專利名稱：基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物手性研究的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物手性研究的方法，屬于材料化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
納米材料的自組裝是納米技術(shù)的一個研究熱點，原因在于自組裝納米材料能夠表現(xiàn)出不同于單分散的納米粒子的獨特的光學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，通過研究自組裝材料的性質(zhì)可以更好地理解宏觀材料的物理和化學(xué)性質(zhì)。聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase ChainReaction)，是分子生物學(xué)中應(yīng)用的基礎(chǔ)實驗手段，是上世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種體外特定核酸序列擴增技術(shù)。它具有特異性強、擴增效率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易實現(xiàn)自動化等優(yōu)點。納米技術(shù)與生物技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的納米生物技術(shù)憑借其獨特的性質(zhì)得到了廣泛的研究發(fā)展，被越來越多的科研人士所青睞。而金納米粒子，由于其獨特的物理、化學(xué)性質(zhì)及生物相容性，在生物電化學(xué)、材料學(xué)及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都有很廣泛的應(yīng)用。將納米材料結(jié)合到PCR過程中已成為近年來的研究熱點，對于提高PCR的特異性和效率，和組裝結(jié)構(gòu)手性性質(zhì)的研究有很大的作用。本發(fā)明首先通過聚合酶鏈反應(yīng)組裝大小金的二聚體，通過在大小金二聚體的表面進行一層銀生長，得到大小金二聚體-銀的核殼結(jié)構(gòu)，并首先對該大小金二聚體-銀的核殼結(jié)構(gòu)的手性性質(zhì)進行了研究和探討。圓二色譜(CD)的原理是由不對稱分子組成的物質(zhì)是光學(xué)各向異性的，物質(zhì)對R和L兩種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象稱為圓二色性。這種吸收程度的不同與波長的關(guān)系稱圓二色譜，是一種測定分子不對稱結(jié)構(gòu)的光譜法?？梢杂脠A二色譜研究某些立體結(jié)構(gòu)，對PCR組裝后不同銀殼厚度的大小金二聚體的手性進行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物手性研究的方法，并對具有不同銀殼厚度的大小金二聚體的手性性質(zhì)進行研究。本發(fā)明的技術(shù)方案:基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物手性研究的方法，包括基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體的組裝，大小金二聚體表面進行不同厚度Inm-1Onm的銀生長，大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征。具體步驟:( I)大小金二聚體的組裝根據(jù)ZL 201110272661.6的權(quán)利要求1進行大小金二聚體組裝。具體為:一種基于聚合酶鏈反應(yīng)進行手性金二聚體的可控組裝方法，步驟包括金納米粒子的合成，金納米粒子和上下游引物的偶聯(lián)，金納米粒子和引物偶聯(lián)物的修飾，金二聚體的組裝及表征；( i )金納米粒子的合成
采用檸檬酸三鈉還原氯金酸合成不同粒徑的金納米粒子；(ii)金納米粒子和上下游引物的偶聯(lián)將合成出的金納米粒子和巰基修飾的上下游引物進行偶聯(lián)形成金納米粒子-引物偶聯(lián)物；(Iii)金納米粒子-引物偶聯(lián)物的修飾將金納米粒子-引物偶聯(lián)物和輔助DNA偶聯(lián)，得金納米粒子-引物-DNA復(fù)合體；(iv)金二聚體的組裝及其表征在合適的PCR條件下，將金納米粒子-引物-DNA復(fù)合體在PCR體系中進行不同循環(huán)數(shù)下的組裝，離心濃縮，進行表征，得可控組裝的手性金二聚體；模板:Plasmidλ DNA,F-primer: 5，-SH-ATGAAACGGCAGGCAGAACAGG—3，，R-primer: 5，-SH-ACAGGGACATCGCCACCAGAAA—3，，輔助DNA:5’ -AAAAAAAAAAAA-3’ ；所述(i )不同粒徑金納米粒子的合成:合成方案:潔凈的三角燒瓶中加入95mL的水，而后向水中加入5mL的濃度為2g/L的氯金酸，加熱，煮沸，緊接著加入2.5mL質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色變成紅色，反應(yīng)持續(xù)6-8min以使檸檬酸三鈉完全沉降；最后，冷卻溶液至室溫，稀釋到100mL，4°C保藏，即制得粒徑18nm的金納米粒子；調(diào)整檸檬酸的用量得到不同粒徑的金納米粒子，質(zhì)量濃度1%的朽1檬酸的用量減少至1.4mL得到粒徑25nm的金納米粒子，1%的檸檬酸的用量增加至5.0mL得到粒徑IOnm的金納米粒子；所述(ii)金納米粒子和上下游引物的偶聯(lián):Ca)將步驟(i )中制備的ImL的金納米粒子10000r/min離心IOmin,用ImL的水分散，10000r/min 離心 IOmin,棄上清，用 100 μ L 含 0.01% 的 SDS 的 pH8.0、0.0lM 的 PBS 分
散，4 C保減、待用；(b)金納米粒子和上游引物偶聯(lián):取上述制備好的50 μ L金納米粒子加入50 μ LI μ M的F-primer，混勻，加2.5 μ L 2Μ的NaCl至反應(yīng)體系中NaCl濃度達到50mM，振搖反應(yīng)20min，再室溫反應(yīng)12h ；(c)金納米粒子和下游引物偶聯(lián):取上述制備好的50 μ L金納米粒子加入50 μ LI μ M的R-primer，混勻，加2.5 μ L 2Μ的NaCl至反應(yīng)體系中NaCl濃度達到50mM，振搖反應(yīng)20min，再室溫反應(yīng)12h ；(d)將上述(b)及(c)步驟中所得反應(yīng)溶液,在8000r/min離心IOmin,棄上清,后用100 μ L超純水分散沉淀，4°C保藏、分別得金納米粒子-上游引物偶聯(lián)物或金納米粒子-下游引物偶聯(lián)物，待用；所述(iii)金納米粒子和引物偶聯(lián)物的修飾:在步驟(d)中制得的金納米粒子-引物偶聯(lián)物中加入50mL 5mM的輔助DNA，加2mL2M NaCl溶液，反應(yīng)12h ;反應(yīng)后的溶液在8000r/min離心lOmin，棄上清，后用IOOmL的超純水分散沉淀，4°C保藏、得金納米粒子-引物-DNA復(fù)合體，待用；所述(iv)金二聚體的PCR組裝及對產(chǎn)物的TEM和⑶的表征:(e)PCR:以λ DNA為模板,采用制得的引物金納米粒子-F-Primer及金納米粒子-R-Primer進行PCR，PCR反應(yīng)體系:dNTPs I μ L，0.5個單位的Taq DNA聚合酶，λ DNA模板質(zhì)粒0.5μ L，PCR反應(yīng)緩沖液5 μ L，分別取金納米粒子-F-Primer4y L和金納米粒子-R-Primer4 μ L,加滅菌水至總體積為50 μ L ;所述金納米粒子選用IOnm金納米粒子、18nm金納米粒子、或25nm金納米粒子之一；(f)擴增程序為:94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，2-20個循環(huán)；72°C再延伸IOmin ; 10°C保存，得PCR產(chǎn)物；(g)取50 μ L PCR產(chǎn)物進行8000r/min離心lOmin，棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，進行TEM和⑶表征。(2)大小金二聚體表面進行不同厚度的銀生長通過調(diào)節(jié)5 μ L-1OO μ L ImM硝酸銀的量達到合成不同銀殼厚度Inm-1Onm的大小
金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物。(3)大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征將合成好的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物離心濃縮，進行電鏡和⑶表征。所述大小金二聚體表面進行不同厚度Inm-1Onm的銀生長將500 μ L 0.1M的磷酸鹽緩沖液和100 μ L 1%聚乙烯吡咯烷酮溶液和50 μ L 0.1M抗壞血酸溶液混合均勻，加入50 μ L 20ηΜ大小金二聚體溶液，震蕩均勻，加入5 μ L-1OO μ LImM的硝酸銀溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中。所述大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征:取500 μ L大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物進行8000rpm離心IOmin,棄上清,后用100 μ L的超純水分散沉淀，進行TEM和⑶表征。本發(fā)明的有益效果:將納米材料結(jié)合到PCR過程中已成為近年來的研究熱點，對于提高PCR的特異性和效率和組裝結(jié)構(gòu)手性性質(zhì)的研究有很大的作用。本發(fā)明首先通過聚合酶鏈反應(yīng)組裝大小金的二聚體，通過在大小金二聚體的表面進行一層銀生長，得到大小金二聚體-銀的核殼結(jié)構(gòu)，并首次對該大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)進行了研究和探討。


圖1大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物的TEM圖。圖2不同銀殼厚度的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物⑶圖譜。l、Au-dimers(二 聚體)，2、Au dimersiAg5 μ L, 3> Au dimersiAglO μ L, 4> Au dimers@Agl5 μ L, 5、Audimers@Ag20μ L，6、Au dimers@Ag30μ L，7、Au dimers@Ag50μ L，8、Au dimers@Ag70μ L，9、Au dimers@AglOOμ L。
具體實施例方式實施例1大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)的組裝( I)大小金二聚體的組裝根據(jù)ZL 201110272661.6權(quán)利要求書的步驟進行大小金二聚體的組裝。包括金納米粒子的合成，金納米粒子和上下游引物的偶聯(lián)，金納米粒子和引物偶聯(lián)物的修飾，金二聚體的組裝及表征；
(2)大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)的合成將500 UL 0.1M的磷酸鹽緩沖液、100 μ L 1%聚乙烯吡咯烷酮溶液和50 μ L 0.1M抗壞血酸溶液混合均勻，加入50 μ L 20ηΜ大小金二聚體溶液，震蕩均勻，加入IOyL ImM的硝酸銀溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中。(3)將步驟(2)中的反應(yīng)溶液進行8000rpm離心lOmin，棄上清，后用100 μ L的超純水分散沉淀，進行TEM和⑶表征。實施例2具有不同銀殼厚度大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝通過調(diào)節(jié)硝酸銀的量達到具有不同銀殼厚度大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)納米粒子。隨著ImM硝酸銀量由5 μ L增大到100 μ L，銀殼的厚度逐漸由Inm增大到10nm。產(chǎn)物的分離純化和表征等其他步驟同實施例1。序列表
F-primer:5， -SH-ATGAAACGGCAGGCAGAACAGG-3，，R-primer:5， -SH-ACAGGGACATCGCCACCAGAAA-3，，輔助 DNA:5’ -AAAAAAAAAAAA-3’。
權(quán)利要求
1.基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物手性研究的方法，其特征在于包括基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體的組裝，大小金二聚體表面進行不同厚度Inm-1Onm的銀生長,大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征； 具體步驟: (1)大小金二聚體的組裝 根據(jù)ZL 201110272661.6的權(quán)利要求1進行大小金二聚體組裝； (2)大小金二聚體表面進行不同厚度Inm-1Onm的銀生長 通過調(diào)節(jié)5 μ L-100 μ L ImM硝酸銀的量達到合成不同銀殼厚度Inm-1Onm的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物； (3)大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征 將合成好的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物離心濃縮，進行電鏡 Μ和園二色譜⑶表征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物手性研究的方法，其特征在于大小金二聚體表面進行不同厚度Inm-1Onm的銀生長:將500 μ L0.1M的磷酸鹽緩沖液和100 μ L 1%聚乙烯吡咯烷酮溶液和50 μ L 0.1M抗壞血酸溶液混合均勻，加入50 μ L 20ηΜ大小金二聚體溶液，震蕩均勻，加入SyL-1OOyL ImM的硝酸銀溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物手性研究的方法，其特征 在于大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征:取500 μ L大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物進行8000rpm離心lOmin，棄上清，后用100 μ L的超純水分散沉淀，進行TEM和CD表征。
全文摘要
基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物手性研究的方法，屬于材料化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明主要內(nèi)容包括基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體的組裝和大小金二聚體表面進行不同厚度1nm-10nm的銀生長，并對大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物進行TEM表征和CD信號比較。主要實施步驟為(1)基于聚合酶鏈反應(yīng)的大小金二聚體的組裝；(2)大小金二聚體表面進行不同厚度的銀生長；(3)將所制得的大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征。本發(fā)明首次通過PCR方法進行了大金和小金的二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)的可控組裝，并首次對大小金二聚體-銀核殼結(jié)構(gòu)組裝產(chǎn)物鏈的手性性質(zhì)進行了研究和探討。
文檔編號B82Y40/00GK103157792SQ20131008086
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者胥傳來, 趙媛, 馬偉, 徐麗廣, 匡華, 王利兵, 劉麗強, 宋珊珊, 胡擁明, 丁利 申請人:江南大學(xué)