專利名稱：Lc-ms非靶向性煙草代謝組學(xué)樣品提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及煙草代謝組學(xué)樣品提取方法，本發(fā)明以LC-MS為分析平臺(tái)，對(duì)影響煙草提前效果的四個(gè)因素在三個(gè)水平上進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，分別采用了 ESI (+，_)離子模式，分析出最佳的適合煙草葉片的最佳提取方法。
背景技術(shù)：
代謝物作為生物體中的終產(chǎn)物，在很多時(shí)候其差異比生物體相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平顯示的差異要大，是代謝組學(xué)分析較之其他“組學(xué)”的優(yōu)勢(shì)之一(漆小泉，王玉蘭，陳曉亞，2011，植物代謝組學(xué)-方法與應(yīng)用，P58-60，化學(xué)工業(yè)出版社)。同時(shí)也正是因?yàn)樯锎x途徑對(duì)外界環(huán)境擾動(dòng)的敏感，造成不同生物個(gè)體之間的代謝物組成及含量差異很大。已經(jīng)有研究表明，即便是在嚴(yán)格控制的生長(zhǎng)條件下，分析樣品之間代謝組的生物差異也要高于其他系統(tǒng)差異好幾倍(Roessner et al.，2000)。所以在樣品取材、提取方法及分析方法盡量保持一致，以盡量避免引入系統(tǒng)誤差。代謝組學(xué)研究中最容易引入系統(tǒng)誤差的是樣品制備過(guò)程，標(biāo)準(zhǔn)的植物代謝物樣品制備分為組織取樣、勻漿、抽提、保存和樣品預(yù)處理等步驟(Fukusaki and Kobayashi, 2005)。代謝產(chǎn)物通常用水和有機(jī)溶劑(如甲醇和乙腈等)分別提取，獲得水提取物和有機(jī)溶劑提取物，從而把非極性的親脂相和極性相分開。然而植物代謝物千差萬(wàn)別，其中很多物質(zhì)稍受干擾，結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生改變，且對(duì)其分析鑒定所采用的設(shè)備也不同。目前還沒有通用所有代謝物的抽提方法，只能根據(jù)所要分析的代謝物特性及使用的鑒定手段選擇合適的提取方法，同時(shí)抽提時(shí)間、溫度、溶劑成分和質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)者的技巧等諸多因素也將影響樣品制備的水平。煙草代謝組學(xué)研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，對(duì)于其代謝組學(xué)樣品的提取方法沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此建立高效、快速、重現(xiàn)性好得煙草代謝組學(xué)樣品提取方法對(duì)促進(jìn)煙草代謝組學(xué)研究，加強(qiáng)相關(guān)研究者之間進(jìn)行數(shù)據(jù)交流具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種基于LC-MS煙草代謝組學(xué)樣品提取方法，實(shí)現(xiàn)煙草代謝組學(xué)樣品的快速、高效、快速提取。該技術(shù)具有分析方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)效率高、重現(xiàn)性好得特點(diǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明的LC-MS非靶向性煙草代謝組學(xué)樣品提取方法包括以下工藝步驟
1)植物勻質(zhì)化方法煙草樣品液氮冷凍，球磨儀打碎；
2)研磨好樣品加入75%酸化(O.1%蟻酸)甲醇，25°C下超聲提取20 min ；3)提取完樣品室溫下(20°0高速(20 OOOg)離心10 min，上清用20 μ m微孔濾膜過(guò)濾。在本發(fā)明中，所述煙草樣品為新鮮組織樣品(非調(diào)制煙葉或花、根、莖等新鮮組織器官)。液氮冷凍的溫度為-196°C，樣品需完全浸沒在液氮中。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
I.提供了一種最適合煙草葉片的最佳提取方法，對(duì)促進(jìn)煙草代謝組學(xué)研究、建立統(tǒng)一的提取方法標(biāo)準(zhǔn)、加強(qiáng)相關(guān)研究者之間進(jìn)行數(shù)據(jù)交流具有重要意義。 2.操作簡(jiǎn)單、快捷，試劑相對(duì)便宜，毒性較小。3.獲得代謝物峰數(shù)據(jù)較大，切對(duì)樣品重現(xiàn)性較好。


圖I為本發(fā)明工藝流程圖。圖2為9種提取方法的實(shí)驗(yàn)樣本TIC輪廓譜比較。圖3為采用本發(fā)明方法對(duì)煙草白花突變體花瓣進(jìn)行6次重復(fù)的進(jìn)樣分析結(jié)果總粒子流色譜圖(Total particles chromatogram, TIC)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)施例做進(jìn)一步描述 實(shí)施案例
O不同提取方法提取效果比較
表1-1影響代謝物提取效果的因素及各種水平
I提取溶劑I提取方式I提取時(shí)間I提取溫度
水平I甲醇(O. IFA)_超聲 IOmin4°C_
采平甲醇氯仿水5:2:2 —震動(dòng) _20min25°C
采平3|乙腈(0. 1FA)I靜置 |40min丨50°〇
根據(jù)上面的四因素三水平設(shè)計(jì)正交設(shè)計(jì)表格
表1-2煙草代謝物提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)正交設(shè)計(jì)表L9 (34)
_號(hào)I提取溶劑I提取方式I提取時(shí)間I提取溫度
1_溶劑 A (Al)_超聲(BI)10 (Cl)_4 (Dl)_
2溶劑 A (Al) 一震搖(B2)20~(C2)25 (D2)
3溶劑 A (Al)-靜置(B3)40 (C3)50 (D3)
4B (A2)超聲(BI)20 (C2) 一 50 (D3)—
5溶劑 B(A2) _震搖(B2)40 (C3)4 (Dl)
6溶劑 B(A2)-靜置(B3)10 (Cl)25 (D2)
7C (A3)超聲(BI)40 (C3) 一25 (D2)—
8溶劑 C (A3) 一震搖(B2)~(Cl)50 (D3)
9I溶劑 C (A3)I靜置(B3)丨20 (C2)K (Dl)
注=A 甲醇(O. 1% FA)，B:甲醇:氯仿:水 5:2:2，C:乙腈(0. 1% FA)
提取溶劑用量A，B，C按照V/W=3:1比例(單位ml/g)，如0. 5g鮮重，加I. 5mL提取溶劑。萃取分相提取后加入0. 4mL ddH20,使得上層水相體積約I. 5mL。
色譜質(zhì)譜分析條件進(jìn)樣量5ul，柱溫30度。流動(dòng)相組成A水(O. 1%FA), B乙腈(O. IFA), UPLC梯度洗脫程序如下
表1-3煙草代謝物提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)色譜梯度洗脫參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種LC-MS非靶向性煙草代謝組學(xué)樣品提取方法，其特征在于包括以下工藝步驟 1)植物勻質(zhì)化方法煙草樣品液氮冷凍，球磨儀打碎； 2)研磨好樣品加入75%酸化(0.1%蟻酸)甲醇，25°C下超聲提取20 min ； 3)提取完樣品室溫下(20°C)高速離心10 min,上清用20 y m微孔濾膜過(guò)濾。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的LC-MS非靶向性煙草代謝組學(xué)樣品提取方法，其特征在于所述煙草樣品為新鮮組織樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的LC-MS非靶向性煙草代謝組學(xué)樣品提取方法，其特征在于液氮冷凍的溫度為_196°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的LC-MS非靶向性煙草代謝組學(xué)樣品提取方法，其特征在于高速離心時(shí)離心力20000g。
全文摘要
一種LC-MS非靶向性煙草代謝組學(xué)樣品提取方法，其特征在于包括以下工藝步驟1)植物勻質(zhì)化方法煙草樣品液氮冷凍，球磨儀打碎；2)研磨好樣品加入75%酸化(0.1%蟻酸)甲醇，25℃下超聲提取20min；3)提取完樣品室溫下(20℃)高速(20000g)離心10min，上清用20μm微孔濾膜過(guò)濾。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、提供了一種最適合煙草葉片的最佳提取方法，對(duì)促進(jìn)煙草代謝組學(xué)研究、建立統(tǒng)一的提取方法標(biāo)準(zhǔn)、加強(qiáng)相關(guān)研究者之間進(jìn)行數(shù)據(jù)交流具有重要意義。2、操作簡(jiǎn)單、快捷，試劑相對(duì)便宜，毒性較小。3、獲得代謝物峰數(shù)據(jù)較大，且對(duì)樣品重現(xiàn)性較好。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102636594SQ20121010843
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月14日
發(fā)明者周會(huì)娜, 曹培健, 李鋒, 楊軍, 林福呈, 王燃, 羅朝鵬, 翟妞, 許亞龍, 金立鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院