專利名稱：板藍(lán)根制劑及其質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了板藍(lán)根制劑及其質(zhì)量控制方法，屬中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort.)的干燥根，味苦性寒，入心、胃經(jīng)，具有清熱解毒，涼血消腫的功效。主要化學(xué)成分有靛苷、靛玉紅、谷甾醇、多種氨基酸、腺苷、多糖等。臨床上廣泛用于治療流行性感冒、流行性腮腺炎、急慢性咽喉炎、單純皰疹性角膜炎、流行性乙腦炎等。藥理活性有抗內(nèi)毒素、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等。板藍(lán)根制劑有板藍(lán)根注射液、板藍(lán)根顆粒、板藍(lán)根膠囊、板藍(lán)根口服液、板藍(lán)根糖漿、板藍(lán)根片、復(fù)方板藍(lán)根膠囊、復(fù)方板藍(lán)根顆粒、復(fù)方板藍(lán)根片等。
目前板藍(lán)根制劑多采用水提醇沉法制備，少量采用滲漉法。板藍(lán)根制劑采用氨基酸或靛藍(lán)、靛玉紅的含量作為質(zhì)量指標(biāo)。氨基酸是一種大眾化的成分，作為質(zhì)量指標(biāo)不具有特異性，專屬性差尤其是在復(fù)方制劑中；而采用靛藍(lán)或靛玉紅作為質(zhì)量指標(biāo)的，由于靛藍(lán)和靛玉紅是脂溶性的成分，采用水煮不易溶出，提取率低，在某些制劑中根本檢測(cè)不出靛玉紅(張潤(rùn)珍、張玉文。板草根的研究進(jìn)展。中草藥，2000，31(6)474-476)，更有文獻(xiàn)報(bào)道說(shuō)菘藍(lán)的根本沒(méi)有靛玉紅和靛藍(lán)，在其制劑中檢測(cè)到的靛玉紅和靛藍(lán)的量是在其采收和加工過(guò)程中混入的根莖和其附帶的葉柄殘基中所含的靛玉紅和靛藍(lán)的量，且兩者不具有抗內(nèi)毒素活性(張漢明、張戈等。板藍(lán)根和大青葉不同部位的靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定及其部分成分的抗內(nèi)毒素作用比較差。藥學(xué)實(shí)踐雜志，2000，18(5)347)。
腺苷又名腺嘌呤核苷，是一種已知的天然成分，分子式C10H13N5O4，分子量267.24，白色結(jié)晶，微有咸苦味，易溶于水，幾乎不溶于乙醇和乙醚，融點(diǎn)234-235℃，比旋度-61.7(C＝0.706％，水中)。腺苷除具有抗凝血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、松弛支氣管平滑肌、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)和抗心率不齊等作用外，又證實(shí)能有效地阻止由PAF誘導(dǎo)的白細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞粘附而參與消炎作用(徐汝明、陸陽(yáng)等。紫外分光光度法測(cè)定貝母中腺苷的含量，中國(guó)中藥雜志1996，21(6)556)。
安全、有效、穩(wěn)定、可控是現(xiàn)代藥物制劑的標(biāo)準(zhǔn)，目前板藍(lán)根制劑報(bào)道具有抗病毒、抑菌、抗內(nèi)毒素等方面的功效，且臨床證明其具備安全、有效的特點(diǎn)，但是由于板藍(lán)根中所含成份復(fù)雜，使板藍(lán)根藥材及其制劑穩(wěn)定性差，不同藥材、成品批次不同，質(zhì)量也有較大的浮動(dòng)，使板藍(lán)根制劑的可控性差。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所要解決的技術(shù)方案是提供板藍(lán)根制劑及其質(zhì)量控制方法。
本發(fā)明提供板藍(lán)根制劑，它是由中藥板藍(lán)根Radix Isatidis藥材或提取物制備而成，其中每制劑單位中腺苷的含量范圍為0.075～2mg，板藍(lán)根藥材中腺苷的含量≥0.3mg/g。
其中所述的制劑單位是指口服液中的每ml、膠囊劑中的每粒、顆粒劑中的每克、片劑中的每片、糖漿劑中的每ml、滴眼液中的每ml。
所述的制劑是滴眼液、原位膠化滴眼液、注射劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、糖漿劑、片劑、丸劑、散劑。進(jìn)一步地，所述的制劑是滴眼液，所述的滴眼液中腺苷的含量范圍為0.0998～2mg。
本發(fā)明還提供了板藍(lán)根制劑的質(zhì)量控制方法，它是采用腺苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行定性與定量控制，每制劑單位中腺苷的含量范圍為0.075～2mg。
所述的定性控制的方法是采用氯仿、醋酸乙酯、異丙醇、水、氨水為展開(kāi)劑，用硅膠GF254薄層板(自制)進(jìn)行一維展開(kāi)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品為腺苷，于紫外燈下，波長(zhǎng)為254nm檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照色譜相應(yīng)處顯相同的暗斑。進(jìn)一步地，該定性控制方法為取板藍(lán)根制劑適量，加水稀釋為10ml，用水飽合的正丁醇萃取三次，分別為20ml、20ml、10ml，分液，合并正丁醇層，水浴蒸干，殘?jiān)?0％乙醇溶解，作為供試品溶液；另取腺苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)878-20000)，加70％乙醇制成每ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；照中國(guó)藥典2000版一部附錄VIB薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于一同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿—醋酸乙酯—異丙醇—水—氨水，體積比為8∶2∶6∶0.5∶0.12，作為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)，取出，晾干，于紫外燈下，波長(zhǎng)為254nm檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照色譜相應(yīng)處顯相同的暗斑。
所述的定量控制的方法是色譜條件儀器HP1000高效液相色譜儀，G1310A IsoPump泵，G1314A VMD紫外檢測(cè)器；Chemstation數(shù)據(jù)處理軟件；色譜柱Alltima C18 5μm，150mm×4.6mm；流動(dòng)相甲醇—水，體積比為5～12∶88～95或磷酸鹽緩沖液-甲醇，體積比為15～20∶3～10；流速1ml/min；柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；進(jìn)樣量20μl；供試品溶液的制備精密吸取板藍(lán)根制劑，置10ml容量瓶中，用30％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的腺苷約10mg，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相定溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；取以上溶液注入高效液相色譜分析儀，測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算，即得。
進(jìn)一步地，所述的流動(dòng)相甲醇—水，體積比為8∶92。
本發(fā)明板藍(lán)根制劑采用腺苷為指標(biāo)性成份，通過(guò)對(duì)腺苷的定性定量測(cè)定，可反映板藍(lán)根藥材及其制劑的穩(wěn)定性，達(dá)到控制質(zhì)量的目的，重現(xiàn)性高，穩(wěn)定可控；通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)證明，腺苷雖然不是有效成分，但通過(guò)對(duì)腺苷含量的控制，可從側(cè)面控制板藍(lán)根制劑的療效，使制劑更加穩(wěn)定、可控，為板藍(lán)根藥材及其制劑提供了一種新的質(zhì)量控制方法。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1板藍(lán)根滴眼液的定性控制薄層色譜圖點(diǎn)1為腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，點(diǎn)2為不含腺苷的陰性對(duì)照，點(diǎn)3，4，5為板藍(lán)根滴眼液樣品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)例1板藍(lán)根原生藥材粉末的制備板藍(lán)根藥材低溫干燥(60℃以下)，切塊，打粉，過(guò)2號(hào)篩，即得。
實(shí)驗(yàn)例2板藍(lán)根滴眼液的制備取板藍(lán)根500g，加10倍量水煎煮兩次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至約750ml，冷卻，加乙醇使含醇量達(dá)70％，攪勻，冷藏24小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇至350～500ml，冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，濾液用氨試液調(diào)節(jié)pH值為8.0～8.5，攪勻，冷藏48小時(shí)，濾過(guò)，加熱除去氨，加入1g尼泊金乙酯，加蒸餾水至1000ml，滅菌，用G4垂熔漏斗、0.22um濾膜濾過(guò)，灌封，即得。
實(shí)驗(yàn)例3板藍(lán)根原位膠化滴眼液的制備取板藍(lán)根500g，加10倍量水煎煮兩次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至約750ml，冷卻，加乙醇使含醇量達(dá)70％，攪勻，冷藏24小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇至350～500ml，冷藏過(guò)夜，濾過(guò)；另取卡波姆3g加適量蒸餾水充分溶脹，羥丙甲基纖維素12g和尼泊金乙酯1g加蒸餾水溶解，合并上述溶液，加氯化鈉8.5g調(diào)節(jié)滲透壓，加蒸餾水至1000ml，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0，滅菌，用G4垂熔漏斗、0.22um濾膜濾過(guò)，灌封，即得。
所謂的原位膠化滴眼液是指大多數(shù)滴眼液的pH值通常與人淚液的pH值相同，偏堿性，pH值在7.3～7.5之間，若pH值不當(dāng)，可引起對(duì)眼部的刺激，增加淚液的分泌，導(dǎo)致藥物被沖洗流失，甚至損傷角膜。本發(fā)明的pH值為5.5-6.0，偏酸性，是由于本發(fā)明采用原位膠化技術(shù)制備滴眼液，使該藥物劑型在酸性條件下為溶液形式，藥液滴入眼中均勻分布后在眼部特有的生理環(huán)境作用下受淚液的pH影響，形成凝膠，覆蓋于眼球表面，且不影響眼睛的正常視覺(jué)，藥物緩慢釋放，達(dá)到長(zhǎng)效緩釋的作用并可以減少使用中對(duì)制劑本身的污染。
實(shí)驗(yàn)例4板藍(lán)根片劑制備取板藍(lán)根藥材1000g，加水煎煮2次，第一次1小時(shí)，第二次45分鐘，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至1000ml。放置至室溫，加入95％乙醇使含醇量達(dá)到60％。冷藏，濾過(guò)，濾液回收乙醇濃縮至稠膏狀，加入淀粉200g及其他輔料適量，制成顆粒，壓制成片1000片，包衣，即得。
實(shí)驗(yàn)例5板藍(lán)根顆粒制備取板藍(lán)根藥材500g，加水煎煮2次(第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí))，濾過(guò)，合并濾液，適當(dāng)濃縮。加乙醇使含醇量達(dá)到60％，取上清液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.33(80℃)的稠膏，加入輔料(清膏1份，蔗糖2份，糊精1.3份)制粒，即得。
實(shí)驗(yàn)例6板藍(lán)根糖漿制備取板藍(lán)根藥材700g，加水煎煮2次(第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí))，濾過(guò)，合并濾液，靜置。取上清液適當(dāng)濃縮，加入矯味劑(蔗糖400g)、防腐劑(苯甲酸鈉3g)，溶解后濾過(guò)，加水調(diào)節(jié)至規(guī)定體積(1000ml)，即得。
實(shí)驗(yàn)例7板藍(lán)根注射液制備取板藍(lán)根藥材500g，加水煎煮2次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，合并煎煮液，濾過(guò)，濾液濃縮至約750ml，冷卻，加乙醇使含醇量70％，攪勻，靜置24小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇至350～500ml，冷藏，濾過(guò)，濾液用氨試液調(diào)節(jié)pH值為8.0～8.5，攪勻，冷藏48小時(shí)，加熱除去氨，加注射用水至900ml，冷藏濾過(guò)，濾液用1％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.5，冷藏，濾過(guò)，濾液加甘露醇10g，并加注射用水調(diào)整總量至1000ml，濾過(guò)，灌封，滅菌，即得。
實(shí)驗(yàn)例8板藍(lán)根膠囊制備取板藍(lán)根藥材1000g，加水煎煮2次，第一次1小時(shí)，第二次45分鐘，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至1000ml。放置至室溫，加入95％乙醇使含醇量達(dá)到60％。冷藏，濾過(guò)，濾液回收乙醇濃縮至稠膏狀，加入淀粉200g及其他輔料適量，制成顆粒，填充于膠囊即得。
實(shí)驗(yàn)例9板藍(lán)根制劑中腺苷定性控制取實(shí)驗(yàn)2制得的滴眼液5ml，加水稀釋為10ml，用水飽合的正丁醇萃取三次(20ml，20ml，10ml)，分液，合并正丁醇層，水浴蒸干，殘?jiān)?0％乙醇溶解，作為供試品溶液。另取腺苷對(duì)照品，加70％乙醇制成每ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于一同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿—醋酸乙酯—異丙醇—水—氨水(8∶2∶6∶0.5∶0.12)為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)，取出，晾干，于紫外燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照色譜相應(yīng)處顯相同的暗斑。(見(jiàn)圖1)實(shí)驗(yàn)例10板藍(lán)根滴眼液中腺苷的含量測(cè)定1.色譜條件儀器HP1100高效色譜儀，G1310A IsoPump泵，G1314AVMD紫外檢測(cè)器。Chemstation數(shù)據(jù)處理軟件。
色譜柱Alltima C18(5μm，150mm×4.6mm)；流動(dòng)相甲醇—水(8∶92)；流速1ml/min；柱溫室溫。檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。
2.供試品溶液的制備精密吸取實(shí)驗(yàn)例2制得的滴眼液作樣品2ml，置10ml容量瓶中，用30％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
3.對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的腺苷約10mg，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相定溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。
4.線性關(guān)系的考察y＝60659x-8.5766，r＝0.99985.穩(wěn)定性樣品溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定6.重現(xiàn)性3份樣品的RSD％小于3％，樣品重現(xiàn)性良好。
7.回收率樣品的回收率在95％～105％之間，試驗(yàn)表明，本法具有良好的回收率。
8.含量測(cè)定三批樣品測(cè)定結(jié)果樣品號(hào) 含量1 0.11242 0.11573 0.1045
根據(jù)測(cè)定結(jié)果，結(jié)合工業(yè)大生產(chǎn)實(shí)際，定本品每ml含腺苷不得少于0.0998mg。
實(shí)驗(yàn)例11 板藍(lán)根藥材中腺苷定量控制1、取板藍(lán)根藥材本品為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根。購(gòu)于成都市荷花池中藥材市場(chǎng)。本品為藥典2000版收載品種，應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2000年版一部第163頁(yè)板藍(lán)根項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。為保障制劑質(zhì)量的需要，又對(duì)其腺苷的含量進(jìn)行了規(guī)定。
2、腺苷的含量測(cè)定取2g藥材+20ml30％甲醇，定容到25ml2.1色譜條件同實(shí)驗(yàn)例10所述的含量測(cè)定條件。
2.2提取溶劑的選擇考察了以水、10％甲醇、30％甲醇為提取溶劑的提取率，結(jié)果表明，30％甲醇的提取效率最高，故選擇30％甲醇作為提取溶劑。
2.3提取方法的選擇考察了回流提取與超聲提取，結(jié)果表明，兩種方法的提取效率幾乎一致，但超聲提取更簡(jiǎn)便，易于操作，故選擇超聲提取。
2.4提取時(shí)間的選擇分別考察了超聲提取30、45、60分鐘，結(jié)果表明，提取45分鐘藥材中腺苷就已基本提取盡，故選擇提取45分鐘。
2.5藥材的含量測(cè)定按擬定的方法，對(duì)4批藥材進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表。
藥材含量測(cè)定結(jié)果(n＝2)樣品號(hào) 1 2 3 4含量(mg/g) 0.3252 0.38060.3016 0.3142平均含量(mg/g) 0.3304由以上測(cè)定結(jié)果，結(jié)合實(shí)際，板藍(lán)根藥材中腺苷的含量不得低于0.3mg/g。通過(guò)對(duì)板藍(lán)根藥材中腺苷含量的測(cè)定，可反映板藍(lán)根藥材的質(zhì)量。
實(shí)驗(yàn)例12 板藍(lán)根藥材及板藍(lán)根顆粒中腺苷的穩(wěn)定性試驗(yàn)1.取板藍(lán)根藥材和板藍(lán)根顆粒各3批置于溫度為37-40℃和相對(duì)濕度75％的條件下進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，每月考察1次，連續(xù)3個(gè)月。
2.主要考察項(xiàng)目是含量測(cè)定，數(shù)據(jù)見(jiàn)下表。
3.色譜條件同實(shí)驗(yàn)例10
試品溶液的制備精密稱取實(shí)驗(yàn)例1藥材顆粒1g和實(shí)驗(yàn)例5制得的顆粒1g，分別5m30％甲醇提取，濾過(guò)，濾液置10ml容量瓶中，用30％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的腺苷約10mg，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相定溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。
表1板藍(lán)根顆粒加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(mg/g)放置時(shí)間(月) 0 1 2301 0.10240.1022 0.1024 0.1021批次 02 0.10200.1019 0.1020 0.101803 0.10230.1024 0.1023 0.1022表2板藍(lán)根藥材加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(mg/g)放置時(shí)間(月) 0 1 2301 0.32520.3252 0.3251 0.3252批次 02 0.38060.3805 0.3804 0.380403 0.31420.3141 0.3140 0.31414.結(jié)論根據(jù)加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可知，上述檢測(cè)板藍(lán)根藥材及其制劑中腺苷含量的方法穩(wěn)定可行。
以下通過(guò)具體藥效學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步證明本發(fā)明的有益效果。
實(shí)施例1 板藍(lán)根滴眼液的體外抗菌試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料1、試驗(yàn)藥物(1)、板藍(lán)根滴眼液紅棕色液體，規(guī)格8ml/支(含生藥4g/8ml)，批號(hào)030401，由實(shí)驗(yàn)例2方法制備，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)例10測(cè)定其中腺苷的含量。試驗(yàn)時(shí)吸取20ml，加入20ml融化的50℃M-H瓊脂(水解酪蛋白瓊脂)培養(yǎng)基混勻后，從40ml中吸出20ml含藥培養(yǎng)基傾倒平皿，余下的20ml含藥培養(yǎng)基中再添加20ml無(wú)藥瓊脂培養(yǎng)基稀釋，混勻后再吸出20ml傾倒平皿，依此類推，即以此二倍稀釋法制備出含板藍(lán)根滴眼液稀釋度為原液的250、125、62.5、31.3、……0.24的系列含藥平皿待用。
(2)、板藍(lán)根注射液紅棕色液體，生藥含量為500mg生藥/ml(每2ml相當(dāng)于板藍(lán)根1g，批號(hào)20030416，由武漢健明藥業(yè)集團(tuán)十堰康迪制藥有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)時(shí)吸取20ml，加入20ml融化的50℃M-H瓊脂培養(yǎng)基混勻后，從40ml中吸出20ml含藥培養(yǎng)基傾倒平皿，余下的20ml含藥培養(yǎng)基中再添加20ml無(wú)藥瓊脂培養(yǎng)基稀釋，混勻后再吸出20ml傾倒平皿，依此類推，即以此二倍稀釋法制備出生藥含量為250、125、62.5、……0.5mg生藥/ml的系列含藥平皿待用。
2、細(xì)菌(1)臨床分離菌株試驗(yàn)所用菌株均為2001-2003年從四川地區(qū)收集的臨床分離致病菌，所有菌種在收集分離的單位(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室)均經(jīng)鑒定后，再經(jīng)本室用API系統(tǒng)(API系統(tǒng)是指細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，是由法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng))重新鑒定后使用。
金黃色葡萄球菌20株、表皮葡萄球菌5株、大腸埃希菌13株、ESBLs大腸埃希菌6株、肺炎克雷伯菌6株、ESBLs肺炎克雷伯菌6株、施氏假單胞4株、產(chǎn)氣桿菌5株、陰溝腸桿菌7株、沙雷菌2株、不動(dòng)桿菌20株，共94株。
(2)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、ESBLs肺炎克雷伯菌ATCC700603以及標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)酶株SHV-1、SHV-2是成都中醫(yī)藥大學(xué)藥理室保存菌株。
3、培養(yǎng)基M-H培養(yǎng)基由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。
M-H肉湯培養(yǎng)基稱取25g，加1000ml蒸餾水，混勻分裝，調(diào)整PH值至7.2-7.4，121℃高壓滅菌20分鐘，用于革藍(lán)陽(yáng)性、陰性需氧菌的藥敏試驗(yàn)。
M-H固體培養(yǎng)基稱取36.5g，加1000ml蒸餾水，混勻分裝，調(diào)整PH值至7.2-7.4，121℃高壓滅菌20分鐘，用于革藍(lán)陽(yáng)性、陰性需氧菌的藥敏試驗(yàn)。
二、試驗(yàn)方法1、最小抑菌濃度的測(cè)定采用瓊脂二倍稀釋法(見(jiàn)《微生物學(xué)》128頁(yè)，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994年5月，)測(cè)定板藍(lán)根滴眼液的最低抑菌濃度(MIC)。將細(xì)菌接種于含不同藥物濃度的瓊脂平皿表面，每點(diǎn)含菌量約為105CFU/ml(CFU即為菌落形成單位，是平板計(jì)數(shù)法的常用單位。)，37℃孵育18-24小時(shí)觀察結(jié)果，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)平皿培養(yǎng)基中所含藥物的最低濃度為藥物對(duì)該菌的最低抑菌濃度(MIC值)。
2、最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定采用液體稀釋法(見(jiàn)《微生物學(xué)》129頁(yè)，上海科學(xué)技術(shù)出版社，1994年5月)測(cè)定板藍(lán)根滴眼液的最小殺菌濃度(MBC)。用M-H肉湯將受試藥液進(jìn)行二倍稀釋后，分別于2ml含藥培養(yǎng)液中接種100ul受試菌液(使終濃度為約105CFU/ml)，置于37℃孵育18-20小時(shí)，肉眼觀察，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)試管中所含藥物的最低濃度為藥物對(duì)該菌的最低抑菌濃度(MIC值)。
將肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的試管的0.01ml培養(yǎng)液涂于不含藥物的瓊脂平皿表面，繼續(xù)37℃孵育18-20小時(shí)后，以瓊脂平皿上未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)試管中的藥物最低濃度作為藥物對(duì)該菌的最低殺菌濃度(MBC)。
三、結(jié)果板藍(lán)根滴眼液對(duì)所試革藍(lán)陽(yáng)性、陰性細(xì)菌均僅有一定的體外抗菌作用。板藍(lán)根滴眼液對(duì)所試革藍(lán)陽(yáng)性菌中金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌有一定的體外抗菌作用，對(duì)所試金葡菌菌株的MIC值范圍為62.5-＞250mg生藥/ml(實(shí)驗(yàn)例10測(cè)定每ml滴眼液中最低含腺苷0.01875mg/ml～0.075mg)，對(duì)所試表葡菌菌株的MIC值均為＞250mg生藥/ml，對(duì)所試革藍(lán)陰性菌中大腸埃希菌、ESBLs大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、ESBLs肺炎克雷伯菌、施氏假單胞菌、產(chǎn)氣桿菌、陰溝腸桿菌、沙雷菌的MIC值范圍均為＞250mg生藥/ml，對(duì)所試不動(dòng)桿菌的MIC值范圍均為125-＞250mg生藥/ml。
板藍(lán)根滴眼液的體外殺菌試驗(yàn)表明板藍(lán)根滴眼液對(duì)所試革藍(lán)陽(yáng)性、陰性細(xì)菌無(wú)殺菌作用。板藍(lán)根滴眼液對(duì)所試大腸桿菌、ESBLs大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌以及不動(dòng)桿菌的殺菌濃度均大于250mg生藥/ml。
表3板藍(lán)根滴眼液的體外殺菌活性

注最低抑菌濃度為62.5mg藥材/ml(采用實(shí)驗(yàn)例10的方法測(cè)定每ml滴眼液中最低含腺苷0.01875mg/ml)即具有抑菌作用。體外抗菌試驗(yàn)中提到＞250mg生藥/ml說(shuō)明板藍(lán)根滴眼液無(wú)最低殺菌濃度，說(shuō)明無(wú)殺菌作用。但濃度為250mg藥材/ml是抑菌效果較強(qiáng)(每ml含腺苷0.075mg)，與抑菌濃度為62.5mg藥材/ml相比，P＜0.05具備顯著性差異，說(shuō)明濃度為250mg藥材/ml是抑菌效果較強(qiáng)(每ml含腺苷0.075mg)具有較強(qiáng)的抑菌作用。
上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明板藍(lán)根滴眼液對(duì)臨床分離的大多數(shù)革藍(lán)陽(yáng)性、陰性細(xì)菌僅有一定體外抗菌作用，無(wú)殺菌作用。
腺苷雖然不是板藍(lán)根制劑的有效成分，但腺苷的含量可從側(cè)面反應(yīng)板藍(lán)根制劑的藥效，因此控制腺苷含量可達(dá)到控制質(zhì)量的目的。當(dāng)板藍(lán)根滴眼液中腺苷含量小于0.075mg/ml，可推知其MIC值小于250mg藥材/ml，抑菌功效差。說(shuō)明控制板藍(lán)根制劑中每制劑單位中腺苷的含量范圍在0.075～2mg，可從側(cè)面控制板藍(lán)根制劑的藥效。
實(shí)施例2板藍(lán)根滴眼液體外抗病毒實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)將板藍(lán)根滴眼液(由實(shí)驗(yàn)例2方法制備，由實(shí)驗(yàn)10方法測(cè)定每ml含腺苷范圍為0.0998～2mg)、原劑型板藍(lán)根注射液(藥品批準(zhǔn)文號(hào)ZZ-5660國(guó)藥準(zhǔn)字Z14021016；規(guī)格2ml/支，含生藥0.5g/ml，批號(hào)200303267；山西晉新雙鶴藥業(yè)公司生產(chǎn)，購(gòu)于成都西部醫(yī)藥集團(tuán)公司)、基質(zhì)液(為無(wú)色透明液體，自制)及陽(yáng)性對(duì)照藥阿昔洛韋滴眼液(阿昔洛韋滴眼液國(guó)藥準(zhǔn)字H 42020646；8ml/支；規(guī)格8ml8mg；批號(hào)為2003101；由湖北潛江制藥股份有限公司生產(chǎn)。購(gòu)于成都西部醫(yī)藥集團(tuán)公司)的原液及1∶10-1∶80稀釋藥液，分別接種Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)觀察。證明板藍(lán)根滴眼液、原劑型板藍(lán)根注射液、基質(zhì)液及陽(yáng)性對(duì)照藥阿昔洛韋滴眼液的原液及1∶10-1∶80稀釋藥液對(duì)Hep-2細(xì)胞(Hep-2細(xì)胞為基質(zhì)檢測(cè)抗核抗體。Hep-2細(xì)胞由汕頭市永恒輝生物工程公司提供，生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液為10％小牛血清Eagles液)無(wú)任何毒性反應(yīng)。
將腺病毒(AdV)3型、4型、7型、8型和單純皰疹病毒(HSV)1型(由首都兒科研究所提供)。與板藍(lán)根滴眼液、原劑型板藍(lán)根注射液、基質(zhì)液及陽(yáng)性對(duì)照藥阿昔洛韋滴眼液的原液及1∶10-1∶80稀釋藥液等量混合作用1小時(shí)后接種Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)觀察。
結(jié)果表明板藍(lán)根滴眼液及原劑型板藍(lán)根注射液的原液(1∶1)對(duì)AdV8型及HSV1型病毒均有抑制細(xì)胞內(nèi)病變作用；對(duì)AdV3、7、4型病毒無(wú)抑制細(xì)胞內(nèi)病變作用。陽(yáng)性對(duì)照藥，阿昔洛韋滴眼液原液(1∶1)對(duì)AdV8及HSV1型病毒均有抑制細(xì)胞內(nèi)病變作用。對(duì)AdV3、7、4型病毒均無(wú)抑制細(xì)胞內(nèi)病變的作用。基質(zhì)液及空白對(duì)照(Hanks液)對(duì)AdV3、7、4、8型及HSV1型病毒均無(wú)抑制細(xì)胞內(nèi)病變的作用。上述實(shí)驗(yàn)證明，板藍(lán)根滴眼液(由實(shí)驗(yàn)例2方法制備，實(shí)驗(yàn)例10方法測(cè)定每ml含腺苷范圍為0.0998～2mg)的范圍內(nèi)，對(duì)AdV8型及HSV1型病毒均有抑制細(xì)胞內(nèi)病變作用，充分說(shuō)明，雖然腺苷不是有效成分，但可從側(cè)面反映板藍(lán)根制劑的療效，通過(guò)控制腺苷達(dá)到控制板藍(lán)根制劑的目的。
通過(guò)上述的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明板藍(lán)根制劑采用腺苷為指標(biāo)性成份，對(duì)普通技術(shù)人員并非顯而易見(jiàn)，通過(guò)對(duì)腺苷的定性定量測(cè)定，可反映板藍(lán)根藥材及其制劑的穩(wěn)定性，達(dá)到控制質(zhì)量的目的，采用腺苷為指標(biāo)性成份，重現(xiàn)性高，穩(wěn)定可控；通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)證明，腺苷雖然不是有效成分，但通過(guò)對(duì)腺苷含量的控制，可從側(cè)面控制板藍(lán)根制劑的療效，使制劑更加穩(wěn)定、可控，為板藍(lán)根藥材及其制劑提供了一種新的質(zhì)量控制方法。
權(quán)利要求
1.板藍(lán)根制劑，它是由中藥板藍(lán)根Radix Isatidis藥材或提取物制備而成，其特征在于每制劑單位中腺苷的含量范圍為0.075～2mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的板藍(lán)根制劑，其特征在于板藍(lán)根藥材中腺苷的含量≥0.3mg/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的板藍(lán)根制劑，其特征在于所述的制劑是滴眼液、原位膠化滴眼液、注射劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、糖漿劑、片劑、丸劑、散劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的板藍(lán)根制劑，其特征在于所述的制劑是滴眼液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的板藍(lán)根制劑，其特征在于所述的滴眼液中腺苷的含量范圍為0.0998～2mg。
6.權(quán)利要求1所述的板藍(lán)根制劑的質(zhì)量控制方法，其特征于它是采用腺苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行定性與定量控制，每制劑單位中腺苷的含量范圍為0.075～2mg。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的板藍(lán)根制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述的定性控制的方法是采用氯仿、醋酸乙酯、異丙醇、水、氨水為展開(kāi)劑，用硅膠GF254薄層板進(jìn)行展開(kāi)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品為腺苷，于紫外燈下，波長(zhǎng)為254nm檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照色譜相應(yīng)處顯相同的暗斑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的板藍(lán)根制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述的定量控制的方法是色譜條件儀器HP1000高效液相色譜儀，G1310A IsoPump泵，G1314A VMD紫外檢測(cè)器；Chemstation數(shù)據(jù)處理軟件；色譜柱Alltima C18 5μm，150mm×4.6mm；流動(dòng)相甲醇-水，體積比為5～12∶88～95或磷酸鹽緩沖液-甲醇，體積比為15～20∶3～10；流速1ml/min；柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；進(jìn)樣量20μl；供試品溶液的制備精密吸取板藍(lán)根制劑，置10ml容量瓶中，用30％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的腺苷約10mg，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相定溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；取以上溶液注入高效液相色譜分析儀，測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的板藍(lán)根制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述的流動(dòng)相甲醇-水，體積比為8∶92。
全文摘要
本發(fā)明提供板藍(lán)根制劑，它是由中藥板藍(lán)根Radix Isatidis藥材或提取物制備而成，其中每制劑單位中腺苷的含量范圍為0.075～2mg，板藍(lán)根藥材中腺苷的含量≥0.3mg/g，采用腺苷為指標(biāo)性成分，重現(xiàn)性高，穩(wěn)定可控，通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)證明，腺苷雖然不是有效成分，但通過(guò)對(duì)腺苷含量的控制，可從側(cè)面控制板藍(lán)根制劑的質(zhì)量與療效，使制劑更加穩(wěn)定、可控，為板藍(lán)根藥材及其制劑提供了一種新的質(zhì)量控制方法。
文檔編號(hào)G01N30/90GK1539454SQ03135688
公開(kāi)日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者陽(yáng)向波, 郭力, 謝永平, 梁恒興 申請(qǐng)人:成都三明藥物研究所