本發(fā)明屬于毛細管整體柱的制備領域，具體涉及一種巰基苯并咪唑磺酸型有機-無機雜化整體柱及其制備方法和應用。

背景技術：

有機-無機雜化整體柱是在無機硅膠基質整體柱基礎上發(fā)展起來的，通過在硅烷化試劑上鍵合上有機功能單體，制備具有所需分離效果的整體柱。相比于有機聚合物整體柱和無機硅膠整體柱，有機-無機雜化整體柱具有良好的機械穩(wěn)定性、寬的pH耐受范圍、高滲透性及高柱效等優(yōu)點，因此也被應用于色譜分離、固定相微萃取及樣品富集中。

“一鍋”法是將有機功能單體直接加入到硅烷化試劑水解后的反應混合液中，并添加適量的引發(fā)劑等，在合適的溫度下，硅烷化試劑在溶膠-凝膠過程中發(fā)生共縮聚反應，同時其特定功能團與有機功能單體的活性基團發(fā)生自由基聚合反應，從而一步制備各種功能化的有機-無機雜化整體柱，免去了繁瑣的柱后修飾。

“巰-烯”點擊化學反應因其在溫和的反應條件下具有簡易性、高效性、高選擇性及高轉換率而備受關注?！皫€-烯”點擊形成穩(wěn)定的共價鍵能夠承受高壓條件下的沖擊已被廣泛應用于有機-無機雜化整柱固定相制備中。Yao課題組（Yang H, Chen Y, Liu Y, et al. One-pot synthesis of (3-sulfopropyl methacrylate potassium)-silica hybrid monolith via thiol-ene click chemistry for CEC. Electrophoresis, 2013, 34, 510–517.）和Feng課題組（Chen M L, Zhang J, Zhang Z, et al. Facile preparation of organic-silica hybrid monolith for capillary hydrophilic liquid chromatography based on " thiol-ene" click chemistry. Journal of Chromatography A, 2013, 1284, 118–125.）以（3-巰基丙基）三甲氧基硅烷（MPTMS）和四甲氧基硅烷（TMOS）為前驅體，以含有乙烯基的有機化合物為有機單體，成功的利用“巰-烯”點擊化學結合“一鍋”法制備有機-無機雜化整體柱。然而，這種方法仍然會發(fā)生有機單體的自聚而影響整體柱的滲透率及柱效(Lin Z, Tan X, Yu R, et al. One-pot preparation of glutathione-silica hybrid monolith for mixed-mode capillary liquid chromatography based on "thiol-ene" click chemistry. Journal of Chromatography A, 2014, 1355, 228–237.)

2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉是帶有巰基的有機功能單體，能夠與硅烷化試劑的雙鍵發(fā)生“巰-烯”點擊化學反應，而且自身不會發(fā)生自聚，制備得到的雜化整體柱骨架孔徑分布均勻，滲透性良好。此外該有機單體帶有磺酸根既具備親水性又能夠提供離子交換位點，對有機小分子和復雜的生物分子都具有良好的分離能力。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種巰基苯并咪唑磺酸型有機-無機雜化整體柱及其制備方法和應用。利用“巰-烯”點擊反應將2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉共價鍵合到硅膠骨架中，所制得的有機-無機雜化整體柱具有良好的通透性、多孔性以及化學和機械穩(wěn)定性，可以實現對有機小分子以及復雜生物分子的分離。

為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種有機-無機雜化整體柱的制備方法：以2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉為有機功能單體，結合“巰-烯”點擊反應和“一鍋”法制成雜化整體柱。

所述巰基苯并咪唑磺酸型有機-無機雜化整體柱的制備方法，包括以下步驟：

1）將聚乙二醇和尿素混合后溶解于醋酸溶液中，置于0℃下攪拌，同時向醋酸溶液中逐滴滴加由無機單體和雜化單體組成的預聚混合液，冰浴下攪拌反應1 h，形成均勻的粘稠液；然后將2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉有機功能單體、引發(fā)劑、致孔劑加入到粘稠液中，冰浴超聲溶解脫氣，制得混合溶液；

2）將步驟1）制得的混合溶液注入經預處理的毛細管內，密封后置于水浴鍋內反應，最后將毛細管取出，用甲醇或乙腈沖洗后制得有機-無機雜化整體柱。

步驟1）所述的無機單體為甲基三甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷中的一種；所述的雜化單體為3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷中的一種；無機單體和雜化單體的體積比為2:1～6:1。

步驟1）中聚乙二醇和尿素的質量比為0.8:1～2:1。

步驟1）中預聚混合液與2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉有機功能單體的質量比為77:1～153:1。

步驟1）中所述的致孔劑為乙二醇、二甘醇、聚乙二醇或1,4-丁二醇；所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈；致孔劑與2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉的質量比為2.6:1～5.3:1；引發(fā)劑的用量占2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉有機功能單體重量的2%～5%。

步驟2）中，水浴鍋內反應溫度為40~75℃，反應時間為12~24 h。

一種如上所述的制備方法制得的有機-無機雜化整體柱，可用于有機小分子、核苷、生物堿、麻醉劑或蛋白質生物分子的分離。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：

本發(fā)明利用“巰-烯”點擊化學將2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉鍵合到硅膠骨架中，所制得的巰基苯并咪唑磺酸型有機-無機雜化整體柱具有良好的通透性、多孔性以及化學和機械穩(wěn)定性，可以實現對有機小分子、核苷、生物堿、麻醉劑或蛋白質等復雜生物分子的分離。

附圖說明

圖1為實施例1所制得的巰基苯并咪唑磺酸型有機-無機雜化整體柱截面掃描電鏡圖；

圖2為實施例1所制得的巰基苯并咪唑磺酸型有機-無機雜化整體柱柱體與管內壁連接處的掃描電鏡圖；

圖3為實施例2中甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、硫脲4種混合樣的分離色譜圖；

圖4為實施例3中不同pH條件下苯胺類的分離色譜圖；

圖5為實施例4中4種核苷堿基混合樣的分離色譜圖；

圖6為實施例5中6種生物堿的分離色譜圖；

圖7為實施例6中6種麻醉劑的分離色譜圖；

圖8為實施例7中5種蛋白質的分離色譜圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步說明。但本發(fā)明并不限于以下實施例。

本發(fā)明提供的制備整體柱的方法，所用的聚合物分離介質是2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉，該聚合體系還包括四甲氧基硅烷和3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷兩種硅烷化試劑、致孔劑乙二醇和引發(fā)劑偶氮二異丁腈。

實施例1

一種有機-無機雜化整體柱的制備方法，具體步驟為：

1.柱子預處理

將毛細管內壁依次用丙酮沖洗1 h，清水沖洗1 h，氫氧化鈉沖洗12 h，清水沖洗2 h，鹽酸沖洗3 h，清水沖洗2 h，甲醇沖洗30 min，最后通氮氣吹干；

2.硅烷化

在預處理過的毛細管內注入無水甲醇和甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）體積比為1:1的混合液，在45℃下反應12 h，然后用甲醇沖洗30 min，在60℃下氮氣吹干；

3.柱內合成

稱取540 mg PEG10000于25 mL的血清瓶中，超聲溶解于5 mL，0.01 mol/L的醋酸溶液中。將該混合液置于0℃的冰浴鍋中并在磁力攪拌器上勻速攪拌，在攪拌的同時勻速逐滴滴加四甲氧基硅烷（TMOS）（1800 μL）和3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）（400μL）的混合液直到滴加完畢，后繼續(xù)在磁力攪拌器上攪拌一個小時；

準確稱取2-巰基苯并咪唑-5-磺酸鈉 25 mg、尿素 300 mg、乙二醇 80 μL及偶氮二異丁腈（AIBN） 1mg于500μL上述攪拌混合溶液中，渦旋振蕩混合均勻后，超聲20 min使其形成均一透明的混合液。將得到的預聚混合液用注射器緩慢注入50 cm長的經過預處理的毛細管中，注入至長度約為25 cm處，毛細管兩端用橡膠墊片密封后，放入40℃水浴鍋中反應12 h，繼續(xù)在75℃條件下反應12 h。反應結束后，用甲醇為流動相在高壓恒流泵的作用下將致孔劑以及未反應的物質沖洗干凈，制得2-巰基苯并咪唑-5-磺酸型有機-無機雜化整體柱；

用掃描電子顯微鏡觀察上述制備得到的整體柱的柱體微觀形貌，可以得知材料具有均勻多孔和連續(xù)的三維骨架，如圖1所示；

用掃描電子顯微鏡觀察上述制備得到的整體柱的柱體微觀形貌，可以得知整體柱基質和石英毛細管內壁鍵合完好，能耐受20兆帕的泵壓，具有較好的機械穩(wěn)定性，如圖2所示。

應用實施例1

在微柱液相色譜（μHPLC）模式下，以5%乙腈水溶液為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B；色譜條件：100%B；泵流速為0.03 mL/min；檢測波長為214 nm；甲苯、硫脲、二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺（各0.1 mg/mL）的混合液在上述實施例1中制得的2-巰基苯并咪唑-5-磺酸型有機-無機雜化整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖3所示，色譜圖中的峰依次為1：甲苯，2：N，N-二甲基甲酰胺，3：硫脲，4：二甲亞砜。

應用實施例2

在微柱液相色譜（μHPLC）模式下，以5%乙腈磷酸鹽緩沖液（150 mM，pH=3、4、7）為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B；色譜條件：90% B；泵流速為0.03 mL/min；檢測波長為214 nm；苯胺、鄰苯二胺、鄰硝基苯胺、二苯胺（各0.1 mg/mL）的混合液在上述實施例1中制得的2-巰基苯并咪唑-5-磺酸型有機-無機雜化整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖4所示，色譜圖中的峰依次為1：苯胺，2：鄰苯二胺，3：鄰硝基苯胺，4：二苯胺。

應用實施例3

在微柱液相色譜（μHPLC）模式下，以5%乙腈磷酸鹽緩沖液（150 mM，pH=7）為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B；色譜條件：85% B；泵流速為0.03 mL/min；檢測波長為214 nm；胸腺嘧啶、巰嘌呤、2-脫氧腺苷、腺嘌呤（各0.1 mg/mL）的混合液在上述實施例1中制得的2-巰基苯并咪唑-5-磺酸型有機-無機雜化整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖5所示，色譜圖中的峰依次為1：2-脫氧腺苷，2：腺嘌呤，3：巰嘌呤，4：胸腺嘧啶。

應用實施例4

在微柱液相色譜（μHPLC）模式下，以5%乙腈磷酸鹽緩沖液（150 mM，pH=7）為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B；色譜條件：90% B；泵流速為0.03 mL/min；檢測波長為214 nm；青藤堿、阿托品、鹽酸小襞堿、秋水仙堿、胡椒堿、可可堿（各0.1 mg/mL）的混合液在上述實施例1中制得的2-巰基苯并咪唑-5-磺酸型有機-無機雜化整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖6所示，色譜圖中的峰依次為1：青藤堿，2：阿托品，3 ：鹽酸小襞堿， 4：秋水仙堿，5：胡椒堿，6：可可堿。

應用實施例5

在微柱液相色譜（μHPLC）模式下，以5%乙腈磷酸鹽緩沖液（150 mM，pH=7）為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B；色譜條件：90%B；泵流速為0.03 mL/min；檢測波長為214 nm；鹽酸罌粟堿、三唑侖、匹莫林、磷酸可待因、嗎啡和鹽酸美沙酮（各0.1 mg/mL）的混合液在上述實施例1中制得的2-巰基苯并咪唑-5-磺酸型有機-無機雜化整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖7所示，色譜圖中的峰依次為1：鹽酸罌粟堿，2：三唑侖，3：匹莫林，4：磷酸可待因，5：嗎啡，6：鹽酸美沙酮。

應用實施例6

在微柱液相色譜（μHPLC）模式下，以5%乙腈水為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B；色譜條件：梯度：0～60 min ，20%～50%B；泵流速為0.05 mL/min；檢測波長為214 nm；核糖核酸酶A、細胞色素C、辣根過氧化物酶、血紅蛋白、轉鐵蛋白（各0.1 mg/mL）的混合液在上述實施例1中制得的2-巰基苯并咪唑-5-磺酸型有機-無機雜化整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖8所示，色譜圖中的峰依次為1：核糖核酸酶A，2：辣根過氧化物酶，3：細胞色素C，4：血紅蛋白，5：轉鐵蛋白。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。