本發(fā)明涉及一種用于天然黃酮類或者含有苯環(huán)的天然產(chǎn)物富集分離的磁性印跡材料及其制備方法與應(yīng)用，所述的磁性印跡材料為磁性殼聚糖顆粒枝接大黃酸材料。

(二)

背景技術(shù)：

大多數(shù)中藥和天然藥物含有豐富的黃酮類成分，這些成分具有抗脂質(zhì)過氧化、清除羥自由基和調(diào)節(jié)血脂功能及抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、抗?jié)?、抗病毒、保護(hù)心血管疾病及保肝等生理活性，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。如何分離富集這些成分是新藥和保健品開發(fā)的重要步驟。

目前一般采用水或酒精提取后，直接用不同有機(jī)溶劑反復(fù)萃取的方法分離富集黃酮；也有一些用無機(jī)堿調(diào)節(jié)pH值后，再進(jìn)行有機(jī)溶劑反復(fù)萃取的方式。獲得萃取浸膏后再用聚酰胺或大孔吸附樹脂吸附其有效成分的方法純化分離黃酮類物質(zhì)，但所得產(chǎn)物黃酮含量均不夠高，無法進(jìn)行更深入的分析及藥效藥理研究。天然活性成分存在含量低，難于富集，成分復(fù)雜，化合物結(jié)構(gòu)相近等特點(diǎn)?，F(xiàn)有的天然產(chǎn)物分離純化方法和技術(shù)存在一定的不足，制約了我國天然藥物與功能食品研究的發(fā)展，研究高效、高選擇、簡捷地分離純化方法非常必要。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

磁印跡分離是一種應(yīng)用比較多的印跡分離方式，是將印跡分子洗脫后，留下印跡空穴來俘獲混合物印跡分子。但是本發(fā)明設(shè)計(jì)將大黃酸(Rhein)作為印跡分子，以共價(jià)鍵鏈接到磁性顆粒上，印跡分子不洗脫，利用大黃酸強(qiáng)共軛效果，從復(fù)雜干擾體系中分離富集黃酮類或者含有苯環(huán)的一些化合物，其應(yīng)用范圍更加廣闊。且該方法較傳統(tǒng)的印跡分子洗脫的方法簡單，易行。

因此，本發(fā)明的目的是提供一種磁性印跡材料及其制備方法與應(yīng)用，所述的磁性印跡材料制備簡單、處理量大，生產(chǎn)成本較傳統(tǒng)印跡方法大大降低；應(yīng)用該材料，可以較簡單的從天然產(chǎn)物中分離富集黃酮類或者含有苯環(huán)的化合物，如黃酮、蒽醌、香豆素等。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種磁性印跡材料，其制備方法為：

(1)制備Fe₃O₄磁性納米顆粒

將FeCl₃·6H₂O溶解于超純水中，再加入水合肼、十二烷基磺酸鈉、FeSO₄·7H₂O，待物料完全溶解后，加入氨水(20wt％～30wt％)至pH≥9(優(yōu)選pH＝9～10)，接著先于30～50℃下反應(yīng)0.3～1.0h，再于70～90℃下反應(yīng)30～90min，之后利用磁鐵從反應(yīng)液中分離出黑色沉淀物，用去離子水、無水乙醇清洗，得到Fe₃O₄磁性納米顆粒，置于真空干燥箱(40～60℃)中干燥備用；

步驟(1)中，所述FeCl₃·6H₂O與水合肼、十二烷基磺酸鈉、FeSO₄·7H₂O的質(zhì)量比為1∶0.1～2∶0.1～2：0.1～2，優(yōu)選1∶0.1～1∶0.1～1：0.1～1；所述超純水的體積用量以FeCl₃·6H₂O的質(zhì)量計(jì)為10～15mL/g。

(2)制備磁性殼聚糖載體(記作Fe₃O₄@CTS)

將殼聚糖溶解于體積分?jǐn)?shù)為1％～2％的乙酸水溶液中，得到殼聚糖溶液；將所得殼聚糖溶液滴加入步驟(1)準(zhǔn)備好的Fe₃O₄磁性納米顆粒中，攪拌均勻，得到磁性殼聚糖溶液；將所得磁性殼聚糖溶液與液體石蠟、乳化劑斯潘80混合，于25～40℃下攪拌15～45min，接著調(diào)節(jié)pH(用5wt％NaOH水溶液)為8.5～9.5，再加入戊二醛，升溫至50～70℃攪拌1～2h，之后利用磁鐵從反應(yīng)液中分離出磁性微球，用石油醚、超純水洗滌至中性，得到磁性殼聚糖載體，置于真空干燥箱(40～60℃)中干燥備用；

步驟(2)中，所述殼聚糖溶液中，殼聚糖的濃度為0.5wt％～2wt％；所述殼聚糖溶液的體積用量以Fe₃O₄磁性納米顆粒的質(zhì)量計(jì)為50～150mL/g；所述磁性殼聚糖溶液與液體石蠟、乳化劑斯潘80、戊二醛的體積比為1∶0.5～1.5∶0.01～0.1∶0.02～0.05。

(3)磁性殼聚糖顆粒枝接大黃酸材料制備(記作MCTS)

將印跡分子大黃酸、羧基活化劑N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液混合，置于20～40℃下活化10～40min，活化后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)、步驟(2)準(zhǔn)備好的磁性殼聚糖載體，在常溫(20～30℃)下攪拌反應(yīng)6～18h，大黃酸通過共價(jià)鍵結(jié)合在磁性殼聚糖載體顆粒之上后，利用磁鐵從反應(yīng)液中分離出負(fù)載大黃酸的磁性固體顆粒，用碳酸氫鈉水溶液(5wt％～20wt％)、乙醇、超純水洗滌至洗脫液中無游離的大黃酸為止，置于真空干燥箱(40～60℃)中干燥后，得到所述的磁性殼聚糖顆粒枝接大黃酸材料，即磁性印跡材料；

步驟(3)中，所述大黃酸與N-羥基丁二酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽的物質(zhì)的量之比為1：0.3～0.6：1.0～1.5；所述嗎啉乙磺酸緩沖液的濃度為25～75mmol/L，pH為6～7；所述嗎啉乙磺酸緩沖液的體積用量以大黃酸的質(zhì)量計(jì)為300～500mL/g；所述大黃酸與磁性殼聚糖載體的質(zhì)量比為1：0.5～2。

本發(fā)明制得的磁性印跡材料可應(yīng)用于天然黃酮類或者含有苯環(huán)的天然產(chǎn)物的富集分離，如黃酮、蒽醌、香豆素等。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明目的是提供一種磁性印跡材料及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明設(shè)計(jì)將大黃酸(Rhein)作為印跡分子，以共價(jià)鍵鏈接到磁性顆粒上，印跡分子不洗脫，利用大黃酸強(qiáng)共軛效果，從復(fù)雜干擾體系中分離富集黃酮類或者含有苯環(huán)的一些化合物，其應(yīng)用范圍更加廣闊。且該方法較傳統(tǒng)的印跡分子洗脫的方法簡單，易行。所述磁性印跡材料制備簡單、處理量大，生產(chǎn)成本較傳統(tǒng)印跡方法大大降低；應(yīng)用該材料，可以較簡單的從天然產(chǎn)物中分離富集黃酮類或者含有苯環(huán)的化合物，如黃酮、蒽醌、香豆素等。

(四)附圖說明

圖1：本發(fā)明磁性印跡材料的合成路線；

圖2：實(shí)施例1中制備的磁性印跡材料MCTS的掃描電子顯微鏡圖；

圖3：磁性粒子的IR圖，A.Fe₃O₄、B.Fe₃O₄@SiO₂、C.Fe₃O₄@SiO₂-CH＝CH₂；

圖4：實(shí)施例2固相萃取過程中豆奶HPLC圖，A：染料木苷標(biāo)準(zhǔn)液、B：大豆苷標(biāo)準(zhǔn)液、C：洗脫液，1-大豆苷、2-染料木苷)；

圖5：實(shí)施例3固相萃取過程中樣品HPLC圖，A：洗脫液、B：知母提取液，1-新芒果苷、2-芒果苷、3-知母皂苷BII、4-知母皂苷BIII。

(五)具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1磁性印跡材料的制備與表征

(1)制備Fe₃O₄磁性納米顆粒

采用改良的共沉淀法，將2.5g FeCl₃·6H₂O溶于30mL超純水中，待完全溶解后，加入1mL水合肼以及1％(w/w)十二烷基磺酸鈉，接著再加入1.0g FeSO₄·7H₂O，等其完全溶解后，將10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.5％的氨水(AR)迅速倒入其中并進(jìn)行劇烈攪拌。然后再滴加氨水使混合溶液的pH＝9。在40℃的條件下反應(yīng)0.5h，繼而在80℃條件下反應(yīng)60min。反應(yīng)結(jié)束后，利用磁鐵把黑色沉淀物從中分離出來，反應(yīng)液棄去，然后交替用去離子水、無水乙醇各清洗3遍，得到Fe₃O₄磁性納米顆粒置于真空干燥箱中干燥備用。

(2)制備磁性殼聚糖載體(Fe₃O₄@CTS)

首先稱取1g殼聚糖分散溶解于100mL2％(V/V)的HAc水溶液中，配制成濃度為1％(W/V)的殼聚糖溶液。把配制好的殼聚糖溶液用恒壓滴液漏斗滴加進(jìn)1g步驟(1)制備好的Fe₃O₄磁性納米顆粒中，機(jī)械攪拌2h，得到磁性殼聚糖溶液。

取50mL磁性殼聚糖溶液加入40mL液體石蠟中，再加入乳化劑斯潘80 0.5mL(約10滴)，30℃條件下攪拌30min，調(diào)pH＝9，再加入2mL戊二醛，升溫至60℃，機(jī)械攪拌1.5h，用磁鐵分離得磁性微球，用石油醚、超純水各洗滌數(shù)遍至中性，放入40℃真空干燥箱中干燥備用。

(3)磁性殼聚糖顆粒枝接大黃酸材料制備

精密稱取印跡分子大黃酸(0.3g，1mmol)、羧基活化劑N-羥基丁二酰亞胺(0.06g，0.5mmol)、量取100mL嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液(50mmol/L，pH 6.5)，將三者混合加入到1L潔凈的三口燒瓶中；再將其置于30℃下反應(yīng)活化20min?；罨笕〕鋈跓?，在常溫條件下機(jī)械攪拌，向里加入(0.25g，1.25mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽及步驟(2)制備好的磁性殼聚糖載體Fe₃O₄@CTS 300mg，反應(yīng)12h，大黃酸通過共價(jià)鍵結(jié)合在磁性殼聚糖顆粒之上后，用磁鐵進(jìn)行分離，所得磁性固體顆粒用10wt％碳酸氫鈉水溶液、乙醇及超純水交替洗滌，直至洗脫液中無游離的大黃酸為止。將其放入真空干燥箱中干燥備用。此磁性印跡固體記作MCTS。

以上磁性印跡材料的合成路線如圖1所示。

(4)磁性印跡材料的表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)、X-射線衍射儀(XRD)以及掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)磁性粒子(包括Fe₃O₄、Fe₃O₄@NH₂、Fe₃O₄@CTS、MCTS)進(jìn)行表征，觀察顆粒的形貌、粒徑及化學(xué)結(jié)構(gòu)特征的變化情況。

實(shí)施例2磁性印跡材料應(yīng)用于豆奶中異黃酮的富集

原料豆奶購自祖名豆制品有限公司。

向50mL具塞錐形瓶中加入精密稱取的MCTS固體50mg，再向里加入5mL豆奶，在30℃條件下放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中進(jìn)行吸附10min，轉(zhuǎn)速200rpm。利用磁鐵吸附沉淀，迅速分離，棄去上層吸附液。剩下的磁性印跡固體MCTS分別用預(yù)熱過的40℃40％甲醇振蕩洗脫5min，恒溫空氣搖床轉(zhuǎn)速200rmp。然后用磁鐵進(jìn)行固液分離，收集合并洗脫液，將其進(jìn)行高效液相色譜-紫外檢測(cè)，分析MCTS固體在吸附后洗脫下來的異黃酮類物質(zhì)含量的變化。

MCTS對(duì)豆奶原液的固相萃取結(jié)果如圖4所示。MCTS對(duì)大豆苷、染料木苷的選擇吸附作用較強(qiáng)，說明了MCTS對(duì)豆奶中的異黃酮類物質(zhì)具有明顯的富集效果，可以達(dá)到分析其異黃酮含量的作用。相比于一般分析方法，此方法具有操作要求低，裝置簡單，分析時(shí)間短，選擇性高的優(yōu)點(diǎn)。

色譜條件：色譜柱為Extend-C18(5μm,4.6×250mm)；流動(dòng)相混合溶劑分別是A(甲醇)和溶劑B(0.5％乙酸·水，v/v)；梯度洗脫條件：20％A(3min),20-40％A(3-7min),40-60％A(8-12min),60-20％A(12-15min)；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長260nm；流動(dòng)相流速0.8mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL；大豆苷、染料木苷購自上海同田生物公司

實(shí)施例3磁性印跡材料在知母提取液中富集知母中的□山酮類化合物

知母是一味清熱解毒的中藥，其主要化學(xué)成分有知母皂苷、_□山酮類成分、生物堿、有機(jī)酸及知母多糖等。為了驗(yàn)證MCTS能夠用于黃酮等含苯環(huán)化合物的富集分析，實(shí)驗(yàn)對(duì)中藥知母熱水提取物中成分進(jìn)行富集分離。精密稱取之前步驟制備的MCTS固體50mg放入50mL具塞錐形瓶中。再向里加入5mL知母提取液(中藥材知母粉碎后，按藥材：水固液比1g：8mL的比例，熱水回流6小時(shí)，按比例補(bǔ)足損失水量制得知母提取液)，在30℃條件下放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中吸附10min，轉(zhuǎn)速200rpm。利用磁鐵吸附沉淀，迅速分離，收集上層吸附液。剩下的磁性印跡固體MCTS-A分別用2.5mL超純水、預(yù)熱過40℃的甲醇振蕩洗脫5min，恒溫空氣搖床轉(zhuǎn)速200rmp。然后用磁鐵分離，收集合并洗脫液，將其進(jìn)行高效液相色譜-紫外檢測(cè)，比較MCTS-A固體在吸附前后知母萃取液中芒果苷類的含量的變化。得到的吸附液、洗脫液進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，色譜圖如圖5所示。由圖5可知，MCTS對(duì)知母提取液吸附后再洗脫，獲得的_□山酮類物質(zhì)(主要是新芒果苷與芒果苷)的含量從7.94％上升到84.2％。它說明MCTS-A對(duì)目標(biāo)異黃酮類化合物有良好的吸附解吸附能力，可以對(duì)中草藥中含量較低下的目標(biāo)化合物進(jìn)行富集，對(duì)今后要進(jìn)行的有效分析檢測(cè)做準(zhǔn)備。

色譜條件：Eclipse SB-Aq色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；流動(dòng)相為溶劑C(乙腈)和溶劑D(0.2％乙酸水,v/v)；梯度洗脫條件：100％D(6min),0～15％C(6-8min),15～35％C(9-14min),35～65％C(15-20min),65～0％C(21-25min)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)參數(shù)：載氣流速為1.5L/min-1；流速0.8mL/min；漂移管溫度為85.0℃，柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷BIII購自上海同田公司。