專利名稱:17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于材料技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種分析測定生物樣品和食品樣品中的 17 β -雌二醇的分子印跡復(fù)合微球。
背景技術(shù):
17 β -雌二醇(17 β -Estradiol)是人工合成雌激素的一種,它主要用于醫(yī)學(xué)上治療婦女更年期綜合癥等疾病,但長期攝入17 β -雌二醇會產(chǎn)生一些副作用,并增加某些疾病的發(fā)病危險,鑒于具有這些風(fēng)險,故而國家嚴禁在食品中使用17 β-雌二醇等人工合成雌激素。但不乏一些不法分子為強化其產(chǎn)品功能,降低成本而添加17 β-雌二醇等具有的雌激素樣作用的人工合成雌激素。此外,濫用同化激素,對人和動物健康,對社會和生態(tài)環(huán)境都會造成直接或潛在的危害。因此對食品、保健食品中17 β-雌二醇等人工合成的雌激素監(jiān)測也是保證此類食品衛(wèi)生安全的必要措施。17 β -雌二醇可通過生命體的代謝進入環(huán)境,或作為雌性激素類藥物生產(chǎn)的母體化合物隨工業(yè)廢水進入環(huán)境,以致在水生物中殘留,由食物鏈進入人體,而其代謝產(chǎn)物又與人類癌癥有密切的關(guān)系。因此,它引起的食品營養(yǎng)和安全問題不容忽視,對這類物質(zhì)的存在水平和生物學(xué)活性的研究具有重要的現(xiàn)實意義。由于食品中的殘留待測藥物濃度低且波動范圍大、樣品基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多、樣品基質(zhì)和待測組分的不確定性等特點,檢測前需去除樣品中干擾雜質(zhì),富集痕跡量待測目的組分。分子印跡聚合物(MIPs)具有特異性識別,可用于復(fù)雜基質(zhì)的樣品前處理,且制備簡單、性質(zhì)穩(wěn)定和可重復(fù)使用,已在分離科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、傳感器技術(shù)和化學(xué)反應(yīng)的控制等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。但現(xiàn)有的制備MPIMs方法都存在明顯的局限性本體聚合得到的聚合物為塊狀,使用前須經(jīng)過研磨、篩分等處理,尺寸和形狀不規(guī)則使得樣品處理困難, 工作繁瑣、費時,且產(chǎn)率低(一般< 50% ),應(yīng)用效率大幅降低;沉淀聚合法對溶劑的要求高,難以得到廣泛應(yīng)用;乳液聚合法制得的MPIMs粒徑小(< Iym),不適合在液相色譜中使用且吸附后不易分離;利用球形硅膠表面印跡或犧牲硅膠法時,硅膠表面的羥基會影響功能單體與模板分子間的作用力,以致MPIMs識別能力較弱;懸浮聚合法雖制備工藝簡單, 但獲得的MPIMs粒徑分布寬,需經(jīng)繁瑣的分級處理才可使用;多步溶脹聚合法雖能制得微米級且粒徑較均勻的MPIMs,經(jīng)簡單的洗滌即可使用,但需經(jīng)多步溶脹,過程較為繁瑣、制備周期較長,難以實現(xiàn)工業(yè)化。相比之下,分子印跡聚合物微球性能較好、制備與使用較方便, 特別適用于分析檢測、傳感器陣列和分離組件。因此,分子印跡聚合物微球的制備和應(yīng)用研究成為分子印跡技術(shù)的研究熱點之一。表面印跡的結(jié)合位點位于聚合物的表面,模板分子易于洗脫,可提高結(jié)合容量;再結(jié)合時目標分子無需進入其剛性結(jié)構(gòu),大大加快了結(jié)合的動力學(xué)過程。但這種方法目前使用的基質(zhì)主要局限于硅膠,使用微粒硅膠要特別注意它的使用PH范圍是2 7. 5,若過堿(pH > 7.幻,硅膠會粉碎或溶解;若過酸(pH <幻,鍵合相的化學(xué)鍵會斷裂。反應(yīng)結(jié)束后去除基質(zhì)比較麻煩,一般采用氫氟酸腐蝕的方法,但對聚合物的骨架結(jié)構(gòu)有一定的不良影響。
發(fā)明內(nèi)溶本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述制備方法的缺點,提供一種反應(yīng)條件溫和,產(chǎn)物穩(wěn)定性好、識別能力強的17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成1、合成單分散聚苯乙烯分散液將苯乙烯、偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮加入無水乙醇中,苯乙烯與偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、無水乙醇的質(zhì)量比為1 0.01 0.04 0.1 0.3 7. 5 9,超聲分散,通氮氣除氧,攪拌,70°C聚合反應(yīng)M小時,制備成聚苯乙烯;將聚苯乙烯用質(zhì)量分數(shù)為0. 2%的十二烷基硫酸鈉水溶液超聲分散,得到單分散聚苯乙烯分散液。上述聚乙烯吡咯烷酮的分子量為10000 70000,由中國 派尼化學(xué)試劑廠 鄭州提供。2、制備單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⑦^氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散劑水溶液加入環(huán)己醇與甲苯的混合溶劑中,甲苯與環(huán)己醇、過氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散劑水溶液的質(zhì)量比為1 2 0. 15 2 3 60,用細胞破碎儀在功率為300 500W下超聲,每間隔10 20秒超聲1次,每次超聲10 20秒,超聲乳化至上層無油滴,加入到步驟1得到的單分散聚苯乙烯分散液中,甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯與單分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的質(zhì)量比為1 0. 1,30°C攪拌溶脹10小時,通氮氣除氧, 70°C聚合反應(yīng)M小時,過濾,依次用甲醇、丙酮洗滌,60°C真空干燥4小時,制備成單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。上述分散劑水溶液中的分散劑為十二烷基硫酸鈉和聚乙烯醇,十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0.2%,聚乙烯醇的質(zhì)量分數(shù)為2%,所述的聚乙烯醇的聚合度為1700,醇解度為88%,由天津天大化工實驗廠提供。3、抽提單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⒉襟E2制備的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球用甲苯在索式提取器中 140°C抽提48小時,依次用無水乙醇、丙酮洗滌,干燥,得到單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。4、單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1,4- 二氧六環(huán)中, 每IOOmL 1,4_ 二氧六環(huán)中加入3 IOg單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球,室溫攪拌溶脹4 12小時,通氮氣除氧,加入甲基丙烯酸羥乙酯與1,4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2 5 4 6的混合液,單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 0. 1 2,30 60°C攪拌8 15小時,過濾,產(chǎn)物依次用 1,4_ 二氧六環(huán)、甲醇、蒸餾水、丙酮洗滌,真空干燥,得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。5、合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球以乙腈為溶劑,超聲分散17 β-雌二醇、甲基丙烯酸、表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球,室溫攪拌溶脹4 12小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈,17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球丙酯微球的質(zhì)量比為1 20 120,17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 2 12 8 20 1 2,通氮氣除氧,60 70°C聚合反應(yīng)16 48小時,產(chǎn)物用甲醇與乙酸的體積比為8 2的洗脫液洗脫,除去17 β-雌二醇,先用蒸餾水洗至中性,再用甲醇洗滌,真空干燥,制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。本發(fā)明的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4中,單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的最佳質(zhì)量比為1 1,甲基丙烯酸羥乙酯與1,4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的最佳質(zhì)量比為1 2.6 5。本發(fā)明的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4中,最佳將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1,4- 二氧六環(huán)中,室溫攪拌溶脹6小時,通氮氣除氧,加入1,4_ 二氧六環(huán)與甲基丙烯酸羥乙酯、三氟化硼乙醚的混合液, 45°C攪拌12小時,得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。本發(fā)明的合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中,17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的最佳質(zhì)量比為1 40,17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的最佳摩爾比為1 4 10 1.2。本發(fā)明的合成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中,最佳將17 β-雌二醇、甲基丙烯酸溶于乙腈中,加入步驟4得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球,超聲分散,室溫攪拌溶脹6小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈,通氮氣除氧,70°C聚合反應(yīng)M小時。本發(fā)明以1,4_ 二氧六環(huán)為溶劑,制備表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球,以表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球為載體,采用表面印跡技術(shù)制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球,該方法反應(yīng)條件溫和,所得產(chǎn)物穩(wěn)定性好,對17 β-雌二醇的識別能力強、吸附速度快,可用于建立簡便的提取、控化和濃縮樣品預(yù)處理,對含雌激素產(chǎn)品的質(zhì)量和成分進行評估,同時可用于經(jīng)受高流速高壓力操作的高效液相色譜,大大提高柱效與重現(xiàn)性。另外,由于印跡的結(jié)合位點位于聚合物的表面,模板分子易于洗脫,結(jié)合時目標分子無需進入其剛性結(jié)構(gòu),大大加快了吸附與解吸的動力學(xué)過程,可將其用作快速、高效的固相萃取吸附劑。
圖1是17 β -雌二醇、白藜蘆醇和辣椒堿在印跡柱上的色譜分離圖。圖2是17 β -雌二醇、白藜蘆醇和辣椒堿在非印跡柱上的色譜分離圖。圖3是17 β -雌二醇和雌酮在印跡柱上的色譜分離圖。圖4是17 β -雌二醇和雌酮在非印跡柱上的色譜分離圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明,但本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1 1、合成單分散聚苯乙烯分散液 將苯乙烯10. 908g、偶氮二異丁腈0. M06g、分子量為10000 70000的聚乙烯吡咯烷酮1.5006g加入盛有96g無水乙醇的250mL單口燒瓶中,苯乙烯與偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、無水乙醇的質(zhì)量比為1 0.02 014 8. 8,用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散20分鐘,通氮氣15分鐘除氧,攪拌,70°C聚合反應(yīng)M小時,反應(yīng)結(jié)束后,離心除去溶劑,用無水乙醇洗滌,制備成聚苯乙烯;將0. 2g聚苯乙烯用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散于IOmL質(zhì)量分數(shù)為0. 2%的十二烷基硫酸鈉水溶液中,得到單分散聚苯乙烯分散液。2、制備單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⑦^氧化苯甲酰0. 1667g、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯2.064g、乙二醇二甲基丙烯酸酯 3. 03g、十二烷基硫酸鈉與聚乙烯醇(醇解度為88% )的混合物水溶液62. 35g加入盛有 1.92g環(huán)己醇與1.0392g甲苯的250mL燒杯中,甲苯與環(huán)己醇、過氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、十二烷基硫酸鈉與聚乙烯醇的混合物水溶液的質(zhì)量比為1 2 0. 15 2 3 60,用細胞破碎儀在功率為400W下超聲,每間隔15秒超聲1 次,每次超聲15秒,超聲乳化至上層無油滴,加入到步驟1得到的單分散聚苯乙烯分散液中,甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯與單分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的質(zhì)量比為1 0.1,120轉(zhuǎn) /分鐘攪拌,30°C溶脹10小時,通氮氣20分鐘除氧,70°C聚合反應(yīng)M小時,用玻砂漏斗抽濾,用70°C蒸餾水洗滌,再依次用甲醇、丙酮洗滌,60°C真空干燥4小時,制備成單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。上述的十二烷基硫酸鈉與聚乙烯醇的混合物水溶液中,十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0. 2%,聚乙烯醇的質(zhì)量分數(shù)為2%,聚乙烯醇的聚合度為1700,醇解度為88%。3、抽提單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⒉襟E2制備的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球置于索式提取器中,加入 50mL甲苯,140°C抽提48小時,依次用無水乙醇、丙酮洗滌,在真空度為0. 06MPa下60°C干燥3小時,得到單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。4、單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球2. Og加入50mL 1, 4- 二氧六環(huán)中,200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌,室溫溶脹6小時,通氮氣20分鐘除氧,加入2. Og甲基丙烯酸羥乙酯、5. 2g 1,4-二氧六環(huán)、10. Og三氟化硼乙醚的混合液,甲基丙烯酸羥乙酯與1, 4-二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2.6 5,單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 1,45°C攪拌12小時,過濾,產(chǎn)物依次用1,4_二氧六環(huán)、甲醇、蒸餾水、丙酮洗滌,30°C真空干燥2小時,得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。5、合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球?qū)?7 3-雌二醇201^(0.078讓01)、甲基丙烯酸27“1^(0.32讓01)溶于15mL乙腈中,加入步驟4得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球0. 8g,用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散5分鐘,200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌,室溫溶脹6小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯147 μ L (0. 774mmol)、偶氮二異丁腈15mg (0. 094mmol),17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為1 40,17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 4 10 1.2,通氮氣20分鐘除氧,70°C聚合反應(yīng)M小時,產(chǎn)物先依次用蒸餾水、甲醇洗滌,再用甲醇與乙酸的體積比為8 2的洗脫液洗脫M小時,除去17β-雌二醇,然后用蒸餾水洗至中性,再用甲醇洗滌,30°C真空干燥2小時,制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。對比實施例1按照實施例1步驟1 4的方法,制備成表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。不添加模板分子17 β-雌二醇,直接將甲基丙烯酸27 yL (0.32mmol)溶于15mL乙腈中,加入0. 8g表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球,用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散5分鐘,200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌,室溫溶脹6小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯147 μ L(0. 774mmol)、偶氮二異丁腈15mg(0. 094mmol),通氮氣20分鐘除氧,70°C聚合反應(yīng)M小時,產(chǎn)物依次用蒸餾水、甲醇洗滌,30°C真空干燥2小時,制備成非分子印跡復(fù)合微球。實施例2在實施例1的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4中, 將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球1. 6g加入53. 2mL 1,4_ 二氧六環(huán)中,200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌,室溫溶脹6小時,通氮氣20分鐘除氧,加入0. 16g甲基丙烯酸羥乙酯、0.32g 1,4-二氧六環(huán)、0.64g三氟化硼乙醚的混合液,甲基丙烯酸羥乙酯與1, 4-二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2 4,單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 0.1,該步驟的其他步驟與實施例1相同。在合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中,將17 β -雌二醇40mg(0. 156mmol)、甲基丙烯酸^yL(0.312mmol)溶于15mL乙腈中,加入步驟4得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球0. Sg,用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散5分鐘,200轉(zhuǎn) /分鐘,室溫溶脹6小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯237yL(1.248mm0l)、偶氮二異丁腈 26mg(0. 156mmol),17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為1 20,17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 :2:8: 1,該步驟的其他步驟與實施例1相同。其他步驟與實施例1相同, 制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。實施例3在實施例1的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4中,將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球1. 6g加入16mL 1,4_ 二氧六環(huán)中, 200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌,室溫溶脹6小時,通氮氣20分鐘除氧,加入3. 2g甲基丙烯酸羥乙酯、16g 1,4-二氧六環(huán)、19. 2g三氟化硼乙醚的混合液,甲基丙烯酸羥乙酯與1,4_二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 5 6,單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 2,該步驟的其他步驟與實施例1相同。在合成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中,將17 β-雌二醇6. 7mg(0. 026mmol)、甲基丙烯酸25 μ L (0. 31mmol)溶于15mL乙腈中,加入步驟4得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球 0. 8g,用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散5分鐘,200轉(zhuǎn)/分鐘,室溫溶脹6小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯 100 μ L (0. 52mmol)、偶氮二異丁腈 9. 3mg (0. 056mmol),17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為1 120,17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 12 20 2,該步驟的其他步驟與實施例1相同。其他步驟與實施例1相同,制備成17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球。
實施例4在實施例1 3的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4 中,將單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1,4_ 二氧六環(huán)中,200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌, 室溫溶脹4小時,通氮氣20分鐘除氧,加入甲基丙烯酸羥乙酯與1,4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的混合液,30°C攪拌15小時,該步驟的其他步驟與相應(yīng)實施例相同。其他步驟與相應(yīng)實施例相同,制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。實施例5在實施例1 3的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4 中,將單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1,4_ 二氧六環(huán)中,200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌, 室溫溶脹12小時,通氮氣20分鐘除氧,加入甲基丙烯酸羥乙酯與1,4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的混合液,60°C攪拌8小時,該步驟的其他步驟與相應(yīng)實施例相同。其他步驟與相應(yīng)實施例相同,制備成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球。實施例6在實施例1 5的合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中,將17 β -雌二醇、甲基丙烯酸、表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球超聲分散于乙腈中,200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌,室溫溶脹4小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈,通氮氣 20分鐘除氧,60°C聚合反應(yīng)48小時,該步驟的其他步驟與相應(yīng)實施例相同。其他步驟與相應(yīng)實施例相同,制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。實施例7在實施例1 5的合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中,將17 β -雌二醇、甲基丙烯酸、表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球超聲分散于乙腈中,200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌,室溫溶脹12小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈,通氮氣20分鐘除氧,70°C聚合反應(yīng)16小時,該步驟的其他步驟與相應(yīng)實施例相同。其他步驟與相應(yīng)實施例相同,制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。為了驗證本發(fā)明的有益效果,發(fā)明人采用本發(fā)明實施例1制備的17β_雌二醇分子印跡復(fù)合微球和對比實施例1制備的非分子印跡復(fù)合微球進行了各種試驗,具體試驗情況如下實驗試劑過氧化苯甲酰(ΒΡ0,A.R.天津市福晨化學(xué)試劑廠);甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(GMA,Sigma-Aldrich);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA,Sigma-Aldrich);甲基丙烯酸(MAA, Sigma-Aldrich);甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA, Sigma-Aldrich) ;1,4-二氧六環(huán)(A.R.天津市福晨化學(xué)試劑廠);N,N-二甲基甲酰胺(DMF,天津市福晨化學(xué)試劑廠); 17 β -雌二醇,雌三醇和雌酮,均采購自上海晶純實業(yè)有限公司。1、色譜實驗(1)稱取17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球(MIP)、非分子印跡復(fù)合微球(NIP)各 0. 8g置于30mL異丙醇中,超聲勻漿10分鐘,在20ΜΙ^壓力下,以乙腈作為頂替液,濕法裝柱 (50mmX4. 6mm),以乙腈為流動相,直到獲得穩(wěn)定的基線。以17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球填充的色譜柱稱為印跡柱,以非分子印跡復(fù)合微球填充的色譜柱稱為非印跡柱。色譜條件以體積分數(shù)為36%的乙腈-水溶液為流動相;流速為0. 5mL/分鐘;進樣量為5. 0 μ L,樣品為20 μ g · mL—1的乙腈水溶液;檢測波長為280nm。
測定數(shù)據(jù)容量因子k' = (、-、)/、,其中、是分析物的保留時間,、是死時間 (以NaNO2測定);印跡因子IF = k' MIP/k' NIP,其中k' 和k' NIP分別為17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球和非分子印跡復(fù)合微球的容量因子;分離因子α =k/ /k2',其中k/ 和1 '分別是17 β -雌二醇和雌三醇在印跡柱上的容量因子。(2) 17 β -雌二醇在印跡柱和非印跡柱上的保留情況以17 β-雌二醇及與其結(jié)構(gòu)差異較大的白藜蘆醇和辣椒堿作為研究對象,研究 17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球和非分子印跡復(fù)合微球的選擇性,結(jié)果如圖1和圖2所示。 由圖1可見,在相同的分離條件下,17 β-雌二醇在印跡柱上的保留比白藜蘆醇、辣椒堿強, 表明17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球?qū)?7 β-雌二醇具有一定的吸附選擇性;如圖2所示, 相同的分離條件下,三種物質(zhì)在非印跡柱上的保留時間十分接近,證明分子印跡復(fù)合微球?qū)δ0宸肿泳哂刑禺愋赃x擇。這是由于在17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備過程中形成了能夠與模板分子17 β-雌二醇空間結(jié)構(gòu)相匹配的印跡孔穴和結(jié)合位點,其對模板分子具有特異識別能力;白藜蘆醇和辣椒堿的結(jié)構(gòu)與17 β-雌二醇的結(jié)構(gòu)不相同,很難與模板分子留下的印跡孔穴相匹配,因此,17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球?qū)ζ洳痪邆渥R別能力。 而非分子印跡復(fù)合微球上并不存在這樣的特異性結(jié)合位點,三種物質(zhì)在非印跡柱上的保留時間十分接近。另外,選擇17 β -雌二醇的結(jié)構(gòu)類似物雌酮作為研究對象研究分子印跡復(fù)合微球?qū)ν愇镔|(zhì)的識別作用。由圖3可以看出,雌二醇和雌酮在印跡柱上的保留時間很接近,說明17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球?qū)Y(jié)構(gòu)類似物具有相似的保留情況。由圖3、4對比可以看出,17 β -雌二醇和其結(jié)構(gòu)類似物雌酮在非印跡柱上的保留時間均小于在印跡柱上的保留時間,由此進一步證明分子印跡復(fù)合微球?qū)δ0宸肿佑刑禺愋宰R別作用。(3) ρΗ值對分離的影響分別以乙腈與ρΗ為3、5、7、9、11的PBS緩沖液05mmol/L的磷酸鹽緩沖液)的體積比為36 64的混合液為流動相,考察流動相的ρΗ對17 β-雌二醇及雌三醇在印跡柱上保留情況的影響。結(jié)果如表1所示。表1流動相中磷酸鹽酸沖液的ρΗ值對分離的影響
權(quán)利要求
1.一種17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法,由下述步驟組成(1)合成單分散聚苯乙烯分散液將苯乙烯、偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮加入無水乙醇中,苯乙烯與偶氮二異丁腈、 聚乙烯吡咯烷酮、無水乙醇的質(zhì)量比為1 0.01 0.04 0.1 0.3 7. 5 9,超聲分散,通氮氣除氧,攪拌,70°C聚合反應(yīng)M小時,制備成聚苯乙烯;將聚苯乙烯用質(zhì)量分數(shù)為 0. 2%的十二烷基硫酸鈉水溶液超聲分散,得到單分散聚苯乙烯分散液;上述聚乙烯吡咯烷酮的分子量為10000 70000 ;(2)制備單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⑦^氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散劑水溶液加入環(huán)己醇與甲苯的混合溶劑中,甲苯與環(huán)己醇、過氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散劑水溶液的質(zhì)量比為1 2 0. 15 2 3 60,用細胞破碎儀在功率為300 500W下超聲,每間隔10 20秒超聲1次,每次超聲10 20秒,超聲乳化至上層無油滴,加入到步驟(1)得到的單分散聚苯乙烯分散液中,甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯與單分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的質(zhì)量比為1 0. 1,30°C攪拌溶脹10小時,通氮氣除氧, 70°C聚合反應(yīng)M小時,制備成單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球;上述分散劑水溶液中的分散劑為十二烷基硫酸鈉和聚乙烯醇,十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0. 2%,聚乙烯醇的質(zhì)量分數(shù)為2%,所述的聚乙烯醇的聚合度為1700,醇解度為 88% ;(3)抽提單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⒉襟E( 制備的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球用甲苯在索式提取器中140°C 抽提48小時,得到單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球;(4)單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基將步驟⑶制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1,4_二氧六環(huán)中,每 IOOmL 1,4_ 二氧六環(huán)中加入3 IOg單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球,室溫攪拌溶脹4 12小時,通氮氣除氧,加入甲基丙烯酸羥乙酯與1,4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2 5 4 6的混合液,單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 0.1 2,30 60°C攪拌8 15小時,得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球;(5)合成17β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球以乙腈為溶劑,超聲分散17 β -雌二醇、甲基丙烯酸、表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球,室溫攪拌溶脹4 12小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈,17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為 1 20 120,17 β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 2 12 8 20 1 2,通氮氣除氧,60 70°C聚合反應(yīng)16 48小時,洗脫 17 β -雌二醇,制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法,其特征在于 在單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟中,所述的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法,其特征在于在單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟中,所述的甲基丙烯酸羥乙酯與1,4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2.6 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法,其特征在于 在單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟(4)中,將步驟C3)制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1,4_ 二氧六環(huán)中,室溫攪拌溶脹6小時,通氮氣除氧,加入1,4_ 二氧六環(huán)與甲基丙烯酸羥乙酯、三氟化硼乙醚的混合液,45°C攪拌12小時,得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法,其特征在于 在合成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟(5)中,所述的17 β-雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為1 40。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法,其特征在于 在合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟( 中,所述的17 β -雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 4 10 1.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法,其特征在于 在合成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟( 中,將17β-雌二醇、甲基丙烯酸溶于乙腈中,加入步驟(4)得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球,超聲分散,室溫攪拌溶脹6小時,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈,通氮氣除氧,70V聚合反應(yīng)M小時。
全文摘要
一種17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法,以1,4-二氧六環(huán)為溶劑,制備表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球,以表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球為載體,采用表面印跡技術(shù)制備成17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球,該方法反應(yīng)條件溫和,所得產(chǎn)物穩(wěn)定性好,對17β-雌二醇的識別能力強、吸附速度快,可用于建立簡便的提取、控化和濃縮樣品預(yù)處理,對含雌激素產(chǎn)品的質(zhì)量和成分進行評估,同時可用于經(jīng)受高流速高壓力操作的高效液相色譜,大大提高柱效與重現(xiàn)性,還可用作快速、高效的固相萃取吸附劑。
文檔編號B01J20/30GK102382273SQ20111019470
公開日2012年3月21日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者岳宣峰, 張靜, 王玲玲, 陳月萌, 韓艷婷, 馬晉琴 申請人:陜西師范大學(xué)