一種新型雙水相高速逆流色譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明為一種新型雙水相高速逆流色譜，將親水性醇或酮、無機(jī)鹽和水組成的雙水相溶劑體系的一相作為固定相，另一相作為流動(dòng)相，通過J-型螺旋管高速逆流色譜儀實(shí)現(xiàn)強(qiáng)極性化合物的分離。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，水煎湯劑是中藥臨床應(yīng)用最廣泛的劑型之一，其藥效物質(zhì)的主體必定由大量強(qiáng)極性組分構(gòu)成，事實(shí)也證明了強(qiáng)極性化合物對(duì)人體的健康發(fā)揮著重要的作用。然而，中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究更多的關(guān)注弱極性和中等極性化合物，對(duì)強(qiáng)極性化合物較少涉足。對(duì)這些強(qiáng)極性組分的物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理藥效的研究將會(huì)開辟一片新的中藥研究領(lǐng)域，其中物質(zhì)基礎(chǔ)研究又是后續(xù)研究的必要保證。但強(qiáng)極性中藥組分的分離一直是中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的難點(diǎn)，這主要是因?yàn)閺?qiáng)極性中藥藥效物質(zhì)從前期的萃取富集到單體化合物的分離制備存在諸多問題，首先，大多數(shù)中藥材的傳統(tǒng)前處理過程為有機(jī)溶劑萃取，以達(dá)到藥效物質(zhì)初步富集的目的，但有機(jī)溶劑極性有限，致使大量的強(qiáng)極性化合物在萃取步驟中已部分或完全損失；再者，強(qiáng)極性化合物的分子結(jié)構(gòu)中大多含有羧基、磺酸基、氨基、糖基等極性基團(tuán)，這些基團(tuán)的存在大大增加了化合物的親水性和不穩(wěn)定性使其在常規(guī)的反相色譜柱上保留很弱，甚至沒有保留。目前的色譜分離方法還不能實(shí)現(xiàn)強(qiáng)極性化合物的良好分離。
[0003]高速逆流色譜(High-speedcountercurrent chromatography, HSCCC)是一種成功的液/液分配色譜，廣泛應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)的分離制備。但一直以來，受到有機(jī)/水兩相溶劑體系極性的限制，高速逆流色譜更多的適用于非極性和中等極性化合物的分離，即使是極性最強(qiáng)的正丁醇-乙酸-水體系仍然不能滿足大多數(shù)強(qiáng)極性中藥藥效物質(zhì)的分離需要。為滿足強(qiáng)極性中藥藥效物質(zhì)分離純化的需要，目前國(guó)內(nèi)外，除研制新型逆流色譜儀夕卜，研究最為活躍的有兩個(gè)方向，一是在傳統(tǒng)有機(jī)/水兩相溶劑體系基礎(chǔ)上發(fā)展新的洗脫方法，如正相和反相洗脫、雙轉(zhuǎn)向洗脫、梯度洗脫(pH梯度、極性梯度)等，在一定程度上解決了強(qiáng)極性中藥藥效物質(zhì)的分離問題。二是新型溶劑體系的提出，包括PH區(qū)帶體系(pH-Zonesystem)、離子對(duì)體系(1n pair system)、雙水相體系(Aqueous two-phase system)、三相體系(Three phase system)、液 / 液 / 固三相體系(Liquid/liquid/solid three-phasesystem)和離子液體體系(1nic liquid system)等親水溶劑體系以適用于強(qiáng)極性中藥藥效物質(zhì)的分離。但目前發(fā)展的新型溶劑體系大多數(shù)都需要在特制的逆流色譜儀中運(yùn)行，尚無法實(shí)現(xiàn)普及應(yīng)用。
[0004]1990年，Greve和Kula首次報(bào)道了由親水性醇、水和無機(jī)鹽組成的新型雙水相體系，該體系與傳統(tǒng)的雙水相體系相比，具有極性更強(qiáng)，黏度更低、且廉價(jià)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。盡管新型雙水相溶劑體系在國(guó)內(nèi)外的研究才剛剛起步，但在強(qiáng)極性中藥藥效物質(zhì)和化工產(chǎn)品的萃取富集及蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)的除去方面已表現(xiàn)出廣闊的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用空間。如譚天偉院士在國(guó)內(nèi)首先報(bào)道了應(yīng)用乙醇/磷酸鹽體系萃取甘草中的甘草酸鉀(b1technologyLetter24 (2002) 1417-1420);修志龍教授將該體系成功應(yīng)用于發(fā)酵液中1，3-丙二醇等化工產(chǎn)品的萃取分離(Separat1n and Purificat1n Technology66 (2009) 472-478)。然而面對(duì)組成復(fù)雜的中藥提取物，僅利用單級(jí)，甚至多級(jí)萃取均無法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的單體制備，將新型雙水相體系應(yīng)用于目前廣泛應(yīng)用的高速逆流色譜技術(shù)中有望解決這一難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于突破有機(jī)/水兩相溶劑體系高速逆流色譜技術(shù)分離強(qiáng)極性中藥藥效物質(zhì)時(shí)，溶劑體系極性低，分離度差、回收率低、保留時(shí)間長(zhǎng)等制備問題，提供一種采用新型雙水相溶劑體系的高速逆流色譜新方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0007]一種新型雙水相高速逆流色譜:是將醇水雙相新型雙水相溶劑體系的一相作為固定相，另一相作為流動(dòng)相應(yīng)用于高速逆流色譜，所述的新型雙水相溶劑體系由中等極性有機(jī)溶劑、親水性醇或酮、無機(jī)鹽和水組成。
[0008]所述的高速逆流色譜儀為J-型半制備高速逆流色譜儀，配備三個(gè)串聯(lián)的螺旋管柱，柱體積210mL，螺旋管自轉(zhuǎn)半徑和公轉(zhuǎn)半徑之比(β值)0.5-0.8。
[0009]所述新型雙水相溶劑體系中的中等極性有機(jī)溶劑為正丁醇，親水性醇或酮為乙醇，無機(jī)鹽為飽和硫酸銨和水組成，它們的體積比在(0-10):(1-10):10:10 (V:V)的范圍內(nèi)配制。
[0010]所述新型雙水相體系配置溫度和分配系數(shù)測(cè)定溫度一致，為30-40°C。
[0011]所述的J-型螺旋管高速逆流色譜儀和所述的兩組新型雙水相溶劑體系優(yōu)選洗脫方式，采用下相為流動(dòng)相由首端向尾端洗脫或上相為流動(dòng)相由尾端向首端洗脫方式。
[0012]所述的的洗脫方式中，高速逆流色譜儀的運(yùn)行參數(shù)為:溫度在30-40 °C，開啟高速逆流色譜儀，主機(jī)正轉(zhuǎn)或反轉(zhuǎn)，主機(jī)轉(zhuǎn)速為700-900rpm，并以0.6-1.5mL/min的流速將流動(dòng)相泵入分離柱內(nèi)，整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡，可通過進(jìn)樣閥注入樣品。
[0013]本發(fā)明提供一種使用新型雙水相高速逆流色譜技術(shù)分離強(qiáng)極性化合物的新方法，包括如下步驟:
[0014]步驟I)強(qiáng)極性化合物分配系數(shù)的測(cè)定:采用高效液相色譜法測(cè)定化合物在上、下相體系中濃度，計(jì)算分配系數(shù)；
[0015]步驟2)制備構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系:根據(jù)步驟I)確定化合物極性，選取適用于目標(biāo)化合物分離的新型雙水相有機(jī)溶劑體系，所述的溶劑體系由四組分構(gòu)成:A組分可選自正丁醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯等疏水性有機(jī)溶劑組分可選自甲醇、乙醇、正丙醇和異丙醇等親水性有機(jī)溶劑；C組分可選自氯化鈉、硫酸銨、碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉和磷酸鉀、磷酸鈉等無機(jī)鹽；D組分為水。優(yōu)選正丁醇-乙醇-硫酸銨-水溶劑體系。
[0016]在正丁醇-乙醇-飽和硫酸銨-水溶劑體系中，他們的體積比可以在(0-10):(10-0):10:10 的范圍內(nèi)配制，例如 10:0:10:10 ；2:8:10:10 ；5:5:10:10 ；8:2:10:10 ；0:
10:10:10等。當(dāng)其中的正丁醇比例變?yōu)镺時(shí)，體系變?yōu)橐掖?硫酸銨-水體系。
[0017]步驟3)選擇高速逆流色譜洗脫方式:根據(jù)步驟2)所選溶劑體系的組成和比例確定洗脫方式，以獲得50%以上的固定相保留，所述洗脫方式主要有四種:第一種，上相為固定相，下相為流動(dòng)相由尾端向首端洗脫；第二種，上相為固定相，下相為流動(dòng)相由首端向尾端洗脫。第三種，下相為固定相，上相為流動(dòng)相由尾端向首端洗脫；第四種，下相為固定相，上相為流動(dòng)相由首端向尾端洗脫；針對(duì)溶劑體系組成，采用第二種和第三種洗脫方式，固定相保留將更高。
[0018]步驟4)使用新型雙水相高速逆流色譜分離強(qiáng)極性化合物:將步驟2)選定的溶劑體系按照步驟3)所述的洗脫方式，使逆流色譜儀中注滿固定相，然后使其主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收目標(biāo)成分。
[0019]本技術(shù)的有益效果在于:本方法采用了普遍應(yīng)用的J-型螺旋管柱高速逆流色譜儀，