水處理廠曝氣池中的活性污泥進行煮沸處理，過濾。使用磨碎后的100 g玉米秸桿和150 g谷物麩皮作為堆肥的初始物料，埋入I kg處理過的活性污泥中，并添加25 g風干粉碎的谷殼作為填充劑，改善堆體的孔隙度。在10 °C下培養(yǎng)堆肥15 d后，保存待用。
[0067]取10 g堆肥樣品置于裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中振蕩25 min后，靜止30min，得到土壤懸液。吸取2 mL土壤懸浮液接種到富集培養(yǎng)基中，放入溫度為25 °C、轉(zhuǎn)速為220 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中進行振蕩培養(yǎng)5 d。吸取上述I mL富集培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，放入溫度為30 °C、轉(zhuǎn)速為220 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中進行振蕩培養(yǎng)，直到觀測到乳化現(xiàn)象后。取I mL稀釋至10—3之后，以該稀釋發(fā)酵液I mL涂布于平板培養(yǎng)基上，于37 °(:恒溫靜置培養(yǎng)3 d。挑選平板長勢良好的菌落進行劃線分離，按照上述方法進行再次發(fā)酵培養(yǎng)、馴化2次，即可得到馴化后的菌株。將馴化后的菌株在富集培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)I d后，吸取I mL菌液按4.5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值為6.5，在溫度為25 °C、轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進行振蕩培養(yǎng)2 d后，即為生物表面活性劑菌株液體。
[0068](3)蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立
將培養(yǎng)基質(zhì)裝入20 cm X 15 cm規(guī)格的泡沫漂浮孔穴育苗盆中，每盆I kg，按照基質(zhì)質(zhì)量的15 %澆水，待水分滲透均勻后，在基質(zhì)表層均勻噴灑55 g需繁殖的叢枝菌根菌劑——地表球囊霉菌劑。使用10 % H2O2對蓖麻種子浸泡25 min，將其陰干后均勻撒種在培養(yǎng)基中，每盆4顆。然后，使用保鮮膜對泡沫漂浮孔穴育苗盆進行覆蓋，以此保濕、增溫，促進蓖麻孢子萌芽、發(fā)育，為保障供應蓖麻孢子萌芽、發(fā)育及其后期幼苗生長所需的空氣，同時方便后期管理，在撒播蓖麻種子上方處的保鮮膜上扎孔4個。待蓖麻萌芽至單株含有80?100個菌根真菌孢子后，使泡沫漂浮孔穴育苗盆的下半部分浸入水中，待蓖麻種子出苗后間苗，每孔留苗I顆，并把水換成1/10強度的改良霍格蘭德營養(yǎng)液，3天后換成1/4強度的改良霍格蘭德營養(yǎng)液，2周后再更換一次1/4強度的改良霍格蘭德營養(yǎng)液。同時，每天對蓖麻萌芽使用含有體積百分比為0.3 %的生物表面活性劑菌株液體的水進行均勻噴淋，保持培養(yǎng)基質(zhì)的含水量60%，在室溫下繼續(xù)培育10 d后，即可得到生物表面活性劑強化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系。
[0069](4)鈾污染土壤的原位修復
將無鈾污染土壤自然風干后，過篩后，取I kg裝入50 cm X 25 cm規(guī)格的塑料花盆中，拌入河砂150 g，有機肥50 g后，然后將UO2(NO3)2.6 H2O溶液均勻噴灑在土壤中，充分攪拌混合后得到含鈾的量為50 mg U / kg 土的鈾污染試驗土壤。然后將上述栽培的蓖麻幼苗整株及其周圍的培養(yǎng)基質(zhì)一起取出，移栽在鈾污染試驗土壤中。鈾污染土壤原位修復試驗在人工氣候室內(nèi)完成，將塑料花盆放在長木架上，控制室內(nèi)溫度，白天溫度25 0C，夜間溫度16 °C，每天光照8 h，并定時澆水以保持土壤持水量在60 %。蓖麻移栽60 d后，沿土面剪取植株地上部分，同時洗出根系，在110 °0下殺青，70 °C烘干(24 h)，分根、莖、葉稱干重，各部分植物樣品經(jīng)磨碎后，用硝酸-高氯酸消解，使用ICP-AES測定各部分植物中總鈾的量。
[0070]結(jié)果表明，在含鈾的量為50 mg U / kg 土的鈾污染試驗土壤，采用生物表面活性劑強化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系來原位修復鈾污染土壤，不僅蓖麻長勢很好，沒有任何不良癥狀，而且蓖麻植株鈾的含量高達32.15 mg U / kg DW，比其他相關(guān)文獻選擇的植物修復方法效果均好。如果連續(xù)采用多年種植，將明顯減少土壤中鈾的含量。
【主權(quán)項】
1.一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系的方法，其特征在于，以無鈾污染土壤、蛭石、泥炭土為培養(yǎng)基質(zhì)，以蓖麻為土壤宿主植物，以叢枝菌根為接種微生物，首先利用育苗裝置培養(yǎng)蓖麻幼苗，在填充有培養(yǎng)基質(zhì)的泡沫漂浮孔穴育苗盆中對蓖麻種子進行叢枝菌根真菌接種，形成蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系，再使用自制的生物表面活性劑菌株液體對蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系進行強化，得到一種生物表面活性劑強化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系， 具體步驟如下: (1)培養(yǎng)基質(zhì)的制備 將無鈾污染土壤、蛭石和泥炭土按照一定質(zhì)量比進行混合，進行滅菌處理，得到所需的培養(yǎng)基質(zhì)； (2)生物表面活性劑菌株液體的制備 取10 g處理后的堆肥樣品，置于裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中振蕩25 min后，靜止30 min，得到土壤懸液，吸取2 mL土壤懸浮液接種到富集培養(yǎng)基中，放入溫度為25 °C、轉(zhuǎn)速為220 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中進行振蕩培養(yǎng)5 d，吸取上述I mL富集培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，放入溫度為30 °C、轉(zhuǎn)速為220 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中進行振蕩培養(yǎng)，直至觀測到乳化現(xiàn)象，取I mL稀釋至10—3之后，以該稀釋發(fā)酵液I mL涂布于平板培養(yǎng)基上，于37 °C恒溫靜置培養(yǎng)3 d，挑選平板長勢良好的菌落進行劃線分離，按照上述方法進行再次發(fā)酵培養(yǎng)、馴化2次，即得到馴化后的菌株，將馴化后的菌株在富集培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)I d后，吸取I mL菌液按4.5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值為6.5，在溫度為25 °C、轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進行振蕩培養(yǎng)2 d后，即得到生物表面活性劑菌株液體； (3)蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立 將培養(yǎng)基質(zhì)裝入20 cm X 15 cm規(guī)格的泡沫漂浮孔穴育苗盆中，每盆I kg，按照基質(zhì)質(zhì)量的15 %澆水，待水分滲透均勻后，在基質(zhì)表層均勻噴灑一定質(zhì)量的叢枝菌根菌劑，使用10 % H2O2對蓖麻種子浸泡25 min，將其陰干后均勻撒種在培養(yǎng)基中，每盆4顆，然后，使用保鮮膜對泡沫漂浮孔穴育苗盆進行覆蓋，用小釘子在撒播蓖麻種子上方處的保鮮膜上扎孔4個，待蓖麻萌芽至單株含有80?100個菌根真菌孢子后，使泡沫漂浮孔穴育苗盆的下半部分浸入水中，待蓖麻種子出苗后間苗，每孔留苗I顆，并把水換成1/10強度的改良霍格蘭德營養(yǎng)液，3天后換成1/4強度的改良霍格蘭德營養(yǎng)液，2周后再更換一次1/4強度的改良霍格蘭德營養(yǎng)液，同時，每天對蓖麻萌芽使用含有生物表面活性劑菌株液體的水進行均勻噴淋，保持培養(yǎng)基質(zhì)的含水量60%，在室溫下培養(yǎng)，繼續(xù)培育1 d后，S卩得到生物表面活性劑強化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系的方法，其特征在于，所述步驟(I)中使用的無鈾污染土壤質(zhì)量是I?2 kg;輕石質(zhì)量是1.5?4.5 kg和泥炭土的質(zhì)量是0.5?0.8 kg ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系的方法，其特征在于，所述步驟(2)中使用的富集培養(yǎng)基組成是:氯化鉀1.5 g;硫酸銨12 g;氯化鈉1.2g;七水硫酸亞鐵3 X 10—5 g;磷酸氫二鉀3.5 g;三水磷酸氫二鉀0.65 g；EDTA 1.1 g;酵母浸膏0.6 g;植物油5 g;蒸饋水1000 mL； 所述步驟(2)中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成是:氯化鉀1.5 g;硫酸銨12 g;氯化鈉1.2 g;七水硫酸亞鐵3 X 10—5 g;磷酸氫二鉀3.5 g;三水磷酸氫二鉀0.65 g;硫酸鎂0.6 g;氯化鈣0.25 g;硫酸鋅0.3 g;硫酸銅0.3 g；EDTA 1.1 g;酵母浸膏0.6 g;植物油5 g;蒸餾水1000mL； 所述步驟(2)中使用的平板培養(yǎng)基組成是:葡萄糖20 g;蛋白胨5 g;酵母浸膏0.25 g;瓊脂20 g;蒸餾水1000 mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系的方法，其特征在于，所述步驟(3)中使用的叢枝菌根菌劑為地表球囊霉、無梗囊霉、盾巨孢囊霉中的任意一種。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系的方法，其特征在于，所述步驟(3)中使用的叢枝菌根菌劑的質(zhì)量是50?60 g； 所述步驟(3)中使用的改良霍格蘭德營養(yǎng)液組成是:四水硝酸鈣945 mg/L;硝酸鉀506mg/L;硝酸錢80 mg/L;磷酸二氫鉀136 mg/L;硫酸鎂493 mg/L;鐵鹽溶液2.5 mL;微量元素液5 mL;蒸饋水500 mL；pH=6.0； 所述步驟(3)中使用的鐵鹽溶液組成是:七水硫酸亞鐵2.78 g;乙二胺四乙酸二鈉3.73g;蒸餾水500 mL；pH=5.5； 所述步驟(3)中使用的微量元素液組成是:碘化鉀0.83 mg/L;硼酸6.2 mg/L;硫酸錳22.3 mg/L;硫酸鋅8.6 mg/L;鉬酸鈉0.25 mg/L;硫酸銅0.025 mg/L;氯化鈷0.02 5mg/L;蒸餾水500 mL； 所述步驟(3)中使用的含有生物表面活性劑菌株液體的體積百分比是0.2?0.4 %。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系在原位修復鈾污染土壤中的應用，其特征在于，具體應用步驟是:將無鈾污染土壤自然風干，過篩后，取I kg裝入50 cm X 25 cm規(guī)格的塑料花盆中，拌入河砂150 g，有機肥50 g后，然后將UO2(Ν03)2.6 H2O溶液均勻噴灑在土壤中，充分攪拌混合后得到鈾污染試驗土壤，然后將上述栽培的蓖麻幼苗整株及其周圍的培養(yǎng)基質(zhì)一起取出，移栽在鈾污染試驗土壤中，鈾污染土壤原位修復試驗在人工氣候室內(nèi)完成，將塑料花盆放在長木架上，控制室內(nèi)溫度，每天光照8h，并定時澆水以保持土壤持水量在60 %，蓖麻移栽60 d后，沿土面剪取植株地上部分，同時洗出根系，在110 °(:下殺青，70 °C烘干24 h，分根、莖、葉稱干重，各部分植物樣品經(jīng)磨碎后，用硝酸-高氯酸消解，使用ICP-AES測定各部分植物中總鈾的量。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系在原位修復鈾污染土壤中的應用，其特征在于，鈾污染土壤中含鈾的量為25 - 75 mg U / kg 土。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系在原位修復鈾污染土壤中的應用，其特征在于，控制室內(nèi)溫度，白天溫度20?30 °C，夜間溫度16?20Γ。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物表面活性劑強化植物—微生物共生體系的方法及其在原位修復鈾污染土壤中的應用。以無鈾污染土壤、蛭石、泥炭土為培養(yǎng)基質(zhì)，以蓖麻為土壤宿主植物，以叢枝菌根為接種微生物，首先利用育苗裝置培養(yǎng)蓖麻幼苗，對蓖麻種子進行叢枝菌根真菌接種，形成蓖麻幼苗—菌根真菌共生體系，再使用生物表面活性劑菌株液體對蓖麻幼苗—菌根真菌共生體系進行強化，得到一種生物表面活性劑強化功能的蓖麻幼苗—菌根真菌共生體系。將其應用于原位修復鈾污染土壤中。本發(fā)明方法在原位修復鈾污染土壤過程中，不僅植物長勢很好，而且修復土壤后植株鈾的含量高，修復效果好。
【IPC分類】B09C1/00, B09C1/10
【公開號】CN105689375
【申請?zhí)枴緾N201610065616
【發(fā)明人】肖方竹, 彭國文, 符建文, 石志科, 余麗梅, 蒲移秋
【申請人】南華大學
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年2月1日