相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年10月22日提交的美國臨時申請系列號62/067258的優(yōu)先權(quán)，其整體通過引用結(jié)合到本文中。

發(fā)明領(lǐng)域

本公開涉及用于進(jìn)行生物學(xué)測定的裝置、系統(tǒng)和方法。特別地，本公開提供用于進(jìn)行快速擴增反應(yīng)的微流控裝置、系統(tǒng)和方法。

發(fā)明背景

核酸擴增反應(yīng)對于許多研究、醫(yī)學(xué)和工業(yè)應(yīng)用而言是極其重要的。這樣的反應(yīng)用于臨床和生物學(xué)研究、傳染性疾病檢測和監(jiān)測、突變檢測、癌癥標(biāo)記物檢測、環(huán)境監(jiān)測、遺傳鑒定、在生物防御應(yīng)用中的病原體檢測等等，例如schweitzer等,currentopinioninbiotechnology,12:21-27(2001)；koch,naturereviewsdrugdiscovery,3:749-761(2004)。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)應(yīng)用于所有這些領(lǐng)域，包括應(yīng)用于病毒和細(xì)菌檢測、病毒載量監(jiān)測、罕見和/或難以培養(yǎng)的病原體檢測、生物恐怖威脅快速檢測、在癌癥患者中檢測極少的殘留疾病、食品病原體檢驗、血液供給篩查等等，例如mackay,clin.microbiol.infect.,10:190-212(2004)；bernard等,clinicalchemistry,48:1178-1185(2002)。關(guān)于pcr，這樣的普遍使用的主要原因是其速度和易于使用(使用標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒和相對簡單和低成本的儀器，通常在幾個小時內(nèi)完成)、其靈敏性(通常在樣品中可檢出幾十個拷貝的靶序列)和其穩(wěn)健性(容易分析質(zhì)量差的樣品或保存的樣品，例如法醫(yī)樣品或固定的組織樣品)，strachan和read,humanmoleculargenetics2(johnwiley&sons,newyork,1999)。

盡管在這樣的普遍應(yīng)用中反映的核酸擴增技術(shù)有許多進(jìn)展，但仍有進(jìn)一步改進(jìn)速度和靈敏性的需要，特別是在例如傳染病檢測、極少殘留疾病檢測、生物防御應(yīng)用等領(lǐng)域。

發(fā)明簡述

本公開涉及用于進(jìn)行生物學(xué)測定的裝置、系統(tǒng)和方法。特別地，本公開提供用于進(jìn)行快速生物化學(xué)(例如，擴增)反應(yīng)的微流控裝置、系統(tǒng)和方法。

例如，在一些實施方案中，本公開提供用于進(jìn)行生物化學(xué)測定的裝置，包含以下一項或多項(例如全部)：a)彈簧加載的熱電冷卻器(tec)子組件(subassembly)；b)熱散播器；c)局部信號增強電路；d)第二儲熱器；和e)連接tec子組件與第二儲熱器的柔性導(dǎo)電材料。在一些實施方案中，tec子組件包含珀爾帖(peltier)元件、具有熱敏電阻嵌入物的熱散播器、熱敏電阻、儲熱器、保護(hù)墊圈、彈簧或球形柱塞、固定支架或溫度測量信號增強電路板的一個或多個。在一些實施方案中，儲熱器由熱傳導(dǎo)材料(例如，金屬例如鋁、鋼、黃銅、鐵、鉛或銅)構(gòu)成。在一些實施方案中，彈簧被嵌入儲熱器的孔中。在一些實施方案中，彈簧推動珀爾帖元件遠(yuǎn)離支架。在一些實施方案中，熱散播器由熱傳導(dǎo)材料(例如，金屬例如鋁、鋼、黃銅、鐵、鉛或銅)構(gòu)成。在一些實施方案中，熱散播器用鍍金或鍍銀改性。在一些實施方案中，熱散播器包含切口。在一些實施方案中，熱敏電阻置于所述切口中。在一些實施方案中，所述柔性導(dǎo)電材料是銅絲或銅帶。

進(jìn)一步的實施方案提供一種系統(tǒng)，包含任何前述裝置和與所述裝置可操作連通的微流控卡盒(cartridge)。在一些實施方案中，所述系統(tǒng)包含兩個所述裝置，并且微流控卡(card)被夾在兩個裝置之間。在一些實施方案中，微流控卡包含一個或多個反應(yīng)室，用于進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)(例如，擴增反應(yīng)、測序反應(yīng)和雜交反應(yīng))。在一些實施方案中，微流控卡用生物相容性粘合劑密封。在一些實施方案中，系統(tǒng)進(jìn)一步包含軟件和計算機處理器，和用戶界面(例如，顯示器屏幕)，其中軟件經(jīng)配置以運行所述裝置。在一些實施方案中，所述軟件經(jīng)配置以在擴增反應(yīng)期間動態(tài)地改變裝置與微流控卡連通的部分的溫度。在一些實施方案中，所述軟件經(jīng)配置以進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)(例如，快速pcr或快速rt-pcr)。

另外的實施方案提供進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的方法，包括使本文所述的系統(tǒng)與用于進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的試劑接觸，和使用所述裝置改變反應(yīng)的溫度(例如，通過向和由儲熱器和第二儲熱器傳遞熱)。在一些實施方案中，所述反應(yīng)是擴增反應(yīng)，并且所述裝置使溫度熱循環(huán)。在一些實施方案中，所述裝置保持比所需要的調(diào)定點更高或更低的調(diào)定點。在一些實施方案中，所述裝置動態(tài)地改變調(diào)定點以達(dá)到目標(biāo)溫度。在一些實施方案中，所述反應(yīng)是診斷或篩查測定。例如，在一些實施方案中，診斷測定鑒定核酸突變或鑒定微生物(例如，病原微生物)。

進(jìn)一步的實施方案提供進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的方法，包括：a)使本文所述的系統(tǒng)與用于進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的試劑接觸；和b)使用所述裝置，通過保持比所需要的調(diào)定點更高或更低的調(diào)定點和動態(tài)地改變所述調(diào)定點以達(dá)到目標(biāo)溫度，從而改變反應(yīng)的溫度。

其它實施方案提供了一種系統(tǒng)，包含本文所述的裝置和與所述裝置可操作連通的微流控卡盒，其中相對于缺少本文所述的一個或多個部件的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)經(jīng)配置以增加快速擴增反應(yīng)的速度或產(chǎn)量，或減少快速擴增反應(yīng)的背景信號。

仍然其它的實施方案提供一種系統(tǒng)，包含本文所述的裝置；與所述裝置可操作連通的微流控卡盒；和計算機軟件和計算機處理器，其經(jīng)配置以使用所述裝置，通過保持比所需要的調(diào)定點更高或更低的調(diào)定點和動態(tài)地改變所述調(diào)定點以達(dá)到目標(biāo)溫度，從而改變反應(yīng)的溫度。

本文描述了另外的實施方案。

附圖簡述

圖1顯示了用于本公開的示例性裝置的彈簧-加載的tec子組件的示意圖。

圖2顯示了本公開的示例性裝置中使用的微流控卡(pcr消耗品)和與tec子組件接合的示意圖。

圖3顯示了本公開的示例性裝置中使用的熱散播器、tec和嵌入的熱敏電阻的單獨的示意圖。

圖4顯示了(左)本公開的示例性裝置中使用的pcb板和與tec和熱敏電阻連接的示意圖。(中)顯示了保護(hù)墊圈。(右)以透明模式顯示了保護(hù)墊圈。

圖5顯示了tec和pcr反應(yīng)器控制的熱傳遞基本原理的示意圖。

圖6顯示了(左)pcr循環(huán)的溫度特征相對于時間的實例，其在20個循環(huán)后由于在儲熱器中積累了太多的熱而失敗。(中)處于打開位置的用于實驗的試驗組件。(右)關(guān)閉的試驗組件(assembly)的照片。

圖7顯示了(左)本公開的示例性裝置中使用的熱橋概念的簡單示意圖。(右)在pcr期間具有銅編織層的tec組件的熱圖像。

圖8顯示了(左)沒有銅編織層的tec組件和與延伸的儲熱器連接的具有銅編織層的tec組件的照片。(中)在pcr循環(huán)之前在照片中的所述相同的兩個系統(tǒng)的熱圖像。(右)在已進(jìn)行35個快速pcr循環(huán)后的所述相同的兩個tec組件。

圖9顯示了(左)溫度相對于時間的圖。(右)使用過沖和下沖調(diào)定點溫度以驅(qū)動快速pcr反應(yīng)的樣品pcr程序腳本。

圖10顯示了(左)快速pcr的四個腳本實例，其產(chǎn)生不同的退火溫度，但具有不變的延伸和變性溫度。(中)左側(cè)描述的pcr方案的溫度相對于時間的疊加圖。(右)來自根據(jù)左側(cè)的試驗?zāi)_本將退火時間標(biāo)準(zhǔn)化的方案的單重(singleplex)pcr產(chǎn)物的電泳圖譜。

圖11顯示了來自非常成功的多重pcr反應(yīng)的電泳圖譜。

圖12顯示了(左)對于1000、100和10個拷貝的模板，與來自標(biāo)準(zhǔn)bad測定pcr方案和一種在商業(yè)系統(tǒng)上開發(fā)的新的和改進(jìn)的pcr方案的擴增子相比，通過本公開的實施方案的噴涂在質(zhì)譜儀上的快速pcr反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的擴增子的幅度。(右)由使用本發(fā)明的快速pcr(左圖譜)和標(biāo)準(zhǔn)pcr(右圖譜)產(chǎn)生的擴增子的質(zhì)譜。

圖13顯示了本公開的實施方案的示例性裝置的線劃圖。顯示了第二儲熱器(13)、主要儲熱器(6)、連接主要儲熱器與第二儲熱器的帶(12)、支架(9)和電路板(10)。

發(fā)明詳述

本公開涉及用于進(jìn)行快速擴增反應(yīng)的裝置、系統(tǒng)和方法。在一些實施方案中，所述裝置和系統(tǒng)包含微流控系統(tǒng)和/或小的手持式儀器平臺。

在一些實施方案中，本公開提供包含以下一項或多項或全部的裝置和系統(tǒng)：(1)彈簧加載的熱電冷卻器(tec)子組件，(2)具有集成的溫度傳感器的熱散播器，(3)局部信號增強電路，(4)將熱重導(dǎo)向至第二儲熱器的柔性導(dǎo)電材料；和(5)驅(qū)動內(nèi)部溫度更快速改變的動態(tài)的下沖和過沖tec調(diào)定點。本公開的實施方案提供分子生物學(xué)系統(tǒng)例如擴增(例如，pcr)系統(tǒng)以高頻率的超快速變化(ultra-fastramping)，能夠進(jìn)行緊湊型儀器設(shè)計，通過用塑料部件替換金屬能夠?qū)崿F(xiàn)較輕重量的手持式儀器，和確保儀器和消耗品之間的極好接觸。

i.裝置和系統(tǒng)

本公開的實施方案提供用于進(jìn)行快速熱循環(huán)或溫度控制的生物化學(xué)測定的裝置和系統(tǒng)。本文描述了示例性的裝置和系統(tǒng)。

示例性的tec子組件1的示意圖在圖1和13中顯示。該圖顯示了用于進(jìn)行快速擴增的元件。這些部件包括例如：tec本身(例如，珀爾帖元件)2，具有熱敏電阻嵌入物4的熱散播器3，熱敏電阻(或rtd)5，儲熱器6，保護(hù)墊圈7，彈簧8，固定支架9和溫度測量信號增強電路板10。熱的貯存器或儲熱器6可由任何熱傳導(dǎo)材料制成，包括但不限于，金屬例如鋁、鋼、黃銅、鐵或鉛。在一些實施方案中，銅由于其高的熱質(zhì)量而使用。

在一些實施方案中，彈簧8適合于儲熱器6中鉆出的孔14和推動tec/熱散播器/儲熱器部件遠(yuǎn)離支架9(例如，用于安裝在儀器中)以與如圖2所示的反應(yīng)卡良好接觸。裝置的彈簧加載方面允許整個組件具有垂直于消耗品表面的一定范圍的移動(例如，其通常在z方向，亦稱為上下方向，但組件能夠傾斜旋轉(zhuǎn)，且仍以x或y平面“東西”或“南北”方向柔性工作)。在一些實施方案中，該移動范圍是0.1-100mm，盡管也預(yù)期其它范圍。在一些實施方案中，小的移動范圍水平(例如，1-10mm)允許消耗品反應(yīng)卡和儀器之間的特別順應(yīng)性，同時保持高度耐受性。換句話說，考慮到通過各種制造和組件實踐產(chǎn)生的在各部分中的典型厚度差異，使熱散播器的表面與卡消耗品良好接觸。在一定范圍的操作條件下，這種良好的物理接觸導(dǎo)致良好的熱接觸，和改進(jìn)熱傳遞性質(zhì)。彈簧的使用主要限制單軸方向的移動程度；然而，如果卡的表面和熱散播器的表面初始不是平行的，一些上下?lián)u動、翻滾和搖晃的部件可存在，這有助于推動系統(tǒng)部件與卡齊平。

在一些實施方案中，壓縮彈簧被替換為球形柱塞。球形柱塞進(jìn)一步限制在與彈簧相反的單方向上更多移動并具有組件安裝的優(yōu)點。在一些實施方案中，在儲熱器中鉆出的孔是旋塞的(例如，帶螺紋的)以允許簡單旋入球形柱塞。當(dāng)與彈簧系統(tǒng)比較時，這種球形柱塞還添加一些熱質(zhì)量至儲熱器并增加從儲熱器至支架的熱傳遞。

tec如何反向推動實例性的反應(yīng)卡11(例如，微流控卡)的示意圖顯示在圖2中。微流控卡11包含用于進(jìn)行生物化學(xué)或分子生物學(xué)測定(例如，擴增反應(yīng)，例如快速pcr、反轉(zhuǎn)錄酶、rt‐pcr、qpcr、等溫擴增等，測序測定和雜交測定)的小室。在一些實施方案中，小室被密封(例如，通過生物化學(xué)相容的粘合劑)。然后將該卡插入儀器中?？?1然后被夾在兩個彈簧加載的tec子組件1之間，其中底組件向上推動卡和頂組件向下推動卡。儀器和卡以這樣的方式設(shè)計，使得利用tec組件1中的兩個彈簧8的壓縮以合適地提供卡與儀器的良好配合。這確保了順應(yīng)性和良好的熱傳遞。另外，粘合劑/粘合劑襯里具有一些一致性。

盡管本公開以彈簧舉例說明，但可使用施加定向的機械力的任何部件(例如，貯存機械能的任何彈性物體)。實例包括但不限于拉伸/延伸彈簧、壓縮彈簧、拉伸彈簧、常量拉伸彈簧、變量拉伸彈簧、螺旋彈簧、片彈簧、機械彈簧、氣體彈簧、波彈簧、懸臂彈簧、平衡彈簧、板彈簧和/或v-彈簧。

熱散播器3顯示在圖3中。在一些實施方案中，熱散播器3比tec1本身更大或更小，以將熱施加至集中或更寬的目標(biāo)區(qū)域。在一些實施方案中，熱散播器3由高度導(dǎo)電的材料(例如鋁或銅)制成，并任選地經(jīng)表面改性(例如，鍍金或鍍銀)以有助于防止腐蝕和氧化，同時保持良好的熱性質(zhì)。

在一些實施方案中，熱散播器包括通過水力噴射或其它機械加工方法或金屬注射成型(injectingmolding)產(chǎn)生的切口14。切口允許熱敏電阻5放置和連接在熱散播器3內(nèi)部，使得熱敏電阻5進(jìn)行熱散播器的溫度測量。熱散播器3包含在整個操作期間提供一致溫度的尺寸。熱敏電阻5測量的溫度與整個熱散播器3一致，并且熱敏電阻5的放置的微小差異是不重要的。熱散播器3/熱敏電阻5的組合允許直接測量散播器上/內(nèi)的溫度，然后用于給予tec驅(qū)動板反饋控制。tec1本身不測量/報告溫度。標(biāo)準(zhǔn)控制算法(例如，pi、pid、級聯(lián)(cascade))然后用于控制熱散播器中的溫度，并因此間接控制反應(yīng)室內(nèi)的溫度。

熱敏電阻/rtd通常產(chǎn)生非常小的信號，其可能受到射頻/電子噪聲干擾。在一些實施方案中，通過在電路板10上在離信號加工短距離(例如，5cm或更少、4cm或更少、3cm或更少、2cm或更少、或1cm或更少)地放置配線，所述板限制干擾的可能性。該板的主要功能是獲取自熱敏電阻5或rtd電路產(chǎn)生的小的信號，和放大/增強該信號，使得其不再受到來自外環(huán)境或儀器本身的其它電子器件的干擾。該板的能夠進(jìn)行可靠的快速熱循環(huán)的第二方面是有害的接合/物理相互作用問題顯著減少和/或消除。例如，在一些實施方案中，tec1和熱敏電阻5二者是脫離支架部件而商業(yè)化的，其具有非常小的靈敏導(dǎo)線。例如，熱散播器3是6mm正方形，如圖4所示。這些靈敏的導(dǎo)線被直接焊接在板中，所述板與作為一剛性金屬件的儲熱器連接。這一技術(shù)使得裝配人員抓取相對大的物體以防止在裝配期間靈敏導(dǎo)線上的應(yīng)力/應(yīng)變，和使得加工過程更容易。其還防止在正常操作期間的隨機問題和減少失敗的可能性。在一些實施方案中，所述子組件還包含保護(hù)墊圈7，其相對于熱散播器3和tec1滑動。在一些實施方案中，墊圈包含結(jié)構(gòu)特征(例如，內(nèi)置通道)，其然后包住靈敏導(dǎo)線并因此防止進(jìn)一步的應(yīng)力和應(yīng)變。保護(hù)墊圈7還提供一定程度的水/飛濺抗性和有助于防止電短路。

墊圈7由任何合適的材料制成，包括但不限于塑料(例如，迭爾林、聚丙烯、丙烯酸或苯乙烯)，和/或由較軟的材料例如橡膠或聚二甲基硅氧烷(pdms)制成。在一些實施方案中，電路板10含有內(nèi)置插頭，其然后連接簡單/標(biāo)準(zhǔn)的帶狀電纜與標(biāo)準(zhǔn)的連接器(作為10針插頭顯示，但可能多于或少于10)。因為從該板測量的輸出溫度信號現(xiàn)在很大，這種標(biāo)準(zhǔn)電纜的長度對于更有用的儀器布局可以是長的或短的。其還允許與進(jìn)行控制操作和給tec提供驅(qū)動電壓和電流的“主板”的簡單接合。

pcr反應(yīng)的溫度通過熱散播器5的溫度測量而間接控制。熱散播器5的溫度通過tec1驅(qū)動。tec通過從儲熱器(例如，銅塊)傳遞熱至/出pcr反應(yīng)而用作熱泵。通過將熱從儲熱器6泵入反應(yīng)卡11，使反應(yīng)卡11更熱，和通過將熱從反應(yīng)卡11泵入儲熱器6，使反應(yīng)卡11更冷。然而，tec不是100％有效的，并且每次tec進(jìn)行加熱、冷卻或穩(wěn)態(tài)溫度控制時，產(chǎn)生廢熱(例如p＝i2r)，其累積在儲熱器中。tec可保持/動態(tài)地控制pcr反應(yīng)在儲熱器的+/‐～30℃內(nèi)。因此，儲熱器優(yōu)選地保持在中間熱態(tài)以允許極度快速變化速率(例如>20℃/秒)以加熱和冷卻，這實現(xiàn)生物化學(xué)反應(yīng)(例如，pcr中存在的變性、退火和延伸步驟)中使用的溫度改變。

在一些實施方案中，為了防止儲熱器的過度加熱(見例如，圖6)，在裝置中包括被動或主動溫度控制部件。主動冷卻例如，通過使用一個或多個風(fēng)扇來實現(xiàn)，或另一個tec系統(tǒng)用于保持溫度。在一些實施方案中，利用被動途徑，其中儲熱器6的尺寸增加或材料改變以增加儲熱器的熱質(zhì)量。

在一些實施方案中，儲熱器分成兩個(或更多個)連接的部件。這一概念類似于電化學(xué)領(lǐng)域的“鹽橋”。較小的主動儲熱器6與tec連接，并使用單獨的較大的第二儲熱器13用作廢熱堆積。在一些實施方案中，一個或多個柔性金屬(例如，銅)熱帶12(或厚規(guī)格的銅絲或石墨烯，或另一種柔性熱導(dǎo)體)用于從一個儲熱器傳遞熱能至另一個較大的儲熱器。銅帶是優(yōu)良的熱導(dǎo)體，并將不需要的廢熱從與tec連接的第一儲熱器除去。在一些實施方案中，較大的廢熱儲熱器是單獨的銅塊(或其它材料)，其特別設(shè)計用于廢熱。在一些實施方案中，第二儲熱器連接至已經(jīng)在系統(tǒng)中的另一較大的蓄熱體(例如，儀器的殼或框架，或金屬泵)。使用銅帶作為熱橋的示意圖顯示于圖7中。

銅帶12和將儲熱器6分成兩個連接的部分6和13具有兩個主要益處。第一個是儀器周圍的設(shè)計是柔性的。例如，在一些實施方案中，柔性銅帶容易導(dǎo)向到盒子內(nèi)部的其它位置，并且大儲熱器容易地位于儀器內(nèi)的任何位置。此外，主儲熱器通過熱傳遞規(guī)則被動地調(diào)節(jié)。

在一些實施方案中，本文描述的系統(tǒng)使用與tec連接的小的主要儲熱器6，其提供快速tec響應(yīng)并因此提供快速生物化學(xué)(例如，擴增)反應(yīng)。此外，第二儲熱器13用作過量熱的清除器和保持第一儲熱器接近最佳溫度。因為較小的主要儲熱器6變得更熱，通過帶12的能量傳遞也增加(q＝uaδt)。這種被動調(diào)節(jié)方案不需要活躍地移動的部件，和不需要額外的動力，這對于手持式儀器是高度理想的。銅帶12的柔性通過上下移動進(jìn)一步提供與彈簧加載的概念一起運行的益處。在本公開的開發(fā)期間進(jìn)行的實驗中，在添加了柔性銅帶12的情況下，運行120個連續(xù)完整的快速pcr循環(huán)而沒有失敗，以及在循環(huán)之間沒有中止。tec子組件的熱成像照片顯示通過銅帶的熱流(經(jīng)由溫度梯度)，顯示于圖7。

在pcr之前和期間，具有和不具有銅熱帶的tec子組件的照片和熱圖像顯示于圖8。在生物化學(xué)反應(yīng)之前，兩個組件具有相同的熱能；然而，隨著生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，與具有銅編織層的tec組件相比，沒有銅帶的tec組件明顯更熱。例如，在圖8所示的系統(tǒng)中，塑料保護(hù)墊圈(由箭頭指示)，與在具有銅編織層的系統(tǒng)上的80‐85℃相比，在沒有銅編織層的系統(tǒng)上為約120‐140℃。在沒有銅帶的系統(tǒng)上的儲熱器也比具有銅編織層的系統(tǒng)熱得多，這表明銅編織層調(diào)節(jié)儲熱器和獲得用于快速pcr的適當(dāng)?shù)臒崃抗芾怼?/p>

在一些實施方案中，裝置包含動態(tài)下沖和過沖tec調(diào)定點，以更快速地驅(qū)動內(nèi)部溫度。熱傳遞原理規(guī)定在冷卻或加熱期間物體將逐漸達(dá)到調(diào)定點。達(dá)到靶調(diào)定點的5％以內(nèi)可能需要1分鐘；然而，取決于系統(tǒng)，達(dá)到靶調(diào)定點的1％以內(nèi)可能需要另外30分鐘的相對時間。為了打破這種關(guān)系，一個方案是使用比真實需要的調(diào)定點更高的調(diào)定點，然后將其動態(tài)地改變，因此加熱的物體不超過該溫度，而是達(dá)到目標(biāo)溫度。這種類型的調(diào)節(jié)方法基于pid控制中發(fā)現(xiàn)的原理–更具體地，級聯(lián)控制方案。例如，當(dāng)在mj熱循環(huán)儀上自95℃冷卻至60℃時，用于控制pcr反應(yīng)的溫度的“熱塊”實際自95℃改變至60℃，并且內(nèi)部反應(yīng)溫度滯后。在本公開的一些實施方案中，這一問題通過以下得到解決：程序化在快速pcr中的較低溫度(例如45℃)數(shù)秒鐘(例如，2-10秒、3-5秒或3.2秒或4.6秒)或若干秒鐘(例如，10‐20秒)，然后一旦內(nèi)部pcr反應(yīng)溫度達(dá)到60℃時回到60℃用于退火步驟。這種方法實現(xiàn)快速pcr的實例溫度與時間圖與用于運行pcr程序的腳本顯示于下面的圖9中。

調(diào)定點的動態(tài)轉(zhuǎn)換應(yīng)以相對精確的時機進(jìn)行。在腳本或程序?qū)懗稍?5℃變性和在55℃退火時，則完成子程序。圖10顯示四個實例腳本，其具有以秒列出的溫度和時間(秒)。這些腳本是經(jīng)設(shè)計給出不同的退火溫度與相同的延伸和變性溫度的試驗程序。溫度相對于時間的結(jié)果在中心部分繪圖。這些腳本成功地分別產(chǎn)生和保持60℃、55℃、52.5℃和50℃的內(nèi)部“吸收溫度”。單重pcr實驗使用這一系統(tǒng)以指示的方案(具有不同的退火溫度)進(jìn)行，以產(chǎn)生所需要的86個堿基對產(chǎn)物和不需要的54個堿基對。在此實驗中，最低的退火溫度50℃和52.5℃方案得到最多的總產(chǎn)物和最少的副產(chǎn)物。

本文所述的系統(tǒng)在用于多種類型的測定的許多引物對上得到了驗證。所述系統(tǒng)在多達(dá)24重pcr測定中以陽性結(jié)果得到了驗證。

下文圖11顯示了>15重pcr擴增的電泳圖譜。對于成功的測定，產(chǎn)生大量產(chǎn)物，并且在此情況下不同的跡線表示各種濃度的再水合的凍干主混合物。

用各種引物對進(jìn)行實驗，具有非常積極的結(jié)果。與“金標(biāo)準(zhǔn)”市售熱循環(huán)儀相比，本公開的實施方案的裝置產(chǎn)生一樣多或更多的pcr產(chǎn)物，如圖12所示。與市售平臺上的大約2小時20分鐘相比，總pcr時間是15‐20分鐘。用本公開的快速pcr系統(tǒng)和市售系統(tǒng)進(jìn)行的分析均在存在15微克人dna背景的情況下完成。這種水平代表了正經(jīng)歷高度感染(例如敗血癥)的患者樣品。這表明快速pcr的穩(wěn)健性和特異性。圖12還顯示一個單獨的實驗的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，其中引物經(jīng)設(shè)計以從白色念珠菌(c.albicans)擴增dna。本公開的實施方案的快速pcr系統(tǒng)產(chǎn)生非常高的信號噪聲比。

本公開的實施方案的裝置、系統(tǒng)和方法提供進(jìn)行快速生物化學(xué)測定的小而低成本方案。這樣的裝置、系統(tǒng)和方法可用于各種用途。實例包括但不限于，醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的研究和診斷應(yīng)用，在臨床、第一急救者和軍隊中的用途。

在一些實施方案中，提供軟件或計算機程序(例如，作為包含本文所述的裝置的系統(tǒng)的一部分或作為一種獨立的產(chǎn)品)。在一些實施方案中，軟件運行本文所述的裝置和/或分析使用本文所述的裝置產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。例如，在一些實施方案中，軟件包含用于運行快速-pcr反應(yīng)、顯示結(jié)果和分析數(shù)據(jù)的算法。例如，在一些實施方案中，軟件經(jīng)配置以使用本文所述的裝置來控制加熱和冷卻步驟，和管理調(diào)定點。例如，在一些實施方案中，軟件經(jīng)配置以使用所述裝置，通過保持比所需要的調(diào)定點更高或更低的調(diào)定點和動態(tài)地改變所述調(diào)定點以達(dá)到目標(biāo)溫度，從而改變反應(yīng)溫度。

在一些實施方案中，pcr算法和/或結(jié)果在用戶界面(例如，顯示屏)上顯示。在一些實施方案中，軟件在計算機、平板電腦或智能手機上運行。

ii.方法

本文描述的裝置和系統(tǒng)可用于各種研究、篩查和診斷方法。實例包括但不限于，樣品制備、突變或多態(tài)性鑒定、和微生物(例如，病原微生物)的鑒定和表征。

在一些實施方案中，本文描述的裝置和系統(tǒng)可用于擴增反應(yīng)。核酸擴增技術(shù)的說明性的非限制性實例包括但不限于，聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(tma)、連接酶鏈反應(yīng)(lcr)、鏈置換擴增(sda)、qpcr、等溫pcr和基于核酸序列的擴增(nasba)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，某些擴增技術(shù)(例如，pcr)需要在擴增之前將rna被反轉(zhuǎn)錄成dna(例如，rt-pcr)，而其它擴增技術(shù)直接擴增rna(例如，tma和nasba)。

在一些實施方案中，本文描述的裝置和系統(tǒng)可用于測序方法。實例包括例如，鏈終止劑(sanger)測序、染料終止劑測序和高通量測序方法。這些測序方法中的許多是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如，sanger等人,proc.natl.acad.sci.usa74:5463-5467(1997)；maxam等人,proc.natl.acad.sci.usa74:560-564(1977)；drmanac,等人,nat.biotechnol.16:54-58(1998)；kato,int.j.clin.exp.med.2:193-202(2009)；ronaghi等人,anal.biochem.242:84-89(1996)；margulies等人,nature437:376-380(2005)；ruparel等人,proc.natl.acad.sci.usa102:5932-5937(2005)，和harris等人,science320:106-109(2008)；levene等人,science299:682-686(2003)；korlach等人,proc.natl.acad.sci.usa105:1176-1181(2008)；branton等人,nat.biotechnol.26(10):1146-53(2008)；eid等人,science323:133-138(2009)；其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中。

下一代測序(ngs)方法共享大規(guī)模平行、高通量策略的共同特征，目的是與較舊的測序方法相比更低的成本(參見例如，voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。ngs方法可廣義上分為通常使用模板擴增的那些方法和不使用模板擴增的那些方法。需要擴增的方法包括作為454技術(shù)平臺(例如，gs20和gsflx)由roche商業(yè)化的焦磷酸測序、由illumina商業(yè)化的solexa平臺和由appliedbiosystems商業(yè)化的supportedoligonucleotideligationanddetection(solid)(支持的寡核苷酸連接和檢測)平臺。非擴增方法，亦稱為單分子測序，由以下例示：由helicosbiosciences商業(yè)化的heliscope平臺，和分別由visigen、oxfordnanoporetechnologiesltd.、lifetechnologies/iontorrent和pacificbiosciences商業(yè)化的新出現(xiàn)的平臺。

在焦磷酸測序中(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；美國專利號6,210,891；美國專利號6,258,568；其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中)，將模板dna片段化、末端修補、連接至銜接頭，和通過用帶有與銜接頭互補的寡核苷酸的珠子捕獲單模板分子進(jìn)行原位克隆擴增。帶有單模板類型的每個珠子被區(qū)室化至油包水微囊中，使用稱為乳液pcr的技術(shù)克隆擴增所述模板。擴增后將乳液破壞，并將珠子沉淀至在測序反應(yīng)期間用作流動池的小型化微量滴定板的各個孔中。在流動池中，在測序酶和發(fā)光報道分子例如螢光素酶的存在下，有序地反復(fù)引入四種dntp試劑的每一種。在合適的dntp加入至測序引物的3′末端的情況下，得到的atp產(chǎn)生在孔內(nèi)引起發(fā)光，其使用ccd相機記錄。有可能實現(xiàn)大于或等于400個堿基的閱讀長度，和可實現(xiàn)10⁶個序列讀出，產(chǎn)生多達(dá)5億個堿基對(500mb)的序列。

在solexa/illumina平臺中(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；美國專利號6,833,246；美國專利號7,115,400；美國專利號6,969,488；其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中)，測序數(shù)據(jù)以較短長度讀出的形式產(chǎn)生。在該方法中，單鏈片段化的dna經(jīng)末端修補，以產(chǎn)生5′-磷酸化的鈍端，接著通過klenow-介導(dǎo)加入單個a堿基至片段的3′末端。a-添加利于加入t-突出銜接頭寡核苷酸，其隨后用于捕獲用寡核苷酸錨鑲嵌在流動池的表面上的模板-銜接頭分子。所述錨用作pcr引物，但因為模板的長度和其接近其它附近的錨寡核苷酸，通過pcr延伸產(chǎn)生“拱形”的分子，以與附近的錨寡核苷酸雜交，在流動池的表面上形成橋結(jié)構(gòu)。將這些dna環(huán)變性和切除。正向鏈然后用可逆染料終止劑測序。摻入的核苷酸序列通過檢測摻入后熒光來確定，其中每個熒光團和封閉基團在下一循環(huán)的dntp添加之前被除去。序列讀出長度范圍為36個核苷酸至超過250個核苷酸，每次分析運行的總體輸出超過10億個核苷酸對。

使用solid技術(shù)測序核酸分子(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；美國專利號5,912,148；美國專利號6,130,073；其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中)也包括模板的片段化，連接至寡核苷酸銜接頭，連接至珠子，和通過乳液pcr克隆擴增。此后，帶有模板的珠子被固定在玻璃流動池的衍生化表面上，和將與銜接頭寡核苷酸互補的引物退火。然而，不是利用該引物用于3′延伸，而是用于提供5′磷酸酯基團以連接至詢問探針，所述詢問探針包含兩個探針特異性堿基接著6個簡并堿基和四種熒光標(biāo)記之一。在solid系統(tǒng)中，詢問探針具有在各探針的3′末端的兩個堿基和在5′末端的四種熒光團之一的16種可能組合。熒光團顏色，和由此各探針的特征，對應(yīng)于規(guī)定的顏色-空間編碼方案。多輪(通常7輪)探針退火、連接和熒光團檢測之后接著變性，然后使用相對于初始引物偏置一個堿基的引物進(jìn)行第二輪測序。以此方式，可在計算機上重建模板序列，和模板堿基被詢問兩次，導(dǎo)致準(zhǔn)確性增加。序列讀出長度平均為35個核苷酸，和每次測序運行的總體輸出超過40億個堿基。

在某些實施方案中，使用納米孔測序(參見例如，astier等人,j.am.chem.soc.2006年2月8日；128(5):1705–10，通過引用結(jié)合到本文中)。納米孔測序的理論必須涉及當(dāng)納米孔浸入導(dǎo)電流體中和在其中施加電位(電壓)時發(fā)生的現(xiàn)象。在這些條件下，可觀察到由于離子通過納米孔傳導(dǎo)產(chǎn)生的輕微電流，和電流的量對納米孔的大小極度敏感。當(dāng)核酸的每個堿基通過納米孔時，這引起通過納米孔的電流幅度改變，其對于四種堿基的每一種是不同的，從而允許測定dna分子的序列。

在某些實施方案中，使用helicosbiosciences的heliscope(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；美國專利號7,169,560；美國專利號7,282,337；美國專利號7,482,120；美國專利號7,501,245；美國專利號6,818,395；美國專利號6,911,345；美國專利號7,501,245；其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。將模板dna片段化，和在3′末端多腺苷酸化，最后的腺苷帶有熒光標(biāo)記。將變性的多腺苷酸化模板片段連接至在流動池表面上的多聚(dt)寡核苷酸。捕獲的模板分子的初始物理位置通過ccd相機記錄，然后切除標(biāo)記并洗去。通過加入聚合酶和連續(xù)加入熒光標(biāo)記的dntp試劑進(jìn)行測序。摻入事件產(chǎn)生對應(yīng)于dntp的熒光信號，并且在每輪dntp添加之前通過ccd相機捕獲信號。序列讀出長度范圍為25–50個核苷酸，每次分析運行的總體輸出超過10億個核苷酸對。

iontorrent技術(shù)是一種基于檢測氫離子的dna測序方法，所述氫離子在dna聚合過程中釋放(參見例如，science327(5970):1190(2010)；美國專利申請公開號20090026082、20090127589、20100301398、20100197507、20100188073和20100137143，通過引用以其整體結(jié)合到本文中用于所有目的)。微孔含有待測序的模板dna鏈。該微孔層的下方是超靈敏isfet離子傳感器。所有層包含在cmos半導(dǎo)體芯片內(nèi)，類似于電子行業(yè)中使用的芯片。當(dāng)dntp摻入增長的互補鏈時，釋放氫離子，其觸發(fā)超靈敏的離子傳感器。如果在模板序列中存在均聚物重復(fù)時，在單個循環(huán)中將摻入多個dntp分子。這導(dǎo)致相應(yīng)大量釋放的氫和按比例更高的電子信號。該技術(shù)不同于其它測序技術(shù)之處在于未使用修飾的核苷酸或光學(xué)。iontorrent測序儀的按堿基的準(zhǔn)確率對于50個堿基讀出是～99.6％，每次運行產(chǎn)生～100mb至100gb。讀出長度是100-300個堿基對。長度為5個重復(fù)的均聚物重復(fù)的準(zhǔn)確率是～98％。離子半導(dǎo)體測序的益處是快的測序速度和低的預(yù)支和操作成本。

stratosgenomics,inc.測序包括使用xpandomer。該測序方法通常包括提供通過模板定向合成產(chǎn)生的子鏈。該子鏈通常包括在序列中偶聯(lián)的多個亞單位，所述序列對應(yīng)于全部或一部分的靶核酸的連續(xù)核苷酸序列，其中單個亞單位包含系鏈、至少一個探針或核堿基殘基，和至少一個可選擇性切割的鍵?？蛇x擇性切割的鍵經(jīng)切割，得到長度大于子鏈的多個亞單位的xpandomer。xpandomer通常包括系鏈和報道元件，其用于分析在對應(yīng)于全部或一部分的靶核酸的連續(xù)核苷酸序列的序列中的遺傳信息。然后檢測xpandomer的報道元件。關(guān)于基于xpandomer的方法的另外的詳情描述于例如，2008年6月19日提交的標(biāo)題為“通過擴增的高通量核酸測序”的美國專利公開號20090035777，其通過引用以其整體結(jié)合到本文中。

其它新出現(xiàn)的單分子測序方法包括使用visigen平臺通過合成的實時測序(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641–58,2009；美國專利號7,329,492；美國專利申請系列號11/671956；美國專利申請系列號11/781166；其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中)，其中使用熒光修飾的聚合酶和熒光接受體分子將固定的引發(fā)dna模板進(jìn)行鏈延伸，在添加核苷酸時生成可檢測的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)。

在一些實施方案中，本文描述的裝置和系統(tǒng)可用于雜交測定。核酸雜交技術(shù)的說明性的非限制性實例包括但不限于，原位雜交(ish)、微陣列和dna或rna印跡。

原位雜交(ish)是一種使用標(biāo)記的互補dna或rna鏈作為探針以定位在組織的一部分或切片(原位)中(或者，如果組織足夠小，則是整個組織(整體固定ish))的特定dna或rna序列的雜交類型。dnaish可用于確定染色體的結(jié)構(gòu)。rnaish用于測量和定位組織切片或整體固定物內(nèi)的mrna和其它轉(zhuǎn)錄物。樣品細(xì)胞和組織通常經(jīng)處理以原位固定靶轉(zhuǎn)錄物和增加探針的接觸。在升高的溫度下探針雜交至靶序列，然后洗去過量的探針。用放射性、熒光或抗原標(biāo)記的堿基來標(biāo)記的探針分別使用放射自顯影、熒光顯微術(shù)或免疫組織化學(xué)在組織中定位和定量。ish也可使用用放射性或其它非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的兩種或更多種探針，以同時檢測兩種或更多種轉(zhuǎn)錄物。

在一些實施方案中，雜交測定是微陣列，包括但不限于：dna微陣列(例如，cdna微陣列和寡核苷酸微陣列)；蛋白質(zhì)微陣列；組織微陣列；轉(zhuǎn)染或細(xì)胞微陣列；化合物微陣列；和抗體微陣列。dna微陣列，通常稱為基因芯片、dna芯片或生物芯片，是連接至固體表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)的微觀dna斑點的集合，因同時為數(shù)千基因的表達(dá)分析或監(jiān)測其表達(dá)水平的目的而形成陣列。固定的dna區(qū)段稱為探針，數(shù)千探針可用于單個dna微陣列中。通過比較在疾病細(xì)胞和正常細(xì)胞中的基因表達(dá)，微陣列可用于鑒定疾病基因或轉(zhuǎn)錄物(例如，mir)。微陣列可使用各種技術(shù)制造，包括但不限于：用細(xì)頭針印刷在玻璃片上；使用預(yù)制的掩模的光刻法；使用動態(tài)微鏡像裝置的光刻法；噴墨打印；或者在微電極陣列上的電化學(xué)。

dna和rna印跡分別用于檢測特定dna或rna序列。將自樣品提取的dna或rna片段化，在基質(zhì)凝膠上電泳分離和轉(zhuǎn)移至濾膜。將濾膜結(jié)合的dna或rna與標(biāo)記探針雜交，所述探針與目的序列互補。檢測結(jié)合至濾膜的雜交探針。該程序的變體是反向rna印跡，其中固定至膜上的底物核酸是分離的dna片段的集合，并且探針是自組織提取并標(biāo)記的rna。

上述說明書中提及的所有出版物、專利、專利申請和登錄號通過引用以其整體結(jié)合到本文中。盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體的實施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解，要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)過度限于這樣的具體實施方案。事實上，本發(fā)明所述的組合物和方法的各種修改和變化對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見的，并意圖包括在隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。