本發(fā)明涉及一種雙酚A的適配體親和柱及其制備方法和用途。屬食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

雙酚A 是2，2-雙（4-羥基苯基）丙烷的俗稱，又稱二酚基丙烷， 由2 分子苯酚和1 分子丙酮在酸性介質(zhì)中催化縮合而成的酚類物質(zhì)。它是生產(chǎn)聚碳酸酯（Polycarbonate，PC） 及環(huán)氧樹脂（epoxyResin，EP）的主要原料，又可用作酚醛樹脂、可塑性聚酯、抗氧劑及聚氯乙烯（PVC）穩(wěn)定劑等。在食品包裝方面， 添加BPA 的塑料具有無色透明、耐用、輕便以及抗摔等特性，在食品包裝材料、容器內(nèi)壁涂料等方面有著重要的用途，尤以嬰兒奶瓶，金屬罐容器的內(nèi)涂層最為普遍存在。

雙酚A 可通過食品包裝和塑料薄膜遷移到食品或是飲料中，被人體吸收，進(jìn)而逐步危害人體健康，可使人類和野生動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)異常，還會(huì)嚴(yán)重干擾人類和動(dòng)物的生殖遺傳功能。研究報(bào)道，雙酚A 具有雌性激素的特性，對(duì)肝臟、腎臟、乳腺有一定的損傷; 同時(shí)雙酚A 也與肥胖癥、糖尿病以及男性不孕有關(guān)，研究證實(shí)，低劑量的雙酚A( 10 ^-7 mol /L) 即能引起支持細(xì)胞和精子細(xì)胞死亡。雙酚A 的危害已引起諸多研究者及世界衛(wèi)生組織的廣泛關(guān)注，很多國家已經(jīng)頒布了相關(guān)法律，禁止在食品包裝材料中添加含雙酚A 的物質(zhì)，尤其是嬰兒用品。2014 年，歐洲食品安全局提議將目前雙酚A 每日最大攝入量由0．05 mg /( kg·d) 降低到0．005 mg /( kg·d) 。1994 年，我國公布的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)雙酚A 用量規(guī)定為每升蒸餾水中所含的雙酚A 要小于0.05 mg。盡管目前對(duì)雙酚A 的限量在不斷降低，但由于管理不夠規(guī)范，人們?cè)谌粘Ｉ钪薪?jīng)常食用的食品常常使用以雙酚A 作為添加劑的材料包裝。有研究表明，在某些食品、紙杯、人體血液、人體尿液、人體唾液、自然界中的水、奶瓶等樣品中均可檢測(cè)出雙酚A。由于雙酚A 危害極大，因此建立檢出限低、準(zhǔn)確、快速的雙酚A 檢測(cè)方法尤為重要。

雙酚A的檢測(cè)方法包括熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、紫外分光光度法、氣相色譜發(fā)及高效液相色譜法等。

紫外分光光度法利用雙酚A在278nm波長是具有吸收峰來檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單便捷。但此方法受到環(huán)境影響及溶劑影響很大，準(zhǔn)確度不高，并且變異較大。

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)法利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)來檢測(cè)，具有特異性高，靈敏性強(qiáng)，且檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)。BPA 是一種小分子，不能直接用于免疫動(dòng)物， 但可以與抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。競(jìng)爭型酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）就是利用這種特性。石春紅[食品工業(yè)科技，2011（01），290-292]等建立了間接競(jìng)爭ELISA檢測(cè)雙酚A的方法，檢測(cè)限為1 ng/mL， 對(duì)PC 材質(zhì)的桶裝水做回收試驗(yàn)， 回收率為92.5%～107.7%。但是由于雙酚A是小分子，免疫原性弱，難以獲得高親和力的抗體。從而限制了此方法的開發(fā)。

原子熒光光譜法是以原子在輻射能激發(fā)下發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析的發(fā)射光譜分析法．唐舒雅等[工業(yè)水處理，２００６，２６（３）：７４－７６］利用在ｐＨ＝１的酸性介質(zhì)中，β－環(huán)糊精對(duì)ＢＰＡ熒光強(qiáng)度有增強(qiáng)作用的特點(diǎn)，建立了熒光測(cè)定法．該方法的線性范圍為0.4-300ug/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%，檢出限為0.02ug/L。

高效液相色譜法( HPLC)具有準(zhǔn)確度高、靈敏性強(qiáng)、可微量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn),是目前常用于食品中小分子檢測(cè)的方法。尤其是高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在雙酚A的檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。但因其此方法對(duì)樣品中小分子純度的要求較高,導(dǎo)致檢測(cè)成本高、周期長,無法滿足大批量樣品快速篩選的需要,所以使用受到限制。今年來發(fā)展起來的固相萃取柱-高效液相色譜（SPE-HPLC)）將固相萃取技術(shù)與高效液相色譜相結(jié)合。使HPLC的使用更加廣泛。固相萃取作為一種新的凈化技術(shù),在食品安全分析檢測(cè)中應(yīng)用越來越廣泛。它是將疏水性固相載體上填充柱管制備而成。當(dāng)樣品提取液通過柱子時(shí),由于樣本中物質(zhì)的極性的不同而分離開來。分步洗脫就能得到純度較高的目的物。

但是由于樣本中成分復(fù)雜，很多物質(zhì)都具有相似的極性，導(dǎo)致固相萃取得到的洗脫產(chǎn)物常常組分較多。導(dǎo)致固相萃取得到的雙酚A雜質(zhì)較多，影響隨后的HPLC檢測(cè)。因而，需要一種特異性的雙酚A純化方法。

免疫親和柱是替代固相萃取柱常用的凈化手段，利用抗原抗體特異性的親和作用來分離目標(biāo)物。是替代固相萃取柱的理想選擇。免疫親和柱-高效液相色譜聯(lián)用（IAC-HPLC）也是目前食品安全檢測(cè)常用的檢測(cè)技術(shù)。免疫親和柱具有操作簡單，特異性高的優(yōu)點(diǎn)。但是由于抗體獲得困難，免疫親和柱通常比較昂貴。并且由于抗體本身是一種蛋白質(zhì)，其活性受到周圍環(huán)境的影響。保存不當(dāng)或者操作不當(dāng)很容易造成抗體失活從而影響免疫親和柱的效率。由于雙酚A是小分子物質(zhì)，免疫原性差，用于制備抗體難度很大。導(dǎo)致無法得到有效的雙酚A抗體用于制備免疫親和柱。

適配體是一段核酸序列，通常為DNA或者RNA序列。 單鏈的核酸序列可以形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而能與靶點(diǎn)特異性結(jié)合。通過多次的富集和篩選，能夠篩選到與靶點(diǎn)有高親和力的特異性適配體。Herman等描述了核酸適配體的結(jié)合特異性，[Science 287,820-825].核酸適配體相對(duì)于抗體來說更穩(wěn)定，不易受到環(huán)境的影響，并且核酸適配體可以化學(xué)合成，保證序列的準(zhǔn)確性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸適配體被應(yīng)用于小分子的檢測(cè)，在專利CN105505940A中，描述了一種黃曲霉毒素B1的適配體DNA傳感器。通過黃曲霉毒素B1的適配體，及多條互補(bǔ)探針序列制備DNA傳感器，通過酶底物反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。在專利CN104399283中，描述了一種黃曲霉毒素B1的適配體親和柱。該專利利用環(huán)氧基活化的瓊脂糖微球，將黃曲霉毒素B1的適配體偶聯(lián)，制備成親和柱。實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素B1的分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種雙酚A適配體親和柱及其制備方法和用途

在本發(fā)明中，我們利用SELEX系統(tǒng)，從適配體文庫中篩選出來一組高特異性、高親和力的的新的雙酚A的單鏈DNA適配體。適配體修飾后與N-羥基琥珀酰亞胺活化的載體通過共價(jià)鍵進(jìn)行偶聯(lián)。經(jīng)過洗滌和封閉得到雙酚A的特異性載體。載體裝柱后就形成了高親和力的雙酚A適配體親和柱

該親和柱操作簡便，純化雙酚A效率高。能耐受有機(jī)溶劑，并且可以重復(fù)使用。樣本經(jīng)過簡單的處理后就可以進(jìn)行純化，得到純度很高的雙酚A。用于高效液相色譜檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)。

具體操作如下：

本發(fā)明最大的優(yōu)勢(shì)就是利用了核酸適配體的特性，通過多輪的富集、洗滌、擴(kuò)增等步驟，篩選出針對(duì)雙酚A的特異性適配體。通過序列測(cè)定得到適配體的序列

核酸適配體相對(duì)于抗體來說，具有適應(yīng)環(huán)境廣泛，能夠耐受高溫、能耐受有機(jī)溶劑并且操作方便等優(yōu)點(diǎn)。最主要的，適配體在制備過程中不需要經(jīng)過動(dòng)物體內(nèi)的過程，而是通過化學(xué)合成來獲得。因此，生產(chǎn)周期短，并且可以通過合成條件保證序列的準(zhǔn)確性

以核酸適配體為基礎(chǔ)制備的親和柱具有特異性好，雙酚A結(jié)合量大，純化效率高的特點(diǎn)

雙酚A適配體親和柱及其制備方法說明如下

1.選擇N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）修飾的瓊脂糖載體sepharose4B，進(jìn)行活化

取1gN-羥基琥珀酰亞胺修飾的瓊脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶脹30min后，凝膠用100ml 1mM HCl洗滌6次，再用100ml超純水洗滌

2.將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液（0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，PH8.2）洗滌3次。加入20mol/L的氨基修飾的雙酚A適配體，室溫偶聯(lián)8小時(shí)

3.將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

4.封閉

將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室溫反應(yīng)2小時(shí)

5.將封閉好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

6.裝柱

將雙酚A—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的雙酚A親和柱。層析柱的結(jié)構(gòu)如附圖1所示：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明充分的利用了核酸適配體的優(yōu)點(diǎn)，通過多輪的篩選和富集。得到了高特異性高親和力的雙酚A核酸適配體。該適配體能夠特異性的結(jié)合樣本中的雙酚A，有效去除了固相萃取柱常見的雜質(zhì)較多，組分復(fù)雜的缺點(diǎn)。降低了抗體親和柱經(jīng)常遇到的交叉反應(yīng)性。親和柱效率大幅度提高

核酸適配體不受操作環(huán)境和有機(jī)溶劑的影響，尤其適合真菌毒素類的脂溶性物質(zhì)的純化。相比較，具有同樣結(jié)合特異性的免疫親和柱，因?yàn)槠渲械目贵w不耐有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑常常會(huì)造成抗體的失活而使親和柱效率降低

此外，由于有機(jī)溶劑導(dǎo)致抗體失活，因此免疫親和柱通常為一次性使用。而核酸適配體親和柱可以耐受有機(jī)溶劑，可以重復(fù)使用多次，大幅度降低了使用成本

2.本發(fā)明使用的核酸適配體可以通過化學(xué)合成法獲得，可以保證序列的正確性。大幅度降低了不同批次間的變異。而相對(duì)來說，不同批次的抗體來自于不同的小鼠或者兔子，導(dǎo)致抗體間質(zhì)量變異較大，使親和柱質(zhì)量存在差別

3.使用本發(fā)明純化雙酚A操作簡便，幾步就可以得到純度較高的雙酚A。更方便操作者使用

4.使用本發(fā)明的產(chǎn)品得到的雙酚A純度很高，后續(xù)不用再做別的純化處理就可以直接用于高效液相色譜檢測(cè)或者熒光檢測(cè)。節(jié)省了操作者的時(shí)間和費(fèi)用。

附圖說明

圖1：雙酚A適配體親和柱結(jié)構(gòu)組份示意圖

A：進(jìn)樣口塞；B：活塞適配器；C：穩(wěn)定箍；D：上篩板；E：柱體；F：載體填料；G：下篩板；H：出樣口堵頭

圖2：雙酚A適配體親和柱外觀結(jié)構(gòu)圖

A：進(jìn)樣口塞；B：活塞適配器；C：穩(wěn)定箍；D：上篩板；E：柱體；F：載體填料； G：下篩板；H：出樣口堵頭

圖3：水中雙酚A檢測(cè)的質(zhì)譜檢測(cè)圖

圖4：奶粉樣本中雙酚A檢測(cè)的質(zhì)譜檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：利用氨基修飾的雙酚A適配體制備親和柱

本發(fā)明制備雙酚A適配體親和柱的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案如下：

1.載體活化

選擇N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）修飾的瓊脂糖載體sepharose4B，進(jìn)行活化

取1gN-羥基琥珀酰亞胺修飾的瓊脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶脹30min后，凝膠用100ml 1mM HCl洗滌6次，再用100ml超純水洗滌

2.將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液（0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，PH8.2）洗滌3次。加入20mol/L的氨基修飾的雙酚A適配體，室溫偶聯(lián)8小時(shí)

3.將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

4.封閉

將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室溫反應(yīng)2小時(shí)

5.將封閉好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

6.裝柱

將交聯(lián)后的雙酚A-瓊脂糖凝膠用10毫升20mM PBS PH7.4重懸，然后裝入空的親和純化柱柱體中

1) 取空的柱體，加入下方篩板，加入1mlPBS，使其自然流干

2)加下方出樣口堵頭，在柱體中加入1ml上述處理后的雙酚A適配體-瓊脂糖凝膠載體，靜止5分鐘，使載體自然沉降

3)加入上方篩板，按壓篩板，使其到達(dá)載體上方

4)加入活塞適配器，適配器有一個(gè)壓緊作用，使上方篩板緊貼載體

5)從下方將穩(wěn)定箍套在柱體上，使其緊貼進(jìn)樣口

6)拔掉出樣口堵頭，用注射器取5mlPBS，將注射器接在進(jìn)樣口上，緩慢的將PBS注入親和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液體注入親和柱

7)套上出樣口堵頭，套上進(jìn)樣口塞，將制備好的雙酚A適配體親和柱放入4℃保存。

實(shí)施例2：利用生物素修飾的雙酚A適配體制備親和柱

本發(fā)明制備雙酚A適配體親和柱的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案如下：

1.取1ml鏈霉親和素（SA）修飾的瓊脂糖凝膠sepharose4B，用10ml超純水洗滌3次

2.將（SA）修飾的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液（0.02M的PBS，0.8M NaCl，PH7.4）洗滌3次。加入20mol/L的生物素修飾的雙酚A適配體，室溫偶聯(lián)4小時(shí)

3.將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

4.裝柱

將雙酚A—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的雙酚A親和純化柱

1)取空的柱體，加入下方篩板，加入1mlPBS，使其自然流干

2)加下方出樣口堵頭，在柱體中加入1ml上述處理后的雙酚A適配體-瓊脂糖凝膠載體，靜止5分鐘，使載體自然沉降

3)加入上方篩板，按壓篩板，使其到達(dá)載體上方

4)加入活塞適配器，適配器一個(gè)壓緊作用，使上方篩板緊貼載體

5)從下方將穩(wěn)定箍套在柱體上，使其緊貼進(jìn)樣口

6)拔掉出樣口堵頭，用注射器取5mlPBS，將注射器接在進(jìn)樣口上，緩慢的將PBS注入親和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液體注入親和柱

7)套上出樣口堵頭，套上進(jìn)樣口塞，將制備好的雙酚A適配體親和柱放入4℃保存。

實(shí)施例3：利用雙酚A適配體親和柱純化和水中的雙酚A

本實(shí)施例利用正常的純化水樣本中加入雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)品，然后用雙酚A適配體親和柱進(jìn)行純化，純化后用高效液相色譜檢測(cè)。測(cè)定回收率

1.樣品處理

按照每毫升水樣品10ng的標(biāo)準(zhǔn)，在水中添加雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品；

w將免疫親和柱連接于10.0 ml一次性注射器下

w準(zhǔn)確移取10ml加入雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品后的水樣，注入一次性注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以1～2滴/秒的速度流出

w待液體排干后，首先用0.1%Tween-20水溶液洗滌10mL，再用蒸餾水或去離子水洗滌10mL，流速2～3滴/秒

w待液體排干后，更換新針筒，上樣2ml乙腈，用刻度試管接洗脫液，流速1滴/秒；

w 洗脫后液體用氮?dú)庠?30℃條件下吹至近干

w 用10%乙腈水溶液溶解并定容到1ml

w 洗脫液用0.22μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于HPLC分析

2.洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜HPLC檢測(cè)

高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示，從檢測(cè)結(jié)果可以看出，在10毫升的水中加入100ng的雙酚A，用本發(fā)明的適配體親和柱可以回受到92.4ng，回收率為92.4%

質(zhì)譜圖見附圖3。

實(shí)施例4：利用雙酚A適配體親和柱純化和檢測(cè)奶粉樣品中的雙酚A

1.前處理

按照每克奶粉樣品100ng的標(biāo)準(zhǔn)，在奶粉樣品中添加雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品

w取1g奶粉樣本，加入100ng雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，加入10ml 10mmolPBSPH7.4緩沖液，充分震蕩混勻

w用快速定性濾紙過濾，收集濾液

w 全部濾液作為上樣液過親和柱凈化

2. 凈化

w 將親和柱連接于10.0 ml一次性注射器下。按照前處理要求，準(zhǔn)確移取相應(yīng)體積的樣品提取液注入一次性注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以1～2滴/秒的速度流出

w 待液體排干后，用蒸餾水或去離子水洗滌2次，每次10mL

w 待液體排干后，上樣1mL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脫液并定容至1mL

w 洗脫液用0.22μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于HPLC分析

檢測(cè)結(jié)果顯示，在1g奶粉中加入100ng雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，回收89.8ng，回收率89.8%

質(zhì)譜圖見附圖4。

實(shí)施例5：雙酚A適配體親和柱重復(fù)使用柱容量的變化

本實(shí)施例利用定量的雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)品，然后用雙酚A適配體親和柱進(jìn)行純化。親和柱上的雙酚A用有機(jī)溶劑洗脫后，用高效液相色譜檢測(cè)其濃度。親和柱重新平衡后重復(fù)上樣和洗脫，測(cè)定洗脫的雙酚A濃度。主要目的是測(cè)試雙酚A適配體親和柱的重復(fù)使用性

1. 配制1ug/ml的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品

2.取出雙酚A適配體親和柱，打開進(jìn)樣口塞，進(jìn)樣口與注射器針筒連接，注射器接入到氣控操作架上

3.打開出樣口塞，用10mmol/L PBS PH7.4洗滌親和柱3次，每次10毫升，調(diào)節(jié)氣孔操作架氣泵壓力，使液體以3滴/秒的流速流出

4.取100ul上述配制的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，總量100ng，加入親和柱柱中，調(diào)節(jié)流量至1-2滴/秒。直至樣品全部流出親和柱

5.用蒸餾水洗滌純化柱3次，每次5毫升

6.加入1ml甲醇，收集洗脫產(chǎn)物

7.洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜HPLC檢測(cè)

8.親和柱用超純水洗滌3次，每次10ml，然后用10mmol/L PBS PH7.4洗滌親和柱3次，每次10毫升

9.再次上樣100ul雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，總量100ng

10. 按照上述操作洗滌及洗脫，洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜檢測(cè)其濃度

11. 再重復(fù)步驟8.9.10三次。檢測(cè)洗脫產(chǎn)物的濃度

12. 計(jì)算總共5次的雙酚A適配體親和柱純化的回收率

高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果見表4：

從上述結(jié)果可以看出，雙酚A適配體親和柱重復(fù)使用5次后，其結(jié)合能力沒有明顯的降低。

雙酚A適配體序列1：

5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'

雙酚A適配體序列2：

5'-CCGCCGTTGGTGTGGTGGGCCTAGGGCCGGCGGCGCACAGCTGTTATAGACGTCTCCAGC-3'

雙酚A適配體序列3：

5'-CCGCCGTTGGTGTGGTGGGCCTAGGGCCGGCGGCGCACAGCTGTTATAGACGCCTCCAGC-3'