一種用于植物代謝組分析的樣品前處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種高效的新鮮植物組織樣品的代謝組分析快速處理方法，具體地 說，是對茶樹等木本植物新鮮組織(含葉片、嫩莖、根）進行代謝組學(xué)分析測試的快速、無損、 無污染的樣品前處理技術(shù)。該方法處理樣品還可用于品質(zhì)成分分析、RNA提取、蛋白質(zhì)組學(xué) 分析等多種檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 代謝組學(xué)技術(shù)逐漸在品種分析、代謝機理的研究方面體現(xiàn)強大的優(yōu)勢。但是代謝 組學(xué)方法對樣品前處理技術(shù)要求很高，代謝物對環(huán)境變化敏感，處理條件要求較高。由于很 多代謝反應(yīng)可W在1sW內(nèi)發(fā)生，所W樣品前處理過程不僅要求絕對低溫處理，而且所有轉(zhuǎn) 移步驟和操作過程也必須不產(chǎn)生溫度變化。
[0003] 很多組學(xué)研究文獻表明，植物代謝組學(xué)分析中的主要誤差來至樣品準備和前處 理，并提出了植物樣品前處理必須遵守的基本要求，即可重復(fù)性、無損、無污染。然而，現(xiàn)有 用于擬南芥、水稻研究的代謝組學(xué)樣品前處理方法在茶葉等木本植物樣品中的運用具有較 大的局限性，主要表現(xiàn)在： 茶樹等木本植物，組織體積較大、取樣的均一性很容易對結(jié)果造成誤差，因此傳統(tǒng)方法 對實驗人員的技術(shù)熟練程度要求較高。
[0004] 茶樹等木本植物，組織堅硬，對與研磨和提取有更高的要求，傳統(tǒng)研磨方法直接在 敞開的大量液氮中操作，不僅操作危險性高，而且研磨效率極低。
[0005] 茶樹等木本植物富含多種易受環(huán)境影響而氧化的特殊次級代謝成分，特別是茶樹 中富含抗氧化活性極強的多酪類物質(zhì)，對環(huán)境變化巧日空氣暴露，溫度）極為敏感，容易發(fā)生 氧化反應(yīng)。
[0006] 當(dāng)前主要采用研鉢研磨樣品，并添加液氮，需要來回轉(zhuǎn)移，清洗研鉢等過程，該方 法不僅對樣品造成大量的浪費，并且很容易造成污染。
[0007] 總之，當(dāng)前所采用的方法很容易使樣品被污染，可重復(fù)性差，且工作效率低，其樣 品前處理過程費時、費力，對操作人員的熟練程度及工作經(jīng)驗要求較高，與代謝組學(xué)的高通 量技術(shù)要求相違背，所采用的處理方法時間較長，對樣品的影響較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種快速高效的植物組織樣品的代謝組分析快速處理技術(shù)， W解決現(xiàn)有技術(shù)存在的弊端，克服了現(xiàn)有技術(shù)中由于樣品前處理中污染、混樣不均等因素 造成的組學(xué)分析重復(fù)性低等缺陷。
[0009] 實現(xiàn)本發(fā)明的所采用的技術(shù)方案如下： 一種用于植物代謝組分析的樣品前處理方法，其特征在于主要包括如下步驟： 1)取樣、滅活：對植物各組織部位分開取樣立即放入離屯、管中冷凍滅活，離屯、管事先豎 直放置在乘有液氮的盛裝容器中；所述離屯、管由離屯、管主體和離屯、管蓋構(gòu)成，離屯、管主體 的中上部設(shè)有一個用于液氮進出的離屯、管孔，離屯、管蓋上設(shè)有供液氮氣化流出的蓋孔；所 述盛裝容器中液氮的液面高度低于離屯、管主體的管口； 2) 樣品均質(zhì)與研磨：將研磨棒置于液氮中預(yù)冷15min后放入離屯、管中，蓋上離屯、管 蓋，帶手套握住離屯、管蓋置于縱滿振蕩器上高速震蕩進行樣品均質(zhì)和研磨30s; 3) 離屯、過濾：加入置于-20度冰箱中預(yù)冷1小時W上的提取溶劑，離屯、，去除蛋白質(zhì)， 取上清液過0.22μm有機濾膜即可上機器分析。
[0010] 所述的一種用于植物代謝組分析的樣品前處理方法，其特征在于：在樣品均質(zhì)與 研磨后還包括樣品精細研磨：在低于o°c條件下迅速稱取研磨好的樣品粉末0.Ig置于預(yù)冷 的2mL離屯、管中，加入1mL置于-20度冰箱中預(yù)冷1小時W上的提取溶劑，用超聲波輔助 提取10min或加入2粒直徑5mm的不誘鋼鋼珠于離屯、管中，用球磨儀進一步精細研磨。
[0011] 所述的一種用于植物代謝組分析的樣品前處理方法，其特征在于：所述離屯、管為 50ml,離屯、管孔的直徑為1. 5mm，蓋孔直徑2-3mm。
[0012] 所述的一種用于植物代謝組分析的樣品前處理方法在木本植物新鮮組織代謝組 分析的樣品前處理上的應(yīng)用。
[0013] 所述的一種用于植物代謝組分析的樣品前處理方法在茶樹新鮮組織代謝組分析 的樣品前處理上的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明通過對新鮮植物各組織部位分開取樣，采用液氮迅速冷凍滅活，在液氮環(huán) 境中采用高速震蕩進行樣品均質(zhì)和研磨(部分樣品可采用球磨儀和鋼珠進一步精細研磨)， 在得到混合樣品后采用超聲波輔助提取，最后高速離屯、去除蛋白質(zhì)，與現(xiàn)有相比具有如下 有益效果：（1)適用于茶葉等堅硬的木本植物樣品各組織部位(含葉片、新梢、嫩莖、根等部 位）均質(zhì)和研磨；（2)能夠處理體積較大的茶樹組織樣品，適用樣品質(zhì)量范圍為0. 1g至35 g，不需分批次，保證均質(zhì)效果，提高實驗可重復(fù)性；（3)適合微量樣品處理，減少樣品在不 同容器轉(zhuǎn)移過程中的浪費；（4)嚴格低溫環(huán)境，樣品沒有融化解凍，樣品溫度變化極小，保 證樣品最原始狀態(tài)；（5)避免過多容器之間的轉(zhuǎn)移造成的污染和轉(zhuǎn)移的浪費。樣品存儲， 均質(zhì)研磨均在同一容器中進行（50mL離屯、管)，不用來回轉(zhuǎn)移，減少污染；（6)所用樣品容 器為獨立容器，比常規(guī)方法中使用研鉢來回轉(zhuǎn)移效率更高、處理樣品時間更短；（7)采用兩 步研磨法(震蕩粗磨加精細球磨）可W很好的處理根等樣品，同時也提高了球磨取樣的均一 性；避免操作過程中液氮的直接接觸，提高了操作的安全性。
[0015] 綜上，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)方法溫度變化、容易被污染、樣品浪費多、可重復(fù)性較差、 混樣不均、工作效率較低、操作危險系數(shù)高、對操作人員的熟練程度及工作經(jīng)驗要求高等眾 多不足之處和技術(shù)難點。該發(fā)明能夠很好的運用于茶樹等木本植物樣品堅硬組織取樣、均 質(zhì)、研磨、提取的前處理方法，是一種對茶樹組織(含葉片、嫩莖、根）進行代謝組學(xué)分析測試 的快速、無損、無污染的樣品前處理技術(shù)，該方法處理樣品還可用于品質(zhì)成分分析、RNA提 取、蛋白質(zhì)組學(xué)分析等。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明中離屯、管的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為方法操作流程圖；(a)取樣、滅活；化）研磨棒預(yù)冷；（C)加研磨棒和離屯、管蓋； (d)樣品均質(zhì)與震蕩研磨；（e)研磨完成； 圖3為專利方法和傳統(tǒng)方法前處理樣品代謝輪廓(負離子模式）； 圖4為專利方法和傳統(tǒng)方法前處理樣品代謝物聚類及熱圖分析結(jié)果； 圖5為專利方法和傳統(tǒng)方法前處理樣品代謝物主成分分析結(jié)果； 圖中：1-離屯、管主體；2-離屯、管蓋；3-管孔；4-蓋孔；5研磨棒；6-盛裝容器。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步具體說明。W下實施例中所述的50ml離屯、管由 離屯、管主體1和離屯、管蓋2構(gòu)成，離屯、管主體1的管壁中部設(shè)有孔徑為1. 5mm管孔3,用 于液氮自動浸入和流出；管蓋2上設(shè)有1-2個孔徑為2-3mm蓋孔4,用于殘留液氮氣化排 出。研磨棒為5cmX2cm陶瓷研磨棒；振蕩器為100W，300r/min振蕩器，設(shè)置為化11 模式；提取試劑為79%甲醇溶液。
[0018] 實施例1茶樹新梢及葉片樣品前處理 W龍井43茶樹兩年生桿插苗為材料，對照組茶樹樣品采用15Γ恒溫培養(yǎng)，實驗組樣品 采用25°C恒溫培養(yǎng)。實驗設(shè)6個生物學(xué)重復(fù)，獨立取樣檢測。培養(yǎng)處理1周后取新梢葉片 用于代謝組學(xué)分析。
[0019] 專利方法為：葉片樣品立即放入50ml離屯、管于液氮中滅活(離屯、管事先豎直放 置在乘有液氮的盛裝容器6中，盛裝容器6中液氮的液面高度低于離屯、管主體1的管口，下 同）。每管樣品約30g(研磨后為離屯、管體積的1/3)，將5cm研磨棒置于液氮中預(yù)冷15 min后放入離屯、管中，蓋上離屯、管蓋