發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及降解和失活生物異源物質(zhì)(xenobiotics)，優(yōu)選抗生素的方法，所述生物異源物質(zhì)存在于水性介質(zhì)(aqueousmedium)中。更具體地，本發(fā)明涉及固定化在固體支持物上以降解和失活存在于水中的抗生素的酶。

本發(fā)明還涉及固體支持物，在其上固定化了能夠降解和滅活存在于水性介質(zhì)中的抗生素的酶。

發(fā)明背景

美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)的us2013/0236944a1涉及通過(guò)使用酶如漆酶，脂肪酶，纖維素酶，酮還原酶，β-內(nèi)酰胺酶和/或紅霉素酯酶來(lái)使環(huán)境中的抗生素失活的方法。所公開(kāi)的組合物具有凈化污染的環(huán)境的目的，并且在它們到達(dá)環(huán)境之前，防止來(lái)自廢物和廢水流出物(wastewatereffluent)的抗生素對(duì)環(huán)境的污染。本公開(kāi)的漆酶來(lái)自于變色栓菌(trametesversicolor)(或采絨革蓋菌(coriolusversicolor))。本公開(kāi)的脂肪酶來(lái)自無(wú)色桿菌屬的種(achromobacterspp)。本公開(kāi)的纖維素來(lái)自里氏木霉(trichodremareesei)。本公開(kāi)的漆酶靶向的抗生素選自環(huán)化素家族(四環(huán)素，土霉素(otc)和金霉素))或β-內(nèi)酰胺類家族，青霉素(阿莫西林)，頭孢菌素(頭孢地尼(cefdinir))和/或碳青霉烯(亞胺培南)。本公開(kāi)的脂肪酶靶向的抗生素選自大環(huán)內(nèi)酯家族(紅霉素)或β-內(nèi)酰胺家族(阿莫西林)。本公開(kāi)的酮還原酶靶向的抗生素選自β-內(nèi)酰胺家族(阿莫西林或亞胺培南)。β-內(nèi)酰胺酶靶向的抗生素選自β-內(nèi)酰胺家族(青霉素，頭孢菌素(cephalosporin)，頭霉素(cephamycin)或碳青霉烯)。本公開(kāi)的紅霉素-酯酶靶向的抗生素選自大環(huán)內(nèi)酯家族(紅霉素或克拉霉素)。本公開(kāi)進(jìn)一步提供了固體支持物，其包含固定化在其上的至少一種抗生素失活酶。固體支持物可以包括吸附材料。固體支持物可以是通過(guò)共價(jià)連接固定酶的膜。酶也可以通過(guò)凝膠捕獲(gelentrapment)來(lái)固定。固體支持物可以包裝在柱中或用于填充床反應(yīng)器中，待處理的環(huán)境的或廢水流經(jīng)反應(yīng)器并與固定化酶接觸。固體支持物還可以與其它固體支持物偶聯(lián)以增強(qiáng)失活過(guò)程。

使用固體支持物的優(yōu)點(diǎn)是公知的。待處理的抗生素與酶之間的接觸面積增加，因此有利于酶反應(yīng)的速率和產(chǎn)率。此外，已知固體支持物相對(duì)地耐高壓和高溫。

然而，上述公開(kāi)的設(shè)定，即在柱中的包裝或在填充床反應(yīng)器中的使用將導(dǎo)致困難，諸如與通過(guò)反應(yīng)器的流體的“栓塞(plug)”的反向混合(backmixing)導(dǎo)致各種問(wèn)題，諸如在整個(gè)載體表面上難以獲得負(fù)載(即待處理的水)的均勻分布的困難。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及用固定化在固體支持物上的酶降解和失活抗生素，諸如在水性介質(zhì)中存在的β-內(nèi)酰胺抗生素和/或磺酰胺抗生素的技術(shù)問(wèn)題。這種技術(shù)問(wèn)題的解決方案尋找促進(jìn)已知工藝和/或防止明顯由固體支持物引起的一些固有問(wèn)題的的方法。

本發(fā)明在主要方面涉及降解和失活至少一種生物異源物質(zhì)的方法，所述至少一種生物異源物質(zhì)存在于水性介質(zhì)中。所述方法包括以下步驟：

a.將至少一種酶移植到固體支持物上，

b.將具有所述至少一種酶的所述固體支持物溫育到所述水性介質(zhì)中，并且

c.測(cè)量所述至少一種生物異源物質(zhì)的濃度的演變。

所述方法的值得注意的之處在于所述至少一種酶是new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1(new-dehlimetallo-β-lactamase1)，從糙皮側(cè)耳菌(pleurotusostreatus)提取的漆酶和/或從銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)提取的β-內(nèi)酰胺酶，并且在于所述固體支持物是移動(dòng)床載體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述移動(dòng)床載體在高密度聚乙烯中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述移動(dòng)床載體是kaldnes生物芯片。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述移動(dòng)床載體在至少一種酶的所述移植之前用至少一種前體活化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在至少一種酶的所述移植之前，用含有反應(yīng)基團(tuán)(reactivegroup)，諸如環(huán)氧基(epoxy)或醌基的層的沉積官能化移動(dòng)床載體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述官能化步驟通過(guò)在大氣壓下通過(guò)冷等離子體沉積(coldplasmadeposition)或通過(guò)涂覆(coating)用所述至少一種前體表面處理所述移動(dòng)床載體進(jìn)行，所述涂覆優(yōu)選為自動(dòng)-聚合過(guò)程。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種前體是聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(polyglycidylmethacrylate)、多巴胺、馬來(lái)酸酐(maleicanhydride)/乙烯基三甲氧基硅烷(vinyltrimethoxysilane)或多巴胺丙烯酰胺(dopamineacrylamide)/乙烯基三甲氧基硅烷(vinyltrimethoxysilane)，優(yōu)選聚甲基丙烯酸縮水甘油酯或多巴胺。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括在將所述至少一種酶移植到所述固體支持物上之后通過(guò)微生物抗粘附層(anti-adhesionlayer)飽和所述固體支持物的步驟。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物抗粘附層包含吐溫20。

在一個(gè)實(shí)施方案中，以純化形式選擇所述至少一種酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟在室溫和攪拌下進(jìn)行，優(yōu)選以30、50、100、200和300rpm，更優(yōu)選以100rpm攪拌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)量所述至少一種生物異源物質(zhì)濃度的演變的步驟通過(guò)uv吸光度測(cè)量或通過(guò)液相色譜(liquidchromatography)/串聯(lián)質(zhì)譜法(tandemmassspectrometry)進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種生物異源物質(zhì)是至少一種抗生素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種抗生素是選自β-內(nèi)酰胺抗生素的類別或選自磺酰胺(sulfonamide)抗生素類別的抗生素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗生素是阿莫西林(amoxicillin)或磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole)。

本發(fā)明在其主要方面還涉及固體支持物，其包含至少一種適于降解和失活至少一種生物異源物質(zhì)的酶，所述至少一種生物異源物質(zhì)存在于水性介質(zhì)中。所述固體支持物的值得注意之處在于所述至少一種酶是new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1，從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶和/或從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶，并且在于所述固體支持物是移動(dòng)床載體。

本發(fā)明在第一輔助方面進(jìn)一步涉及降解和失活至少一種生物異源物質(zhì)的方法，所述至少一種生物異源物質(zhì)存在于水性介質(zhì)中。所述方法包括以下步驟：

a.將從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶溫育到所述水性介質(zhì)中，并且

b.測(cè)量所述至少一種生物異源物質(zhì)的濃度的演變。

所述方法的值得注意之處在于從糙皮側(cè)耳菌提取的所述漆酶以其純的形式使用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟在室溫和攪拌下進(jìn)行，優(yōu)選以30、50、100、200和300rpm，更優(yōu)選以100rpm攪拌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)量所述至少一種生物異源物質(zhì)濃度的演變的步驟通過(guò)uv吸光度測(cè)量或通過(guò)液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種生物異源物質(zhì)是至少一種抗生素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種抗生素是選自磺酰胺抗生素類別的抗生素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗生素是磺胺甲惡唑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，從糙皮側(cè)耳菌提取的所述漆酶固定化在固體支持物上，優(yōu)選固定化在移動(dòng)床載體上。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述移動(dòng)床載體在高密度聚乙烯中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述移動(dòng)床載體是kaldnes生物芯片。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在從糙皮側(cè)耳菌提取的所述漆酶的所述移植之前，用含有反應(yīng)基團(tuán)，諸如環(huán)氧基或醌基的層的沉積官能化所述移動(dòng)床載體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述官能化步驟通過(guò)在大氣壓下通過(guò)冷等離子體沉積或通過(guò)涂覆用所述至少一種前體表面處理所述移動(dòng)床載體進(jìn)行，所述涂覆優(yōu)選為自動(dòng)-聚合過(guò)程。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種前體是聚甲基丙烯酸縮水甘油酯、多巴胺、馬來(lái)酸酐/乙烯基三甲氧基硅烷或多巴胺丙烯酰胺/乙烯基三甲氧基硅烷，優(yōu)選聚甲基丙烯酸縮水甘油酯或多巴胺。

在一個(gè)實(shí)施方案中，從糙皮側(cè)耳菌提取的所述漆酶的所述固定化還包括在從糙皮側(cè)耳菌提取的所述漆酶固定化到所述所述固體支持物上之后通過(guò)微生物抗粘附層飽和所述固體支持物的步驟。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物抗粘附層包含吐溫20。

本發(fā)明在第二輔助方面進(jìn)一步涉及降解和失活至少一種抗生素的方法，所述至少一種抗生素存在于水性介質(zhì)中。所述方法包括以下步驟：

a.將new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1溫育到所述水性介質(zhì)中，并且

b.測(cè)量所述至少一種抗生素的濃度的演變。

所述方法的值得注意之處在于所述至少一種抗生素是選自β-內(nèi)酰胺，多肽，lincosanide，四環(huán)素，磺酰胺和/或大環(huán)內(nèi)酯類別的一種抗生素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1由bl212d3型的細(xì)菌大腸桿菌(escherichiacoli)產(chǎn)生。

在一個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)用質(zhì)粒，優(yōu)選popinf質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了所述bl212d3型的細(xì)菌大腸桿菌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述popinf質(zhì)粒包含編碼肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumonia)的new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1的基因。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選自β-內(nèi)酰胺類別的所述抗生素選自青霉素和carbapanem，優(yōu)選阿莫西林和/或亞胺培南。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選自多肽類中的所述抗生素是桿菌肽(bacitracin)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所選擇的linconsanide類中的所述抗生素是林可霉素(lincomycin)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選自四環(huán)素類的所述抗生素是土霉素(oxytetracycline)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選自磺酰胺類中的所述抗生素是磺胺甲惡唑和/或甲氧芐啶(trimethoprime)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選自大環(huán)內(nèi)酯類之中的所述抗生素是泰樂(lè)菌素(tylosine)和/或紅霉素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種抗生素的濃度為100μg.ml^-1。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述new-dehli金屬β-內(nèi)酰胺酶1在所述水性介質(zhì)中的濃度為300μg.ml^-1。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟在室溫和攪拌下進(jìn)行，優(yōu)選以30、50、100、200和300rpm，更優(yōu)選以100rpm攪拌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溫育步驟在1小時(shí)期間進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水性介質(zhì)包含去離子水。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水性介質(zhì)還包含濃度為12.5mm的作為緩沖劑的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid)(hepes)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)量所述至少一種生物異源物質(zhì)濃度的演變的步驟通過(guò)uv吸光度測(cè)量或通過(guò)液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行。

本發(fā)明的上述方面的所有特征可以組合或彼此替換。

附圖簡(jiǎn)述

在下文中，我們簡(jiǎn)要地描述根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的圖。在實(shí)施方案的詳細(xì)描述中給出進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。該圖的目的是說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)被理解為限制性的。

圖1：通過(guò)用從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶生物官能化(基于pgma的層)的kaldnes生物芯片的掃描電子顯微鏡(sem)獲得的圖像；圖1a，無(wú)吐溫20；圖1b，有吐溫20(5％)，與微生物溶液(構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)和銅綠假單胞菌)接觸196小時(shí)后。

圖2：通過(guò)用從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶生物官能化(多巴胺作為層前體)的kaldnes生物芯片的sem獲得的圖像；圖2a，沒(méi)有吐溫20；圖2b，有吐溫20(5％)，與微生物溶液(構(gòu)巢曲霉和銅綠假單胞菌)接觸196小時(shí)后。

圖3：通過(guò)用從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶生物官能化(基于pgma的層)的kaldnes生物芯片的sem獲得的圖像；圖3a，無(wú)吐溫20；圖3b，有吐溫20(5％)，與微生物溶液(構(gòu)巢曲霉和銅綠假單胞菌)接觸196小時(shí)后。

圖4：通過(guò)用從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶生物官能化(多巴胺作為層前體)的kaldnes生物芯片的sem獲得的圖像；圖4a，沒(méi)有吐溫20；圖4b，有吐溫20(5％)，與微生物溶液(構(gòu)巢曲霉和銅綠假單胞菌)接觸196小時(shí)后。

發(fā)明詳述

以下描述本質(zhì)上僅僅是示例性的，并且不旨在以任何方式限制本教導(dǎo)，應(yīng)用或用途。

在固體支持物上固定化酶是有用的，因?yàn)樗鰪?qiáng)了酶的性質(zhì)。例如，可以證明以下優(yōu)點(diǎn)：

1)酶的自溶受到限制或相當(dāng)大地減慢，

2)酶針對(duì)放置支持物的化學(xué)和生物環(huán)境受到保護(hù)，

3)酶的壽命增加，并且

4)酶活性的增加。

最后一個(gè)特征(酶活性的增加)可能是由于以下事實(shí)：首先，由于剛性增加，酶移植到固體支持物上時(shí)更穩(wěn)定，其次，存在有布置為與一個(gè)底物反應(yīng)的多種酶。在固體支持物上，酶處于準(zhǔn)備進(jìn)行酶促反應(yīng)的構(gòu)造，而在大體積中，一些酶可以處于活化狀態(tài)，而另一些酶不是活化的。

new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1(ndm-1)是屬于金屬-β-內(nèi)酰胺酶家族的酶。它由blandm-i基因編碼，該基因從導(dǎo)致醫(yī)院感染中的多抗性問(wèn)題的細(xì)菌中分離。實(shí)際上，這種酶被認(rèn)為是一種碳青霉烯酶。來(lái)自kumarasamyk.k.etal.(lancetinfect.dis.,2010,10,597-602)的研究已經(jīng)顯示，肺炎克雷伯桿菌ndm-1陽(yáng)性菌株或大腸桿菌ndm-1陽(yáng)性菌株對(duì)除了替吉環(huán)素(tigecycline)和粘菌素之外的所有抗生素均具有高度抗性。

銅綠假單胞菌是非常普遍的醫(yī)院細(xì)菌，從該細(xì)菌中提取的β-內(nèi)酰胺酶提供了賦予抗生素抗性的大的一組機(jī)制，如在livermored.m.(antimicrobialresistance,2002,34,634-640)的研究中所顯示。

因此，可以使用上述提到的ndm-1和從銅綠假單胞菌中提取的β-內(nèi)酰胺酶的負(fù)面特征來(lái)降解在水性介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺抗生素。

來(lái)自miglioriel.etal.(journalofhazardousmaterials,2012,215-216,227-232)的研究表明，土霉素(otc)可以通過(guò)粗制的糙皮側(cè)耳菌漆酶生物降解。但是，漆酶以其純化形式，即從真菌中提取的漆酶，在不存在菌絲體的情況下仍然不能降解otc。

因此，本發(fā)明包括將new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1(ndm-1)，從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶和/或從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶固定化在特定的固體支持物上。

上面固定有酶的固體支持物是移動(dòng)床載體(movingbedcarrier)。所述移動(dòng)床載體適于在移動(dòng)床反應(yīng)器中使用。

事實(shí)上，移動(dòng)床反應(yīng)器，意指移動(dòng)床載體諸如如歐洲專利公開(kāi)ep0575314b1所述的kaldnes載體，可以用于降低使用包裝反應(yīng)器(packed-bereactor)固有的堵塞風(fēng)險(xiǎn)。

國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)wo2013/149662a1公開(kāi)了具有kaldnes樣載體形狀并接種有一種或多種微生物菌株的移動(dòng)床生物膜載體。這些載體用于移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器(mbbr)。載體在mbbr中的主要作用是為其表面上的微生物群落(microorganismcommunity)的生長(zhǎng)提供支持物。載體提供了在體積和表面之間的比例方面的最佳解決方案，這可用于載體本身上的微生物的生長(zhǎng)。kaldnes樣載體也由可生物降解的材料制成，例如生物塑料，并且因此是用于培養(yǎng)微生物的碳源。

優(yōu)選地，構(gòu)成移動(dòng)床反應(yīng)器的所述載體在高密度聚乙烯，例如kaldnes生物芯片中。

為了比較的目的，上述酶也將錨定在其它固體支持物上，例如304型不銹鋼鏡(type304stainlesssteelmirror)或尼龍聚酰胺膜。

kaldnes載體的形狀類似于盤(dish)，其具有在盤內(nèi)部的三維制格(checkering)和外部上的翅片(fin)。表面積等同于75cm²。

304型不銹鋼鏡的表面積等同于3.14cm²。

尼龍聚酰胺膜的表面積等同于2.25cm²。

固體支持物的官能化

kaldnes載體通過(guò)抗性共價(jià)鍵用酶生物活化。在酶固定化之前，kaldnes載體的表面被官能化。

kaldnes載體的表面處理可以通過(guò)在大氣壓下通過(guò)冷等離子體沉積法沉積官能化的層來(lái)進(jìn)行，例如使用甲基丙烯酸縮水甘油酯生成環(huán)氧基官能化的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(pgma)層。

kaldnes載體的表面處理也可以通過(guò)涂覆進(jìn)行，優(yōu)選通過(guò)自動(dòng)-聚合過(guò)程，更優(yōu)選地通過(guò)多巴胺的自動(dòng)聚合。例如，自動(dòng)聚合方法可以通過(guò)在攪拌(150rpm)下將kaldnes載體浸入包含鹽酸多巴胺(2mg.ml^-1)和三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸-tris-hcl(10mm)的溶液(ph＝8.5)進(jìn)行。攪拌4小時(shí)后，將載體用水沖洗5次，干燥并在4℃下儲(chǔ)存。所得到的官能化表面呈現(xiàn)反應(yīng)性的醌基團(tuán)。

活化載體的生物官能化

這些活性表面隨后可以與酶(ndm-1，從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶，和/或從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶)生物綴合。

酶通過(guò)與官能團(tuán)反應(yīng)的共價(jià)結(jié)合而錨定。這確保酶對(duì)表面的牢固錨定。也可能涉及酶和表面之間的較弱的相互作用(非共價(jià)結(jié)合)。

為了進(jìn)行固定化過(guò)程，將酶溶解在緩沖溶液中。緩沖溶液為磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，并加入終濃度為1mg.ml^-1的酶，然后將官能化的kaldnes載體加入到該溫育溶液中，并在1小時(shí)期間以100rpm攪拌后實(shí)現(xiàn)官能化(即，形成肽鍵)。然后將固體支持物用pbs漂洗5次并干燥。

通過(guò)使用多巴胺作為層前體，只有用kaldnes載體才可能通過(guò)酶生物官能化固體支持物。沒(méi)有成功地將酶移植到304型不銹鋼鏡子上，盡管那些表面已經(jīng)用多巴胺官能化。

必須注意，載體可以用幾種不同的酶進(jìn)行生物官能化，例如用從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶和用從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶。

用吐溫20飽和載體

生物活化的kaldnes載體進(jìn)一步用微生物抗粘附層飽和。微生物抗粘附層包含吐溫20，并具有限制微生物在生物活化的kaldnes載體表面上粘附的功能。

該飽和步驟的目的是保護(hù)酶免受微生物的不期望的代謝。該飽和步驟的目的還是保護(hù)酶免受微生物積聚引起的抑制/中和。

蛋白質(zhì)的定量和分布

通過(guò)比色測(cè)定法對(duì)生物活化的kaldnes載體進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。比色測(cè)定法是可從bio-rad獲得的rcdc^tm(還原劑和去垢劑相容(reducingagentanddetergentcompatible))蛋白質(zhì)測(cè)定法。該測(cè)定法通過(guò)在含有溶解的酶的溫育溶液上反向滴定(backtitration)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

還進(jìn)行了生物活化的kaldnes載體上酶的分布的測(cè)定。測(cè)試是lavapurple^tm測(cè)試，其是深紫色總蛋白質(zhì)染色，使用具有epicocconone的酶的可逆熒光染色過(guò)程進(jìn)行，并且可從gehealthcarelifesciences獲得。在這種情況下，這種lavapurple^tm測(cè)試用于通過(guò)染色固定化酶來(lái)定位生物芯片的表面。

還使用lavapurple^tm測(cè)試來(lái)確定生物官能化載體對(duì)水層流的阻力。

酶活性的測(cè)量

一旦已經(jīng)根據(jù)上述方案激活kaldnes載體，測(cè)量酶活性。已經(jīng)測(cè)試了存在于水性介質(zhì)中的兩種抗生素。已將選自β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗生素，即阿莫西林和選自磺胺類抗生素的抗生素，即磺胺甲惡唑用于確定生物活化的kaldnes載體的潛力。

在注射器過(guò)濾器單元(一次性孔徑為0.22μm)上預(yù)先過(guò)濾的自來(lái)水樣品，且具有hepes(12.5mm)，和濃度為100μg/ml的抗生素。

為了比較的目的，將測(cè)試用游離酶降解抗生素。準(zhǔn)備在注射器過(guò)濾器單元(一次性孔徑為0.22μm)上預(yù)先過(guò)濾的自來(lái)水樣品，具有hepes(12.5mm)，和濃度為100μg.ml^-1的抗生素。

實(shí)現(xiàn)uv吸光度測(cè)量以確定抗生素濃度的演變。阿莫西林是在210nm吸收的化合物，并且磺胺甲惡唑是在260nm吸收的化合物。每24小時(shí)測(cè)定吸光度，并因此測(cè)定濃度。

結(jié)果

下表鑒定了關(guān)于抗生素降解的不同實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

表i：當(dāng)利用從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶(基于pgma的層)時(shí)，降解的阿莫西林的量。

對(duì)于kaldnes生物芯片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次，并且對(duì)于鋼鏡重復(fù)9次。降解的阿莫西林的量對(duì)應(yīng)于在整個(gè)活性持續(xù)時(shí)間整合的降解的阿莫西林的總量。

表i清楚地表明，當(dāng)從銅綠假單胞菌提取的酶β-內(nèi)酰胺酶通過(guò)在大氣壓下通過(guò)冷等離子體涂覆應(yīng)用到固體支持物上的基于pgma的層錨定時(shí)，固定化酶的量在kaldnes載體上比另一種支持物(即304型不銹鋼鏡)上更重要約10倍。

當(dāng)酶固定在kaldnes載體上時(shí)，降解的抗生素的量也顯著增加。

實(shí)際上，通過(guò)使用kaldnes支持物，已經(jīng)降解了比在酶以其游離形式使用時(shí)高12倍的阿莫西林的濃度(參見(jiàn)條目3和4)。相比之下，相對(duì)于使用游離酶，使用鋼支持物并沒(méi)有改善抗生素的降解過(guò)程(條目1和2)。

已經(jīng)研究的游離酶的量對(duì)應(yīng)于已經(jīng)固定在固體支持物上的酶量，并且在固體支持物的生物官能化期間通過(guò)反向滴定溫育溶液來(lái)測(cè)定。

這表明kaldnes載體增強(qiáng)阿莫西林的酶促降解的功效。

吐溫20與kaldnes載體上的β-內(nèi)酰胺酶一起的存在具有增加生物活化的固體支持物的活性時(shí)間的效果。

表ii：當(dāng)利用從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶(基于pgma的層)時(shí)降解的磺胺甲惡唑的量。

對(duì)于kaldnes生物芯片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次，并且對(duì)于鋼鏡重復(fù)9次。降解的磺胺甲惡唑的量對(duì)應(yīng)于在整個(gè)活性持續(xù)時(shí)間整合的降解的磺胺甲惡唑的總量。

表ii清楚地表明，當(dāng)從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶通過(guò)在大氣壓下通過(guò)冷等離子體涂覆應(yīng)用到固體支持物上的基于pgma的層錨定時(shí)，固定化酶的量在kaldnes載體上比另一種支持物(即304型不銹鋼鏡)上更重要約150倍。在將酶在kaldnes載體上固定haunted時(shí)，降解的抗生素的量也顯著增加。

使用漆酶，固定化是增強(qiáng)酶活性的重要參數(shù)。實(shí)際上，酶以其游離形式使用時(shí)，不會(huì)給出降解的抗生素的高水平。

吐溫20與kaldnes載體上的漆酶一起的存在具有增加生物活化的固體支持物的活性時(shí)間的效果。

表iii：使用從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶(多巴胺作為層前體)時(shí)降解的阿莫西林的量。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次。降解的阿莫西林的量對(duì)應(yīng)于在整個(gè)活性持續(xù)時(shí)間整合的降解的阿莫西林的總量。

表iii清楚地表明，阿莫西林的降解在β-內(nèi)酰胺酶固定化在kaldnes載體上時(shí)比在β-內(nèi)酰胺酶以其游離形式使用時(shí)更有效約8至9倍。

微生物抗粘附層的存在也增強(qiáng)了由固定化酶進(jìn)行的降解反應(yīng)。

表iv：當(dāng)使用從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶(多巴胺作為層前體)時(shí)降解的磺胺甲惡唑的量。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次。降解的磺胺甲惡唑的量對(duì)應(yīng)于在整個(gè)活性持續(xù)時(shí)間整合的降解的磺胺甲惡唑的總量。

與使用β-內(nèi)酰胺酶獲得的結(jié)果類似，表iv清楚地表明，阿莫西林的降解在漆酶固定化在kaldnes載體上時(shí)比在漆酶以其游離形式使用更有效約8至9倍。

微生物抗粘附層的存在也增強(qiáng)了由固定化酶進(jìn)行的降解反應(yīng)。

表v：使用固定在kaldnes生物芯片上的new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1(ndm-1)時(shí)降解的阿莫西林的量。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次。降解的阿莫西林的量對(duì)應(yīng)于在整個(gè)活性持續(xù)時(shí)間整合的降解的阿莫西林的總量。

表v指示將ndm-1固定在kaldnes載體上時(shí)獲得的結(jié)果。當(dāng)固定化ndm-1時(shí)，降解的阿莫西林的量比以當(dāng)該酶以其游離形式使用時(shí)重要約8倍。

進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ndm-1酶的令人感興趣的特征。事實(shí)上，不僅可以降解阿莫西林(β-內(nèi)酰胺抗生素)，而且還可降解幾種其他的屬于其他抗生素家族的抗生素。

為了證明ndm-1酶的這些新性質(zhì)，已經(jīng)用含有編碼肺炎克雷伯氏菌ndm-1的基因的popinf質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了bl212d3型的細(xì)菌大腸桿菌。蛋白質(zhì)的產(chǎn)生如greenv.l.etal.(actacrystallogr.2011,f67,1160-1164)所述進(jìn)行，具有很少修改：用弗氏壓碎器(frenchpress)進(jìn)行細(xì)胞裂解之前加入另外的冷凍步驟。僅使用histrapff柱(gehealthcare)進(jìn)行ndm-1分離和純化。在ultra-4離心過(guò)濾單位3000mwl(1000xg，15分鐘)中洗滌三次，允許去除過(guò)量的咪唑。然后將酶重新懸浮于pbs中。

使用在含有去離子水和hepes12.5mm的水性介質(zhì)中的濃度300μg.ml^-1的游離的ndm-1酶已經(jīng)進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。以100μg.ml^-1(終體積：1ml)的終濃度加入抗生素。在1小時(shí)期間在室溫下以100rpm攪拌進(jìn)行降解測(cè)定。實(shí)現(xiàn)uv吸收測(cè)量以確定培養(yǎng)基中抗生素濃度的演變。

表vi：ndm-1酶降解抗生素列表。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

結(jié)果表明，ndm-1能夠降解屬于6個(gè)不同家族的9種抗生素。不僅可以降解β-內(nèi)酰胺(條目1和2)，而且還可以降解多肽、lincosanide、四環(huán)素、磺酰胺和大環(huán)內(nèi)酯抗生素。

根據(jù)與上面解釋的相同的方案，kaldnes載體可以進(jìn)一步由幾種酶官能化。當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶和漆酶兩種同時(shí)使用時(shí)研究的抗生素是阿莫西林。

表vii：當(dāng)使用從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶(lact.)和從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶(lacc.)兩種(基于pgma的層)時(shí)降解的阿莫西林的量。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表viii:當(dāng)使用從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶(lact.)和從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶(lacc.)兩種(多巴胺作為層前體)時(shí)降解的阿莫西林的量。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

具有底物限制條件的結(jié)果

在前面表格中呈現(xiàn)的結(jié)果關(guān)注的是在100μg.·ml^-1濃度的水性介質(zhì)中抗生素降解的結(jié)果。該濃度比在屬于天然環(huán)境的水性介質(zhì)中可以發(fā)現(xiàn)的濃度高1000倍。

實(shí)際上，本發(fā)明的kaldnes載體設(shè)計(jì)為有效地處理水性介質(zhì)，其顯著地是工業(yè)廢水(industrialwastewater)、再循環(huán)工藝用水(recycledprocesswater)、藥用植物廢水(pharmaceuticalplantwastewater)、城市廢水(municipalwastewater)、衛(wèi)生設(shè)備廢水(sanitarywastewater)、污水(sewage)、污泥(sludge)、農(nóng)場(chǎng)廢水(farmwastewater)、動(dòng)物農(nóng)場(chǎng)廢水(animalfarmwastewater)、養(yǎng)魚場(chǎng)廢水(fishfarmwastewater)、農(nóng)業(yè)場(chǎng)所廢水(agriculturalsitewastewater)、醫(yī)院廢水(hospitalwastewater)、醫(yī)療中心廢水(medicalcenterwastewater)、療養(yǎng)院廢水(nursinghomewastewater)、城市污水(urbanwastewater)、合并廢水(collectivewastewater)、廢水處理廠流出物(wastewatertreatmentplanteffluent)或農(nóng)用肥料(agriculturalmanure)。

因此，在含有濃度為100ng.ml^-1(即比先前實(shí)驗(yàn)中少1000倍的抗生素)的介質(zhì)中測(cè)試用一種或多種酶生物官能化的kaldnes載體。

已知酶促反應(yīng)受到最小濃度的限制，低于所述最小濃度，酶和底物之間相互作用的概率為零。低于最小濃度的濃度不能由系統(tǒng)處理。然而，如果酶的量在介質(zhì)中增加，例如通過(guò)增加生物活化生物芯片或載體的數(shù)量，則可以處理僅含有弱劑量抗生素(即100ng·ml^-1)的介質(zhì)。

通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc/ms-ms)實(shí)現(xiàn)了在該弱劑量下抗生素濃度的檢測(cè)。

表ix：當(dāng)使用弱濃度的抗生素時(shí)，降解的抗生素(ab)的量(層前體：多巴胺；固體支持物：kaldnes生物芯片)

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

這些上述結(jié)果表明，當(dāng)幾個(gè)生物活化的kaldnes載體一起使用時(shí)(例如，總共7個(gè)生物芯片)，整個(gè)系統(tǒng)能夠降解弱劑量的抗生素。

測(cè)試在室溫下在1小時(shí)期間以100rpm的攪拌進(jìn)行。

使用β-內(nèi)酰胺酶時(shí)研究的抗生素是阿莫西林。

當(dāng)使用漆酶時(shí)研究的抗生素是磺胺甲惡唑。

當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶和漆酶同時(shí)使用時(shí)研究的抗生素是阿莫西林。

吐溫20的作用

使用生物活化的kaldnes生物芯片進(jìn)一步詳細(xì)地研究了吐溫20(聚山梨醇20)存在的影響。

制備包含真菌構(gòu)巢曲霉和細(xì)菌銅綠假單胞菌的溶液。將生物培養(yǎng)物離心并洗滌兩次至pbs中。除去上清液，并且將團(tuán)粒懸浮于pbs中。將懸浮的團(tuán)粒與生物活化的kaldnes生物芯片溫育以測(cè)試微生物對(duì)這些生物活化的kaldnes生物芯片的粘附。在不攪動(dòng)的情況下進(jìn)行溫育以有利于粘附，并在196小時(shí)期間進(jìn)行。

通過(guò)掃描電子顯微術(shù)(sem)分析檢查粘附性。

一方面，圖1(用從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶生物官能化的kaldnes生物芯片)和3(用從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶生物官能化的kaldnes生物芯片)表明當(dāng)使用基于pgma的層來(lái)官能化kaldnes生物芯片時(shí)，用吐溫20的表面飽和對(duì)防止構(gòu)巢曲霉粘附是必要的。有或沒(méi)有吐溫20的表面飽和時(shí)，沒(méi)有觀察到細(xì)菌銅綠假單胞菌的粘附。

另一方面，圖2(從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶)和4(從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶)表明當(dāng)使用多巴胺作為層前體官能化kaldnes生物芯片時(shí)，用吐溫20飽和表面對(duì)防止真菌構(gòu)巢曲霉在表面上的粘附是需要的。有或沒(méi)有吐溫20的表面飽和時(shí)，沒(méi)有觀察到細(xì)菌銅綠假單胞菌的粘附。

使用用pgma或自動(dòng)聚合的多巴胺官能化的304型不銹鋼鏡的固體支持物獲得類似的結(jié)果。也在不攪動(dòng)的情況下進(jìn)行溫育以有利于粘附，并在96小時(shí)期間進(jìn)行。

對(duì)水通量的阻力

固體支持物(kaldnes載體或304型不銹鋼鏡)已經(jīng)對(duì)水層流測(cè)試。流速為30km.h^-1。將lavapurple^tm測(cè)試用于在一定時(shí)間后定位固體支持物的表面。

對(duì)載體進(jìn)行抗生素降解試驗(yàn)，以測(cè)量層流測(cè)試后的活性。

對(duì)于用pgma官能化的支持物，測(cè)試在10天后進(jìn)行。

對(duì)于用多巴胺官能化的支持物，測(cè)試在6天后進(jìn)行

在所有情況下，已經(jīng)觀察到已經(jīng)保留了生物芯片的活性。

kaldnes載體的存儲(chǔ)

干燥后的生物官能化kaldnes載體已經(jīng)在4℃的冰箱中保存。對(duì)載體進(jìn)行抗生素降解測(cè)試以測(cè)量活性。

表x：在4℃下用pgma官能化的kaldnes載體保存的長(zhǎng)度。

表xi：在4℃下用多巴胺官能化的kaldnes載體保存的長(zhǎng)度

在這兩種情況下(表x和xi)，已經(jīng)觀察到用酶生物官能化的kaldnes載體保留了用于抗生素降解反應(yīng)的酶活性。

評(píng)估由降解產(chǎn)生的產(chǎn)物的毒性

通過(guò)生態(tài)毒性測(cè)試來(lái)估計(jì)生成的次級(jí)代謝物的毒性，以證明該方法降解和失活抗生素的能力。

為此，在通過(guò)在pgma和dopa官能化的kaldnes上固定化的酶代謝之前(t0)和之后在30分鐘，1小時(shí)和24小時(shí)接觸后，對(duì)降解介質(zhì)進(jìn)行測(cè)試。

通過(guò)進(jìn)行以下測(cè)試來(lái)估計(jì)上清液的毒性：

-對(duì)微藻的急性毒性測(cè)試羊角月牙藻(selenastrumcapricornutut)根據(jù)iso8692：2012水質(zhì)-對(duì)淡水藻類和單細(xì)胞綠藻的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)。

-水蚤(daphnia)急性毒性測(cè)試根據(jù)iso6341：2012水質(zhì)-daphniamagnastraus(枝角目(cladocera)，甲殼綱(crustacea))的移動(dòng)性的抑制測(cè)定-急性毒性測(cè)定。

-對(duì)細(xì)菌的非特異性毒性測(cè)試：發(fā)光細(xì)菌法(microtox)根據(jù)eniso11348-3水質(zhì)-水樣品對(duì)費(fèi)希爾氏弧菌(vibriofischeri)發(fā)光的抑制作用的測(cè)定(發(fā)光細(xì)菌測(cè)試(luminescentbacteriatest))。

-對(duì)大鼠肝瘤細(xì)胞系h4iie.luc的細(xì)胞毒性測(cè)試：細(xì)胞活力測(cè)定

使用可以由先前引用的標(biāo)準(zhǔn)提供和限定的最大體積的測(cè)試溶液進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表示為藻類和水蚤測(cè)試的生長(zhǎng)抑制的百分比，為microtox測(cè)試的光發(fā)射抑制百分比和細(xì)胞毒性測(cè)試的細(xì)胞活力抑制百分比。

表xii：通過(guò)從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶降解的阿莫西林的降解期間毒性的演變。

表xiii：通過(guò)從銅綠假單胞菌提取的β-內(nèi)酰胺酶和通過(guò)從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶降解的阿莫西林的降解期間毒性的演變。

表xiv：通過(guò)new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1(ndm-1)降解的阿莫西林的降解期間毒性的演變。

表xv:通過(guò)new-dehli金屬-β-內(nèi)酰胺酶1(ndm-1)和通過(guò)從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶降解的阿莫西林的降解期間毒性的演變。

表xvi:通過(guò)從糙皮側(cè)耳菌提取的漆酶降解的磺胺甲惡唑的降解期間毒性的演變。

結(jié)果(表xii至xvi)表明，在所有情況下，并且對(duì)于所有測(cè)試，抗生素降解后的毒性降低，這表明生成的代謝物不會(huì)產(chǎn)生比親本化合物更高的毒性和/或細(xì)胞毒性。

已經(jīng)參考實(shí)施本發(fā)明的最佳方式描述了本發(fā)明。顯然，在閱讀和理解本說(shuō)明書時(shí)，他人會(huì)想到修改和改變。旨在包括所有這些修改和改變，只要它們?cè)谒綑?quán)利要求書或其等同物的范圍內(nèi)。

在任何情況下，上述實(shí)施方案不應(yīng)以限制性的意義理解。特別地，上述實(shí)施方案的特征也可以彼此替換或組合。