專利名稱：：親水性高分子微粒、和離子交換液相色譜用填充劑及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抑制在水系介質(zhì)中的溶脹且對(duì)于水系介質(zhì)的分散性優(yōu)異的親水性高分子微粒、可以有效抑制蛋白質(zhì)等的非特異吸附的離子交換液相色譜用填充劑、使用了該離子交換液相色譜用填充劑的糖化血紅蛋白的分析方法、可以長時(shí)間維持對(duì)溶脹、非特異吸附等的抑制效果的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法、使用該離子交換液相色譜用填充劑的制造方法進(jìn)行制造的離子交換液相色譜用填充劑、以及糖化血紅蛋白分析用的離子交換液相色譜用填充劑。
背景技術(shù)：
：從亞微米至微米尺寸的高分子微粒，廣泛應(yīng)用于有機(jī)顏料、調(diào)色劑粒子、液晶用間隔基、乳膠微粒、離子交換液相色譜用填充劑等，其中，近年來向離子交換液相色譜用填充劑的應(yīng)用備受矚目。離子交換液相色譜法，作為對(duì)各種生物相關(guān)物質(zhì)的分離分析極其有效的方法被人們所熟知。其中，近年來作為糖化血紅蛋白類(以下也稱為血紅蛋白Alc)的分析方法受到矚目。血紅蛋白Alc是血液中的糖與血紅蛋白的P鏈N末端進(jìn)行化學(xué)鍵合而成的，血紅蛋白中血紅蛋白Alc所占的比例，即相對(duì)于血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)的血紅蛋白Alc的比例，可以說反映了12個(gè)月期間血糖值的平均值。因此，表示血紅蛋白Alc所占比例的血紅蛋白Alc值(％)，代替短時(shí)間可能變動(dòng)很大的血糖值，作為糖尿病診斷的指標(biāo)正在被廣泛使用。當(dāng)為水系介質(zhì)中使用的高分子微粒時(shí)，為了抑制由于水系介質(zhì)的環(huán)境變化引起的形狀變化，要求在水系介質(zhì)中的溶脹小，并且為了提高分散性等要求粒子表面的親水性高，特別是作為離子交換液相色譜法中的離子交換液相色譜用填充劑使用時(shí)，為了使色譜柱內(nèi)的壓力變動(dòng)減小、盡快平衡，要求對(duì)于水系介質(zhì)的溶脹極小。為了使水系介質(zhì)中的溶脹變小，作為目前公知的方法，可以通過大量使用疏水性交聯(lián)性單體提高交聯(lián)度而進(jìn)行應(yīng)對(duì)。但是，在使用疏水性交聯(lián)性單體而成的微粒中，由于表面的疏水性高，因此存在水系介質(zhì)中的分散性差的問題。另外，將這樣的微粒用作液相色譜用填充劑時(shí)，也存在由于接觸蛋白質(zhì)等生物樣品而引起非特異吸附的問題?？梢哉J(rèn)為該非特異吸附是由于疏水性相互作用而引起的，因此必須盡量提高離子交換液相色譜用填充劑表面的親水性。作為提高離子交換液相色譜用填充劑的親水性的方法，可以列舉例如使離子交換液相色譜用填充劑的基材微粒部分大量含有親水性單體的方法等。但是，使親水性單體的含量增加時(shí)，離子交換液相色譜用填充劑內(nèi)部的親水性也提高，作為結(jié)果離子交換液相色譜用填充劑的機(jī)械強(qiáng)度變?nèi)?，因此產(chǎn)生以下問題變得不能高速分離，或者離子交換液相色譜用填充劑本身引起溶脹，從而導(dǎo)致測(cè)定精度下降。作為解決這些問題的方法，己知有下述方法例如在由硅類化合物構(gòu)成的基劑中引入離子交換基團(tuán)的方法、或在由有機(jī)合成高分子構(gòu)成的交聯(lián)性粒子中使含有離子交換基團(tuán)的化合物反應(yīng)而得到的方法(專利文獻(xiàn)1等)。另外，已知使交聯(lián)性單體與含有離子交換基團(tuán)的化合物反應(yīng)得到的方法(專利文獻(xiàn)2等)等。另外，在專利文獻(xiàn)3中，公開了在疏水性交聯(lián)聚合物微粒的表面上形成有親水性聚合物層的被覆聚合物粒子。疏水性交聯(lián)聚合物微粒，通過構(gòu)成的疏水性交聯(lián)性單體，高強(qiáng)度地進(jìn)行交聯(lián)，因此機(jī)械強(qiáng)度增高，可以抑制溶脹。另外，通過使形成的親水性聚合物層的厚度為130nm，可以實(shí)現(xiàn)以下效果防止分析對(duì)象物質(zhì)等的非特異吸附，及維持親水性的狀態(tài)，抑制由親水性聚合物層引起的溶脹。但是，現(xiàn)實(shí)情況中，在這樣的親水性聚合物層的厚度范圍內(nèi)，很難防止疏水性交聯(lián)聚合物微粒的露出，結(jié)果不能充分防止由疏水性相互作用引起的非特異吸附。特別是測(cè)定糖化血紅蛋白這樣的在臨床檢查等中使用的物質(zhì)時(shí)，要求在更高的水平下的測(cè)定精度，因此必須盡可能防止由疏水性相互作用引起的非特異吸附。對(duì)此在專利文獻(xiàn)4中公開了一種對(duì)具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子表面進(jìn)行親水化處理而得到的離子交換液相色譜用填充劑，具體而言，是在具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子表面吸附蛋白質(zhì)等具有親水性基團(tuán)的化合物進(jìn)行親水化而得到的離子交換液相色譜用填充劑。在這樣的離子交換液相色譜用填充劑中，基材既不溶脹也不收縮，另一方面，通過親水性表面可以有效防止蛋白質(zhì)等的非特異吸附。但是，這樣通過物理吸附固定親水性化合物的情況，在使用初期階段可以發(fā)揮高性能，但在長期使用中親水性化合物從填充劑粒子的表面脫離，存在保留時(shí)間或測(cè)定值產(chǎn)生變動(dòng)的問題。另外，根據(jù)吸附的親水性化合物的批間差異，也存在保留時(shí)間或測(cè)定值變動(dòng)的問題點(diǎn)。專利文獻(xiàn)l:日本特開平1-262468號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本特公昭63-59463號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:日本特公平8-7197號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4:日本特開2001-91505號(hào)公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明鑒于上述現(xiàn)狀，其目的在于提供一種抑制在水系介質(zhì)中的溶脹且對(duì)于水系介質(zhì)的分散性優(yōu)異的親水性高分子微粒、可以有效抑制蛋白質(zhì)等的非特異吸附的離子交換液相色譜用填充劑、使用了該離子交換液相色譜用填充劑的糖化血紅蛋白的分析方法、可以長時(shí)間維持對(duì)溶脹、非特異吸附等的抑制效果的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法、使用該離子交換液相色譜用填充劑的制造方法進(jìn)行制造的離子交換液相色譜用填充劑、以及糖化血紅蛋白分析用的離子交換液相色譜用填充劑。本發(fā)明為一種親水性高分子微粒，其特征在于，分別使其分散在水和丙酮中之后照射超聲波15分鐘，并在25'C下放置240小時(shí)使其平衡后，用粒度分布測(cè)定儀分別測(cè)定粒徑時(shí)，使其在水中分散時(shí)的粒徑Dw與使其在丙酮中分散時(shí)的粒徑DA的比Dw/DA為2.0以下，并且，將所述親水性高分子微粒無間隙地排列成單層并在其上面形成純水的液滴之后，在25°。條件下用接觸角計(jì)測(cè)定的水的接觸角為70°以下。另外，本發(fā)明為一種離子交換液相色譜用填充劑，其由基材微粒和在該基材微粒表面存在的離子交換基團(tuán)構(gòu)成，其特征在于，分別使其分散在水和丙酮中之后，照射超聲波15分鐘，并在25'C下放置240小時(shí)使其平衡后，用粒度分布測(cè)定儀分別測(cè)定粒徑時(shí)，使其在水中分散時(shí)的粒徑Dw與使其在丙酮中分散時(shí)的粒徑DA的比Dw/DA為2.0以下，并且，所述離子交換液相色譜用填充劑無間隙地排列成單層并在其上面形成純水的液滴之后，在25'C條件下用接觸角計(jì)測(cè)定的水的接觸角為60。以下。本發(fā)明為一種離子交換液相色譜用填充劑，其具有離子交換基團(tuán)，水的接觸角為60。以下，且表面沒有被親水性化合物覆蓋。另外，本發(fā)明為一種離子交換液相色譜用填充劑，其是由疏水性交聯(lián)聚合物粒子和具有離子交換基團(tuán)的親水性聚合物層構(gòu)成的，所述疏水性交聯(lián)聚合物粒子由合成有機(jī)高分子組成，所述親水性聚合物層共聚在所述疏水性交聯(lián)聚合物粒子的表面上，所述離子交換液相色譜用填充劑的最表面被臭氧水實(shí)施親水化處理。本發(fā)明還為一種離子交換液相色譜用填充劑的制造方法，其中具有如下的親水化工序，所述親水化工序中通過使用溶存臭氧氣濃度為20ppm以上的臭氧水洗滌具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子表面而進(jìn)行親水化，所述親水化工序中，進(jìn)行基于加速氧化法的處理。以下詳細(xì)敘述本發(fā)明。本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使高分子微粒的Dw/DA(以下也稱為溶脹度)及對(duì)于表面的水的接觸角在一定的范圍，可以得到一種抑制在水系介質(zhì)中的溶脹且對(duì)于水系介質(zhì)的分散性優(yōu)異的親水性高分子微粒，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的親水性高分子微粒，分別使其分散在水和丙酮中之后照射超聲波15分鐘，并在25。C下放置240小時(shí)使其平衡后，用粒度分布測(cè)定儀分別測(cè)定粒徑時(shí)，使其在水中分散時(shí)的粒徑Dw與使其在丙酮中分散時(shí)的粒徑Da的比Dw/DA為2.0。通常高分子微粒具有在有機(jī)溶劑中收縮、在水系介質(zhì)中進(jìn)行不同程度溶脹的傾向。因此，在水系介質(zhì)中的溶脹程度大時(shí)，Dw/Da増大，相反，在水系介質(zhì)中的溶脹程度小時(shí)，Dw/Da減小。當(dāng)Dw/DA超過2.0時(shí)，由于在水系介質(zhì)中的溶脹程度過大，因此在用于例如液相色譜用填充劑時(shí)，壓力變動(dòng)增大，平衡花費(fèi)時(shí)間，因此不實(shí)用。另外，用于水性涂料時(shí)，由于引起涂裝前的粘度上升，操作性變差，因此不實(shí)用。優(yōu)選的下限為l.O，優(yōu)選的上限為1.8。作為上述粒度分布測(cè)定儀，沒有特別的限定，可以列舉例如Accusizer780(ParticleSizingSystems公司制)等。另外，本發(fā)明的親水性高分子微粒，將該親水性高分子微粒無間隙地排列成單層并在其上面形成純水的液滴之后，在25'C條件下用接觸角計(jì)測(cè)定的水的接觸角為70°以下。接觸角測(cè)定，被用作評(píng)價(jià)以高分子材料為主的表面親水性、疏水性的方法。水的接觸角越小，則判斷親水性越高，本發(fā)明中通過設(shè)定上限為70°，親水性大幅度提高，對(duì)水的分散性提高，另外，將本發(fā)明的親水性高分子微粒作為液相色譜用填充劑使用時(shí)，即使接觸蛋白質(zhì)等生物樣品，也幾乎不引起非特異吸附。另外，用于水性涂料時(shí)，由于分散性良好，因此涂裝操作性提高。優(yōu)選的上限為60。。作為上述接觸角計(jì)，可以使用例如協(xié)和界面科學(xué)公司制造的Dropmaster500等自動(dòng)接觸角計(jì)。上述水的接觸角可以使用如上所述的接觸角計(jì)，可以根據(jù)由連結(jié)液滴左右端點(diǎn)與頂點(diǎn)的直線相對(duì)于固體表面的角度而求出接觸角的方法(9/2法)等進(jìn)行測(cè)定，具體可以列舉如下方法。用顯微鏡進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)將干燥的親水性高分子微粒在載玻片上貼附的雙面帶上無間隙地排列成單層，之后用空氣噴涂除去剩余的親水性高分子微粒，將親水性高分子微粒在雙面帶上固定。制作25'C的純水1uL的液滴，使其著液在載玻片上固定的親水高分子微粒上，使用接觸角計(jì)通過e/2法計(jì)算出接觸角。需要說明的是，當(dāng)接觸角小于90°時(shí)，著液后的水滴容易潤濕，因此著液后的接觸角經(jīng)時(shí)變小。因此使用著液后0.5秒后的接觸角值進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明的親水性高分子微粒，通過其溶脹度滿足上述范圍，可以成為即使在水系介質(zhì)也幾乎不溶脹的高分子微粒，通過水的接觸角滿足上述范圍，可以成為對(duì)于水系介質(zhì)的分散性優(yōu)異的高分子微粒。作為滿足上述溶脹度范圍和上述水的接觸角范圍的親水性高分子微粒，具體可以列舉例如由疏水性交聯(lián)聚合物構(gòu)成、并且在最表面實(shí)施了親水化處理的微粒，其中所述疏水性交聯(lián)聚合物，由水溶解度為5重量％以下的疏水性交聯(lián)性單體和/或疏水性非交聯(lián)性單體構(gòu)成。上述疏水性交聯(lián)聚合物可以是以下聚合物中的任意物質(zhì)將1種水溶解度為5重量％以下的疏水性交聯(lián)性單體進(jìn)行單獨(dú)聚合而得到的疏水性交聯(lián)聚合物(例如，由乙二醇二甲基丙烯酸酯單獨(dú)構(gòu)成的聚合物、由二乙烯基苯單獨(dú)構(gòu)成的聚合物等);將2種以上的水溶解度為5重量°/。以下的疏水性交聯(lián)性單體進(jìn)行共聚而得到的疏水性交聯(lián)聚合物(例如，由乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羥甲基丙垸三甲基丙烯酸酯構(gòu)成的共聚物、由二乙烯基苯和二乙烯基甲苯構(gòu)成的共聚物等);將至少1種水溶解度為5重量％以下的疏水性交聯(lián)性單體和至少1種水溶解度為5重量％以下的疏水性非交聯(lián)性單體進(jìn)行共聚而得到的疏水性交聯(lián)聚合物(例如，由乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸丁酯構(gòu)成的共聚物、由二乙烯基苯和苯乙烯構(gòu)成的共聚物等)。作為上述水溶解度為5重量％以下的疏水性交聯(lián)性單體，只要在單體1分子中具有2個(gè)以上乙烯基，則沒有特別的限定，可以列舉例如乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等二(甲基)丙烯酸酯；四羥甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙垸三(甲基)丙烯酸酯、四羥甲基甲垸四(甲基)丙烯酸酯等三(甲基)丙烯酸酯或四(甲基)丙烯酸酯；二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基萘等芳香族類化合物等。在此，水溶解度是指在水100mL中加入單體20mL，室溫下攪拌10分鐘X3次，在20'C的保溫器中放置一夜，之后，將在水中溶解的單體量用氫炎氣相色譜儀根據(jù)雙鍵(PSDB)法進(jìn)行測(cè)定，由此而計(jì)算得到的值。作為上述水溶解度為5重量％以下的疏水性非交聯(lián)性單體，只要是具有疏水性性質(zhì)的非交聯(lián)性的聚合性有機(jī)單體，則沒有特別的限定，可以列舉例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸異丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等(甲基)丙烯酸酯；苯乙烯、甲基苯乙烯等苯乙烯類單體等。上述疏水性交聯(lián)聚合物由上述水溶解度為5重量％以下的疏水性交聯(lián)性單體與上述水溶解度為5重量％以下的疏水性非交聯(lián)性單體的共聚構(gòu)成時(shí)，水溶解度為5重量％以下的疏水性非交聯(lián)性單體的使用量，相對(duì)于水溶解度為5重量％以下的疏水性交聯(lián)性單體100重量份，優(yōu)選為50重量份以下。作為對(duì)最表面進(jìn)行親水化處理的方法，沒有特別的限定，可以列舉例如在高分子微粒的表面實(shí)施臭氧水處理、臭氧氣處理、等離子體處理、電暈處理、通過雙氧水、次氯酸鈉等的表面氧化處理等的方法，或者使以蛋白質(zhì)或多糖類為主的來自生物體的親水性化合物或聚乙稀醇、聚乙稀吡咯垸酮、聚丙烯酸、磷脂質(zhì)聚合物等親水性高分子化合物進(jìn)行物理吸附或化學(xué)鍵在高分子微粒表面的方法等。其中，當(dāng)考慮制備時(shí)的操作性、批管理的容易性、經(jīng)時(shí)性能維持等時(shí)，優(yōu)選臭氧水處理。上述臭氧水，是指臭氧氣在水中溶解而成的臭氧水。臭氧中具有強(qiáng)力的氧化作用，但在臭氧氣中，通過將高分子微粒表面進(jìn)行均勻氧化而實(shí)施親水化處理非常困難。但是，通過使用臭氧水，可以僅僅通過使高分子微粒分散在臭氧水中而簡便地使高分子微粒表面氧化而實(shí)施親水化處理。親水化處理的結(jié)果，可以認(rèn)為疏水性的結(jié)構(gòu)部分被氧化，生成親水基團(tuán)(-OH、-CHO、-COOH等)。作為上述臭氧水中溶存臭氧氣的濃度，沒有特別限定，但優(yōu)選下限為20ppm。當(dāng)?shù)陀?0ppm時(shí)，在親水化處理上費(fèi)時(shí)間，且不能實(shí)施充分的親水化處理，從而將高分子微粒用作液相色譜用填充劑時(shí)不能充分抑制測(cè)定對(duì)象物質(zhì)等的非特異吸附。更優(yōu)選的下限為50ppm。濃度的優(yōu)選上限沒有特別限定。作為上述臭氧水的制備方法，沒有特別的限定，可以列舉例如曰本報(bào)中所記載，通過只透過氣體而阻止液體透過的臭氧氣透過膜，使原料水和臭氧氣接觸的方法等。另外，進(jìn)行上述臭氧水處理時(shí)，優(yōu)選使用加速氧化處理法。加速氧化處理法是指使臭氧水的氧化作用增強(qiáng)的方法，可以將紫外線照射、超聲波照射、堿水添加等促進(jìn)溶存臭氧分解的方法進(jìn)行單獨(dú)使用或者并用2種以上。通過進(jìn)行基于這樣的加速氧化處理法的處理，促進(jìn)溶存臭氧的分解，增加由臭氧的分解而生成的羥基自由基的生成量。這樣生成的羥基自由基，由于具有比臭氧更高的氧化力，因此認(rèn)為可能進(jìn)一步提高親水化處理的效果。利用上述加速氧化處理法時(shí)，可以進(jìn)一步促進(jìn)高分子微粒表面上的親水基(-OH、-CHO、-COOH等)的生成。即使未進(jìn)行親水化處理而對(duì)于高分子微粒表面的水的接觸角也為70°以下的情況，沒有必要特別進(jìn)行親水化處理。作為本發(fā)明的親水性高分子微粒的平均粒徑，沒有特別限定，可以采用對(duì)應(yīng)目的的粒徑。作為本發(fā)明的親水性高分子微粒的粒度分布(CV值)，沒有特別限定，但優(yōu)選的上限為40%。當(dāng)超過40%時(shí)，不實(shí)用。更優(yōu)選的上限為15%。本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑，為由基材粒子、及上述基材粒子表面存在的離子交換基團(tuán)構(gòu)成的離子交換液相色譜用填充劑，分別使其分散在水和丙酮中之后照射超聲波15分鐘，并在25"C下放置240小時(shí)使其平衡后，用粒度分布測(cè)定儀分別測(cè)定粒徑時(shí)，使其在水中分散時(shí)的粒徑Dw與使其在丙酮中分散時(shí)的粒徑DA的比Dw/DA為2.0以下，并且，將所述親水性高分子微粒無間隙地排列成單層并在其上面形成純水的液滴之后，在25'C條件下用接觸角計(jì)測(cè)定的水的接觸角為60。以下。以下對(duì)本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑進(jìn)行詳述。本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過將離子交換液相色譜用填充剤的Dw/Da(以下也稱為溶脹度)及對(duì)于表面的水的接觸角設(shè)定在一定的范圍，可以抑制水系介質(zhì)中的溶脹，并且有效抑制蛋白質(zhì)等的非特異吸附，從而完成了本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑。本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑，分別使其分散在水和丙酮中之后照射超聲波15分鐘，并在25'C下放置240小時(shí)使其平衡后，用粒度分布測(cè)定儀分別測(cè)定粒徑時(shí)，使其在水中分散時(shí)的粒徑Dw與使其在丙酮中分散時(shí)的粒徑DA的比DW/DA的上限為2.0。通常離子交換液相色譜用填充劑具有在有機(jī)溶劑中收縮、在水系介質(zhì)中進(jìn)行程度不同的溶脹的傾向，因此，當(dāng)水系介質(zhì)中的溶脹程度大時(shí)，Dw/Da変大，相反，當(dāng)水系介質(zhì)中的溶脹程度小時(shí)，Dw/Da変小。由于Dw/DA超過2.0時(shí)水系介質(zhì)中的溶脹程度過大，色譜柱內(nèi)壓力變動(dòng)增大，平衡花費(fèi)時(shí)間，因此不實(shí)用。優(yōu)選的下限為1.0，優(yōu)選的上限為1.8。作為上述粒度分布測(cè)定儀，沒有特別的限定，可以列舉例如Accusizer780(ParticleSizingSystems公司制)等。另外，本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑，將該離子交換液相色譜用填充劑無間隙地排列成單層并在其上面形成純水的液滴之后，在25。C條件下用接觸角計(jì)測(cè)定的水的接觸角的上限為60。。接觸角測(cè)定作為評(píng)價(jià)以高分子材料為主的表面親水性、疏水性的方法而使用。水的接觸角越小，判斷親水性越高，本發(fā)明中通過設(shè)定上限為60°，親水性大幅度提高，即使接觸蛋白質(zhì)等生物樣品時(shí)非特異吸附也很少。更優(yōu)選的上限為50。。水的接觸角，可以與本發(fā)明的親水性高分子微粒的情況使用同樣的接觸角計(jì)，通過同樣的方法進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑，通過使其溶脹度滿足上述范圍，可以成為即使在水系介質(zhì)也幾乎不溶脹的填充劑，通過使水的接觸角滿足上述范圍，可以成為即使接觸蛋白質(zhì)等生物樣品也不會(huì)引起非特異吸附和測(cè)定精度下降。本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑，與目前公知的離子交換液相色譜用填充劑同樣，由基材微粒、和上述基材微粒表面上存在的離子交換基團(tuán)構(gòu)成。作為滿足上述溶脹度范圍和上述水的接觸角范圍的離子交換液相色譜用填充劑，具體可以列舉例如由疏水性交聯(lián)聚合物構(gòu)成的基材微粒和在上述基材微粒表面存在的離子交換基團(tuán)構(gòu)成、并且在最表面實(shí)施了親水化處理的填充劑，其中所述疏水性交聯(lián)聚合物，由水溶解度為5重量％以下的疏水性交聯(lián)性單體和/或疏水性非交聯(lián)性單體構(gòu)成。關(guān)于上述疏水性交聯(lián)聚合物、以及對(duì)最表面進(jìn)行親水化處理的方法，由于與本發(fā)明的親水性高分子微粒的情況相同，因此省略其詳細(xì)說明。上述親水化處理可以在基材微粒的表面引入離子交換基團(tuán)之前進(jìn)行，也可以在基材微粒的表面引入離子交換基團(tuán)之后進(jìn)行。另外，即使未進(jìn)行親水化處理而對(duì)于表面的水的接觸角也為60°以下的情況，沒有必要特別進(jìn)行親水化處理。作為上述離子交換基團(tuán)，沒有特別限定，可以列舉例如磺酸基、羧酸基、磷酸基等，其中使用磺酸基時(shí)，經(jīng)過長時(shí)間也可以維持性能，另外，對(duì)于血紅蛋白Alc等的分析也可以得到很高的效果，因此優(yōu)選。作為上述離子交換基團(tuán)的引入方法，沒有特別的限定，可以列舉例如日本特公平8-7197號(hào)公報(bào)中記載的使在基材微粒表面具有離子交換基團(tuán)的單體進(jìn)行共聚的方法等。作為具有上述離子交換基團(tuán)的親水性單體，沒有特別的限定，從在水系介質(zhì)中可能溶解的聚合性單體中，根據(jù)本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的使用目的進(jìn)行選擇即可，在用于陽離子交換液相色譜的情況下，可以列舉例如丙烯酸、甲基丙烯酸等具有羧基的單體；苯乙烯磺酸、烯丙基磺酸、2-(甲基)丙烯酰胺-2-甲基丙垸磺酸等具有磺酸基的單體；((甲基)丙烯酰氧乙基)酸性磷酸鹽、(2-(甲基)丙烯酰氧乙基)酸性磷酸鹽等具有磷酸基的單體等。其中，優(yōu)選使用具有磺酸基的單體。在用于陰離子交換液相色譜的情況下，可以使用例如(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸二乙基氨基乙酯、烯丙胺等具有氨基的單體等。如果包含1種以上的含有離子交換基團(tuán)的單體，則為了提高親水性，可以與不含有離子交換基團(tuán)的親水性單體進(jìn)行共聚。另外，可以使用在基材微粒表面使具有官能團(tuán)的單體共聚并在該官能團(tuán)上使具有離子交換基團(tuán)的化合物進(jìn)行反應(yīng)而在基材微粒表面引入離子交換基團(tuán)的方法。作為本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的平均粒徑，沒有特別限定，但優(yōu)選的下限為O.lwm，優(yōu)選的上限為20um。當(dāng)?shù)陀?.1um時(shí)，色譜柱內(nèi)壓力過高，引起分離不良；當(dāng)超過20um時(shí)，色譜柱內(nèi)的死區(qū)容積過大，引起分離不良。作為本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的粒度分布(CV值)，沒有特別限定，但優(yōu)選的上限為40%。當(dāng)超過40%時(shí)，色譜柱內(nèi)的死區(qū)容積過大，引起分離不良。更優(yōu)選的上限為15%。本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑，可以用于糖化血紅蛋白等血紅蛋白類(Hb)的測(cè)定。這樣的糖化血紅蛋白類的測(cè)定方法也是本發(fā)明之一。具體而言，例如，將本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑填充到公知的色譜柱內(nèi)之后，以預(yù)定的條件將洗脫液及測(cè)定樣品送液到所得到的色譜柱，由此可以測(cè)定血紅蛋白類。作為上述洗脫液，可以使用目前公知的洗脫液，例如，可以使用有機(jī)酸、無機(jī)酸、或者以它們的鹽類作為成分的液體等。其他形式的本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑，為具有離子交換基團(tuán)、水的接觸角為60。以下、且表面沒有用親水化合物被覆的填充劑。以下對(duì)其他形式的本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑進(jìn)行詳述。本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有用親水化合物被覆表面而通過將對(duì)于表面的水的接觸角設(shè)定在一定的范圍，可以充分抑制由疏水性相互作用引起的非特異吸附，結(jié)果具有很高的測(cè)定精度，因此可以得到對(duì)各種分離分析極其有效的填充劑，從而完成了本發(fā)明。其他形式的本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑(以下也簡單稱為其他形式的本發(fā)明的填充劑)，其水的接觸角為60。以下。在此，接觸角測(cè)定可以作為評(píng)價(jià)以高分子材料為主的表面的親水性、疏水性的方法使用，判斷水的接觸角越小親水性越高。因此，通過設(shè)定水的接觸角為60°以下，親水性大幅度提高，可以充分抑制由疏水性相互作用引起的蛋白質(zhì)等測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的非特異吸附，優(yōu)選為50°以下。上述水的接觸角，例如可以使用自動(dòng)接觸角計(jì)，根據(jù)由連結(jié)液滴左右端點(diǎn)與頂點(diǎn)的直線相對(duì)于固體表面的角度而求出接觸角的方法(e/2法)等，進(jìn)行測(cè)定。其他形式的本發(fā)明的填充劑，沒有被親水性化合物被覆表面。在本說化合物被覆表面"，是指以蛋白質(zhì)或多糖類為主的來自生物體的親水性化合物、或者聚乙稀醇、聚乙稀吡咯烷酮、磷脂質(zhì)聚合物等合成高分子親水性化合物沒有向填充劑的基材表面進(jìn)行物理吸附或化學(xué)鍵。由于沒有被親水性化合物被覆表面，不存在親水性化合物脫落的情況，經(jīng)過長時(shí)間也可以維持親水性。作為使其他形式的本發(fā)明的填充劑對(duì)于表面的水的接觸角為60°以下的方法，沒有特別限定，可以列舉例如在填充劑的基材上進(jìn)行臭氧水處理、臭氧氣處理、等離子體處理、電暈處理、通過雙氧水、次氯酸鈉等的表面氧化處理等親水化處理的方法等，其中，優(yōu)選通過臭氧水進(jìn)行親水化處理。即使填充劑的基材未進(jìn)行親水化處理而水的接觸角也為60°以下的情況，沒有必要特別進(jìn)行親水化處理。作為其他形式的本發(fā)明的填充劑的基材，沒有特別的限定，可以使用例如使用了聚合性單體等的合成高分子微粒、無機(jī)微粒等，優(yōu)選為以下構(gòu)成由合成有機(jī)高分子構(gòu)成的疏水性交聯(lián)聚合物粒子、及由在上述疏水性交聯(lián)聚合物粒子表面進(jìn)行共聚的具有離子交換基團(tuán)的親水性聚合物構(gòu)成的層。另外，使用這樣的基材時(shí)，優(yōu)選最表面通過臭氧水實(shí)施親水化處理。使用這樣的基材時(shí)，通過使用疏水性粒子保持作為填充劑的機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)由親水性的層被覆粒子表面，進(jìn)一步實(shí)施親水化處理，由此可以充分抑制由疏水性相互作用引起的非特異吸附，結(jié)果具有很高的測(cè)定精度，因此可以得到對(duì)各種分離分析極其有效的填充劑。其他形式的本發(fā)明的填充劑具有離子交換基團(tuán)，作為上述離子交換基團(tuán)，可以列舉例如磺酸基、羧基、磷酸基等。其中，優(yōu)選磺酸基。作為其他形式的本發(fā)明的填充劑的另外其他的形式，為具有以下構(gòu)成的離子交換液相色譜用填充劑，該構(gòu)成為由合成有機(jī)高分子構(gòu)成的疏水性交聯(lián)聚合物粒子、及由在上述疏水性交聯(lián)聚合物粒子表面進(jìn)行共聚的具有離子交換基團(tuán)的親水性聚合物構(gòu)成的層。其為最表面通過臭氧水實(shí)施親水化處理的離子交換液相色譜用填充劑。另外其他形式的本發(fā)明的填充劑具有以下構(gòu)成由合成有機(jī)高分子構(gòu)成的疏水性交聯(lián)聚合物粒子、及由在上述疏水性交聯(lián)聚合物粒子表面進(jìn)行共聚的具有離子交換基團(tuán)的親水性聚合物構(gòu)成的層。上述疏水性交聯(lián)聚合物可以為以下聚合物中的任意物質(zhì)，所述聚合物為將1種疏水性交聯(lián)性單體進(jìn)行單獨(dú)聚合而得到的疏水性交聯(lián)聚合物、將2種以上的疏水性交聯(lián)性單體進(jìn)行共聚而得到的疏水性交聯(lián)聚合物、將至少1種的疏水性交聯(lián)性單體和至少1種的疏水性非交聯(lián)性單體進(jìn)行共聚而得到的疏水性交聯(lián)聚合物。作為上述疏水性交聯(lián)性單體，只要為在單體1分子中具有2個(gè)以上乙烯基的疏水性交聯(lián)性單體，則沒有特別的限定，可以列舉例如乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等二(甲基)丙烯酸酯；四羥甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙垸三(甲基)丙烯酸酯、四羥甲基甲烷四(甲基)丙烯酸酯等三(甲基)丙烯酸酯或四(甲基)丙烯酸酯；二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基萘等芳香族類化合物等。作為上述疏水性非交聯(lián)性單體，只要是具有疏水性性質(zhì)的非交聯(lián)性的聚合性有機(jī)單體，則沒有特別的限定，可以列舉例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸異丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等(甲基)丙烯酸酯；苯乙烯、甲基苯乙烯等苯乙烯類單體等。上述疏水性交聯(lián)聚合物由上述疏水性交聯(lián)性單體和上述疏水性非交聯(lián)性單體的共聚構(gòu)成時(shí)，上述疏水性交聯(lián)性單體，相對(duì)于全部單體100重量份，優(yōu)選為10重量份以上，更優(yōu)選為20重量份以上。上述具有離子交換基團(tuán)的親水性聚合物，是由具有離子交換基團(tuán)的親水性單體構(gòu)成的聚合物，只要含有具有離子交換基團(tuán)的親水性單體1種以上即可，即，可以列舉使具有離子交換基團(tuán)的親水性單體單獨(dú)聚合、使具有離子交換基團(tuán)的親水性單體與不具有離子交換基團(tuán)的親水性單體進(jìn)行共聚的方法等。作為上述具有離子交換基團(tuán)的親水性單體，沒有特別的限定，從在水性分散介質(zhì)中可能溶解的聚合性單體中，根據(jù)本發(fā)明的填充劑的使用目的進(jìn)行選擇即可，在用于陽離子交換液相色譜的情況下，可以列舉例如丙烯酸、甲基丙烯酸等具有羧基的單體；苯乙烯磺酸、烯丙基磺酸、2-(甲基)丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸等具有磺酸基的單體；((甲基)丙烯酰氧乙基)酸性磷酸鹽、(2-(甲基)丙烯酰氧乙基)酸性磷酸鹽等具有磷酸基的單體等。其中，優(yōu)選使用具有磺酸基的單體。在用于陰離子交換液相色譜的情況下，可以使用例如(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸二乙基氨基乙酯、烯丙胺等具有氨基的單體等。作為上述不具有離子交換基團(tuán)的親水性單體，沒有特別的限定，從在水性分散介質(zhì)中可能溶解的聚合性單體中，根據(jù)本發(fā)明的填充劑的使用目的進(jìn)行選擇即可，可以列舉例如2-羥基乙基(甲基)丙烯酸酯、甘油單(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯基吡咯垸酮等。上述具有離子交換基團(tuán)的親水性單體與上述不具有離子交換基團(tuán)的親水性單體進(jìn)行混合使用時(shí)，混合比率沒有特別限定，根據(jù)需要的離子交換基團(tuán)容量，可以決定混合比率。另外其他形式的本發(fā)明的填充劑，最表面通過雙氧水實(shí)施親水化處理。已知臭氧與雙鍵的反應(yīng)性很高，與雙鍵反應(yīng)后的臭氧，形成作為中間體的臭氧化物，然后形成羧基等。本發(fā)明中，用親水性聚合物被覆后，表面上露出的疏水性交聯(lián)聚合物的結(jié)構(gòu)，可以認(rèn)為是未反應(yīng)的乙烯基，即雙鍵，因此通過臭氧可以有效實(shí)施氧化處理。上述臭氧水是指臭氧氣在水中溶解而成的臭氧水。關(guān)于上述臭氧水的溶存臭氧氣濃度、制備方法，與本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的情況相同，因此省略對(duì)其的詳細(xì)說明。另外其他形式的本發(fā)明的填充劑的接觸角也與上述同樣，優(yōu)選為60°以下，更優(yōu)選為50°以下。作為另外其他形式的本發(fā)明的填充劑的制造方法，沒有特別限定，根據(jù)目前公知的方法，制造上述被覆聚合物粒子，使該被覆聚合物粒子分散在臭氧水中，由此可以進(jìn)一步實(shí)施親水化處理。作為上述其他形式的本發(fā)明以及另外其他形式的本發(fā)明的填充劑的平均粒徑，沒有特別限定，但優(yōu)選的下限為0.1iim，優(yōu)選的上限為20ym。當(dāng)?shù)陀?.1um時(shí)，色譜柱內(nèi)壓力過高，引起分離不良；當(dāng)超過20um時(shí)，色譜柱內(nèi)的死區(qū)容積過大，引起分離不良。作為上述其他形式的本發(fā)明以及另外其他形式的本發(fā)明的填充劑的粒度分布(CV值)，沒有特別限定，但優(yōu)選的上限為40%。當(dāng)超過40%時(shí)，色譜柱內(nèi)的死區(qū)容積過大，引起分離不良。更優(yōu)選的上限為15%。上述其他形式的本發(fā)明以及另外其他形式的本發(fā)明的填充劑，可以用于糖化血紅蛋白等血紅蛋白類(Hb)的測(cè)定。這樣的糖化血紅蛋白類的測(cè)定方法也是本發(fā)明之一。具體而言，例如，將上述其他形式的本發(fā)明以及另外其他形式的本發(fā)明的填充劑填充到公知的色譜柱內(nèi)之后，以預(yù)定的條件將洗脫液及測(cè)定樣品送液到所得到的色譜柱，由此可以測(cè)定血紅蛋白類。作為上述洗脫液，可以使用目前公知的洗脫液，例如，可以使用有機(jī)酸、無機(jī)酸、或者以它們的鹽類作為成分的液體等。本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法，具有如下的親水化工序，所述親水化工序中通過使用溶存臭氧氣濃度為20ppm以上的臭氧水洗滌具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子表面而進(jìn)行親水化，所述親水化工序中，進(jìn)行基于加速氧化法的處理。以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳述。本發(fā)明人至此發(fā)現(xiàn)，通過利用臭氧水洗滌具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子表面，可以制造一種僅僅填充劑粒子表面被親水化、即使在水系介質(zhì)中也不發(fā)生溶脹或收縮、能夠有效抑制蛋白質(zhì)等的非特異吸附的離子交換液相色譜用填充劑。但是，即使使用這樣的方法時(shí)，得到的離子交換液相色譜用填充劑的表面也不能充分被親水化。因此，進(jìn)一步深入研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用臭氧水的親水化工序中，通過進(jìn)行基于加速氧化法的處理，可以促進(jìn)溶存臭氧的分解，通過由分解生成的羥基自由基，可以進(jìn)一步提高親水化處理的效果，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法中，通過使用溶存臭氧氣濃度為20ppm以上的臭氧水洗滌具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子表面，而進(jìn)行親水化的親水化工序，由此僅僅將填充劑粒子表面進(jìn)行親水化。上述臭氧水中具有強(qiáng)力的氧化作用，另外，溶存臭氧氣緩慢分解，無殘留性，因此廣泛利用于日本特開2001-33069號(hào)公報(bào)中記載的半導(dǎo)體的抗蝕劑去除、日本特開2003-024464號(hào)公報(bào)中記載的有害物質(zhì)的分解處理等。因此，通過這樣的方法進(jìn)行親水化處理的情況下，僅僅臭氧水直接接觸的表面部分被親水化，因此即使在水系介質(zhì)中也不會(huì)發(fā)生溶脹或收縮，另一方面，在其親水化表面蛋白質(zhì)等未進(jìn)行非特異吸附。另外，由于是化學(xué)的親水化處理，因此不會(huì)像物理的親水化處理方法那樣出現(xiàn)親水性化合物脫落，經(jīng)過長時(shí)間也可以維持親水性。本發(fā)明中，在上述親水化工序中進(jìn)行基于加速氧化法的處理。本說明書中，加速氧化法是指使臭氧水的氧化作用增強(qiáng)的方法，可以將紫外線照射、超聲波照射、堿水添加等促進(jìn)溶存臭氧分解的方法進(jìn)行單獨(dú)使用，或者并用2種以上。通過進(jìn)行基于這樣的加速氧化法的處理，促進(jìn)溶存臭氧的分解，增加由臭氧的分解而生成的羥基自由基的生成量。這樣生成的羥基自由基，由于具有比臭氧更高的氧化力，因此認(rèn)為可能進(jìn)一步提高親水化處理的效果。利用上述加速氧化法時(shí)，可以進(jìn)一步促進(jìn)填充劑粒子表面上的親水基(-OH、-CHO、-COOH等)的生成。作為上述基于加速氧化法的處理，優(yōu)選使用將臭氧水的pH設(shè)定為7.0以上、并且照射超聲波的方法。上述臭氧水的pH通常顯示4.05.0的較低值，但如果pH增高，則溶解性變得不穩(wěn)定，促進(jìn)分解。另外，通過在臭氧水中照射超聲波，由于超聲波照射時(shí)產(chǎn)生的空化作用，可以進(jìn)一步促進(jìn)羥基自由基的生成。因此，通過將這些進(jìn)行組合，可以更加提高親水化處理的效果。作為上述將臭氧水的pH調(diào)節(jié)為7.0以上的方法，沒有特別限定，可以使用例如添加氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿金屬氫氧化物的水溶液的方法等。在上述基于加速氧化法的處理中，照射超聲波時(shí)，超聲波頻率的優(yōu)選下限為20kHz，優(yōu)選的上限為lMHz。如果考慮到空化在低頻率一側(cè)容易發(fā)生，則更優(yōu)選的上限為500kHz，進(jìn)一步優(yōu)選的上限為100kHz。作為進(jìn)行超聲波照射時(shí)的超聲波照射裝置，如果是可以照射具有上述頻率數(shù)的超聲波的裝置，則沒有特別的限定。另外，作為上述基于加速氧化法的處理，也優(yōu)選為在臭氧水中進(jìn)行紫外線照射。作為上述基于加速氧化法的處理，進(jìn)行紫外線照射時(shí)，紫外線波長的優(yōu)選下限為160nm，優(yōu)選上限為280nm。通過照射波長領(lǐng)域在該范圍的紫外線，可以進(jìn)行加速氧化處理。另外，特別優(yōu)選紫外線包括波長254nm。波長254nm的紫外線直接作用于臭氧分子，具有分解的功能。在該分解過程中，由于產(chǎn)生羥基自由基，因此能夠進(jìn)一步提高親水化處理的效果。作為上述紫外線照射時(shí)使用的紫外線燈，沒有特別限定，優(yōu)選可以照射如上所述含有波長254nm的紫外線的燈，可以列舉例如低壓汞燈、高壓汞燈、金屬鹵化物燈等。作為上述紫外線的照射強(qiáng)度及照射時(shí)間，沒有特別限定，進(jìn)行適宜調(diào)整即可，但在波長254nm的照射強(qiáng)度為0.5200mW/cm2下優(yōu)選照射l1200秒，更優(yōu)選照射60600秒。當(dāng)照射強(qiáng)度過小、或者照射時(shí)間過短時(shí)，填充劑粒子表面的親水化不充分、且不能充分防止蛋白質(zhì)等的非特異吸附，當(dāng)照射強(qiáng)度過強(qiáng)、或者照射時(shí)間過長時(shí)，可能導(dǎo)致填充劑粒子的強(qiáng)度下降。進(jìn)行上述基于加速氧化法的處理時(shí)，優(yōu)選在20'C以上進(jìn)行，更優(yōu)選的上限為8(TC。當(dāng)超過80。C時(shí)，溶存臭氧氣直接進(jìn)行氣泡化的可能性增高，反而可能導(dǎo)致反應(yīng)效率降低。作為上述填充劑粒子，可以使用一直以來作為離子交換液相色譜法的填充劑粒子使用的粒子，可以列舉例如二氧化硅、氧化鋯等無機(jī)類粒子;由纖維素、聚氨基酸、殼聚糖等天然高分子構(gòu)成的有機(jī)類粒子；由聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等合成高分子構(gòu)成的有機(jī)類粒子等。其中，由合成高分子構(gòu)成的有機(jī)類粒子，通過調(diào)整交聯(lián)度等可以得到很高的耐壓性或耐溶脹性，因此優(yōu)選。作為上述離子交換基團(tuán)，沒有特別限定，可以為陽離子交換基團(tuán)，也可以為陰離子交換基團(tuán)。作為陽離子交換基團(tuán)，沒有特別限定，可以列舉例如羧基、磷酸基、磺酸基等。作為陰離子交換基團(tuán)，沒有特別限定，可以列舉例如叔氨基、季氨基等。其中使用磺酸基時(shí)，經(jīng)過長時(shí)間也可以維持性能，另外，對(duì)于血紅蛋白Alc等的分析也可以得到很高的效果，因此優(yōu)選。上述具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子，可以通過在粒子表面引入離子交換基團(tuán)、或者將包括具有離子交換基團(tuán)的單體的單體混合物進(jìn)行聚合制備粒子的方法，進(jìn)行制備。作為上述在粒子表面引入離子交換基團(tuán)的方法，沒有特別的限定，可以使用目前公知的方法?？梢粤信e例如為由高分子構(gòu)成的有機(jī)類粒子時(shí)，制備由具有官能團(tuán)的高分子構(gòu)成的粒子后，在該官能團(tuán)上使具有離子交換基團(tuán)的化合物進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的方法等。作為上述將包括具有離子交換基團(tuán)的單體的單體混合物進(jìn)行聚合制備粒子的方法，可以列舉例如將具有離子交換基團(tuán)的單體與交聯(lián)性單體混合，在聚合引發(fā)劑存在下進(jìn)行聚合的方法等。另外，也可以使用以下方法如日本特公平8-7197號(hào)公報(bào)中記載的方法，在制備交聯(lián)性聚合物粒子后，添加具有離子交換基團(tuán)的單體，在聚合物粒子的表面附近使具有離子交換基團(tuán)的單體進(jìn)行聚合的方法；將(甲基)丙烯酸甲酯或(甲基)丙烯酸乙酯等聚合性酯化合物與交聯(lián)性單體等混合，在聚合引發(fā)劑存在下進(jìn)行聚合之后，水解處理得到的粒子，將酯化合物變換為陽離子交換基團(tuán)的方法等。作為上述具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子的平均粒徑，沒有特別限定，但優(yōu)選的下限為0.1um，優(yōu)選的上限為20ym。當(dāng)?shù)陀?.1ym時(shí)，色譜柱內(nèi)壓力過高，引起分離不良；當(dāng)超過20um時(shí)，色譜柱內(nèi)的死區(qū)容積過大，引起分離不良。關(guān)于上述具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子的粒度分布，粒徑的CV值的優(yōu)選上限為40%。當(dāng)超過40%時(shí)，色譜柱內(nèi)的死區(qū)容積過大，引起分離不良。更優(yōu)選的上限為15%。在本發(fā)明中使用的臭氧水，溶存臭氧氣濃度的下限為20ppm。當(dāng)?shù)陀?0ppm時(shí)，沒有實(shí)施充分的親水化處理，不能充分抑制蛋白質(zhì)的非特異吸附。優(yōu)選的下限為50ppm。另外，溶存臭氧氣濃度的上限沒有特別限定。這樣高濃度的臭氧水可以通過以下方法進(jìn)行制備，所述方法為..例如日本特開2001-330969號(hào)公報(bào)中所記載的那樣，借助只透過氣體而阻止液體透過的臭氧氣透過膜，使原料水和臭氧氣接觸的方法等。通過本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法制造得到的離子交換液相色譜用填充劑，僅臭氧水直接接觸的表面部分被親水化，因此即使在水系介質(zhì)中也不會(huì)發(fā)生溶脹或收縮，另外，也不會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)等非特異吸附，因此可以進(jìn)行極其準(zhǔn)確的測(cè)定。另外，經(jīng)過長時(shí)間也可以維持這樣的性能，即使長期使用后保留時(shí)間或測(cè)定值的偏差也很少。另外，由于批間差異的保留時(shí)間或測(cè)定值的偏差也極少。通過本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法制造得到的離子交換液相色譜用填充劑，也是本發(fā)明之一。本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的水的接觸角優(yōu)選為60°以下。在此，接觸角測(cè)定被用作評(píng)價(jià)以高分子材料為主的表面親水性、疏水性的方法。水的接觸角越小，判斷親水性越高。本發(fā)明中，需要充分抑制蛋白質(zhì)等測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的非特異吸附，優(yōu)選上述范圍。更優(yōu)選為5(T以下。通過本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法制造得到的離子交換液相色譜用填充劑，可以特別適用于糖化血紅蛋白的分析。通過本發(fā)明的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法制造得到的糖化血紅蛋白分析用離子交換液相色譜用填充劑，也是本發(fā)明之一。另外，使用本發(fā)明的糖化血紅蛋白分析用離子交換液相色譜用填充劑的糖化血紅蛋白分析方法，也是本發(fā)明之一。具體而言，例如，將本發(fā)明的糖化血紅蛋白分析用離子交換液相色譜用填充劑填充到公知的色譜柱內(nèi)，然后，以預(yù)定的條件將洗脫液及測(cè)定樣品送液到所得到的色譜柱，由此可以分析糖化血紅蛋白。作為上述洗脫液，可以使用目前公知的洗脫液，例如，可以使用有機(jī)酸、無機(jī)酸、或者以它們的鹽類作為成分的液體等。根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種抑制在水系介質(zhì)中的溶脹且對(duì)于水系介質(zhì)的分散性優(yōu)異的親水性高分子微粒、可以有效抑制蛋白質(zhì)等的非特異吸附的離子交換液相色譜用填充劑、使用了該離子交換液相色譜用填充劑的糖化血紅蛋白的分析方法、可以長時(shí)間維持對(duì)溶脹、非特異吸附等的抑制效果的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法、使用該離子交換液相色譜用填充劑的制造方法進(jìn)行制造的離子交換液相色譜用填充劑、以及糖化血紅蛋白分析用的離子交換液相色譜用填充劑。圖1是將關(guān)于實(shí)施例3、比較例5的血紅蛋白Alc測(cè)定中的血紅蛋白類(Hb)回收率的結(jié)果用曲線表示的圖。圖2是將關(guān)于實(shí)施例4、比較例6、比較例7的血紅蛋白Alc測(cè)定中的Hb回收率的結(jié)果用曲線表示的圖。圖3是將關(guān)于實(shí)施例6、比較例8、比較例9的血紅蛋白Alc測(cè)定中的Hb回收率的結(jié)果用曲線表示的圖。圖4是將耐久性評(píng)價(jià)中血紅蛋白Alc測(cè)定的測(cè)定值變動(dòng)用曲線表示的圖。圖5是將關(guān)于實(shí)施例11、比較例1416的血紅蛋白Alc測(cè)定中的血紅蛋白類(Hb)回收率的結(jié)果用曲線表示的圖。具體實(shí)施方式以下列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明更加詳細(xì)進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不只限定于這些實(shí)施例。實(shí)施例(實(shí)施例O在帶有攪拌機(jī)的反應(yīng)器中，向3%聚乙烯醇(日本合成化學(xué)社制)水溶液中添加四甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)300g、三甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)100g及過氧化苯甲酰(年、乂夕M七學(xué)社制)1.0g的混合物。攪拌的同時(shí)進(jìn)行加熱，在氮?dú)夥諊性?(TC下聚合1小時(shí)。將得到的聚合組合物用水和丙酮洗漆，由此得到高分子微粒。關(guān)于得到的高分子微粒，使用激光衍射式粒度分布測(cè)定裝置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為5um，CV值為14。/。。將得到的高分子微粒10g浸漬于溶存臭氧氣濃度為110ppm的臭氧水300mL中，進(jìn)行攪拌，同時(shí)使用可以照射含波長254nm的紫外線的點(diǎn)式UV照射裝置(7M夕，7C/夕7社制UP-200G)，從lcm的距離以照射強(qiáng)度95mW/cm^照射紫外線300秒，從而實(shí)施親水化處理。紫外線照射后，使用離心分離機(jī)(日立制作所社制HimacCR20G)進(jìn)行離心分離，除去上清液。重復(fù)該操作2次，實(shí)施親水化處理，從而得到親水性高分子微粒。臭氧水使用包括臭氧溶解組件的臭氧水制造系統(tǒng)(積水化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行制備，所述臭氧溶解組件，在具有內(nèi)徑15cmX長度20cm的圓柱形的外套內(nèi)，容納由全氟烷氧樹脂構(gòu)成的內(nèi)徑0.5mmX厚度0.04mmX長度350cm的中空管狀臭氧氣透過膜400根。(實(shí)施例2)在帶有攪拌機(jī)的反應(yīng)器中，向3%聚乙烯醇(日本合成化學(xué)社制)水溶液中添加二乙烯基苯(年、乂夕M七學(xué)社制)300g、苯乙烯(和光純藥社制)100g及過氧化苯甲酰(斧、乂夕'化學(xué)社制)l.Og的混合物。攪拌的同時(shí)進(jìn)行加熱，在氮?dú)夥諊性?(TC下聚合1小時(shí)。將得到的聚合組合物用水和丙酮洗滌，由此得到高分子微粒。關(guān)于得到的高分子微粒，使用激光衍射式粒度分布測(cè)定裝置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為5um，CV值為13。/c)。以下與實(shí)施例1同樣操作，進(jìn)行通過臭氧水的親水化處理，由此制作親水性高分子微粒。(比較例1)除了沒有進(jìn)行通過臭氧水的親水化處理之外，與實(shí)施例1同樣操作，制造高分子微粒。(比較例2)除了沒有進(jìn)行通過臭氧水的親水化處理之外，與實(shí)施例2同樣操作，制造高分子微粒。(比較例3)在帶有攪拌機(jī)的反應(yīng)器中，向3%聚乙烯醇(日本合成化學(xué)社制)水溶液中添加四甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)100g、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(日本油脂社制，乙二醇鏈n-4)400g、及過氧化苯甲酰(年〉夕'化學(xué)社制)l.Og的混合物。攪拌的同時(shí)進(jìn)行加熱，在氮?dú)夥諊性?0'C下聚合1小時(shí)。將得到的聚合組合物用水和丙酮洗滌，由此得到高分子微粒。關(guān)于得到的高分子微粒，使用激光衍射式粒度分布測(cè)定裝置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為10ym，CV值為14n/。。<評(píng)價(jià)>關(guān)于實(shí)施例l、2以及比較例13中得到的(親水性)高分子微粒，進(jìn)行以下評(píng)價(jià)。結(jié)果如表l所示。(1)溶脹度測(cè)定關(guān)于實(shí)施例1、2以及比較例13中得到的(親水性)高分子微粒，進(jìn)行溶脹度測(cè)定。測(cè)定使用粒度分布儀Accusizer780(ParticleSizingSystem社制)。在干燥的(親水性)高分子微粒lg中加入純水或丙酮30mL，充分?jǐn)嚢?，照射超聲?5分鐘，得到分散液。分散后，至達(dá)到平衡溶脹在25"C下放置240小時(shí)，測(cè)定水中粒徑Dw與丙酮中的粒徑DA，使Dw/Da作為溶脹度。(2)接觸角測(cè)定關(guān)于實(shí)施例1、2以及比較例13中得到的(親水性)高分子微粒，進(jìn)行接觸角測(cè)定。測(cè)定使用自動(dòng)接觸角計(jì)(協(xié)和界面科學(xué)公司制，Dropmaster500)進(jìn)行。將干燥的(親水性)高分子微粒在25mmX75mm載玻片上貼附的雙面帶上無間隙排列成單層，之后用空氣噴涂除去剩余的粒子。由此，將高分子微粒固定在雙面帶上。該狀態(tài)用顯微鏡進(jìn)行確認(rèn)。25X:的條件下，制作純水1UL的液滴，使其著液在載玻片上固定的高分子微粒上，通過e/2法計(jì)算出接觸角。需要說明的是，當(dāng)接觸角小于90°時(shí)，著液后的水滴容易潤濕，因此，著液后的接觸角經(jīng)時(shí)變小。使用著液后0.5秒后的接觸角值進(jìn)行評(píng)價(jià)。(3)分散性評(píng)價(jià)關(guān)于實(shí)施例1、2以及比較例13中得到的(親水性)高分子微粒，進(jìn)行分散性評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)方法為在25'C的條件下，在干燥的(親水性)高分子微粒lg中加入純水30mL后，充分?jǐn)嚢?，照射超聲?5分鐘之后，放置30分鐘。其后，將輕微攪拌的分散液少量滴加在載玻片上，蓋上蓋玻片，進(jìn)行顯微鏡觀察，根據(jù)以下基準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。〇無凝聚的粒子。X:有凝聚的粒子。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實(shí)施例1、2的溶脹度、接觸角均比較小，因此，水根據(jù)環(huán)境變化的形狀變化小，并且由于親水性高，因此分散性也良好。相對(duì)于此，比較例1、2的溶脹度小，但接觸角大。因此，水根據(jù)環(huán)境的形狀變化小，但由于疏水性高，因此分散性差。比較例3由于增加了親水性單體的含量，故溶脹度大，接觸角小。因此，水根據(jù)環(huán)境變化的變化大，但由于親水性高，因此分散性良好。(實(shí)施例3)在帶有攪拌機(jī)的反應(yīng)器中，向3%聚乙烯醇(日本合成化學(xué)社制)水溶液中添加四甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)300g、三甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)100g、及過氧化苯甲酰(年、乂夕'化學(xué)社制)l.Og的混合物。攪拌的同時(shí)進(jìn)行加熱，在氮?dú)夥諊性?(TC聚合1小時(shí)。之后，在離子交換水中溶解2-甲基丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(東亞合成化學(xué)社制)100g、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(日本油脂社制，乙二醇鏈11=4)100g作為具有離子交換基團(tuán)的單體。將該混合物添加到相同反應(yīng)器中，進(jìn)行同樣操作，攪拌的同時(shí)在氮?dú)夥諊性?0'C聚合2小時(shí)。將得到的聚合組合物用水和丙酮洗滌，由此得到具有離子交換基團(tuán)的親水性的被覆聚合物粒子(具有離子交換基團(tuán)的基材微粒)。關(guān)于得到的被覆聚合物粒子，使用激光衍射式粒度分布測(cè)定裝置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為8nm，CV值為14。/。。將得到的被覆聚合物粒子10g浸漬于溶存臭氧氣濃度為100ppm的臭氧水300mL中，進(jìn)行攪拌30分鐘，攪拌結(jié)束后，使用離心分離機(jī)(日立制作所社制HimacCR20G)進(jìn)行離心分離，除去上清液。重復(fù)該操作2次，實(shí)施親水化處理，從而得到離子交換液相色譜用填充劑。臭氧水使用包括臭氧溶解組件的臭氧水制造系統(tǒng)(積水化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行制備，所述臭氧溶解組件，在具有內(nèi)徑15cmX長度20cm的圓柱形的外套內(nèi)，容納由全氟垸氧樹脂構(gòu)成的內(nèi)徑0.5mmX厚度0.04mmX長度350cm的中空管狀臭氧氣透過膜400根。(比較例4)在帶有攪拌機(jī)的反應(yīng)器中，向3%聚乙烯醇(日本合成化學(xué)社制)水溶液中添加乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)240g、甲基丙烯酸正丁酯(共榮社化學(xué)社制)160g、及過氧化苯甲酰(年、乂夕'化學(xué)社制)l.Og的混合物。攪拌的同時(shí)進(jìn)行加熱，在氮?dú)夥諊性?(TC聚合1小時(shí)。之后，在離子交換水中溶解2-甲基丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(東亞合成化學(xué)社制)100g、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(日本油脂社制，乙二醇鏈11=4)100g作為具有離子交換基團(tuán)的單體。將該混合物添加到相同反應(yīng)器中，進(jìn)行同樣操作，攪拌的同時(shí)在氮?dú)夥諊性?(TC聚合2小時(shí)。將得到的聚合組合物用水和丙酮洗滌，由此得到具有離子交換基團(tuán)的親水性的被覆聚合物粒子(具有離子交換基團(tuán)的基材微粒)。關(guān)于得到的被覆聚合物粒子，使用激光衍射式粒度分布測(cè)定裝置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為8um，CV值為16c/。。將得到的被覆聚合物粒子10g進(jìn)行與實(shí)施例3同樣的操作，進(jìn)行臭氧水處理，得到離子交換液相色譜用填充劑。(比較例5)除了沒有進(jìn)行臭氧水處理之外，與實(shí)施例3同樣操作，得到被覆聚合物粒子、以及離子交換液相色譜用填充劑。<評(píng)價(jià)>關(guān)于實(shí)施例3以及比較例45中得到的離子交換液相色譜用填充劑，進(jìn)行以下評(píng)價(jià)。結(jié)果如表2、圖1所示。(1)溶脹度測(cè)定關(guān)于實(shí)施例3以及比較例4、5中得到的離子交換液相色譜用填充劑，進(jìn)行溶脹度測(cè)定。測(cè)定使用粒度分布儀Accusizer780(ParticleSizingSystem社制)。在干燥的離子交換液相色譜用填充劑lg中加入純水或丙酮30mL，充分?jǐn)嚢?，照射超聲?5分鐘，得到分散液。分散后，至達(dá)到平衡溶脹在25'C下放置240小時(shí)，測(cè)定水中粒徑Dw與丙酮中的粒徑DA，使DW/DA作為溶脹度。(2)接觸角測(cè)定關(guān)于實(shí)施例3以及比較例4、5中得到的離子交換液相色譜用填充劑，進(jìn)行接觸角測(cè)定。測(cè)定使用自動(dòng)接觸角計(jì)(協(xié)和界面科學(xué)公司制，Dropmaster500)進(jìn)行。將干燥的離子交換液相色譜用填充劑在25mmX75mm載玻片上貼附的雙面帶上無間隙排列，之后用空氣噴涂除去剩余的粒子。由此，將離子交換液相色譜用填充劑固定在雙面帶上。該狀態(tài)用顯微鏡進(jìn)行確認(rèn)。25'C的條件下，制作純水IPL的液滴，使其著液在載玻片上固定的離子交換液相色譜用填充劑上，通過9/2法計(jì)算出接觸角。需要說明的是，當(dāng)接觸角小于90。時(shí)，著液后的水滴容易潤濕，因此，著液后的接觸角經(jīng)時(shí)變小。使用著液后0.5秒后的接觸角值進(jìn)行評(píng)價(jià)。(3)壓力變動(dòng)評(píng)價(jià)將實(shí)施例3以及比較例4、5中得到的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。向填充離子交換液相色譜用填充劑后的色譜柱中通液pH不同的洗脫液，測(cè)定此時(shí)色譜柱的壓力變動(dòng)、以及至色譜柱壓力穩(wěn)定所需要的時(shí)間(平衡時(shí)間)。具體將50mM磷酸緩沖液(pH5.7:A液)通液30分鐘。色譜柱壓力達(dá)到一定后，通液300mM磷酸緩沖液(pH8.5:B液)，確認(rèn)色譜柱壓力的變動(dòng)。(4)基于血紅蛋白Alc測(cè)定的Hb回收率的評(píng)價(jià)將實(shí)施例3以及比較例5中得到的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。另一方面，將glycoHbcontroUevel2(國際試藥制，參考數(shù)值10.4±0.5%)用200uL注射用水溶解后，制備用稀釋液(含有0.1%卜!J卜^X-100的磷酸緩沖液(pH7.0))稀釋至100倍的溶液，作為測(cè)定樣品。使用得到的色譜柱，根據(jù)下述條件用色譜峰面積對(duì)測(cè)定樣品中的血紅蛋白Ale量、以及血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)定以10試樣連續(xù)進(jìn)行，以后一半5試樣的血紅蛋白Alc峰的面積值、以及血紅蛋白Alc峰與非糖化血紅蛋白峰的面積值的平均值作為測(cè)定值。圖1是將實(shí)施例3中得到的血紅蛋白Alc峰面積、以及血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白峰的面積值合計(jì)設(shè)定為100%，對(duì)實(shí)施例3、比較例5中得到的各峰面積進(jìn)行比較。系統(tǒng)輸液泵LC-9A(島津制作所社制)自動(dòng)進(jìn)樣器ASU-420(積水化學(xué)工業(yè)社制)檢測(cè)器SPD-6AV(島津制作所社制)洗脫液第l液170mM磷酸緩沖液(pH5.7)第2液300mM磷酸緩沖液(pH8.5)洗脫法03分鐘用第1液洗脫、33.2分鐘用第2液洗脫、3.24分鐘用第1液洗脫流速1.0mL/分鐘檢測(cè)波長415nm進(jìn)樣量10uL表2<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>變動(dòng)小，另外，也完全沒有血紅蛋白成分的非特異吸附。另外，在實(shí)施例3中，形成含有離子交換基團(tuán)的親水性聚合物層，并且，通過用臭氧水進(jìn)行親水化處理，可以成為水的接觸角為60。以下的表面。另一方面，比較例4為交聯(lián)度低的填充劑，因此溶脹度大，色譜柱內(nèi)壓力變動(dòng)非常大。由于接觸角小，因此認(rèn)為是可以抑制血紅蛋白的非特異吸附的填充劑，但色譜柱內(nèi)壓力變動(dòng)過大，不能進(jìn)行評(píng)價(jià)(4)。因此，控制溶脹度在一定范圍內(nèi)非常重要。比較例5的填充劑的交聯(lián)度與實(shí)施例3同樣，因此溶脹度小，色譜柱內(nèi)壓力變動(dòng)也小。但是，由于接觸角大，因此容易引起血紅蛋白成分的非特異吸附。因此，控制接觸角在一定范圍內(nèi)，與溶脹度同樣非常重要。(實(shí)施例4)在帶有攪拌機(jī)的反應(yīng)器中，向3%聚乙烯醇(日本合成化學(xué)社制)水溶液中添加四甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)300g、三甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)100g、及過氧化苯甲酰(年〉夕'化學(xué)社制)l.Og的混合物。攪拌的同時(shí)進(jìn)行加熱，在氮?dú)夥諊性?(TC聚合1小時(shí)。之后，在離子交換水中溶解2-甲基丙烯酰胺-2-甲基丙垸磺酸(東亞合成化學(xué)社制)100g、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(日本油脂社制，乙二醇鏈n-4)100g作為具有離子交換基團(tuán)的單體。將該混合物添加到相同反應(yīng)器中，進(jìn)行同樣操作，攪拌的同時(shí)在氮?dú)夥諊性?0。C聚合2小時(shí)。將得到的聚合組合物用水和丙酮洗滌，由此得到具有離子交換基團(tuán)的親水性的被覆聚合物粒子。關(guān)于得到的被覆聚合物粒子，使用激光衍射式粒度分布測(cè)定裝置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為8um，CV值為14。/。。將得到的被覆聚合物粒子10g浸漬于溶存臭氧氣濃度為100ppm的臭氧水300mL中，進(jìn)行攪拌30分鐘，攪拌結(jié)束后，使用離心分離機(jī)(日立制作所社制HimacCR20G)進(jìn)行離心分離，除去上清液。重復(fù)該操作2次，實(shí)施親水化處理，從而得到離子交換液相色譜用填充劑。臭氧水使用包括臭氧溶解組件的臭氧水制造系統(tǒng)(積水化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行制備，所述臭氧溶解組件，在具有內(nèi)徑15cmX長度20cm的圓柱形的外套內(nèi)，容納由全氟垸氧樹脂構(gòu)成的內(nèi)徑0.5mmX厚度0.04mmX長度350cm的中空管狀臭氧氣透過膜400根。(實(shí)施例5)除了將聚乙二醇甲基丙烯酸酯置換為甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯(日本油脂社制，乙二醇鏈11=4)之外，與實(shí)施例4同樣操作，得到被覆聚合物粒子、以及離子交換液相色譜用填充劑。(比較例6)除了沒有進(jìn)行臭氧水處理之外，與實(shí)施例4同樣操作，得到被覆聚合物粒子、以及離子交換液相色譜用填充劑。(比較例7)在與實(shí)施例4同樣操作得到的被覆聚合物粒子中，實(shí)施蛋白質(zhì)的涂布處理代替臭氧水處理。將在磷酸緩沖液(pH5.7)中溶解的0.2%BSA(牛血清白蛋白)200mL加入到上述填充劑粒子10g中，超聲波處理2分鐘，在60'C的恒溫水槽中緩慢攪拌24小時(shí)之后，從恒溫水槽中取出，放置至室溫。之后，離心分離除去上清液，向其中添加磷酸緩沖液(pH8.5)200mL，再次通過離心分離除去上清液。向其中添加磷酸緩沖液(pH5.7)200mL，再次通過離心分離除去上清液。得到通過物理吸附進(jìn)行蛋白質(zhì)涂布的離子交換液相色譜用填充劑。<評(píng)價(jià)>關(guān)于實(shí)施例45以及比較例67中得到的離子交換液相色譜用填充劑，進(jìn)行以下評(píng)價(jià)。(1)接觸角測(cè)定關(guān)于實(shí)施例45以及比較例67中得到的被覆聚合物粒子，進(jìn)行接觸角測(cè)定。測(cè)定使用自動(dòng)接觸角計(jì)(協(xié)和界面科學(xué)公司制，Dropmaster500)進(jìn)行。將干燥的被覆聚合物粒子在載玻片上貼附的雙面帶上排列均勻，之后用空氣噴涂除去剩余的粒子。由此，將被覆聚合物粒子1層分固定在雙面帶上。該狀態(tài)用顯微鏡進(jìn)行確認(rèn)。制作離子交換水1"L的液滴，使其著液在載玻片上固定的被覆聚合物粒子上，通過e/2法計(jì)算出接觸角。需要說明的是，當(dāng)接觸角小于90°日寸，著液后的水滴容易潤濕，因此，著液后的接觸角經(jīng)時(shí)變小。因此使用著液后0.5秒后的接觸角值進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表3所示。(2)基于血紅蛋白Alc測(cè)定的Hb回收率的評(píng)價(jià)將實(shí)施例4以及比較例6、7中制作的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。另一方面，將glycoHbcontrollevel2(國際試藥制，參考數(shù)值10.4±0.5%)用200uL注射用水溶解后，制備用稀釋液(含有0.1%卜y卜yX-100的磷酸緩沖液(pH7.0))稀釋至100倍的溶液，作為測(cè)定樣品。使用得到的色譜柱，根據(jù)下述條件用色譜峰面積對(duì)測(cè)定樣品中的血紅蛋白Alc量、以及血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)定以10試樣連續(xù)進(jìn)行，以其后一半5試樣的血紅蛋白Alc峰的面積值、以及血紅蛋白Alc峰與非糖化血紅蛋白峰的面積值的平均值作為測(cè)定值。結(jié)果如表4、圖2所示。圖2是將實(shí)施例4中得到的血紅蛋白Alc峰面積、以及血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的峰面積值合計(jì)設(shè)定為100%，對(duì)比較例6、比較例7中得到的各峰面積進(jìn)行比較。系統(tǒng)輸液泵LC-9A(島津制作所社制)自動(dòng)進(jìn)樣器ASU-420(積水化學(xué)工業(yè)社制)檢測(cè)器SPD-6AV(島津制作所社制)洗脫液第l液170mM磷酸緩沖液(pH5.7)第2液300mM磷酸緩沖液(pH8.5)洗脫法03分鐘用第1液洗脫、33.2分鐘用第2液洗脫、3.24分鐘用第1液洗脫流速1.0mL/分鐘檢測(cè)波長415nm進(jìn)樣量10UL(3)血紅蛋白Alc測(cè)定中的測(cè)定值變動(dòng)的評(píng)價(jià)(耐久性評(píng)價(jià))將實(shí)施例4、比較例6及比較例7中制作的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。另一方面，將glycoHbcontrollevel2(國際試藥制，參考數(shù)值10.4±0.5%)用200uL注射用水溶解后，制備用稀釋液(含有0.1%卜y卜>X-100的磷酸緩沖液(pH7.0))稀釋至100倍的溶液，作為測(cè)定樣品。另外，作為負(fù)荷樣品，健康人血進(jìn)行NaF采血，用溶血稀釋液(含有0.1重量％卜y卜乂X-100的磷酸緩沖液(pH7.0))進(jìn)行溶血，使用稀釋至150倍的溶液。測(cè)定樣品與負(fù)荷樣品一起進(jìn)行約1000試樣的測(cè)定，以任意間隔連續(xù)測(cè)定了測(cè)定樣品10試樣，使用其平均值進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)下述條件對(duì)測(cè)定樣品中的血紅蛋白Alc量及非糖化血紅蛋白量進(jìn)行測(cè)定，求出相對(duì)于血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)的血紅蛋白Alc的比例(血紅蛋白Alc值(％))。另外，也測(cè)定血紅蛋白Alc的保留時(shí)間。結(jié)果如表5所示。系統(tǒng)輸液泵LC-9A(島津制作所社制)自動(dòng)進(jìn)樣器ASU-420(積水化學(xué)工業(yè)社制)檢測(cè)器SPD-6AV(島津制作所社制)洗脫液第l液170mM磷酸緩沖液(pH5.7)第2液300mM磷酸緩沖液(pH8.5)洗脫法03分鐘用第1液洗脫、33.2分鐘用第2液洗脫、3.24分鐘用第1液洗脫流速1.0mL/分鐘檢測(cè)波長415nm進(jìn)樣量10UL表3接觸角實(shí)施例4400實(shí)施例5470比較例6650比較例735。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>如表3所示，在實(shí)施例4、5中，形成了包含離子交換基團(tuán)的親水性聚合物層，并且通過用臭氧水進(jìn)行親水化處理，可以得到使水的接觸角為60°以下的表面。另外，在比較例7中，通過用作為親水性化合物的蛋白質(zhì)進(jìn)行涂布，也可以得到使水的接觸角為60°以下的表面。在比較例6中，與實(shí)施例4比較接觸角明顯變大。如圖2所示，其結(jié)果與實(shí)施例4比較，接觸角大的比較例6中，血紅蛋白Alc峰的面積值、以及血紅蛋白Alc峰與非糖化血紅蛋白峰的面積值合計(jì)降低。另外，接觸角小的比較例7中，血紅蛋白Alc峰的面積值、以及血紅蛋白Alc峰與非糖化血紅蛋白峰的面積值合計(jì)，與實(shí)施例4水平相同。即，接觸角為60°以上時(shí)，顯示血紅蛋白Alc或其他的血紅蛋白成分吸附在填充劑粒子表面。如表4所示可知，使用實(shí)施例4中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，在1000試樣測(cè)定之間，血紅蛋白Alc值(％)的變動(dòng)、保留時(shí)間的變動(dòng)均非常小，能夠準(zhǔn)確測(cè)定。另一方面，在比較例6的情況下，血紅蛋白Alc值大幅變動(dòng)。認(rèn)為這是由于血紅蛋白Alc或其他的血紅蛋白成分產(chǎn)生非特異吸附引起的。另外，比較例7的情況下，保留時(shí)間變動(dòng)，認(rèn)為這是由于為了提高親水性而進(jìn)行涂布的蛋白質(zhì)在測(cè)定中脫離引起的。(實(shí)施例6)在帶有攪拌機(jī)的反應(yīng)器中，向3%聚乙烯醇(日本合成化學(xué)社制)水溶液中添加四甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)300g、三甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)100g、及過氧化苯甲酰(年乂夕M七學(xué)社制)l.Og的混合物。攪拌的同時(shí)進(jìn)行加熱，在氮?dú)夥諊性?(TC聚合1小時(shí)。之后，在離子交換水中溶解2-甲基丙烯酰胺-2-甲基丙垸磺酸(東亞合成化學(xué)社制)100g、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(日本油脂社制，乙二醇鏈n-4)100g作為具有離子交換基團(tuán)的單體。將該混合物添加到相同反應(yīng)器中，進(jìn)行同樣操作，攪拌的同時(shí)在氮?dú)夥諊性?(TC聚合2小時(shí)。將得到的聚合組合物用水和丙酮洗滌，由此得到具有離子交換基團(tuán)的親水性的被覆聚合物粒子。關(guān)于得到的被覆聚合物粒子，使用激光衍射式粒度分布測(cè)定裝置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為8um，CV值為14。/c)。將得到的被覆聚合物粒子10g浸漬于溶存臭氧氣濃度為100ppm的臭氧水300mL中，進(jìn)行攪拌30分鐘，攪拌結(jié)束后，使用離心分離機(jī)(日立制作所社制HimacCR20G)進(jìn)行離心分離，除去上清液。重復(fù)該操作2次，實(shí)施親水化處理，從而得到離子交換液相色譜用填充劑。臭氧水使用包括臭氧溶解組件的臭氧水制造系統(tǒng)(積水化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行制備，所述臭氧溶解組件，在具有內(nèi)徑15cmX長度20cm的圓柱形的外套內(nèi)，容納由全氟烷氧樹脂構(gòu)成的內(nèi)徑0.5mmX厚度0.04mmX長度350cm的中空管狀臭氧氣透過膜400根。(實(shí)施例7)除了將聚乙二醇甲基丙烯酸酯置換為甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯(日本油脂社制，乙二醇鏈11=4)之外，與實(shí)施例6同樣操作，得到被覆聚合物粒子、以及離子交換液相色譜用填充劑。(實(shí)施例8)除了將聚乙二醇甲基丙烯酸酯置換為甲基丙烯酸甘油酯(日本油脂社制)之外，與實(shí)施例6同樣操作，得到被覆聚合物粒子、以及離子交換液相色譜用填充劑。(實(shí)施例9)除了未添加聚乙二醇甲基丙烯酸酯之外，與實(shí)施例6同樣操作，得到被覆聚合物粒子、以及離子交換液相色譜用填充劑。(比較例8)除了沒有進(jìn)行臭氧水處理之外，與實(shí)施例6同樣操作，得到被覆聚合物粒子、以及離子交換液相色譜用填充劑。(比較例9)除了使用雙氧水實(shí)施氧化處理代替臭氧水處理之外，與實(shí)施例6同樣操作，得到被覆聚合物粒子、以及離子交換液相色譜用填充劑。使用雙氧水的氧化處理方法如下所示。將得到的被覆聚合物粒子10g浸漬于1%的雙氧水300mL中，進(jìn)行攪拌30分鐘。需要說明的是，1%的雙氧水使用30。％的雙氧水(和光純藥工業(yè)社制)進(jìn)行制備。攪拌結(jié)束后，使用離心分離機(jī)(日立制作所社制HimacCR20G)進(jìn)行離心分離，除去上清液。重復(fù)該操作2次，得到離子交換液相色譜用填充劑。<評(píng)價(jià)>關(guān)于實(shí)施例69以及比較例89中得到的離子交換液相色譜用填充劑，進(jìn)行以下評(píng)價(jià)。(4)由親水性聚合物構(gòu)成的層的厚度測(cè)定關(guān)于實(shí)施例69以及比較例89中制作的具有離子交換基團(tuán)的親水性被覆聚合物粒子，根據(jù)日本特公平8-7197號(hào)公報(bào)中公開的"被覆層的平均厚度的測(cè)定方法"，對(duì)由親水性聚合物構(gòu)成的層的厚度進(jìn)行測(cè)定。其結(jié)果確認(rèn)得到的被覆聚合物粒子的被覆層厚度為510nm，在優(yōu)選范圍l30nm的范圍內(nèi)。(5)接觸角測(cè)定關(guān)于實(shí)施例69以及比較例89中得到的被覆聚合物粒子，進(jìn)行接觸角測(cè)定。測(cè)定使用協(xié)和界面科學(xué)公司制造的Dropmaster500進(jìn)行。將干燥的被覆聚合物粒子在載玻片上貼附的雙面帶上排列均勻，之后用空氣噴涂除去剩余的粒子。由此，將被覆聚合物粒子l層分固定在雙面帶上。該狀態(tài)用顯微鏡進(jìn)行確認(rèn)。制作離子交換水1PL的液滴，使其著液在載玻片上固定的被覆聚合物粒子上，通過e/2法計(jì)算出接觸角。需要說明的是，當(dāng)接觸角小于90°時(shí)，著液后的水滴容易潤濕，因此，著液后的接觸角經(jīng)時(shí)變小。因此使用著液后0.5秒后的接觸角值進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表6所示。(6)通過紅蛋白Alc測(cè)定的Hb回收率的評(píng)價(jià)將實(shí)施例6以及比較例8、9中制作的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。另一方面，將glycoHbcontrollevel2(國際試藥制，參考數(shù)值10.4±0.5%)用200uL注射用水溶解后，制備用稀釋液(含有0.1%卜U卜>X-100的磷酸緩沖液(pH7.0))稀釋至100倍的溶液，作為測(cè)定樣品。使用得到的色譜柱，根據(jù)下述條件用色譜峰面積對(duì)測(cè)定樣品中的血紅蛋白Alc量、以及血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)定以10試樣連續(xù)進(jìn)行，以其后一半5試樣的血紅蛋白Alc峰的面積值、以及血紅蛋白Alc峰與非糖化血紅蛋白峰的面積值的平均值作為測(cè)定值。結(jié)果如表7、圖3所示。圖3是將實(shí)施例6中得到的血紅蛋白Alc峰面積、以及血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白峰的面積值合計(jì)設(shè)定為100%，對(duì)比較例8、9中得到的各峰面積進(jìn)行比較。系統(tǒng)輸液泵LC-9A(島津制作所社制)自動(dòng)進(jìn)樣器ASU-420(積水化學(xué)工業(yè)社制)檢測(cè)器SPD-6AV(島津制作所社制)洗脫液第l液170mM磷酸緩沖液(pH5.7)第2液300mM磷酸緩沖液(pH8.5)洗脫法03分鐘用第1液洗脫、33.2分鐘用第2液洗脫、3.24分鐘用第1液洗脫流速1.0mL/分鐘檢測(cè)波長415nm進(jìn)樣量10UL(7)血紅蛋白Alc測(cè)定中的測(cè)定值變動(dòng)的評(píng)價(jià)(耐久性評(píng)價(jià))將實(shí)施例6、比較例8、9中制作的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。另一方面，將glycoHbcontrollevel2(國際試藥制，參考數(shù)值10.4±0.5%)用200uL注射用水溶解后，制備用稀釋液(含有0.1%卜y卜yX-100的磷酸緩沖液(pH7.0))稀釋至100倍的溶液，作為測(cè)定樣品。另外，作為負(fù)荷樣品，對(duì)健康人血進(jìn)行NaF采血，用溶血稀釋液(含有0.1重量％卜y卜yX-100的磷酸緩沖液(pH7.0))進(jìn)行溶血，使用稀釋至150倍的溶液。測(cè)定樣品與負(fù)荷樣品一起進(jìn)行約1000試樣的測(cè)定，以任意間隔連續(xù)測(cè)定測(cè)定樣品10試樣，使用其平均值進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)下述條件對(duì)測(cè)定樣品中的血紅蛋白Alc量及非糖化血紅蛋白量進(jìn)行測(cè)定，求出相對(duì)于血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)的血紅蛋白Alc的比例(血紅蛋白Alc值(％))。結(jié)果如表8、圖4所示。系統(tǒng)輸液泵LC-9A(島津制作所社制)自動(dòng)進(jìn)樣器ASU-420(積水化學(xué)工業(yè)社制)檢測(cè)器SPD-6AV(島津制作所社制)洗脫液第l液170mM磷酸緩沖液(pH5.7)第2液300mM磷酸緩沖液(pH8.5)洗脫法03分鐘用第1液洗脫、33.2分鐘用第2液洗脫、3.24分鐘用第1液洗脫流速1.0mL/分鐘<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>如表6所示，在實(shí)施例69中，形成了包含離子交換基團(tuán)的親水性聚合物層，并且通過用臭氧水進(jìn)行親水化處理，可以得到使水的接觸角為60。以下的表面。另外，實(shí)施例6由于沒有添加不包含離子交換基團(tuán)的親水性單體，疏水性聚合物的露出面增大，由此接觸角也有所增大。在比較例8、9中，與實(shí)施例6比較接觸角明顯變大。由比較例9的結(jié)果可知，使用雙氧水的氧化處理方法不充分。根據(jù)表7、圖3，得到結(jié)果為與實(shí)施例6比較，比較例8、9中血紅蛋白Alc峰的面積值、以及血紅蛋白Alc峰與非糖化血紅蛋白峰的面積值合計(jì)均降低。即，顯示血紅蛋白Alc或其他的血紅蛋白成分吸附在填充劑粒子表面。根據(jù)表8、圖4可知，使用實(shí)施例6中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，在1000試樣測(cè)定之間，血紅蛋白Alc值的變動(dòng)非常小，能夠準(zhǔn)確測(cè)定。另一方面，可知使用比較例8、9中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，至初期300試樣測(cè)定，血紅蛋白Alc值(X)大幅變動(dòng)。認(rèn)為這是由于評(píng)價(jià)(6)中觀察到的血紅蛋白Alc或其他的血紅蛋白成分產(chǎn)生非特異吸附引起的。(實(shí)施例10)(1)具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子的制備將2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸200g、二乙二醇二甲基丙烯酸酯400g、2-羥基-l,3-二甲基丙烯酰氧丙垸80g、以及苯甲酰過氧化物1.5g進(jìn)行混合，使其分散在2.5L的4重量％聚乙烯醇水溶液中。將其在氮?dú)夥諊逻M(jìn)行攪拌，同時(shí)升溫，8(TC下聚合8小時(shí)后，進(jìn)行洗滌、分級(jí)，得到具有磺酸基的填充劑粒子。關(guān)于得到的填充劑粒子，使用激光衍射式粒度分布測(cè)定裝置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為8um，CV值為14%。(2)通過臭氧水的親水化處理將得到的填充劑粒子10g浸漬于溶存臭氧氣濃度為150ppm的臭氧水300mL中，進(jìn)行攪拌，同時(shí)滴加1N的NaOH(和光純藥工業(yè)社制)，調(diào)節(jié)溶液pH至ll.O。調(diào)節(jié)pH后，迅速在設(shè)定水槽內(nèi)的溫度為5CTC的超聲波照射裝置(7X'7y社制USD-2)內(nèi)照射頻率為28kHz的超聲波30分鐘。照射超聲波后，使用離心分離機(jī)(日立制作所社制HimacCR20G)進(jìn)行離心分離，除去上清液。重復(fù)該操作2次，實(shí)施親水化處理，從而得到離子交換液相色譜用填充劑。臭氧水使用包括臭氧溶解組件的臭氧水制造系統(tǒng)(積水化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行制備，所述臭氧溶解組件，在具有內(nèi)徑15cmX長度20cm的圓柱形的外套內(nèi)，容納由全氟烷氧樹脂構(gòu)成的內(nèi)徑0.5mmX厚度0.04mmX長度350cm的中空管狀臭氧氣透過膜400根。(比較例IO)不進(jìn)行通過臭氧水的親水化處理，而直接將實(shí)施例10中制造的具有磺酸基的填充劑粒子作為離子交換液相色譜用填充劑。(比較例11)除了在通過臭氧水進(jìn)行的親水化處理中將溶存臭氧氣濃度設(shè)定為10ppm以外，與實(shí)施例10同樣操作，進(jìn)行親水化處理，得到離子交換液相色譜用填充劑。(比較例12)除了在通過臭氧水進(jìn)行的親水化處理中不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)和超聲波照射的操作以外，與實(shí)施例10同樣操作，進(jìn)行親水化處理，得到離子交換液相色譜用填充劑。(比較例13)將在磷酸緩沖液(pH5.7)中溶解的0.2%牛血清白蛋白(BSA)200mL加入到實(shí)施例10中制備的具有磺酸基的填充劑粒子10g中，超聲波處理2分鐘，在8CTC的恒溫水槽中緩慢攪拌24小時(shí)之后，從恒溫水槽中取出，放置至室溫。之后，離心分離除去上清液，向其中添加磷酸緩沖液(pH8.5)200mL，再次通過離心分離除去上清液。之后，添加磷酸緩沖液(pH5.7)200mL，再次通過離心分離除去上清液。得到通過物理吸附固定BSA的離子交換液相色譜用填充劑。<評(píng)價(jià)>關(guān)于實(shí)施例10以及比較例1013中得到的離子交換液相色譜用填充劑，進(jìn)行以下評(píng)價(jià)。(1)血紅蛋白Alc測(cè)定中的初期測(cè)定值的評(píng)價(jià)將實(shí)施例10以及比較例1012中制作的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。另一方面，將glycoHbcontrollevel2(國際試藥制，參考數(shù)值10.4±0.5%)用200^L注射用水溶解后，制備用稀釋液(含有0.1%卜y卜yX-100的磷酸緩沖液(pH7.0))稀釋至100倍的溶液，作為測(cè)定樣品。使用得到的色譜柱，根據(jù)下述條件對(duì)測(cè)定樣品中的血紅蛋白Alc量、以及非糖化血紅蛋白量進(jìn)行測(cè)定。求出相對(duì)于血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)的血紅蛋白Alc的比例(血紅蛋白Alc值(％))。測(cè)定以10試樣連續(xù)進(jìn)行，以其后一半5試樣的平均值作為測(cè)定值。結(jié)果如表9所示。系統(tǒng)輸液泵LC-9A(島津制作所社制)自動(dòng)進(jìn)樣器ASU-420(積水化學(xué)工業(yè)社制)檢測(cè)器SPD-6AV(島津制作所社制)洗脫液第1液170mM磷酸緩沖液(pH5.7)第2液300mM磷酸緩沖液(pH8.5)洗脫法03分鐘用第1液洗脫、33.2分鐘用第2液洗脫、3.24分鐘用第1液洗脫流速1.0mL/分鐘檢測(cè)波長415nm進(jìn)樣量10"L表9<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>根據(jù)表9，使用實(shí)施例10中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，能夠極其準(zhǔn)確進(jìn)行測(cè)定。相對(duì)于此，使用比較例10中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，得到比預(yù)想值低很多的血紅蛋白Alc值(％)。這是由于使用比較例10中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)血紅蛋白Alc的比例特別地顯著降低的原因，即，表示血紅蛋白成分在填充劑粒子表面進(jìn)行非特異吸附。另外，使用比較例11中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，雖然與比較例10相比有所改善，但得到比預(yù)想值低的血紅蛋白Alc值(％)，即，在溶存臭氧氣濃度為10ppm時(shí)，顯示不能得到充分的親水化效果。另外，使用比較例12中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，得到與實(shí)施例IO相當(dāng)?shù)难t蛋白Alc值(％)。但是，與實(shí)施例10比較可知，計(jì)算出血紅蛋白Alc值(％)的血紅蛋白Alc量和非糖化血紅蛋白量分別降低約10%。因此，即使血紅蛋白Alc值(％)相當(dāng)，也意味著血紅蛋白成分非特異吸附在填充劑表面。(2)血紅蛋白Alc測(cè)定中的測(cè)定值變動(dòng)的評(píng)價(jià)(耐久性評(píng)價(jià))將實(shí)施例10、比較例13中制作的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。另一方面，將glycoHbcontrollevel2(國際試藥制，參考數(shù)值10.4±0.5%)用200uL注射用水溶解后，制備用稀釋液(含有0.1%卜i;卜yX-100的磷酸緩沖液(pH7.0))稀釋至100倍的溶液，作為測(cè)定樣品。另外，作為負(fù)荷樣品，對(duì)健康人血進(jìn)行NaF采血，用溶血稀釋液(含有0.1重量％卜y卜^X-100的磷酸緩沖液(pH7.0))進(jìn)行溶血，使用稀釋至150倍的溶液，l天測(cè)定300試樣。使用各負(fù)荷試樣數(shù)測(cè)定后的色譜柱，根據(jù)下述條件對(duì)測(cè)定樣品中的血紅蛋白Alc量及非糖化血紅蛋白量進(jìn)行測(cè)定。求出相對(duì)于血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)的血紅蛋白Alc的比例(血紅蛋白Alc值(％))。測(cè)定以10試樣連續(xù)進(jìn)行，以其平均值作為測(cè)定值。另外，也測(cè)定血紅蛋白Alc的保留時(shí)間。結(jié)果如表10所示。系統(tǒng)輸液泵LC-9A(島津制作所社制)自動(dòng)進(jìn)樣器ASU-420(積水化學(xué)工業(yè)社制)檢測(cè)器SPD-6AV(島津制作所社制)洗脫液第l液170mM磷酸緩沖液(pH5.7)第2液300mM磷酸緩沖液(pH8.5)洗脫法03分鐘用第1液洗脫、33.2分鐘用第2液洗脫、3.24分鐘用第1液洗脫流速1.0mL/分鐘檢測(cè)波長415nm進(jìn)樣量10UL表10<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>根據(jù)表10，判斷使用實(shí)施例10中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，即使在進(jìn)行4500試樣的負(fù)荷試驗(yàn)之后，血紅蛋白Alc的保留時(shí)間也幾乎不變化，能夠得到準(zhǔn)確的血紅蛋白Alc值(％)。另一方面，使用比較例13中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，隨著負(fù)荷試樣數(shù)增加，存在血紅蛋白Alc的保留時(shí)間變化的傾向，得到的血紅蛋白Alc值(％)與實(shí)施例10的情況相比，偏差也比更大。(實(shí)施例11)(1)具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子的制備在帶有攪拌機(jī)的反應(yīng)器中，向3%聚乙烯醇(日本合成化學(xué)社制)水溶液中添加四甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)300g、三甘醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)社制)100g、及過氧化苯甲酰(年、乂夕'化學(xué)社制)l.Og的混合物。攪拌的同時(shí)進(jìn)行加熱，在氮?dú)夥諊性?0'C聚合1小時(shí)。之后，在離子交換水中溶解2-甲基丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(東亞合成化學(xué)社制)100g、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(日本油脂社制，乙二醇鏈n-4)100g作為具有離子交換基團(tuán)的單體。將該混合物添加到相同反應(yīng)器中，同樣進(jìn)行操作，攪拌的同時(shí)在氮?dú)夥諊性?(TC聚合2小時(shí)。將得到的聚合組合物用水和丙酮洗滌，由此得到具有磺酸基作為離子交換基團(tuán)的填充劑粒子。關(guān)于得到的填充劑粒子，使用激光衍射式粒度分布測(cè)定裝置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為8um，CV值為14n/。。(2)通過臭氧水進(jìn)行的親水化處理將得到的填充劑粒子10g浸漬于溶存臭氧氣濃度為130ppm的臭氧水300mL中，進(jìn)行攪拌，同時(shí)使用可以照射包括波長254nm的紫外線的點(diǎn)式UV照射裝置(T^7，:7Y、;/夕7社制造的UP-200G)，從lcm的距離以照射強(qiáng)度95mW/cm^照射紫外線300秒，從而實(shí)施親水化處理。紫外線照射后，使用離心分離機(jī)(日立制作所社制HimacCR20G)進(jìn)行離心分離，除去上清液。重復(fù)該操作2次，實(shí)施親水化處理，從而得到離子交換液相色譜用填充劑。臭氧水使用包括臭氧溶解組件的臭氧水制造系統(tǒng)(積水化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行制備，所述臭氧溶解組件，在具有內(nèi)徑15cmX長度20cm的圓柱形的外套內(nèi)，容納由全氟烷氧樹脂構(gòu)成的內(nèi)徑0.5mmX厚度0.04mmX長度350cm的中空管狀臭氧氣透過膜400根。(比較例14)不進(jìn)行通過臭氧水的親水化處理，而直接將實(shí)施例11中制造的具有磺酸基作為離子交換基團(tuán)的填充劑粒子，作為離子交換液相色譜用填充劑。(比較例15)的親水化處理中將溶存臭氧氣濃度設(shè)定為10ppm以外，與實(shí)施例11同樣操作，進(jìn)行親水化處理，得到離子交換液相色譜用填充劑。(比較例16)除了在通過臭氧水進(jìn)行的親水化處理中不進(jìn)行基于加速氧化法的處理以外，與實(shí)施例11同樣操作，進(jìn)行親水化處理，得到離子交換液相色譜用填充劑。(比較例17)將在磷酸緩沖液(pH5.7)中溶解的0.2重量％牛血清白蛋白(BSA)200mL加入到實(shí)施例11中制備的具有磺酸基作為離子交換基團(tuán)的填充劑粒子10g中，超聲波處理2分鐘，在80'C的恒溫水槽中緩慢攪拌24小時(shí)之后，從恒溫水槽中取出，放置至室溫。之后，離心分離除去上清液，向其中添加磷酸緩沖液(pH8.5)200mL，再次通過離心分離除去上清液。之后，添加磷酸緩沖液(pH5.7)200mL，再次通過離心分離除去上清液。得到通過物理吸附固定BSA的離子交換液相色譜用填充劑。<評(píng)價(jià)>關(guān)于實(shí)施例11以及比較例1417中得到的離子交換液相色譜用填充劑，進(jìn)行以下評(píng)價(jià)。結(jié)果如表1113所示。(3)接觸角測(cè)定關(guān)于實(shí)施例11以及比較例14、16中得到的填充劑粒子，進(jìn)行接觸角測(cè)定。觀l淀使用協(xié)和界面科學(xué)公司制造的Dropmaster500進(jìn)行。將干燥的填充劑粒子在載玻片上貼附的雙面帶上排列均勻，之后用空氣噴涂除去剩余的粒子。由此，將填充劑粒子1層分固定在雙面帶上。該狀態(tài)用顯微鏡進(jìn)行確認(rèn)。制作離子交換水1PL的液滴，使其著液在載玻片上固定的填充劑粒子上，通過e/2法計(jì)算出接觸角。需要說明的是，當(dāng)接觸角小于卯。時(shí)，著液后的水滴容易潤濕，因此，著液后的接觸角經(jīng)時(shí)變小。因此使用著液后0.5秒后的接觸角值進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表ll所示。(4)基于血紅蛋白Alc測(cè)定的血紅蛋白類(Hb)回收率的評(píng)價(jià)將實(shí)施例11以及比較例1416中制作的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。另一方面，將glycoHbcontrollevel2(國際試藥制，參考數(shù)值10.4±0.5%)用200uL注射用水溶解后，制備用稀釋液(含有0.1%卜U卜yX-100的磷酸緩沖液(pH7.0))稀釋至100倍的溶液，作為測(cè)定樣品。使用得到的色譜柱，根據(jù)下述條件用色譜峰面積對(duì)測(cè)定樣品中的血紅蛋白Alc量、以及血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)定以10試樣連續(xù)進(jìn)行，以其后一半5試樣的血紅蛋白Alc峰的面積值、以及血紅蛋白Alc峰與非糖化血紅蛋白峰的面積值的平均值作為測(cè)定值。結(jié)果如表12、圖5所示。將實(shí)施例11中得到的血紅蛋白Alc峰面積、以及血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白峰的面積值合計(jì)設(shè)定為100%，對(duì)比較例1416中得到的各峰面積進(jìn)行比較。系統(tǒng)輸液泵LC-9A(島津制作所社制)自動(dòng)進(jìn)樣器ASU-420(積水化學(xué)工業(yè)社制)檢測(cè)器SPD-6AV(島津制作所社制)洗脫液第1液170mM磷酸緩沖液(pH5,7)第2液300mM磷酸緩沖液(pH8.5)洗脫法03分鐘用第1液洗脫、33.2分鐘用第2液洗脫、3.24分鐘用第1液洗脫流速1.0mL/分鐘檢測(cè)波長415nm進(jìn)樣量10iiL(3)血紅蛋白Alc測(cè)定中的測(cè)定值變動(dòng)的評(píng)價(jià)(耐久性評(píng)價(jià))將實(shí)施例11、比較例17中制作的離子交換液相色譜用填充劑填充到液相色譜系統(tǒng)的色譜柱中。另一方面，將glycoHbcontrollevel2(國際試藥制，參考數(shù)值10.4土0.5%)用200UL注射用水溶解后，制備用稀釋液(含有0.1%卜y卜yX-100的磷酸緩沖液(pH7.0))稀釋至100倍的溶液，作為測(cè)定樣品。另外，作為負(fù)荷樣品，健康人血進(jìn)行NaF采血，用溶血稀釋液(含有0.1重量％卜y卜yX-100的磷酸緩沖液(pH7.0))進(jìn)行溶血，使用稀釋至150倍的溶液。測(cè)定樣品與負(fù)荷樣品一起進(jìn)行約1000試樣的測(cè)定，以任意間隔連續(xù)測(cè)定測(cè)定樣品10試樣，使用其平均值進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)下述條件對(duì)測(cè)定樣品中的血紅蛋白Alc量及非糖化血紅蛋白量進(jìn)行測(cè)定，求出相對(duì)于血紅蛋白Alc與非糖化血紅蛋白的合計(jì)的血紅蛋白Alc的比例(血紅蛋白Alc值(％))。另外，也測(cè)定血紅蛋白Alc的保留時(shí)間。結(jié)果如表13所示。系統(tǒng)輸液泵LC-9A(島津制作所社制)自動(dòng)進(jìn)樣器ASU-420(積水化學(xué)工業(yè)社制)檢測(cè)器SPD-6AV(島津制作所社制)洗脫液第1液170mM磷酸緩沖液(pH5.7)第2液300mM磷酸緩沖液(pH8.5)洗脫法03分鐘用第1液洗脫、33.2分鐘用第2液洗脫、3.24分鐘用第1液洗脫流速1.0mL/分鐘檢測(cè)波長415nm進(jìn)樣量10uL表11<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表12<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表13<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>如表11所示，在實(shí)施例11中，與比較例16所示的僅經(jīng)過臭氧水處理的接觸角相比小8。，從而可知通過基于加速氧化法的處理，填充劑粒子表面的親水性提高。如表12、圖5所示可知，進(jìn)行基于加速氧化法的處理的實(shí)施例11，Alc面積和總面積均比比較例1416大。即，可以抑制血紅蛋白Alc成分或其他血紅蛋白成分向填充劑粒子表面的吸附。如表13所示可知，使用實(shí)施例11中制作的離子交換液相色譜用填充劑時(shí)，在1000試樣測(cè)定之間，血紅蛋白Alc值的變動(dòng)、保留時(shí)間的變動(dòng)均非常小，能夠準(zhǔn)確測(cè)定。另一方面，在比較例17的情況下，保留時(shí)間變動(dòng)大，認(rèn)為這是由于為了提高親水性而進(jìn)行涂布的蛋白質(zhì)在測(cè)定性根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種抑制在水系介質(zhì)中的溶脹且對(duì)于水系介質(zhì)的分散性優(yōu)異的親水性高分子微粒、可以有效抑制蛋白質(zhì)等的非特異吸附的離子交換液相色譜用填充劑、使用了該離子交換液相色譜用填充劑的糖化血紅蛋白的分析方法、可以長時(shí)間維持對(duì)溶脹、非特異吸附等的抑制效果的制造離子交換液相色譜用填充劑的方法、使用該離子交換液相色譜用填充劑的制造方法進(jìn)行制造的離子交換液相色譜用填充劑、以及糖化血紅蛋白分析用的離子交換液相色譜用填充劑。權(quán)利要求1.一種親水性高分子微粒，其特征在于，分別使其分散在水和丙酮中之后照射超聲波15分鐘，并在25℃下放置240小時(shí)使其平衡后，用粒度分布測(cè)定儀分別測(cè)定粒徑時(shí)，使其在水中分散時(shí)的粒徑Dw與使其在丙酮中分散時(shí)的粒徑DA的比Dw/DA為2.0以下，并且，將所述親水性高分子微粒無間隙地排列成單層并在其上面形成純水的液滴之后，在25℃條件下用接觸角計(jì)測(cè)定的水的接觸角為70°以下。2.—種離子交換液相色譜用填充劑，其由基材微粒和在該基材微粒表面存在的離子交換基團(tuán)構(gòu)成，其特征在于，分別使其分散在水和丙酮中之后，照射超聲波15分鐘，并在25t:下放置240小時(shí)使其平衡后，用粒度分布測(cè)定儀分別測(cè)定粒徑時(shí)，使其在水中分散時(shí)的粒徑Dw與使其在丙酮中分散時(shí)的粒徑DA的比Dw/DA為2.0以下，并且，所述離子交換液相色譜用填充劑無間隙地排列成單層并在其上面形成純水的液滴之后，在25'C條件下用接觸角計(jì)測(cè)定的水的接觸角為60°以下。3.—種離子交換液相色譜用填充劑，其特征在于，具有離子交換基團(tuán)，水的接觸角為60。以下，且表面沒有被親水性化合物覆蓋。4.一種離子交換液相色譜用填充劑，其特征在于，其是由疏水性交聯(lián)聚合物粒子和具有離子交換基團(tuán)的親水性聚合物層構(gòu)成的，所述疏水性交聯(lián)聚合物粒子由合成有機(jī)高分子組成，所述親水性聚合物層共聚在所述疏水性交聯(lián)聚合物粒子的表面上，所述離子交換液相色譜用填充劑的最表面被臭氧水實(shí)施親水化處理。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的離子交換液相色譜用填充劑，其中，水的接觸角為60°以下。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的離子交換液相色譜用填充劑，其中，臭氧水的濃度為20ppm以上。7.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4、5或6所述的離子交換液相色譜用填充劑，其中，離子交換基團(tuán)為磺酸基。8.—種糖化血紅蛋白的分析方法，其特征在于，使用權(quán)利要求l所述的親水性高分子微粒或權(quán)利要求2、3、4、5、6或7所述的離子交換液相色譜用填充劑。9.一種離子交換液相色譜用填充劑的制造方法，其特征在于，其中具有如下的親水化工序，所述親水化工序中通過使用溶存臭氧氣濃度為20ppm以上的臭氧水洗滌具有離子交換基團(tuán)的填充劑粒子表面而進(jìn)行親水化，所述親水化工序中，進(jìn)行基于加速氧化法的處理。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法，其中，作為基于加速氧化法的處理，使臭氧水的pH為7以上并且進(jìn)行超聲波照射。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法，其中，使用頻率為20kHzlMHz的超聲波進(jìn)行照射。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法，其中，作為基于加速氧化法的處理，進(jìn)行紫外線照射。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法，其中，紫外線包括254nm的波長。14.根據(jù)權(quán)利要求9、10、11、12或13所述的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法，其中，在2(TC以上進(jìn)行基于加速氧化法的處理。15.根據(jù)權(quán)利要求9、10、11、12、13或14所述的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法，其中，離子交換基團(tuán)為磺酸基。16.—種離子交換液相色譜用填充劑，其特征在于，通過權(quán)利要求9、10、11、12、13、14或15所述的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法所制造而成。17.—種用于糖化血紅蛋白分析的離子交換液相色譜用填充劑，其特征在于，通過權(quán)利要求9、10、11、12、13、14或15所述的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法所制造而成。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供一種抑制在水系介質(zhì)中的溶脹且對(duì)于水系介質(zhì)的分散性優(yōu)異的親水性高分子微粒、可以有效抑制蛋白質(zhì)等的非特異吸附的離子交換液相色譜用填充劑、使用了該離子交換液相色譜用填充劑的糖化血紅蛋白的分析方法、可以長時(shí)間維持對(duì)溶脹、非特異吸附等的抑制效果的離子交換液相色譜用填充劑的制造方法、使用該離子交換液相色譜用填充劑的制造方法進(jìn)行制造的離子交換液相色譜用填充劑、以及糖化血紅蛋白分析用的離子交換液相色譜用填充劑。本發(fā)明為一種親水性高分子微粒，分別使其分散在水和丙酮中之后照射超聲波15分鐘，并在25℃下放置240小時(shí)使其平衡后，用粒度分布測(cè)定儀分別測(cè)定粒徑時(shí)，使其在水中分散時(shí)的粒徑D_w與使其在丙酮中分散時(shí)的粒徑D_A的比D_w/D_A為2.0以下，并且，將所述親水性高分子微粒無間隙地排列成單層并在其上面形成純水的液滴之后，在25℃條件下用接觸角計(jì)測(cè)定的水的接觸角為70°以下。文檔編號(hào)B01J20/26GK101257969SQ20068003260公開日2008年9月3日申請(qǐng)日期2006年11月14日優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日發(fā)明者與谷卓也,高原誠申請(qǐng)人:積水化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社