一種用于動(dòng)物組織核酸提取的磁性微球的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種磁性微球及其制備方法，更具體來說，涉及用于動(dòng)物組織核酸提取的磁性微球及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物疾病對(duì)畜牧業(yè)以及人類的食品安全都有著重要的影響，采用分子生物學(xué)方法對(duì)動(dòng)物組織進(jìn)行病原菌診斷能夠獲得最準(zhǔn)確的結(jié)果。關(guān)鍵步驟是要從動(dòng)物組織樣品中提取細(xì)菌或病毒的DNA。能獲取不同種類的細(xì)菌DNA或不同種類病毒的DNA，以及基因組的完整性、純度和濃度，是從動(dòng)物組織中提取DNA用于動(dòng)物病原菌診斷的首要目標(biāo)。
[0003]現(xiàn)有的DNA提取過程中常常有污染，并且步驟繁瑣，提取過程時(shí)間較長。如高氯酸鈉法、SDS法和尿素法等提取方法，但這些方法需要樣本量較大，并且苯酚類等有機(jī)物容易在DNA溶液中殘留，特別是在后續(xù)的PCR擴(kuò)增過程中會(huì)干擾擴(kuò)增過程，影響擴(kuò)增結(jié)果，使得該方法的應(yīng)用受到一定的限制。
[0004]磁性微球在外加磁力的作用下，可快速分離純化核酸DNA/RNA，因安全并易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化而迅速發(fā)展。磁性微球核酸提取方法是指以超順磁性的磁性微球在高鹽、低PH溶液中吸附核酸，而在低鹽溶液中將核酸從磁性微球表面脫離的原理進(jìn)行核酸提取的方法。
[0005]現(xiàn)有的磁性微球通常是由四氧化三鐵或三氧化二鐵等磁芯與二氧化硅等材料復(fù)合而成的具有一定磁性的球形微粒。中國發(fā)明專利(CN1217352)公開了一種二氧化硅包覆四氧化三鐵的磁性微球的制備方法，其采用酸化法在四氧化三鐵表面沉積二氧化硅。而加入的酸性物質(zhì)(HCl)會(huì)在一定程度上與磁芯四氧化三鐵發(fā)生反應(yīng)，從而會(huì)對(duì)磁性微球的磁性產(chǎn)生不確定性影響，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述【背景技術(shù)】中存在的某些和某個(gè)問題，提供一種用于動(dòng)物組織核酸提取的磁性微球及其制備方法。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的用于動(dòng)物組織核酸提取的磁性微球的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將聚碳硅烷固體溶解到有機(jī)苯類溶劑中，形成乳液；
[0009](2)將納米級(jí)磁性粉體加入到含有表面活性劑的有機(jī)醇類溶劑中，攪拌均勻形成懸浮液；
[0010](3)將步驟⑵中的懸浮液加入到步驟⑴中的乳液中，攪拌均勻，得到混合液；其中聚碳硅烷與磁性粉體的質(zhì)量比為2-5:1 ;
[0011](4)將混合液通過微孔膜滴入到含有交聯(lián)劑的溫水溶液中；水溫保持在60_90°C，使得混合液中的聚碳硅烷交聯(lián)固化在磁性粉體表面；
[0012](5)利用減壓蒸餾手段將水分和有機(jī)溶劑去除，得到聚碳硅烷包覆磁性粉體的固體微球；
[0013](6)將固體微球在500_1000°C下、氮?dú)饣蚨栊詺怏w保護(hù)下進(jìn)行保溫1_2小時(shí)，聚碳硅烷裂解后形成表面多孔的固體微球；
[0014](7)將熱處理后的固體微球通過磁分離手段進(jìn)行篩選，篩選出合格的成品磁性微球。
[0015]步驟(I)中，有機(jī)苯類溶劑選自甲苯、二甲苯和二乙烯基苯中的一種或幾種組合。聚碳硅烷與有機(jī)苯類溶劑的質(zhì)量比優(yōu)選控制在1-1.5:1，在該配比范圍內(nèi)，形成的乳液能夠保持適中的粘度，以便于后續(xù)的混合。
[0016]步驟(2)中，有機(jī)醇類溶劑選自乙醇或乙二醇；表面活性劑選自二辛基琥珀酸磺酸鈉、十烷基硫酸鈉、溴化十烷基三甲基銨或溴化十烷基銨。上述表面活性劑能夠與有機(jī)醇互溶，從而能夠?qū)⒓{米磁性粉體充分分散并懸浮。其中磁性粉體為鐵、鈷、鎳或它們的合金，也可以為Fe304。磁性粉體的粒徑優(yōu)選為lnm-30nm，在該粒徑范圍內(nèi)的磁性粉體具有超順磁性，即當(dāng)外加磁場(chǎng)撤去后，磁性粉體無剩磁，從而不會(huì)發(fā)生聚集。
[0017]步驟(2)中，磁性粉體與有機(jī)醇類溶劑的質(zhì)量比優(yōu)選為1-3:1，表面活性劑與有機(jī)醇類溶劑的質(zhì)量比優(yōu)選為0.05-0.2:1。在這些配比條件下，磁性粉體不僅能夠很好地分散，并且具有相對(duì)高的濃度，從而為最終產(chǎn)品的磁強(qiáng)度提供的保證。
[0018]步驟(4)中，交聯(lián)劑選自N，N_亞甲基雙丙烯酰胺或氨丙啶，這兩種交聯(lián)劑能夠與水互溶，交聯(lián)劑與水的質(zhì)量比優(yōu)選為0.05-0.2:1。在該步驟中，微孔膜的孔徑優(yōu)選為1-50 μ m，更優(yōu)選為10-30 μ m。通過微孔膜的液滴進(jìn)入溫水溶液后，形成尺寸均一的水包油球形結(jié)構(gòu)，并且球形結(jié)構(gòu)表面的聚碳硅烷在交聯(lián)劑和溫度促進(jìn)作用下，迅速發(fā)生交聯(lián)固化，從而均勻包覆住磁性粉體。
[0019]步驟￠)中，對(duì)固體微球進(jìn)行熱處理，包覆在磁性粉體表面的聚碳硅烷發(fā)生裂解，一些小分子碳?xì)浠衔飺]發(fā)出去，從而形成多孔包覆層。其中升溫速率尤為關(guān)鍵，若采用普通的熱處理升溫速率(5-30°C /min)，聚碳硅烷的裂解速度過快，就會(huì)發(fā)生發(fā)泡和結(jié)構(gòu)崩塌。本發(fā)明的發(fā)明人在采用0.1-2°C /min的超低升溫速率時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)聚碳硅烷的裂解得以緩慢進(jìn)行，從而形成主要為0.01 μπι以下孔徑的超微孔，這對(duì)磁性微球應(yīng)用過程中吸附核酸具有非常重要的作用。
[0020]通過步驟￠)的熱處理，聚碳硅烷裂解后形成主要成分為碳化硅的包覆層，不僅具有多孔結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有較高的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，并且與磁性粉體結(jié)合緊密。
[0021]步驟(7)中，采用磁分離手段，對(duì)得到的磁性微球進(jìn)行篩選，去除沒有磁性或磁性不夠要求的不合格磁性微球，最終得到符合磁性要求的合格磁性微球成品。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的磁性微球，粒徑均一可控，比表面積大，具有超順磁性，可快速高效分離提純動(dòng)物組織核酸，在動(dòng)物疫病(如禽流感、口蹄疫、豬瘟、藍(lán)耳病等)檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面通過具體實(shí)施例來介紹本發(fā)明的用于動(dòng)物組織核酸提取的磁性微球的制備方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面描述的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明的示例性說明，而非用于對(duì)其作出任何限制。
[0024]實(shí)施例1
[0025]稱取聚碳娃燒固體1000g，研磨成粉末后，加入到盛有100g甲苯的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，在水浴40°C下旋轉(zhuǎn)溶解形成乳液。在燒杯中先加入300g的乙醇，再加入20g的二辛基琥珀酸磺酸鈉，攪拌均勻后，將500g的納米鐵粉(粒徑為30nm以下)加入到燒杯中，攪拌10分鐘，形成懸浮液。將制備的懸浮液緩慢加入到制備的乳液中，攪拌均勻，得到混合液。在收集容器中加入100g去離子水，并加入1