專(zhuān)利名稱(chēng):制備型等電點(diǎn)電泳分離方法及設(shè)備的制作方法
本發(fā)明涉及一種用于分離兩性生物物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽)的制備型等電點(diǎn)電泳分離方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域：
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在已有技術(shù)中，有一種多腔室的等電聚焦裝置，名稱(chēng)為“多腔室電泳裝置中的等電聚焦”，出自一篇由瑪茨·喬納森(Mats.Jonsson)和哈里·黎泊(Harry.Rilbe)所寫(xiě)的名為“Large-scale fracitionationof proteins by isoelectric focusing in a multi-compartment electrolysisapparatus”的論文，發(fā)表于《電泳》雜志1980年第一期第3頁(yè)到第14頁(yè)(Electrophoresis，1，P3-14(1980))。該技術(shù)利用載體兩性電解質(zhì)溶液形成的連續(xù)的pH梯度場(chǎng)為背景，蛋白質(zhì)根據(jù)各自等電點(diǎn)的不同在相應(yīng)的pH背景下聚焦而得以分離，并提出了相應(yīng)的分離設(shè)備。其核心部分為一個(gè)長(zhǎng)圓柱形電泳槽，由相隔一定間距的隔膜將其分隔為數(shù)十個(gè)腔室，如
附圖一所示分離前，將載體兩性電解質(zhì)溶液與待分蛋白質(zhì)樣品均勻混合后注入各腔室中；分離時(shí)，在電泳槽的兩端加直流電壓，載體兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)作用下發(fā)生電遷移，形成由正極到負(fù)極pH值逐漸升高的梯度，蛋白質(zhì)在相異于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中不能保持電中性，因而在電場(chǎng)作用下發(fā)生電泳遷移，穿過(guò)隔膜，在相當(dāng)于其等電點(diǎn)的pH值的腔室中聚焦，電泳產(chǎn)生的熱量通過(guò)一套復(fù)雜的內(nèi)循環(huán)冷卻系統(tǒng)帶走，這樣經(jīng)過(guò)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間(2-3天)后，聚焦結(jié)束，具有不同等電點(diǎn)的蛋白相互分開(kāi)在不同的腔室中；最后打開(kāi)各腔室的樣品出口，分別收集樣品液，在某一個(gè)或與之相鄰的幾個(gè)腔室中就得到純化了的目標(biāo)蛋白質(zhì)組分。
該技術(shù)的缺點(diǎn)是(1)需要大量?jī)r(jià)格昂貴的載體兩性電解質(zhì)，另外在后續(xù)處理中還需通過(guò)透析等方法除去目標(biāo)組分樣品中混雜的載體兩性電解質(zhì)，使分離的成本很高；(2)由于蛋白質(zhì)的遷移距離很長(zhǎng)，電極間距大，而提高場(chǎng)強(qiáng)又受到裝置的換熱能力的限制，造成該法分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，處理量較低。
在已有技術(shù)中，還有一種多腔室的循環(huán)流動(dòng)等電聚焦裝置，名稱(chēng)為“使用非載體兩性電解質(zhì)緩沖劑的等電聚焦”，出自一篇由皮埃爾·溫格爾(Pierre.Wenger)和菲里蒲·杰夫特(Philippe.Javet)所寫(xiě)的名為“Isoelectric focusing using non-amphoteric buffers in freesolutionII.Apparatus and measures of pH stability”的論文，發(fā)表于《生物化學(xué)和生物物理方法》雜志1986年第13期第275頁(yè)到第287頁(yè)(Journal of Biochemical and Biophysical Methods，13，P275-287(1986))。該技術(shù)采用多腔室的循環(huán)流動(dòng)的形式，利用簡(jiǎn)單緩沖液(不含載體兩性電解質(zhì))在電場(chǎng)作用下形成的pH梯度作為等電聚焦的背景，用以分離氨基酸和蛋白質(zhì)，并提出了相應(yīng)的分離設(shè)備。如附圖二所示1 為一個(gè)多腔室的電泳槽，2 為織物支撐的瓊脂糖凝膠膜，3為離子交換膜，4 為換熱器，5 為電極液貯槽，6 為緩沖液貯槽。凝膠膜和離子交換膜將電泳槽分隔成相互平行的若干腔室和二個(gè)電極室，在電極室中通入電極液，中間的各腔室中通入醋酸—醋酸鈉緩沖液，電極液和緩沖液都在相互獨(dú)立的通路中循環(huán)，在電泳槽的兩側(cè)加載直流電壓，在電場(chǎng)作用下，緩沖液中的一部分離子發(fā)生電泳遷移，通過(guò)凝膠膜和離子交換膜進(jìn)入鄰近的腔室，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，各腔室的pH值發(fā)生變化，形成從陰極到陽(yáng)極逐漸升高的pH梯度，并使用此pH梯度作為等電聚焦的背景。
該技術(shù)的缺點(diǎn)是(1)形成的pH梯度不夠穩(wěn)定，各腔室的pH值容易發(fā)生漂移，很難用簡(jiǎn)便的方法校正每一個(gè)腔室的pH值；(2)其分離精度的提高受腔室數(shù)目的制約，過(guò)多的腔室數(shù)目將給操作帶來(lái)極大的不便，所以只能用于粗分，難以分離等電點(diǎn)接近的樣品。
本發(fā)明的目的是提出一種新型電泳分離方法，應(yīng)用等電聚焦的原理，使用簡(jiǎn)單緩沖液來(lái)形成一個(gè)穩(wěn)定的單一pH值，而不是一個(gè)穩(wěn)定的pH梯度作為分離的背景，其目的是分離一個(gè)目標(biāo)產(chǎn)品而不是一系列產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的在垂直放置的二個(gè)相互平行的窄長(zhǎng)電極之間，沿電極的長(zhǎng)度方向平行設(shè)置二張到四張凝膠膜，它們將電極之間的空間分隔成三到五個(gè)相互平行的腔室，中間的腔室為分離室，分離室的兩側(cè)為沖洗室，分離進(jìn)行時(shí)，分離室內(nèi)通入pH值調(diào)至目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI值)的待分離的樣品液，兩側(cè)沖洗室中通入pH值等于目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)且電導(dǎo)小的緩沖液，兩電極之間加載恒定的直流電壓。
下面結(jié)合附圖，詳細(xì)介紹本發(fā)明的內(nèi)容。
附圖三是制備型等電點(diǎn)電泳分離方法原理圖。
圖中7為電極，8為凝膠膜，9為通入的樣品液，9a為分離室，10為通入的緩沖液，10a為沖洗室，11為目標(biāo)蛋白質(zhì)，12為等電點(diǎn)(pI值)大于目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的雜蛋白，13為等電點(diǎn)(pI值)小于目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的雜蛋白。
其分離過(guò)程是分離室9a通入pH值調(diào)至目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI值)的待分離的樣品液，沖洗室10a通入pH值等于目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的緩沖液，兩電極7之間加載恒定的直流電壓。在這樣的pH值條件下目標(biāo)蛋白質(zhì)分子11(附圖三中以小園圈表示)總體上呈電中性，因此在電場(chǎng)作用下不發(fā)生電泳遷移；而其它等電點(diǎn)與目標(biāo)蛋白有差別的雜蛋白在此條件下則帶正電荷或負(fù)電荷，等電點(diǎn)(pI值)大的蛋白12帶正電(附圖三中以三角形表示)，等電點(diǎn)小的蛋白13帶負(fù)電(附圖三中以小黑方塊表示)，在電場(chǎng)作用下，必然發(fā)生電泳遷移，它們分別穿過(guò)分離室兩側(cè)的凝膠膜進(jìn)入兩側(cè)沖洗室，從而實(shí)現(xiàn)了與目標(biāo)蛋白質(zhì)的相互分離。
本發(fā)明的目的也可以這樣實(shí)現(xiàn)在垂直放置的二個(gè)相互平行的窄長(zhǎng)電極之間，沿電極的長(zhǎng)度方向平行設(shè)置二張凝膠膜，在凝膠膜的外側(cè)設(shè)置二張離子交換膜，從而將電極之間的空間分隔成五個(gè)相互平行的腔室，中間腔室為分離室，與分離室相鄰的兩個(gè)腔室為沖洗室，靠近電極的兩個(gè)腔室為電極室，分離進(jìn)行時(shí)，分離室內(nèi)通入pH值調(diào)至目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的待分離的樣品液，兩側(cè)沖洗室中通入pH值等于目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)且電導(dǎo)小的緩沖液，電極室內(nèi)通入電極液，兩電極之間加載恒定的直流電壓。
本發(fā)明使用普通緩沖液，如三羥甲基氨基甲烷—廿氨酸、三羥甲基氨基甲烷—醋酸、醋酸—醋酸鈉等，濃度為0.005-0.1摩爾/升；分離室的流速為100-1000毫升/小時(shí)，沖洗室的流速為200-2000毫升/小時(shí)；所用的凝膠膜的厚度為0.2-2毫米；電極之間的電壓為20-500伏，電流強(qiáng)度不高于100毫安，在此范圍內(nèi)，可以適當(dāng)調(diào)整電極電壓。
在本發(fā)明原理的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了制備型等電點(diǎn)電泳的設(shè)備，其核心部分都為電泳槽。
附圖四是制備型等電點(diǎn)電泳的三腔室電泳槽的裝配示意圖。
上圖為平視圖，下圖為頂視圖，圖中14為分離室，15為沖洗室，16為分離室腔室框，17為沖洗室腔室體，18為凝膠膜，19為導(dǎo)管，20為用有機(jī)玻璃粘制而成的夾緊裝置，21為電源插座，22為用來(lái)固定腔室體的六角螺栓。
四個(gè)螺栓用來(lái)固定腔室體17、腔室框16和凝膠膜18以圍成三個(gè)四周封閉的腔室，中間為分離室14，兩側(cè)為沖洗室15，分離室和沖洗室上下都有供樣品液和緩沖液出入的導(dǎo)管，鉑絲電極放在沖洗室內(nèi)，并與電源插座連接，電泳槽易于拆卸和組裝，以便于更換凝膠膜和加裝組件。
附圖五是電泳槽的腔室體和腔室框示意圖。
23為分離室腔室框，24、25為兩側(cè)沖洗室腔室體(二者左右對(duì)稱(chēng))，26為用來(lái)加裝電源插座的通孔，27為鉑絲電極，28為聚四氟乙稀導(dǎo)管，腔室體用有機(jī)玻璃等絕緣材料制成。
附圖六是制備型等電點(diǎn)電泳的五腔室電泳槽的結(jié)構(gòu)示意圖圖中29為凝膠膜，30為離子交換膜，31為電極，32為分離室，33為沖洗室，34為陽(yáng)極室，35為陰極室，36為樣品液，37為緩沖液，38為陽(yáng)極電極液，39為陰極電極液。
如附圖六左圖所示，操作時(shí)，分離室32內(nèi)通入pH值等于目標(biāo)組分等電點(diǎn)的樣品液，沖洗室33內(nèi)通入pH值等于目標(biāo)組分等電點(diǎn)的緩沖液，陽(yáng)極室34內(nèi)通入陽(yáng)極電極液，陰極室35內(nèi)通入陰極電極液。
由于使用離子交換膜和電極液比較復(fù)雜，為方便起見(jiàn)也可以采用附圖六右圖中所示的結(jié)構(gòu)，四張膜都采用凝膠膜，兩側(cè)電極室中通入與沖洗室相同的緩沖液，也能起到較好的穩(wěn)定pH值的效果。
附圖七是制備型等電點(diǎn)電泳的五腔室電泳槽的裝配示意圖(只畫(huà)出了平視圖)用螺栓固定腔室體、腔室框、凝膠膜和離子交換膜圍成五個(gè)四周封閉的腔室，中間為分離室，分離室的兩側(cè)為沖洗室，最外的兩側(cè)電極室(陽(yáng)極室和陰極室)。每個(gè)腔室的上下都有供液體出入的導(dǎo)管，鉑絲電極放在電極室內(nèi)，并與電源插座連接。
在以上介紹的電泳槽的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一系列的制備型電泳分離設(shè)備。下面逐一介紹附圖八是制備型等電點(diǎn)電泳三腔室的工作情況的流程示意圖。
40為電泳槽，41為換熱器，42為活性炭吸附柱，43為夾套冷卻緩沖液貯槽，44為夾套冷卻樣品液貯槽，45為多組恒流泵(圖中以一個(gè)示意)，46為磁力攪拌器，47為直流恒壓電源，48為帶制冷的恒溫循環(huán)器。進(jìn)行電泳分離時(shí)，兩個(gè)沖洗室內(nèi)的鉑絲電極上通上恒定的直流電壓；樣品液通過(guò)恒流泵45的驅(qū)動(dòng)從樣品液貯槽44進(jìn)入電泳槽的分離室40a，在電泳槽中，雜蛋白在電場(chǎng)作用下通過(guò)凝膠膜遷移到兩側(cè)的沖洗室40b中，從兩個(gè)沖洗室流出的緩沖液相互混合，經(jīng)過(guò)換熱器41換熱后進(jìn)入活性炭吸附柱42吸盡雜蛋白，返回緩沖液貯槽43，再由恒流泵送入沖洗室重復(fù)使用；經(jīng)過(guò)分離的樣品液從電泳槽的分離室40a流出，經(jīng)過(guò)換熱器41進(jìn)入樣品液貯槽44，再經(jīng)恒流泵的驅(qū)動(dòng)進(jìn)入電泳槽的分離室，如此循環(huán)反復(fù)直獲得合格的目標(biāo)蛋白質(zhì)產(chǎn)品；由恒溫循環(huán)器48產(chǎn)生的低溫循環(huán)水(0-10℃可調(diào))，在換熱器和各貯槽中給緩沖液和樣品液以充分的冷卻，保證了生物物質(zhì)的活性；多組恒流泵45驅(qū)動(dòng)緩沖液和樣品液分別以設(shè)定的流量循環(huán)流動(dòng)；另外還有pH電極(圖中略去)檢測(cè)樣品液貯槽和緩沖液貯槽中的pH值的變化情況，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間后，樣品液貯槽和緩沖液貯槽的pH值會(huì)略有變化，此時(shí)可以滴加pH緩沖液調(diào)整。
當(dāng)所使用三張凝膠膜和四張凝膠膜(分別構(gòu)成四腔室和五腔室)的電泳槽時(shí)，所使用的工作流程與上面所述的三腔室電泳槽的流程基本相同。
附圖九是制備型等電點(diǎn)電泳五腔室的工作情況的流程示意圖49為五腔室電泳槽，50為陽(yáng)極電極液貯槽，51為陰極電極液貯槽，52為換熱器，53為活性炭吸附柱，54為夾套冷卻緩沖液貯槽，55為夾套冷卻樣品液貯槽，56為多組恒流泵(圖中以一個(gè)示意)，57為磁力攪拌器，58為直流恒壓電源，59為帶制冷的恒溫循環(huán)器。樣品液在樣品液貯槽55和電泳槽分離室49a之間循環(huán)，緩沖液在緩沖液貯槽54和電泳槽沖洗室49b之間循環(huán)，電極液在電極室49c和電極液貯槽50、51之間循環(huán)。
需要說(shuō)明的是，附圖八、九是等電點(diǎn)電泳裝置三腔室和五腔室典型的工作情況，適合于目標(biāo)產(chǎn)物比較穩(wěn)定，在樣品液中含量不是很稀的情況。在實(shí)際應(yīng)用中，有時(shí)會(huì)遇到非常易失活的產(chǎn)品以及大量的稀濃度樣品，可以采用單程的操作方式，如附圖十所示，為簡(jiǎn)便起見(jiàn)只畫(huà)出由三腔室電泳槽構(gòu)成的工作流程。
附圖十是適合于易失活樣品和大量稀濃度樣品情況的等電點(diǎn)電泳工作流程。
60是電泳槽(為簡(jiǎn)便起見(jiàn)只畫(huà)出了三腔室的情況)，61是夾套冷卻樣品液貯槽，62為夾套冷卻緩沖液貯槽，63是夾套冷卻樣品液收集槽，64為換熱器，65為活性炭吸附柱，66為多組恒流泵(圖中以一個(gè)示意)，67為磁力攪拌器，68為直流恒壓電源，69為帶制冷的恒溫循環(huán)器。
當(dāng)電泳進(jìn)行時(shí)，樣品液在經(jīng)過(guò)電泳槽60后不返回樣品液貯槽61，而是進(jìn)入樣品液收集槽63，當(dāng)樣品液貯槽61的樣品液全部通過(guò)電泳槽60后，就完成了一個(gè)單程的操作。此時(shí)，將樣品液收集槽63中的樣品液轉(zhuǎn)移回樣品液貯槽61，便可進(jìn)入下一個(gè)單程分離過(guò)程，經(jīng)過(guò)幾次單程后(一般為2-4次)，就可以完成分離。這種操作方式總的分離時(shí)間可以大大縮短，更利于保證生物樣品的活性，但操作要比循環(huán)操作要略微復(fù)雜。
當(dāng)采用三張凝膠膜、四張凝膠膜的電泳槽時(shí)，其流程與上面二張凝膠膜的工作流程相同。當(dāng)采用使用離子交換膜的電泳槽時(shí)，其流程基本相同，所不同點(diǎn)在于增加兩個(gè)電極液貯槽，電極液在電泳槽的電極室和電極液貯槽之間循環(huán)。
由于等電點(diǎn)電泳進(jìn)行過(guò)程中，仍有少量的目標(biāo)產(chǎn)品通過(guò)擴(kuò)散等作用通過(guò)凝膠膜進(jìn)入沖洗室，所以對(duì)于分離價(jià)值很昂貴的樣品，為最大限度的提高收率，設(shè)計(jì)了可回收目標(biāo)產(chǎn)品的操作流程。
附圖十一是等電點(diǎn)電泳的可回收操作流程圖70為電泳槽，71是夾套冷卻緩沖液貯槽，72是緩沖液收集槽，73為換熱器，74為夾套冷卻樣品液貯槽，75為多組恒流泵(圖中以一個(gè)示意)，76為磁力攪拌器，77為直流恒壓電源，78為帶制冷的恒溫循環(huán)器，79是恒流泵，80是離子交換層析柱，81是梯度混合器，82是自動(dòng)部分收集器。
在這種操作流程中，沖洗室的出口的緩沖液不返回原來(lái)的緩沖液貯槽71，另外用一個(gè)緩沖液收集槽72收集。然后對(duì)這部分緩沖液進(jìn)行離子交換柱層析，少量通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入沖洗室的目標(biāo)產(chǎn)品可以被離子交換柱80吸附，當(dāng)離子交換柱吸附接近飽和時(shí)，進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液中包含目標(biāo)產(chǎn)品的洗脫組分，調(diào)整pH值和電導(dǎo)后(可用透析法)，再次進(jìn)行等電點(diǎn)電泳。
當(dāng)采用三張凝膠膜、四張凝膠膜的電泳槽時(shí)，其流程與上面二張凝膠膜的工作流程相同的。當(dāng)采用使用離子交換膜的電泳槽時(shí)，其流程基本相同，所不同點(diǎn)在于增加兩個(gè)電極液貯槽，電極液在電泳槽的電極室和電極液貯槽之間循環(huán)。
本發(fā)明的效果是由于分離過(guò)程中利用簡(jiǎn)單緩沖液形成一個(gè)穩(wěn)定的pH點(diǎn)(而不是一個(gè)過(guò)續(xù)的區(qū)帶)來(lái)作為等電聚焦所必需的pH背景，既降低了成本又避免了對(duì)產(chǎn)品引入新的污染。與傳統(tǒng)的多腔室等電聚焦相比，其分離精度的提高不是靠增加腔室的數(shù)目來(lái)實(shí)現(xiàn)，而是采用少數(shù)的幾個(gè)腔室(一般為三到五個(gè))，就可以完成較高精度的分離；分離過(guò)程中電場(chǎng)方向與沖洗載流的方向相互垂直，可以通過(guò)縮短電極之間的距離，在低電壓條件下產(chǎn)生高的電場(chǎng)強(qiáng)度，加快了組分遷移速度，縮短了電遷移的路徑，減小了電泳熱效應(yīng)，總體上提高了分離的效率；而且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行規(guī)模放大。
通過(guò)對(duì)牛血紅—牛血清模式蛋白混合物和尿激酶、白細(xì)胞介素-6等實(shí)際體系的分離實(shí)驗(yàn)，證明了制備型等電點(diǎn)電泳可以快速、高精度的分離目的樣品。
下面介紹本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例。
實(shí)施例1用等電點(diǎn)電泳的典型流程分離模式蛋白混合物1 沖洗室緩沖液醋酸—醋酸鈉(0.01摩爾/升)2 分離室樣品液含牛血紅蛋白1毫克/毫升、牛血清蛋白1毫克/毫升，用0.01摩爾/升醋酸—醋酸鈉配制3 凝膠膜厚度1毫米4 操作 附圖八所示流程電極電壓100伏 電流強(qiáng)度小于100mA流量分離室200毫升/小時(shí)，沖洗室200毫升/小時(shí)5 結(jié)果緩沖液pH值為4.83(牛血清等電點(diǎn))時(shí)，獲得純度為98％的牛血清蛋白，收率92％；緩沖液pH值為6.90(牛血紅等電點(diǎn))時(shí)，獲得純度為95％的牛血紅蛋白，收率大于90％。
處理量100毫克蛋白/小時(shí)實(shí)施例2用等電點(diǎn)電泳的典型流程分離模式蛋白混合物1 沖洗室緩沖液醋酸—醋酸鈉(0.1摩爾/升)2 分離室樣品液含牛血紅蛋白1毫克/毫升，含牛血清蛋白1毫克/毫升，用0.1摩爾/升醋酸—醋酸鈉配制3 凝膠膜厚度0.2毫米4 操作 附圖八所示流程電極電壓20伏 電流強(qiáng)度小于100mA
流量分離室100毫升/小時(shí)，沖洗室5000毫升/小時(shí)5結(jié)果緩沖液pH值為4.83(牛血清等電點(diǎn))時(shí)，獲得純度為88％的牛血清蛋白，收率71％；緩沖液pH值為6.90(牛血紅等電點(diǎn))時(shí)，獲得純度為79％的牛血紅蛋白，收率60％。處理量20毫克蛋白/小時(shí)實(shí)施例3用等電點(diǎn)電泳的五腔室流程分離模式蛋白混合物1沖洗室緩沖液醋酸—醋酸鈉(0.01摩爾/升)2分離室樣品液含牛血紅蛋白0.5毫克/毫升，含牛血清蛋白0.5毫克/毫升，用0.01摩爾/升醋酸—醋酸鈉配制3凝膠膜厚度2毫米4陰、陽(yáng)離子交換膜0.5毫米5操作 附圖九所示流程電極電壓350伏 電流強(qiáng)度小于100mA流量分離室500毫升/小時(shí)，沖洗室1000毫升/小時(shí)；陽(yáng)極室0.05摩爾/升的硫酸溶液，300毫升/小時(shí)；陰極室0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液，300毫升/小時(shí)6結(jié)果緩沖液pH值為6.90(牛血紅等電點(diǎn))時(shí)，獲得純度為95％的牛血紅蛋白，收率大于95％。處理量50毫克蛋白/小時(shí)實(shí)施例4用可回收流程分離白細(xì)胞介素-61電極電壓155伏2沖洗室緩沖液三羥甲基氨基甲烷—檸檬酸(pH＝5.65，0.01摩爾/升)3分離室樣品液經(jīng)過(guò)粗分的白細(xì)胞介素-6包函體破碎液，其中白細(xì)胞介素-6含量約0.22毫克/毫升，用三羥甲基氨基甲烷—檸檬酸(pH＝5.65，0.01摩爾/升)透析平衡4凝膠膜厚度1.5毫米5操作 附圖十一回收操作流程電極電壓155伏 電流強(qiáng)度小于100mA流量分離室300毫升/小時(shí)，沖洗室500毫升/小時(shí)6回收離子交換柱DEAE-Sephadex A-50陰離子交換劑回收樣品電泳電極電壓140伏，分離室流量400毫升/小時(shí)，沖洗室流量2000毫升/小時(shí)7結(jié)果將第一次的樣品和回收樣品混合后，取樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳分析，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，沒(méi)有雜質(zhì)譜帶檢出。總蛋白收率大于80％實(shí)施例5單程操作分離尿激酶1沖洗室緩沖液三羥甲基氨基甲烷—甘氨酸(pH＝8.60，0.02摩爾/升)2分離室樣品液尿激酶半精品(比活為4000活力單位/毫克蛋白)，用三羥甲基氨基甲烷—甘氨酸(pH＝8.60，0.02摩爾/升)透析平衡3凝膠膜厚度1.5毫米4操作 附圖十單程操作流程電極電壓180伏 電流強(qiáng)度小于100mA
流量分離室200毫升/小時(shí)，沖洗室500毫升/小時(shí)四次單程操作5結(jié)果獲得比活大于40000活力單位/毫克蛋白的尿激酶精品，活性收率為32％實(shí)施例6單程操作分離尿激酶1沖洗室緩沖液三羥甲基氨基甲烷—甘氨酸(pH＝8.60，0.005摩爾/升)2分離室樣品液尿激酶半精品(比活為4000活力單位/毫克蛋白)，用三羥甲基氨基甲烷—甘氨酸(pH＝8.60，0.005摩爾/升)透析平衡3凝膠膜厚度1.5毫米4操作 附圖十單程操作流程電極電壓500伏 電流強(qiáng)度小于100mA流量分離室1000毫升/小時(shí)，沖洗室1000毫升/小時(shí)三次單程操作5結(jié)果獲得比活大于20000活力單位/毫克蛋白的尿激酶產(chǎn)品，活性收率為40％
權(quán)利要求
1.一種用于制備型的等電點(diǎn)電泳分離的電泳槽，其特征是在電泳槽的腔室體內(nèi)，垂直設(shè)置兩個(gè)窄長(zhǎng)的電極；在所述的兩個(gè)電極之間，沿電極長(zhǎng)度方向平行設(shè)置凝膠膜；所述的凝膠膜將所述電極之間的空間分隔成幾個(gè)相互平行的腔室，中間的腔室為分離室，在分離室內(nèi)，通入pH值調(diào)至目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的待分離樣品液；在分離室的兩側(cè)為沖洗室，在沖洗室內(nèi)，通入pH值等于目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)且電導(dǎo)小的緩沖液；在所述的兩電極之間，加載恒定的直流電壓，電極所在的腔室，為陰(陽(yáng))極室。
2.按權(quán)利要求
1的電泳槽，其特征是在凝膠膜的外側(cè)，設(shè)置離子交換膜，從而將電極之間的空間分隔成相互平行的腔室，中間腔室為分離室，與分離室相鄰的兩個(gè)腔室為沖洗室，靠近電極的兩個(gè)腔室為電極室(陰或陽(yáng)極室)。
3.按權(quán)利要求
1或2的電泳槽，其特征是所述的凝膠膜為2～4張，其每張的厚度為0.2～2毫米。
4.按權(quán)利要求
2的電泳槽，其特征是等離子交換膜為陰離子交換膜和/或陽(yáng)離子交換膜。
5.按權(quán)利要求
1或2的電泳槽，其特征是腔室為3～5個(gè)。
6.一種制備型的等電點(diǎn)電泳分離方法，其特征是利用權(quán)利要求
1～4之一的電泳槽，該方法包括如下步驟(1)將pH值調(diào)至目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的待分離樣品液通入分離室；(2)將pH值等于目標(biāo)樣品蛋白質(zhì)等電點(diǎn)且電導(dǎo)小的緩沖液通入沖洗室；(3)將電極液通入電極室內(nèi)；(4)兩電極之間加載恒定的直流電壓。
7.按權(quán)利要求
6的電泳分離方法，其特征是緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷—甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷—醋酸、醋酸—醋酸鈉溶液的一種。
8.按權(quán)利要求
6的電泳分離方法，其特征是通入分離室的待分離樣品液的流速為100～1000ml/分。
9.按權(quán)利要求
6的電泳分離方法，其特征是通入沖洗室的緩沖液的流速為200～2000ml/分。
10.按權(quán)利要求
6的電泳分離方法，其特征是緩沖液的濃度為0.005～0.1摩爾/升。
11.按權(quán)利要求
6的電泳分離方法，其特征是施加于電極間的電壓為20～500伏，電流強(qiáng)度為小于100毫安。
12.按權(quán)利要求
6的分離方法，其特征是樣品液為含牛血紅蛋白、牛血清蛋白的液體。
13.按權(quán)利要求
6的電泳分離方法，其特征是樣品液是經(jīng)過(guò)粗分的白細(xì)胞介素-6包函體破碎液，其中白細(xì)胞介素-6含量為約0.22克/毫升。
14.按權(quán)利要求
6的電泳分離方法，其特征是樣品液為尿激酶半精品，其比活為4000活力單位/毫克蛋白。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及一種用于分離蛋白質(zhì)不同組分的制備型等電點(diǎn)電泳分離方法和分離設(shè)備，屬生物化工技術(shù)領(lǐng)域：
。本方法是在二個(gè)平行的窄長(zhǎng)電極之間，沿長(zhǎng)度方向設(shè)置凝膠膜，將電極間的空間分成中間的分離室和兩側(cè)的沖洗室。分離室中通入pH調(diào)至目標(biāo)產(chǎn)品等電點(diǎn)(pI值)的待分離樣品液，沖洗室中通入pH為目標(biāo)產(chǎn)品等電點(diǎn)普通緩沖液，在電場(chǎng)作用下等電點(diǎn)與目標(biāo)產(chǎn)品相異的雜蛋白遷移入兩側(cè)的沖洗室而被洗出，從而實(shí)現(xiàn)了分離。
文檔編號(hào)B01D57/02GKCN1051245SQ95101184
公開(kāi)日2000年4月12日 申請(qǐng)日期1995年1月20日
發(fā)明者朱德權(quán), 丁富新, 袁乃駒, 劉錚, 黃正, 張春潔 申請(qǐng)人:清華大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2),