿性磷酸酶的作用時間的變化曲線。
[0032]圖5.本發(fā)明實施例3的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的相對熒光強度與堿性磷酸酶的濃度的線性曲線。[0033]圖6.本發(fā)明實施例2的基于單根硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器對溶液中堿性磷酸酶進行檢測的熒光圖像；其中:a為基于單根硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器(在沒有堿性磷酸酶存在時)的明場照片；b為基于單根硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器(在沒有堿性磷酸酶存在時)的熒光照片；c為基于單根硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器并置于ImL濃度為0.01M的PBS緩沖溶液中，且加入0.5U/mL的堿性磷酸酶作為被視為待檢測的溶液體系，于水浴(37°C )中恒溫2小時后在熒光顯微鏡下進行觀察得到的熒光照片；d為b和c中箭頭標識位置的熒光強度。
【具體實施方式】
[0034]實施例1
[0035]I)室溫下，將一氧化硅經(jīng)研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放置于水平管式爐的石英管的中部，然后對系統(tǒng)先用機械泵和分子泵抽真空至10_3Pa,隨后以50sccm(mL/min)的流速通入氬氣(占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩(wěn)定在1000Pa時，系統(tǒng)開始升溫；系統(tǒng)以10°C /min升至300°C，再以20°C /min升溫至800°C，此時關(guān)閉氣閥和泵閘，保持10分鐘后繼續(xù)升溫至1350°C，并保持溫度7小時后，管式爐自然降溫；在瓷舟的兩側(cè)收集產(chǎn)物硅納米線，所得到的硅納米線是中心直徑為10~12nm的單晶娃線,外邊有一層I~2nm的非晶氧化娃層,娃納米線的TEM照片見圖1 ;
[0036]2)室溫下，將步驟I)制備得到的硅納米線浸泡在質(zhì)量濃度1%的氫氟酸水溶液中5分鐘，取出硅納米線并用去離子水洗干凈，真空干燥，得到表面具有S1-H鍵的硅納米線；
[0037]3)將步驟2)得到的干燥的表面具有S1-H鍵的IOmg的硅納米線、5mL的無水均三甲苯和0.1mL的3- 丁烯-1胺加入到反應(yīng)器中，在氬氣保護下加熱至90°C后，恒溫反應(yīng)6小時，冷卻至室溫，過濾收集硅納米線，用乙醇超聲清洗除去未反應(yīng)的3- 丁烯-1-胺，過濾收集表面修飾有氣基的娃納米線；
[0038]4)將步驟3)得到的表面修飾有氨基的硅納米線置于反應(yīng)器中，加入濃度為0.5mol/L的醛基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應(yīng)0.5小時，然后用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的醛基熒光素，直至洗滌液無熒光，再加入濃度為0.03mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為30°C下加熱反應(yīng)4小時，然后用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的三乙酰氧基硼氫化鈉，得到表面修飾有熒光素的硅納米線；
[0039]5)將步驟4)得到的表面修飾有熒光素的硅納米線置于反應(yīng)器中，加入5mL的二氯甲燒，冷卻至0°C,加入1.2mmol的吡唳,0.5mmol的三氯氧磷,在IS氣保護下反應(yīng)0.5小時，然后逐滴加入0.5mL體積比為1:1的丙酮與水的混合溶液淬滅反應(yīng)，用去離子水和乙醇超聲清洗，過濾，真空干燥得到表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線熒光化學(xué)傳感器。所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的制備過程中硅納米線表面的修飾過程如圖3a所示。
[0040]將上述得到的表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線熒光化學(xué)傳感器分散在0.01M的PBS緩沖溶液中作為熒光檢測的活性基底，用熒光光譜儀對該硅納米線熒光化學(xué)傳感器的傳感性能進行表征，激發(fā)光源為氙燈。在含有上述制備得到的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的2mL0.01M的PBS緩沖溶液體系中，加入被視為待檢測的0.5U/mL的堿性磷酸酶，并于水浴(37°C )中恒溫，用480nm的光激發(fā)，每隔2分鐘進行一次熒光檢測，所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器會產(chǎn)生熒光增強，并發(fā)現(xiàn)隨著所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與被視為待檢測的堿性磷酸酶反應(yīng)時間的增加，被視為待檢測的溶液體系的熒光強度逐漸增強。如圖4所示的所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與被視為待檢測的堿性磷酸酶的不同反應(yīng)時間點所測的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的熒光光譜的變化曲線。在含有所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的2mL0.01M的PBS緩沖溶液體系中，加入已知的不同濃度的堿性磷酸酶，并于水浴(37°C)中保溫，用480nm的光激發(fā)，所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與已知 的堿性磷酸酶反應(yīng)20分鐘后進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)隨著已知的堿性磷酸酶濃度的增加，已知的溶液體系的熒光特征峰(最大發(fā)射波長為517nm)的強度逐漸增強。通過繪制已知的堿性磷酸酶的濃度和熒光特征峰相對強度的定標曲線，并與被視為待檢測的溶液體系中的由所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器檢測到的熒光特征峰的熒光增強進行比較，確定了被視為待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的濃度為0.5U/mL，從而實現(xiàn)了對被視為待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的檢測。所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與堿性磷酸酶的作用機理如圖3b所示。
[0041]實施例2
[0042]I)取2cmXl.0cm的η(100)娃片，依次用丙酮、乙醇、蒸懼水各超聲清洗10分鐘；將清洗后的硅片取出后置于含有濃度為5mmol/L的AgNO3和4.8mol/L的HF的混合水溶液中；浸泡5分鐘后取出放入IOmL含有濃度為4.8mol/L的HF和0.2mol/L的H2O2的混合水溶液中，體系于50°C水浴保溫；15分鐘后取出硅片，放入盛有4.5mL濃鹽酸(質(zhì)量濃度為36% )和1.5mL濃硝酸(質(zhì)量濃度為36% )的混合液中；浸泡0.5小時后取出硅片，用蒸餾水沖洗，洗干凈后置于表面皿中自然晾干，得到由硅納米線構(gòu)成的硅納米線陣列，其中硅納米線陣列中的硅納米線的直徑為200~400nm，長度為15~20μπι，硅納米線陣列的SEM照片見圖2;
[0043]2)室溫下，將步驟I)中制備得到的硅納米陣列浸泡在質(zhì)量濃度為10%的氫氟酸水溶液中I分鐘，取出硅納米線陣列并用去離子水洗干凈，真空干燥，得到表面具有S1-H鍵的硅納米陣列；
[0044]3)將步驟I)得到的干燥的表面具有S1-H鍵的硅納米線陣列，與20mL的無水均三甲苯和0.4mL的3- 丁烯-1胺加入到反應(yīng)器中，在氬氣保護下加熱至180°C后，恒溫反應(yīng)2小時，冷卻至室溫，取出硅納米線陣列，用乙醇超聲清洗除去未反應(yīng)的3- 丁烯-1-胺，得到表面修飾有氨基的硅納米陣列；其中，硅納米線陣列的加入量，是以從硅納米線陣列上刮下來的娃納米線為IOmg為基準；
[0045]4)將步驟3)得到的表面修飾有氨基的硅納米陣列置于反應(yīng)器中，加入濃度為1.5mol/L的醛基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應(yīng)2小時，然后用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的醛基熒光素，直至洗滌液無熒光，再加入濃度為0.06mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為65°C下加熱反應(yīng)1.5小時，然后用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的三乙酰氧基硼氫化鈉，得到表面修飾有熒光素的硅納米線陣列；
[0046]5)將步驟4)得到的表面修飾有熒光素的硅納米線陣列置于反應(yīng)器中，加入IOmL的二氯甲燒，冷卻至0°c,加入1.5mmol的吡唳，l.0mmol的三氯氧磷,在IS氣保護下反應(yīng)2小時，然后逐滴加入ImL體積比為1:1的丙酮與水的混合溶液淬滅反應(yīng)，用去離子水和乙醇超聲清洗，真空干燥得到表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線陣列熒光化學(xué)傳感器。所述的硅納米線陣列熒光化學(xué)傳感器的制備過程中硅納米線表面的修飾過程如圖3a所示。
[0047]從所述的硅納米線陣列熒光化學(xué)傳感器上刮取Img的單根納米線并置于2mL乙醇中，超聲使其分散后滴在硅片上，得到表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器。
[0048]將上述得到的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器用于含有堿性磷酸酶分子的溶液體系中的堿性磷酸酶分子的檢測，在檢測堿性磷酸酶分子時，以所述的單根硅納米線傳感器作為熒光檢測的活性基底，聯(lián)用熒光顯微鏡，激發(fā)光源為汞燈(450~480nm)，在有堿性磷酸酶存在的溶液體系中，所述的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器會產(chǎn)生熒光增強。如圖6所示的基于單根硅納米線的堿 性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器對溶液中堿性磷酸酶進行檢測的熒光圖像，其中:a為基于單根硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器(在沒有堿性磷酸酶存在時)的明場照片；b為基于單根硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器(在沒有堿性磷酸酶存在時)的熒光照片；(:為基于單根硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器并置于ImL濃度為0.01M的PBS緩沖溶液中，且加入0.5U/mL的堿性磷酸酶作為被視為待檢測的溶液體系，于水浴(37°C )中恒溫2小時后在熒光顯微鏡下進行觀察得到的熒光照片；d為b和c中箭頭標識位置的熒光強度。通過繪制已知的堿性磷酸酶的濃度和單根硅納米線熒光傳感器在同一位置(如圖6b箭頭表示位置)的熒光特征峰相對強度的定標曲線，并與被視為待檢測的溶液體系中的由所述的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器檢測到的熒光特征峰的熒光增強進行比較，確定了被視為待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的濃度為0.5U/mL，從而實現(xiàn)了對被視為待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的檢測。所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與堿性磷酸酶的作用機理如圖3b所示。
[0049]實施例3
[0050]I)室溫下，將一氧化硅經(jīng)研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放置于水平管式爐的石英管的中部，然后對系統(tǒng)先用機械泵和分子泵抽真空至10_3Pa,隨后以20sccm(mL/min)的流速通入氬氣(占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩(wěn)定在700Pa時，系統(tǒng)開始升溫；系統(tǒng)以20°C /min升至300°C，再以10°C /min升溫至800°C，此時關(guān)閉氣閥和泵閘，保持30分鐘后繼續(xù)升溫至1350°C，并保持溫度3小時后，管式爐自然降溫；在瓷舟的兩側(cè)收集產(chǎn)物硅納米線，所得到的硅納米線是中心直徑為6~8nm的單晶娃線,外邊有一層I~2nm的非晶氧化娃層；[0051]2)室溫下，將步驟I)制備得到的硅納米線浸泡在質(zhì)量濃度10%的氫氟酸水溶液中10分鐘，取出硅納米線并用去離子水洗干凈，真空干燥，得到表面具有S1-H鍵的硅納米線；
[0052]3)將步驟2)得到的干燥的表面具有S1-H鍵的30mg的硅納米線、20mL新蒸的無水均三甲苯和0.4mL的3- 丁烯-1胺加入到反應(yīng)器中，在氬氣保護下加熱至180°C后，恒溫反應(yīng)2小時，冷卻至室溫，過濾收集硅納米線，用乙醇超聲清洗除去未反應(yīng)的3- 丁烯-1-胺，過濾收集表面修飾有氣基的娃納米線；
[0053]4)將步驟3)得到的表面修飾有氨基的硅納米線置于反應(yīng)器中，加入濃度為
1.5mol/L的醛基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應(yīng)2小時，然后用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的醛基熒光素，直至洗滌液無熒光，再加入濃度為0.06mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為65°C下加熱反應(yīng)1.5小時，然后用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的三乙酰氧 基硼氫化鈉，得到表面修飾有熒光素的硅納米線；
[0054]5)將步驟4)得到的表面修飾有熒光素的硅納米線置于反應(yīng)器中，加入IOmL的二氯甲燒，冷卻至0°C,加入1.5mmol的吡唳，4mmol的三氯氧磷,在気氣保護下反應(yīng)2小時,然后逐滴加入1.0mL體積比為1:1的丙酮與水的混合溶液淬滅反應(yīng)，用去離子水和乙醇超聲清洗，過濾，真空干燥得到表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線熒光化學(xué)傳感器。所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的制備過程中硅納米線表面的修飾過程如圖3a所示。
[0055]將上述得到的表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線熒光化學(xué)傳感器分散在0.01M的HEPES緩沖溶液中作為熒光檢測的活性基底，用熒光光譜儀對該硅納米線熒光化學(xué)傳感器的傳感性能進行表征，激發(fā)光源為氙燈。在含有上述制備得到的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的2mL0.01M的HEPES緩沖溶液體系中，加入被視為待檢測的0.25U/mL的堿性磷酸酶，并于水浴(37°C )中恒溫，用480nm的光激發(fā)，每隔5分鐘進行一次熒光檢測，所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器會產(chǎn)生熒光增強，并發(fā)現(xiàn)隨著所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與被視為待檢測的堿性磷酸酶反應(yīng)時間的增加，被視為待檢測的溶液體系的熒光強度逐漸增強。在含有所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的2mL0.01M的HEPES緩沖溶液體系中，加入已知的不同濃度的堿性磷酸酶，并于水浴(37°C )中保溫，用480nm的光激發(fā)，所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與已知的堿性磷酸酶反應(yīng)20分鐘后進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)隨著已知的堿性磷酸酶濃度的增加，已知的溶液體系的熒光特征峰(最大發(fā)射波長為517nm)的強度逐漸增強。通過繪制已知的堿性磷酸酶的濃度和熒光特征峰相對強度的定標曲線(如圖5所示)，并與被視為待檢測的溶液體系中的由所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器檢測到的熒光特征峰的熒光增強進行比較，確定了被視為待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的濃度為0.25U/mL,從而實現(xiàn)了對被視為待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的檢測。所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與堿性磷酸酶的作用機理如圖3b所
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[0056]實施例4
[0057]I)取1.5cmX Icm的η (100)娃片，依次用丙酮、乙醇、蒸懼水各超聲清洗30分鐘；將清洗后的硅片取出后置于含有濃度為5mmol/L的AgNO3和4.8mol/L的HF的混合水溶液中；浸泡10分鐘后取出放入IOmL含有濃度為4.8mol/L的HF和0.2mol/L的H2O2的混合水溶液中，體系于50°C水浴保溫；45分鐘后取出硅片，放入盛有4.5mL濃鹽酸(質(zhì)量濃度為36% )和1.5mL濃硝酸(質(zhì)量濃度為36% )的混合液中；浸泡2.5小時后取出硅片，用蒸餾水沖洗，洗干凈后置于表面皿中自然晾干，得到由硅納米線構(gòu)成的硅納米線陣列，其中硅納米線陣列中的硅納米線的直徑為200~400nm，長度為30~35 μ m ;
[0058]2)室溫下，將步驟I)中制備得到的硅納米陣列浸泡在質(zhì)量濃度為1%的氫氟酸水溶液中5分鐘，取出硅納米線陣列并用去離子水洗干凈，真空干燥，得到表面具有S1-H鍵的硅納米陣列；
[0059]3)將步驟I)得到的干燥的表面具有S1-H鍵的硅納米線陣列，與5mL新蒸的無水均三甲苯和0.1mL的3- 丁烯-1胺加入到反應(yīng)器中，在氬氣保護下加熱至90°C后，恒溫反應(yīng)6小時，冷卻至室溫，取出硅納米線陣列，用丙酮超聲清洗除去未反應(yīng)的3- 丁烯-1-胺，得到表面修飾有氨基的硅納米陣列；其中，硅納米線陣列的加入量，是以從硅納米線陣列上刮下來的硅納米線為30mg為基準；
[0060]4)將步驟3)得到的表面修飾有氨基的硅納米陣列置于反應(yīng)器中，加入濃度為
0.5mol/L的醛基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應(yīng)0.5小時，然后用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的醛基熒光素，直至洗滌液無熒光，再加入濃度為0.03mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為30°C下加熱反應(yīng)4小時，然后用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的三乙酰氧基硼氫化鈉，得到表面修飾有熒光素的硅納米線陣列；
[0061]5)將步驟4)得到的表面修飾有熒光素的硅納米線陣列置于反應(yīng)器中，加入5mL的二氯甲燒，冷卻至0°c,加入1.2mmol的吡唳,0.5mmol的三氯氧磷,在IS氣保護下反應(yīng)0.5小時，然后逐滴加入0.5mL體積比為1:1的丙酮與水的混合溶液淬滅反應(yīng),用去離子水和丙酮超聲清洗，真空干燥得到表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線陣列熒光化學(xué)傳感器。所述的硅納米線陣列熒光化學(xué)傳感器的制備過程中硅納米線表面的修飾過程如圖3a所示。
[0062]從所述的硅納米線陣列熒光化學(xué)傳感器上刮取Img的單根納米線并置于2mL乙醇中，超聲使其分散后滴在硅片上，得到表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器。
[0063]將上述得到的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器用于含有堿性磷酸酶分子的溶液體系中的堿性磷酸酶分子的檢測，在檢測堿性磷酸酶分子時，以所述的單根硅納米線傳感器作為熒光檢測的活性基底，聯(lián)用熒光顯微鏡，激發(fā)光源為汞燈(450~480nm)，在有堿性磷酸酶存在的溶液體系中，所述的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器會產(chǎn)生熒光增強。通過繪制已知的堿性磷酸酶的濃度和單根硅納米線熒光傳感器在同一位置的熒光特征峰相對強度的定標曲線，并與待檢測的溶液體系中的由所述的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器檢測到的熒光特征峰的熒光增強進行比較，以確定待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的濃度，從而實現(xiàn)了對待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的檢測。所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與堿性磷酸酶的作用機理如圖3b所示。
[0064]實施例5
[0065] I)室溫下，將一氧化硅經(jīng)研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放置于水平管式爐的石英管的中部，然后對系統(tǒng)先用機械泵和分子泵抽真空至10_3Pa,隨后以30sccm(mL/min)的流速通入氬氣(占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩(wěn)定在900Pa時，系統(tǒng)開始升溫；系統(tǒng)以10°C /min升至300°C，再以20°C /min升溫至800°C，此時關(guān)閉氣閥和泵閘，保持20分鐘后繼續(xù)升溫至1350°C，并保持溫度5小時后，管式爐自然降溫；在瓷舟的兩側(cè)收集產(chǎn)物硅納米線，所得到的硅納米線是中心直徑為10~12nm的單晶娃線,外邊有一層2~3nm的非晶氧化娃層；
[0066]2)室溫下，將步驟I)制備得到的硅納米線浸泡在質(zhì)量濃度4%的氫氟酸水溶液中2分鐘，取出硅納米線并用去離子水洗干凈，真空干燥，得到表面具有S1-H鍵的硅納米線；
[0067]3)將步驟2)得到的干燥的表面具有S1-H鍵的20mg的硅納米線、IOmL的無水均三甲苯和0.2mL的3- 丁烯-1胺加入到反應(yīng)器中，在氬氣保護下加熱至120°C后，恒溫反應(yīng)4小時，冷卻至室溫，過濾收集硅納米線，用乙醇超聲清洗除去未反應(yīng)的3-丁烯-1-胺，過濾收集表面修飾有氣基的娃納米線；
[0068]4)將步驟3)得到的表面修飾有氨基的硅納米線置于反應(yīng)器中，加入濃度為Imol/L的醛基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應(yīng)I小時，然后用丙酮反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的醛基熒光素，直至洗滌液無熒光，再加入濃度為0.04mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為50°C下加熱反應(yīng)3小時，然后用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的三乙酰氧基硼氫化鈉，得到表面修飾有熒光素的硅納米線；
[0069]5)將步驟4)得到的表面修飾有熒光素的硅納米線置于反應(yīng)器中，加入SmL的二氯甲燒，冷卻至0°C,加入1.4mmol的吡唳,0.8mmol的三氯氧磷,在気氣保護下反應(yīng)I小時，然后逐滴加入0.SmL體積比為1:1的丙酮與水的混合溶液淬滅反應(yīng)，用去離子水和乙醇超聲清洗，過濾，真空干燥得到 表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線熒光化學(xué)傳感器。所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的制備過程中硅納米線表面的修飾過程如圖3a所示。
[0070]將上述得到的表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線熒光化學(xué)傳感器分散在0.01M的PBS緩沖溶液中作為熒光檢測的活性基底，用熒光光譜儀對該硅納米線熒光化學(xué)傳感器的傳感性能進行表征，激發(fā)光源為氙燈。在含有上述制備得到的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的2mL0.01M的PBS緩沖溶液體系中，加入被視為待檢測的0.5U/mL的堿性磷酸酶，并于水浴(37°C )中恒溫，用480nm的光激發(fā)，每隔2分鐘進行一次熒光檢測，所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器會產(chǎn)生熒光增強，并發(fā)現(xiàn)隨著所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與被視為待檢測的堿性磷酸酶反應(yīng)時間的增加，被視為待檢測的溶液體系的熒光強度逐漸增強。在含有所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器的2mL0.01M的PBS緩沖溶液體系中，加入已知的不同濃度的堿性磷酸酶，并于水浴(37°C)中保溫，用480nm的光激發(fā)，所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與已知的堿性磷酸酶反應(yīng)20分鐘后進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)隨著已知的堿性磷酸酶濃度的增加，已知的溶液體系的熒光特征峰(最大發(fā)射波長為517nm)的強度逐漸增強。通過繪制已知的堿性磷酸酶的濃度和熒光特征峰相對強度的定標曲線，并與被視為待檢測的溶液體系中的由所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器檢測到的熒光特征峰的熒光增強進行比較，確定了被視為待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的濃度為0.5U/mL，從而實現(xiàn)了對被視為待檢測的溶液體系中的堿性磷酸酶的檢測。所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器與堿性磷酸酶的作用機理如圖3b所示。
【權(quán)利要求】
1.一種基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器，其特征是:所述的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器是表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線熒光化學(xué)傳感器或硅納米線陣列熒光化學(xué)傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器，其特征是:所述的硅納米線是由化學(xué)氣相沉積法制備得到的直徑為7~15nm的硅納米線； 所述的硅納米線陣列是由化學(xué)刻蝕法制備得到的由直徑為200~400nm，長度為15~35 μ m的娃納米線構(gòu)成的娃納米線陣列。
3.—種權(quán)利要求1或2所述的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的制備方法，其特征是，所述的制備方法包括以下步驟: O室溫下，將硅納米線或硅納米線陣列浸泡在質(zhì)量濃度為1%~10%的氫氟酸水溶液中，取出硅納米線或硅納米線陣列并用去離子水洗干凈，真空干燥，得到表面具有S1-H鍵的娃納米線或娃納米線陣列； 2)將步驟I)得到的干燥的表面具有S1-H鍵的10~30mg的硅納米線，或?qū)⒏稍锏谋砻婢哂蠸1-H鍵的硅納米線陣列，與5~20mL的無水均三甲苯和0.1~0.4mL的3- 丁烯-1胺加入到反應(yīng)器中，在惰性氣體保護下加熱至90~180°C后，恒溫反應(yīng)2~6小時，冷卻至室溫，過濾收集硅納米線或取出硅納米線陣列，用有機溶劑超聲清洗除去未反應(yīng)的3- 丁烯-1-胺，得到表面修飾有氨基的娃納米線或娃納米線陣列；其中，娃納米線陣列的加入量，是以從硅納米線陣列上刮下來的硅納米線為10~30mg為基準； 3)將步驟2)得到的表面修飾有氨基的硅納米線或硅納米線陣列置于反應(yīng)器中，加入濃度為0.5~1.5mol/L的醒基熒光素的乙醇溶液,室溫下攪拌反應(yīng)0.5~2小時,然后用有機溶劑反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的醛基熒光素，直至洗滌液無熒光；再加入濃度為0.03~0.06mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為30~65°C下加熱反應(yīng)1.5~4小時，然后用有機溶劑反復(fù)超聲洗滌除去未反應(yīng)的三乙酰氧基硼氫化鈉，得到表面修飾有熒光素的硅納米線或硅納 米線陣列； 4)將步驟3)得到的表面修飾有熒光素的硅納米線或硅納米線陣列置于反應(yīng)器中，加入5~IOmL的二氯甲燒,冷卻至OdflA 1.2~1.5mmol的吡唳,0.5~Immol的三氯氧磷，在惰性氣體保護下反應(yīng)0.5~2小時，然后逐滴加入0.5~ImL的體積比為1:1的丙酮與水的混合溶液淬滅反應(yīng)，用去離子水和有機溶劑超聲清洗，真空干燥，得到表面修飾有對堿性磷酸酶具有選擇性熒光響應(yīng)的磷酸化熒光素分子的硅納米線熒光化學(xué)傳感器或硅納米線陣列突光化學(xué)傳感器。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是:步驟I)所述的硅納米線是由化學(xué)氣相沉積法制備得到的直徑為?~15nm的硅納米線； 步驟I)所述的硅納米線陣列是由化學(xué)刻蝕法制備得到的由直徑為200~400nm，長度為15~35 μ m的娃納米線構(gòu)成的娃納米線陣列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是:所述的將硅納米線或硅納米線陣列浸泡在質(zhì)量濃度為1%~10%的氫氟酸水溶液中的時間是I~10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是:所述的有機溶劑是甲醇、乙醇、二氯甲烷或丙酮。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是:所述的無水均三甲苯是新蒸的無水均三甲苯。
8.—種權(quán)利要求1或2所述的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器的應(yīng)用，其特征是:所述的基于硅納米線的堿性磷酸酶熒光化學(xué)傳感器用于含有堿性磷酸酶分子的溶液體系中的堿性磷酸酶分子的檢測，以硅納米線熒光化學(xué)傳感器，或以從硅納米線陣列上刮下來的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器作為熒光檢測的活性基底；聯(lián)用熒光光譜儀或聯(lián)用熒光顯微鏡，在有堿性磷酸酶存在的溶液體系中，所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器，或所述的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器會產(chǎn)生熒光增強，通過繪制已知堿性磷酸酶的濃度和熒光特征峰相對強度的定標曲線，由所述的硅納米線熒光化學(xué)傳感器，或由所述的單根硅納米線熒光化學(xué)傳感器 檢測到的熒光特征峰的熒光增強確定溶液體系中的堿性磷酸酶的濃度。
【文檔編號】B82Y20/00GK103937488SQ201410114590
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】穆麗璇, 王會敏, 師文生 申請人:中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所