一種氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的富集與馴化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)甲烷的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的富集與馴化方法，屬于沼 氣發(fā)酵微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 在沼氣發(fā)酵過程中，有機物在水解和發(fā)酵階段、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段等兩個階段中產(chǎn) 生的氫氣（H2)和二氧化碳（C02)，能被氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群代謝生成甲烷（CH4),沼氣中CH4 的產(chǎn)生有28%來源于這一途徑，即H2還原CO2生成CH4。
[0003] 沼氣中CH4含量為60%左右，CO2含量為35%左右，CO2含量超過CH4含量的一半，造 成沼氣高值化利用的瓶頸，同時CO2沒有得到有效利用，浪費了沼氣發(fā)酵微生物生長所需的 碳源；從H2還原CO2生成CH4這一途徑得到啟發(fā)，若將沼氣中的CO2通過H2來進行微生物還 原，必將有效提升沼氣中CH4的含量，開發(fā)生物天然氣，促進沼氣高值化利用；產(chǎn)甲烷菌可分 類為乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌(代謝基質(zhì)為乙酸)、氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌(代謝基質(zhì)為HdPCO2)以 及甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌(代謝基質(zhì)為甲酸、甲醇及甲胺等)，而示蹤實驗表明沼氣發(fā)酵微生 物體系中的產(chǎn)甲烷菌有70%以上是乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，為了在沼氣發(fā)酵體系中高效實現(xiàn) H2還原CO2生成CH4，有必要采取方法促進微生物體系中氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的生長；因此， 本實驗設(shè)計在常溫常壓條件下運行沼氣發(fā)酵體系，通過外源加入4和CO2基質(zhì)的馴化方法， 促進沼氣發(fā)酵活性污泥中氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的代謝生長，以期提升氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群 在產(chǎn)甲烷菌中的含量，并獲得富集了氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的沼氣發(fā)酵活性污泥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于生產(chǎn)甲烷的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的富集與馴化 方法。
[0005] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案完成： ⑴沼氣發(fā)酵溫度、壓力：常溫、常壓 ⑵沼氣發(fā)酵活性污泥用量：沼氣發(fā)酵活性污泥用量為沼氣發(fā)酵反應(yīng)器容積的50%，剩 余反應(yīng)器體積空間由沼液填充。
[0006] ⑶代謝基質(zhì)配料：按照112還原CO2生成CH4的生化方程式4? +CO2 -CH4+ 2H20， 以H2:C02體積比4:1進行配料，并配1體積的N2作為微生物生長所需的氮源，每組實驗混 合氣體配料 3000mL，其中 112有 2000mL、CO2有 500mL、N2有 500mL。
[0007] ⑷馴化方法：將配好的混合氣體通至濕式儲氣柜中，此時氣柜浮罩上升至3000mL 的位置，然后利用氣體循環(huán)泵將混合氣體抽至沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中，在沼氣發(fā)酵活性污泥床 中反應(yīng)后又回到氣柜中，這樣反復(fù)進行氣體循環(huán)，隨著反應(yīng)進行，氣柜浮罩不斷下降，當(dāng)浮 罩不再下降時表明反應(yīng)結(jié)束。
[0008](5)沼氣發(fā)酵活性污泥樣品總DNA的提取、檢測及測序 ①基因組DNA的提?。翰捎铆h(huán)境DNA提取試劑盒Fast DNA spin kit for soil (MP Biomedicals, LLC;www. mpbio. com)對樣品進行總DNA的提取，之后采用瓊脂糖凝膠電泳檢 測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至lng/y1。
[0009] ②PCR擴增：稀釋后的基因組DNA為模板；根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物；使用NewEnglandBiolabs公司的Phusion?High-FidelityPCRMaster MixwithGCBuffer。使用高效和高保真的酶進行PCR，確保擴增效率和準(zhǔn)確性。引物 對應(yīng)區(qū)域：16SV4區(qū)引物為515F-806R;18SV4區(qū)引物為528F-706R;18SV9區(qū)引物為 1380F-1510R;ITS1 區(qū)引物為ITS1-5F-ITS2 ;ITS2 區(qū)引物為：ITS2-3F-ITS2-4R。
[0010] ③PCR產(chǎn)物的混樣和純化：PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根 據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使 用ThermoScientific公司的GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。
[0011] ④文庫構(gòu)建和上機測序：使用NewEnglandBiolabs公司的NEBNext?Ultra? DNALibraryPr印KitforIllumina建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過 Qubit定量和文庫檢測，合格后，使用MiSeq進行上機測序。
[0012] 本發(fā)明的作用機理：本發(fā)明通入沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中的底物是H2XOjPN2,HdPCO2 作為沼氣發(fā)酵微生物的代謝基質(zhì)，隊作為沼氣發(fā)酵微生物的氮源；在氣體循環(huán)過程中，氫營 養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌由于有充足的代謝基質(zhì)4和co2，因而能在沼氣發(fā)酵過程中不斷生長富集，而 乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌由于沒有得到代謝基質(zhì)，在沼氣發(fā)酵過程中就 會不斷消亡。
[0013] 本發(fā)明的有益效果：⑴本發(fā)明兼?zhèn)?)2減排的環(huán)保意義、生物合成CH4的再生能源 意義和潛在經(jīng)濟收益等優(yōu)勢，有著廣泛應(yīng)用前景。⑵將不易被高效安全利用的H2，通入沼氣 發(fā)酵體系中，與沼氣中占比35%左右的CO2發(fā)生生化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為另一種清潔能源CH4，有效 提升傳統(tǒng)沼氣發(fā)酵的CH4含量，打造生物天然氣，實現(xiàn)沼氣的高值化利用。
[0014]
【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本發(fā)明實施例H2還原CO2生成CH4的實驗結(jié)果。
[0015]
【具體實施方式】： 實施例： ⑴H2還原CO2生成CH4的實驗結(jié)果 在實驗的正常運行階段，氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的富集馴化共進行了 5組有效實驗，這5組 有效實驗的〇14生成量結(jié)果見圖2。
[0016] 從圖2中可以看出，第1至5組氣體循環(huán)實驗的CH4產(chǎn)量分別為185mL、258mL、 166mL、136mL、140mL，表明沼氣發(fā)酵體系中的微生物能將4和0)2較好的轉(zhuǎn)換成CH4;按照 H2還原0)2轉(zhuǎn)換生成CH4的生化方程式4H2+CO2 -CH4+ 2H20,外源加入的2000mL4和 500mLCO2在理論上可轉(zhuǎn)換生成500mLCH4，從實驗結(jié)果可知，第1至5組氣體循環(huán)實驗的實 際〇14產(chǎn)量分別占理論產(chǎn)量的37%、51. 6%、33. 2%、27. 2%、28%，其中第2組的CH4產(chǎn)量最高， 達(dá)到理論值的51. 6%。
[0017] N2減少(或利用)的情況說明：第1至5組氣體循環(huán)實驗的N2消耗量分別為151mL、 44mL、210mL、157mL、45mL，表明在本實驗條件下，通過氣體循環(huán)的方式，外源加入的N2可被 沼氣發(fā)酵微生物當(dāng)作氮源直接利用，同時也表明富集得到的沼氣發(fā)酵微生物中存在著以N2 為氮源的微生物。
[0018] ⑵產(chǎn)甲烷菌群落及變化分析 從圖2的氣體循環(huán)實驗結(jié)果可知，本發(fā)明可將外源加入的HdPCO2較好的轉(zhuǎn)換生成CH4，從微生物學(xué)的角度上看，應(yīng)是體系中的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌發(fā)揮了重要作用，因此，對啟 動前的沼氣發(fā)酵活性污泥和第5組氣體循環(huán)實驗結(jié)束后的沼氣發(fā)酵活性污泥分別進行總 DNA提取，應(yīng)用16SrRNA基因技術(shù)對氣體循環(huán)實驗前后沼氣發(fā)酵活性污泥中的原核微生物 群落進行研宄，比較分析原核微生物群落的前后變化情況，實驗前后沼氣發(fā)酵活性污泥中 產(chǎn)甲烷菌在古菌中的含量變化情況參見下表(表中丨表示增長、丨表示降低)。
[0019]由上表可知，專性乙酸型的甲烷鬃毛菌屬含量在實驗前后明顯降低，從84%降低 至64%，降幅達(dá)23. 8%，這是由于本實驗沒有提供乙酸基質(zhì)，而甲烷鬃毛菌屬又不能利用H2 和CO2基質(zhì)，甲烷鬃毛菌屬由于缺乏代謝基質(zhì)而導(dǎo)致含量顯著降低；甲烷八疊球菌屬既可以 利用乙酸基質(zhì)又可以利用!1 2和CO2基質(zhì)，本實驗沒有提供乙酸基質(zhì)，但甲燒八萱球菌屬在古 菌中的含量由實驗前的8%提高到實驗后的16%，含量增長了一倍，這是由于外源加入的H2 和CO2作為甲烷八疊球菌屬的生長基質(zhì)，使其不斷富集生長所致；屬于氫營養(yǎng)型的甲烷粒菌 屬、甲烷袋狀菌屬、甲烷螺菌屬、甲烷桿菌屬在實驗前后的含量同樣發(fā)生了明顯增長，增長 率分別為16. 7%、80%、150%、11. 1%，表明了本實驗中外源加入的4和CO2充分促進了這些氫 營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長；值得注意的是，在實驗前沒有檢測到的甲烷繩菌屬、甲烷盤菌屬、 甲烷泡菌屬等氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，在實驗結(jié)束后的沼氣發(fā)酵活性污泥中都檢測到了這些產(chǎn) 甲烷菌的存在，說明了通過外源加入4和CO2基質(zhì)，可有效刺激能利用H2和CO2的產(chǎn)甲烷菌 的富集。
【主權(quán)項】
1. 一種氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的富集與馴化方法，其特征在于：在常溫常壓下，將配好 的混合氣體通至濕式儲氣柜中，然后利用氣體循環(huán)泵將混合氣體抽至沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中， 在沼氣發(fā)酵活性污泥床中反應(yīng)后又回到氣柜中，這樣反復(fù)進行氣體循環(huán)。2. 根據(jù)權(quán)利要求書1中所述的混合氣體，其特征是：混合氣體由H2、0)2和N2構(gòu)成，按 照H2還原⑶2生成CH4的生化方程式4H^ +CO2 -CH4 + 2H20,以H2:CO2體積比4:1進行配 料，并配1體積的N2，每組實驗混合氣體配料3000mL，其中4有2000mL、C0 2有500mL、N2有 500mT,n3. 根據(jù)權(quán)利要求書1中所述的沼氣發(fā)酵活性污泥床，其特征是：沼氣發(fā)酵活性污泥用 量為沼氣發(fā)酵反應(yīng)器容積的50%。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)甲烷的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的富集與馴化方法。本發(fā)明設(shè)計在常溫常壓條件下運行沼氣發(fā)酵體系，通過外源加入H2和CO2基質(zhì)并進行氣體循環(huán)的馴化方法，促進沼氣發(fā)酵活性污泥中氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的生長與富集。本發(fā)明可以有效提升氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群在產(chǎn)甲烷菌中的含量，并能獲得富集了氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群的沼氣發(fā)酵活性污泥。
【IPC分類】C02F11/04
【公開號】CN104926062
【申請?zhí)枴緾N201510393213
【發(fā)明人】張無敵, 楊斌, 尹芳, 田光亮, 趙興玲, 王昌梅, 柳靜, 楊紅, 劉士清, 毛羽
【申請人】云南師范大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月7日