本發(fā)明涉及一種能適應高固液比體系的鎘污染土壤治理復合菌劑的應用，屬于微生物轉化治理重金屬污染土壤技術領域。

背景技術：

近幾年，鎘污染事件已成為全世界關注的環(huán)境安全保護問題。工業(yè)中排放的金屬鎘廢渣、廢氣、廢水會直接或間接污染耕地土壤。鎘極易被農(nóng)作物的根吸收而向籽實遷移，最后通過食物鏈進入人體，對人類健康構成嚴重威脅。與傳統(tǒng)的物理化學和植物修復鎘污染土壤技術相比，微生物修復技術具有很大的優(yōu)勢。微生物能夠影響鎘在土壤中的地球化學行為，使各種不同形態(tài)鎘轉化為可溶態(tài)從土壤中徹底清除，從而使鎘失去“毒性”，并且微生物修復技術對土壤肥力和代謝活性沒有影響，能夠避免二次污染物對人類健康和環(huán)境的影響；同時，微生物具有豐富的物種資源，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，微生物修復機理研究的也越來越深入，使得微生物修復成為最具有發(fā)展和應用前景的技術之一。

微生物對鎘污染土壤的修復效率受許多因素的影響，比如土壤性質、含水量、溫度、氧含量、ph值、氧化還原電位和有機物含量等。其中，修復環(huán)境中土壤和液體固液比在構建和優(yōu)化微生物功能菌群并保持菌群活性，從而提高污染土壤鎘去除率方面起到非常重要的作用。隨著固液比的提高，修復環(huán)境中重金屬濃度、有機質的增加以及本土微生物對功能菌群的競爭抑制，均會影響微生物的生長速率；此外，固液比的增加會由于土壤的緩沖能力而影響土壤ph的變化，重金屬在土壤中的鈍化及溶解反應與土壤ph有很大相關性，ph值是影響微生物轉化重金屬形態(tài)過程的重要因素。要實現(xiàn)鎘污染土壤微生物修復技術的工業(yè)化應用，提高功能微生物群落對高固液比體系的適應性是一個重要的前提，這將大大降低微生物在擴大培養(yǎng)過程中的生產(chǎn)成本和工業(yè)用水量的大量減少。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能適應高固液比體系的鎘污染土壤治理復合菌劑的應用。該復合菌劑不僅保證了污染土壤中不溶態(tài)鎘轉化為離子態(tài)鎘所需的微生物和化學反應多樣性，而且使該功能菌群在高固液比體系中也能有較高的鎘去除率。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的。

一種能適應高固液比體系的鎘污染土壤治理復合菌劑的應用，將所述的菌劑用于治理鎘污染土壤。具體是將菌濃為1-4×10⁷個/ml的復合菌劑中加入60％質量濃度的鎘污染土壤，恒溫培養(yǎng)箱轉速為170～175rpm，溫度為25～30℃，初始ph值為2.5-3.0，處理時間為3～7天。所述的復配菌劑由隱性嗜酸桿菌(acidiphiliumcryptum)、皺褶假絲酵母菌(candidarugosa)、固氮醋酸桿菌(acetobacterdiazotrophicus)、粘紅酵母菌(rhodotorulaglutinis)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、嗜酸氧化硫硫桿菌(acidithiobacillusthiooxidans)和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(acidthiobacillusferrooxidans)混合組成。

作為進一步的改進，先將隱性嗜酸桿菌、皺褶假絲酵母菌、固氮醋酸桿菌、粘紅酵母菌和銅綠假單胞菌混合得到復合群落a；嗜酸氧化硫硫桿菌和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌混合得到復合群落b；然后將復合群落a和b混合得到復合群落c，最后再培養(yǎng)得到復合菌劑。

作為進一步的改進，先將各種微生物單獨培養(yǎng)，當達到對數(shù)生長期時離心收菌并計數(shù)，根據(jù)微生物數(shù)量比例混合獲得兩種復合群落，其中隱性嗜酸桿菌、皺褶假絲酵母菌、固氮醋酸桿菌、粘紅酵母菌和銅綠假單胞菌按照1～1.5：1～1.5：1～1.5：1～1.5：1～1.5的比例混合得到復合群落a；嗜酸氧化硫硫桿菌和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌按照1.1～1.5：1.2～1.5的比例混合得到復合群落b；將得到的復合群落a和b按照菌濃數(shù)量比1:1混合。

作為進一步的改進，各微生物單獨培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分為：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；單獨培養(yǎng)隱性嗜酸桿菌、皺褶假絲酵母菌、固氮醋酸桿菌、粘紅酵母菌和銅綠假單胞菌時，培養(yǎng)基中加入葡萄糖0.5～1g/l，酵母粉0.05～0.1g/l；單獨培養(yǎng)嗜酸氧化硫硫桿菌和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌時，在培養(yǎng)基中加入硫粉0.5～1g/l，硫酸亞鐵2.50～4.47g/l。

作為進一步的改進，將得到的復合群落a和b分別在含鎘培養(yǎng)基中進行馴化；然后將復合群落a和b混合得到復合群落c，最后在高固液比體系的鎘污染土壤環(huán)境下進行適應性培養(yǎng)得到復合菌劑。

作為進一步的改進，，將得到的復合群落a和b分別在馴化培養(yǎng)基中進行馴化，馴化培養(yǎng)基成分為：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；培養(yǎng)復合群落a時，在培養(yǎng)基中加入葡萄糖0.5～1g/l，酵母粉0.05～0.1g/l；培養(yǎng)復合群落b時在培養(yǎng)基中加入硫粉0.5～1g/l，硫酸亞鐵2.50～4.47g/l；此外，在培養(yǎng)基中均加入-20目的5-10wt％鎘污染土樣，土壤中鎘含量范圍為10～30mg/kg；每次傳代接種的微生物濃度為1-4×10⁷個/ml，培養(yǎng)后微生物的濃度至少達到4×10⁸-10⁹個/ml；復合群落a和b各自培養(yǎng)5-8代后，按照菌濃度等比例混合得到復合群落c。

作為進一步的改進，復合群落a和b的馴化過程在200-250ml的錐形瓶中進行，恒溫培養(yǎng)箱轉速為170-175rpm，培養(yǎng)溫度為25-30℃，初始ph值為2.5-3.0。

作為進一步的改進，所述的復合群落c對高固液比的適應性培養(yǎng)過程如下：基本培養(yǎng)基成分為：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；培養(yǎng)基還加入葡萄糖0.5～1g/l，酵母粉0.05～0.1g/l，硫粉0.5～1g/l，硫酸亞鐵2.50～4.47g/l；此外，在培養(yǎng)基中加入-20目的鎘污染土樣進行適應性培養(yǎng)，土樣中鎘含量范圍為10～30mg/kg，以5wt％為一個濃度梯度，加入土壤含量從10wt％增加至60wt％，；每個濃度梯度至少連續(xù)培養(yǎng)3代。

作為進一步的改進，對復合菌劑進行適應性培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱轉速為170～175rpm，培養(yǎng)溫度為25～30℃，初始ph值為2.5-3.0，每代培養(yǎng)時間為3～7天，當菌液ph值達到2.0以下，微生物菌體密度達到4×10⁸-10⁹個/ml時，進行傳代培養(yǎng)，每次傳代接種的微生物濃度為1-4×10⁷個/ml。

本發(fā)明的菌劑用于處理某處鎘污染土壤時，該菌劑用于馴化和適應性培養(yǎng)時所用土樣就取自于該處鎘污染土壤。

本發(fā)明針對污染土壤中鎘形態(tài)的微生物轉化機理及微生物生理生化特征，采用多種微生物復配成一種可高效治理鎘污染土壤的功能菌群，不但解決了功能菌群在加入到鎘污染土壤中適應性差，生長速度慢的問題，而且保證了污染土壤中不溶態(tài)鎘轉化為離子態(tài)鎘所需的微生物和化學反應多樣性，該功能菌群在高固液比體系中也能有較高的鎘去除率。

附圖說明

圖1為在逐步提高土壤含量(固液比)體系下復合菌劑對污染土壤的鎘去除率的影響；

圖2為不同復合群落修復污染土壤時鎘的去除率的變化。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不作為對本發(fā)明的限定。

本實施例所用鎘污染土樣取自于湖南省湘潭縣湘江入口4公里處，此地區(qū)土壤鎘污染由工業(yè)廢水的隨意排放所致，污染時間長達十余年，污染程度嚴重，治理難度大。經(jīng)測定，土樣中鎘含量為21mg/kg，其他重金屬離子含量低于國家標準規(guī)定gb15618－1995《土壤環(huán)境質量標準》。

制備復合菌劑的微生物由隱性嗜酸桿菌atcc33463、皺褶假絲酵母菌cctccay93026、固氮醋酸桿菌cgmccno.5455、粘紅酵母菌atcc96365、銅綠假單胞菌cctccab2013184、嗜酸氧化硫硫桿菌atcc19377和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌atcc23270混合組成。各微生物單獨培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分為：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l，其中單獨培養(yǎng)隱性嗜酸桿菌atcc33463、皺褶假絲酵母菌cctccay93026、固氮醋酸桿菌cgmccno.5455、粘紅酵母菌atcc96365和銅綠假單胞菌cctccab2013184時，培養(yǎng)基中加入葡萄糖1g/l，酵母粉0.1g/l；單獨培養(yǎng)嗜酸氧化硫硫桿菌atcc19377和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌atcc23270時，在培養(yǎng)基中加入硫粉1g/l，硫酸亞鐵4.47g/l；各種微生物的培養(yǎng)溫度為30℃，恒溫培養(yǎng)箱轉速為175rpm，初始ph值為2.8。

當各微生物達到對數(shù)生長期時，離心收菌并利用顯微鏡計數(shù)，根據(jù)微生物數(shù)量比例混合獲得兩種復合群落，其中隱性嗜酸桿菌atcc33463、皺褶假絲酵母菌cctccay93026、固氮醋酸桿菌cgmccno.5455、粘紅酵母菌atcc96365和銅綠假單胞菌cctccab2013184按照1:1:1:1:1的比例混合得到復合群落a；嗜酸氧化硫硫桿菌atcc19377和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌atcc23270按照1:1.2的比例混合得到復合群落b。

將得到的復合群落a和b分別在馴化培養(yǎng)基中進行馴化，馴化培養(yǎng)基成分為：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；培養(yǎng)復合群落a時，在培養(yǎng)基中加入葡萄糖1g/l，酵母粉0.1g/l；培養(yǎng)復合群落b時在培養(yǎng)基中加入硫粉1g/l，硫酸亞鐵4.47g/l；此外，在培養(yǎng)基中均加入-20目的5wt％鎘污染土樣，土壤中鎘含量為21mg/kg；每次傳代接種的微生物濃度為4×10⁷個/ml，培養(yǎng)后微生物的濃度至少達到4×10⁹個/ml；培養(yǎng)過程在250ml的錐形瓶中進行，培養(yǎng)溫度為30℃，恒溫培養(yǎng)箱轉速為175rpm，ph值為3.0，分別培養(yǎng)5代后，將復合菌群a和b按照菌濃度等數(shù)量比例混合得到復合群落c。

得到的復合群落c對高固液比體系的適應性培養(yǎng)過程在250ml的錐形瓶中進行，基本培養(yǎng)基成分為：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；另外，培養(yǎng)基加入葡萄糖1g/l，酵母粉0.1g/l，硫粉1g/l，硫酸亞鐵4.47g/l；此外，在培養(yǎng)基中加入-20目的鎘污染土樣(鎘含量范圍為21mg/kg)進行適應性培養(yǎng)，以5wt％為一個濃度梯度，加入土壤含量從10wt％增加至60wt％，；每個濃度梯度連續(xù)培養(yǎng)3代。對復合群落c進行適應性培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為30℃，恒溫培養(yǎng)箱轉速為175rpm，ph值為3.0，每代培養(yǎng)時間為7天，當菌液ph值達到2.0以下，微生物菌體密度達到4×10⁹個/ml時，進行傳代培養(yǎng)，每次接種的微生物濃度為4×10⁷個/ml。

在250ml錐形瓶中加入100ml基本培養(yǎng)基，成分為：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l；ca(no3)2，0.001g/l；葡萄糖1g/l；酵母粉0.1g/l；硫粉1g/l和硫酸亞鐵4.47g/l；此外，在此體系中加入60wt％的粒徑小于20目鎘含量為21mg/kg的鎘污染土壤(即之前進行馴化和適應性培養(yǎng)用的鎘污染土樣)；將馴化后的復合群落a和復合群落b、未適應性培養(yǎng)的復合群落c(馴化后的復合群落a+b)以及本發(fā)明適應性培養(yǎng)(進行了馴化和適應性培養(yǎng))得到的復合菌劑分別加入到錐形瓶中，在初始加入的微生物濃度為4×10⁷個/ml，恒溫培養(yǎng)箱轉速為175rpm，溫度為30℃條件下進行比較試驗。

如圖1所示，在以5wt％鎘污染土樣為濃度梯度，在每個梯度進行7天的適應性培養(yǎng)的體系下，隨著土壤含量的增加，鎘的去除率雖然逐漸降低，但在60wt％濃度下，鎘的去除率仍達到60.3％；然而，如圖2所示，與利用本發(fā)明適應性培養(yǎng)得到的復合菌劑治理鎘污染土樣的結果相比，利用未適應性培養(yǎng)的復合群落c(復合群落a+b)、馴化后的復合群落a和復合群落b治理污染土壤的鎘去除率僅為13.2％、5.3％和8.6％。