專利名稱：黃黃色桿菌dt8及其在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)醚類化合物降解桿菌及其應(yīng)用，特別涉及一種黃黃色桿菌DT8 及其在微生物降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)醚類化合物是工業(yè)上應(yīng)用極其廣泛的有機溶劑，包括四氫呋喃(THF)、二噁烷、 三噁烷等。環(huán)醚類化合物可通過呼吸道、消化道、皮膚侵入機體，低濃度時對皮膚和粘膜有刺激作用；高濃度時有麻醉作用、肝臟毒性和致死作用；長期的毒性試驗表明環(huán)醚類化合物對動物還有較強的致癌性。近年來，環(huán)醚類物質(zhì)尤其是THF和二噁烷的消費量逐年增加， 環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)重。目前多個發(fā)達(dá)國家如美國、日本、加拿大等已在地下水井及大氣中檢測到THF和1，4_ 二噁烷的污染；李海燕等發(fā)現(xiàn)我國某藥廠出廠水和某飲用地表水均存在 THF的污染。因此，由環(huán)醚類物質(zhì)造成環(huán)境污染的治理刻不容緩。環(huán)醚類物質(zhì)是含氧雜環(huán)類物質(zhì)，通過一般的高級氧化如臭氧法難以將其降解。生物法去除環(huán)醚類物質(zhì)的污染得到了國內(nèi)外的一致認(rèn)可。目前篩選到具有降解THF和1，4_二噁燒的菌株有 Rhodococcus ruber 219，放線菌 CB1190、Pseudonocardia sp. ENV478 以及 Cordyceps sinesis等。但是這些菌株的底物廣譜性有待進一步擴展，菌體的擴大培養(yǎng)也較困難。因此，篩選出能夠降解多種環(huán)醚類物質(zhì)的菌株，并進行大規(guī)模培養(yǎng)以應(yīng)用于環(huán)醚類物質(zhì)污染的治理具有極其重要的工程價值和經(jīng)濟價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種由環(huán)境中篩選得到的黃黃色桿菌DT8及其在微生物降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用，并提供了菌體擴培方法和菌劑制備方式，可用于環(huán)境中含環(huán)醚類化合物的廢水及廢氣的治理。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是黃黃色桿菌DT8 (Xanthobacter flavus DT8)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國·武漢·武漢大學(xué)，保藏日期2011年4月四日，保藏編號CCTCC NO =M 2011148。本發(fā)明所述黃黃色桿菌DT8菌株的篩選1)菌種來源上海某醫(yī)藥廠污水站好氧池的活性污泥。2)菌株篩選取自上海某醫(yī)藥廠污水站好氧池的活性污泥，與無機鹽培養(yǎng)基按 1 l(v/v)混合后制成混合培養(yǎng)基置于廣口瓶中，總體積為4L，以1，4_ 二噁烷為底物作為唯一碳源和能源，25°C 35°C馴化培養(yǎng)，并間隔2d加一次底物使得加入后底物濃度達(dá)到 500mg/L(底物投加前取樣檢測殘余底物濃度)，間隔7d更換混合培養(yǎng)基，7 9月后，馴化的污泥每天可穩(wěn)定降解200mg/L 二噁烷，此樣品轉(zhuǎn)接入搖瓶進一步富集，獲得馴化樣品；3)將馴化樣品按10%的接入量接種至50mL無機鹽培養(yǎng)基，以1，4_ 二噁烷為底物，30°C、160r/min搖床上培養(yǎng)24h后檢測殘余底物濃度，待底物降解率達(dá)到80%左右，再
4以10%的接入量轉(zhuǎn)接到含相等濃度的1，4-二噁烷的新鮮無機鹽培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分與馴化培養(yǎng)基相同)中，進行多次傳代富集后，進行稀釋涂布，挑取單菌落，再以1，4_ 二噁烷為底物，進行降解活性測定，分離純化，獲得一株具有1，4- 二噁烷降解活性的菌株DT8，所述 1，4-二噁烷濃度為100mg/L。本發(fā)明所述目的菌株DT8的菌種鑒定1)所述的菌株DT8形態(tài)特征和生理生化特征為光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形狀為桿狀或弧狀，大小為0. 2 0. 5μπιΧ1 2. 5 μ m，有鞭毛，無芽孢，革蘭氏染色陰性，在固體平板培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)4 后，單菌落呈黃色，圓形，不透明，邊緣整齊，易挑起；生理生化試驗結(jié)果為氧化酶和接觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗和檸檬酸鹽試驗陽性；吲哚、甲基紅試驗陰性，淀粉水解酶陰性，明膠試驗陰性。2)所述的菌株DT8的16S rRNA序列分析首先由提取基因組試劑盒提取目的菌株的全基因組，對該菌株的DNA進行 PCR擴增，獲得約1500bp的16S rRNA擴增產(chǎn)物，擴增引物為細(xì)菌保守序列的通用引物 F8 (5 ‘ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 Rl541(5 ‘ -AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3 ‘)。該序列經(jīng)測序后，同GenBank中的基因序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株DT8與黃黃色桿菌 (Xanthobacter flavus)的相似度達(dá) 99%。經(jīng)16S rRNA同源性分析并結(jié)合生理生化特征，將本發(fā)明菌株鑒定為黃黃色桿菌， 命名為黃黃色桿菌 DT8 (Xanthobacter flavus DT8)。本發(fā)明所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用。所述的環(huán)醚類化合物優(yōu)選為四氫呋喃(THF)或1，4_ 二噁烷。本發(fā)明所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用為以含黃黃色桿菌 DT8的菌劑為酶源，以環(huán)醚類化合物為底物，于無機鹽培養(yǎng)基中，在25 35°C，120 160r/ min搖床培養(yǎng)40 80h，使環(huán)醚類化合物降解；所述環(huán)醚類化合物為THF或1，4-二噁烷；所述底物初始濃度為50 1200mg/L ；所述無機鹽培養(yǎng)基終濃度組成為=Na2HPO4 · 12H20 4. 5g/ L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 023g/L，微量元素母液 lmL/L, pH 7. 0，溶劑為水，所述微量元素母液終濃度組成=FeSO4 · 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20
0.02g/L、H3BO3O. 014g/L、MnSO4 ·4Η20 0. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. lOg/L,Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/ L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。進一步，所述含黃黃色桿菌DT8菌的細(xì)胞的菌劑為黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液。進一步，所述含黃黃色桿菌DT8的菌劑為含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑，所述含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑按如下方法制備將黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液于草炭載體和無機鹽培養(yǎng)基中，攪拌混勻后，于25 35°C下固態(tài)發(fā)酵M 48h，30 37°C恒穩(wěn)干燥，干燥后研磨成粉末，獲得含DT8菌的細(xì)胞固態(tài)菌劑；所述草炭載體為草炭與水以質(zhì)量比1 2的混合物；所述黃黃色桿菌DT8的含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液中干菌體濃度為0.77
1.54g/L ；所述含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑中細(xì)胞個數(shù)為0. lXKT-SXK^CFU/g ；所述草炭載體的用量和無機鹽培養(yǎng)基的用量對本發(fā)明沒有影響，本發(fā)明含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑以DT8的細(xì)胞個數(shù)來計量，通常能夠使含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液固態(tài)發(fā)酵即可。上述所述黃黃色桿菌DT8的含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液可按如下步驟制備1)斜面培養(yǎng)將黃黃色桿菌DT8接種至R2A固體培養(yǎng)基，30 32 °C斜面培養(yǎng)40 48h，獲得斜面菌體，所述R2A固體培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉 0. 50g/L、MgSO4 · 7Η200· 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸鈉 0. 30g/ L、KH2PO4O. 45g/L，ρΗ7· 2，溶劑為水；瓊脂15 18g/L ；2)種子培養(yǎng)挑取步驟1)制備的斜面菌體接種至R2A液體培養(yǎng)基，30 37°C培養(yǎng)M 48h，獲得種子液，所述R2A液體培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸鈉 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/L，ρΗ7· 2， 溶劑為水；3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2)制備的種子液以5 10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基， 發(fā)酵罐內(nèi)30 37°C，pH值6. 5 7. 3，溶解氧(DO)維持在2. 0 3. 0，培養(yǎng)40 48h，獲得含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉0. 5g/L，Na2HPO4 · 12H20 4. 5g/L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2O. 023g/L，微量元素母液 lmL/L，溶劑為水，初始pH值為6. 7 7. 2，微量元素母液終濃度組成為=FeSO4 · 7H20 1. Og/ L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/L、MnSO4 · 4H20 0. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、 Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。另外，所述的黃黃色桿菌DT8的含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液還可按如下方法制備a) 斜面培養(yǎng)將黃黃色桿菌DT8接種至R2A固體培養(yǎng)基，30 32°C斜面培養(yǎng)40 48h，獲得斜面菌體，所述R2A固體培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉 0. 50g/L、MgSO4 · 7Η200· 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸鈉 0. 30g/L、 KH2PO4O. 45g/L，瓊脂15 18g/L，ρΗ7· 2，溶劑為水；b)種子培養(yǎng)挑取步驟a)制備的斜面菌體接種至R2A液體培養(yǎng)基，30 37°C培養(yǎng)M 48h，獲得種子液；所述R2A液體培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、MgS04 ·7Η20 0. 05g/L、 胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸鈉 0. 30g/L、KH2P040. 45g/L，pH7. 2，溶劑為水；c) 發(fā)酵培養(yǎng)將步驟b)制備的種子液以5 10%接種量接種至R2A液體培養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基，發(fā)酵罐內(nèi)加入甘油消泡劑，30 37°C，pH值6. 5 7. 5，溶解氧(DO)維持在2. 0 3. 0， 培養(yǎng)40 48h，獲得含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液；所述R2A液體培養(yǎng)基終濃度組成同步驟b)，所述肉湯培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，溶劑為水，pH7. 2 7. 4，所述甘油消泡劑的用量對本發(fā)明沒有影響，通常能夠達(dá)到消泡目的即可。更進一步，本發(fā)明所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用為以含黃黃色桿菌DT8的菌劑為酶源，所述的含黃黃色桿菌DT8的菌劑為含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑，以環(huán)醚類化合物為唯一碳源和能源，在無機鹽培養(yǎng)基中，30 37°C，120 160r/ min搖床培養(yǎng)40 48h，使環(huán)醚類化合物降解；所述含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑中細(xì)胞個數(shù)為1 X 1010CFU/g,所述環(huán)醚類化合物為THF或1，4- 二噁烷，THF或二噁烷的初始濃度優(yōu)選為 50 1200mg/L。本發(fā)明所述黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液可以直接用于環(huán)醚類化合物的降解，取黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液0. 5mL (干細(xì)胞濃度為0. 77 1. 54g/mL)或取固態(tài)菌劑0. 5g(細(xì)胞個數(shù)為101(lCFU/g)接種至含100mg/L 1,4- 二噁烷的無機鹽培養(yǎng)基中，檢測1，4_ 二噁烷的降解情況；其中，含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液在30 40h內(nèi)可將1，4_ 二噁烷完全降解；固態(tài)菌劑在35 50h內(nèi)可完全降解1，4_ 二噁烷。本發(fā)明含黃黃色桿菌DT8的菌劑降解環(huán)醚類化合物的適宜pH值和溫度分別為6. 5 7. 5和30 37°C;通過研究菌劑對不同濃度底物的降解情況，表明1，4_ 二噁烷的降解速率受底物初始濃度高低的影響較小，在降解初期并無明顯延滯期，但是高濃度(1. 2g/ L)底物不能完全降解。底物濃度均為100mg/L時，THF的降解只需^h，而1，4_ 二噁烷則需要48h，可見DT8對不同底物的降解能力不同。本發(fā)明所述干菌體濃度測定方法為取一定量發(fā)酵液，測定OD6tltl值，再將發(fā)酵液離心，沉淀干燥至恒重，測定發(fā)酵液中菌體干重，以O(shè)D6tltl值為橫坐標(biāo)，菌體干重為縱坐標(biāo)，繪制濃度圖，根據(jù)發(fā)酵液中0D_值計算干菌體濃度。本發(fā)明所述含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑采用細(xì)胞個數(shù)CFU/g來表示，其表示方法為取0. 5g固態(tài)菌劑溶于5mL的生理鹽水中，稀釋不同濃度后滴到血球計數(shù)板于顯微鏡下進行菌體計數(shù)，再通過單位換算得到細(xì)胞個數(shù)。本發(fā)明所述的采用R2A液體培養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵期間不需要向發(fā)酵罐中加入其余物質(zhì)，降低染菌概率，且縮短細(xì)胞生長的世代時間，從而在相同時間內(nèi)獲得更多的菌體，該培養(yǎng)基獲得的菌體不影響其對環(huán)醚類化合物的降解活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明黃黃色桿菌DT8菌株易于擴大培養(yǎng)，具有高效降解環(huán)醚類化合物的性能，適用于含環(huán)醚類化合物的廢水或廢氣的生物降解，環(huán)境友好，具有極其重要的工程價值和經(jīng)濟價值。


圖1含黃黃色桿菌DT8菌劑對環(huán)醚類化合物的降解情況圖2含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑制備流程3黃黃色桿菌DT8降解環(huán)醚類化合物的性能圖4pH值對含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑降解環(huán)醚類化合物的影響圖5溫度對含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑降解環(huán)醚類化合物的影響圖6含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑對不同濃度環(huán)醚類化合物降解的性能，A為黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑對不同濃度1，4_ 二噁烷降解的性能，B為黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑對不同濃度THF降解的性能。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此所述無機鹽培養(yǎng)基終濃度組成為=Na2HPO4· 12H20 4. 5g/L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 023g/L，微量元素母液 lmL/L，pH 7. 0，溶劑為水，所述微量元素母液組成=FeSO4 · 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/L、 MnSO4 · 4H200. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。所述R2A液體培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉 0. 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸鈉 0. 30g/L、 KH2PO4O. 45g/L，pH7. 2，溶劑為水。所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉0. 5g/L，Na2HPO4 · 12H204. 5g/L、 KH2PO4L 0g/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2O. 023g/L,微量元素母液 ImL/L，溶劑為水，初始pH值為6. 7 7. 2，微量元素母液終濃度組成為=FeSO4 · 7H20 1. Og/ L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/L、MnSO4 · 4H20 0. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、 Na2MoO4 · 2H200. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。所述肉湯培養(yǎng)基的終濃度組成為酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/L，溶劑為水，pH7. 2 7. 4。所述R2A固體培養(yǎng)基終濃度組成為R2A液體培養(yǎng)基中加入1. 5% 1. 8%的瓊脂。實施例1黃黃色桿菌DT8菌種的篩選及鑒定(1)菌株篩選a、初篩取自上海某醫(yī)藥廠污水站好氧池的活性污泥，與無機鹽培養(yǎng)基按 1 l(v/v)混合后制成混合培養(yǎng)基置于廣口瓶中，以1，4_ 二噁烷為底物作為碳源和能源， 水浴溫度30°C下曝氣馴化培養(yǎng)，并間隔2d加一次底物，底物投加前取樣檢測殘余底物濃度后再加入適量的底物，使得加入后1，4_ 二噁烷濃度達(dá)到500mg/L，間隔7d更換混合培養(yǎng)液， 7 9個月后，馴化的污泥每天可平均降解約200mg/L二噁烷，說明馴化有效果，此樣品轉(zhuǎn)接入搖瓶進一步富集；b、復(fù)篩及分離純化將馴化樣品按10%的接入量接種至50mL無機鹽培養(yǎng)基(與馴化培養(yǎng)基成分相同)中，以100mg/L的1，4_ 二噁烷為唯一碳源和能源，進行目的菌株的篩選，300C、160r/min搖床上培養(yǎng)，隔24h檢測底物殘余濃度，待底物濃度降解率達(dá)80%以上后，再以10%的接種量轉(zhuǎn)接至含100mg/L的1，4-二噁烷的新鮮無機鹽培養(yǎng)基中，以此類推，進行多次傳代富集，進行稀釋涂布，挑取單菌落，再以1，4- 二噁烷為底物，進行降解活性測定，分離純化，獲得一株具有1，4- 二噁烷降解活性的菌株DT8。(2)菌株鑒定a、菌株形態(tài)特征及生理生化特征光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形狀為桿狀或弧狀，大小為0. 2 0. 5 μ mX 1 2. 5 μ m，有
鞭毛，無芽孢，革蘭氏染色陰性，在固體平板培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)4 后，單菌落呈黃色，圓形， 不透明，邊緣整齊，易挑起；部分生理生化試驗結(jié)果為氧化酶和接觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗和檸檬酸鹽試驗陽性；吲哚、甲基紅試驗陰性，淀粉水解酶陰性，明膠試驗陰性，糖發(fā)酵試驗陰性。b、16S rDNA 序列測定首先由提取基因組試劑盒(3S DNA Isolution Kit V2. 2申能博彩生物科技有限公司)提取目的菌株的全基因組，對該菌株的DNA進行PCR擴增，獲得約1500bp的16S rRNA 擴增產(chǎn)物，擴增引物為細(xì)菌保守序列的通用引物F8 (5 ‘ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘) 和R1541 (5 ‘ -AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3 ‘)。該擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后，同GenBank中的基因序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株DT8與黃黃色桿菌(Xanthobacter flavus)的相似度達(dá)99%。經(jīng)16S rDNA同源性分析并結(jié)合生理生化特征，將本發(fā)明菌株鑒定為黃黃色桿菌 (Xanthobacter flavus),命名為黃黃色桿菌(Xanthobacter flavus) DT8。實施例2黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液的制備1)斜面培養(yǎng)將黃黃色桿菌DT8接種至R2A固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)48h，獲得斜面菌體。
2)種子培養(yǎng)挑取步驟1)制備的斜面菌體接種至R2A液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)Mh， 獲得種子液；3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟幻制備的種子液以接種量10%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐內(nèi) 30°C，pH值7. 0，溶解氧(DO)維持在2. 0 3. 0，培養(yǎng)48h，獲得含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液；所述含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液最終測得菌體0D_約達(dá)到2. 0，干菌體濃度達(dá)到0. 77g/L。實施例3黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液的制備1)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)方法同實施例2。2)發(fā)酵培養(yǎng)將制備的種子液以接種量10%接種至3. 5L的R2A液體培養(yǎng)基，發(fā)酵罐內(nèi)加入0. 5g甘油作為消泡劑，300C，pH值7. 0，溶解氧(DO)維持2. 0 3. 0，培養(yǎng)48h，獲得含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液；所述含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液最終測得菌體0D_達(dá)到4. 0，含DT8 菌的細(xì)胞發(fā)酵液干菌體濃度達(dá)到1. 54g/L0實施例4黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液的制備1)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)方法同實施例2。2)發(fā)酵培養(yǎng)將制備的種子液以接種量10%接種至3. 5L的肉湯培養(yǎng)基，發(fā)酵罐內(nèi)加入0. 5g甘油作為消泡劑，300C，pH值7. 0，溶解氧(DO)維持2. 0 3. 0，培養(yǎng)48h，獲得含 DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液；所述含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液最終測得菌體0D_達(dá)到3. 0，含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液干菌體濃度達(dá)到1. 2g/L。實施例5黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液菌劑的制備及活性檢測1)含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液菌劑的制備將實施例3制備方法得到的發(fā)酵液出罐直接用IOL的塑料包裝桶封裝作為液態(tài)菌劑，該液態(tài)菌劑可直接應(yīng)用于含1，4_ 二噁烷污水的治理。取液態(tài)菌劑0. 5mL接種至含100mg/L 1,4- 二噁烷的50mL無機鹽培養(yǎng)基中，間隔4h， 取樣檢測1，4_ 二噁烷的殘余濃度。結(jié)果如圖1液態(tài)菌劑在36h內(nèi)可將1，4_ 二噁烷完全降解。因此，證明液態(tài)菌劑具有較高的降解活性。2)含DT8菌的細(xì)胞固態(tài)菌劑的制備制備過程如圖2所示首先將20g草炭中加入兩倍質(zhì)量的水，混合均勻獲得草炭載體60g，滅過菌備用；將實施例2制備方法得到的發(fā)酵液出罐后，取發(fā)酵液(( _約2. 0，干菌體濃度為0. 77g/L) IOmL加入到滅過菌的含60g草炭載體容器中，再加入IOmL無機鹽培養(yǎng)基作為營養(yǎng)液，攪拌混勻后室溫固體發(fā)酵48h，37°C 恒溫干燥，干燥后研磨成粉末分裝保存，獲得含黃黃色桿菌DT8菌的固態(tài)菌劑，其細(xì)胞個數(shù)穩(wěn)定在1 X 1010CFU/g左右，取固態(tài)菌劑0. 5g接種至含100mg/L 1,4- 二噁烷的50mL無機鹽培養(yǎng)基中，間隔4h，取樣檢測1，4_ 二噁烷的殘余濃度。如圖1所示固態(tài)菌劑在40h內(nèi)可將 1，4_ 二噁烷完全降解。因此，證明固態(tài)菌劑也具有較高的降解活性。實施例6黃黃色桿菌DT8降解不同環(huán)醚類化合物的特性將實施例5方法制備的液態(tài)菌劑(菌體濃度0D_達(dá)2.0)離心富集菌體，用 0. 5mol/L的磷酸緩沖液潤洗兩次制成含DT8菌的細(xì)胞菌懸液，分別接種至以1，4_ 二噁烷和THF為唯一碳源和能源的50mL無機鹽培養(yǎng)基，使含DT8菌的細(xì)胞菌懸液初始菌體濃度 (OD600)為0. 01 (干重4. 4mg/L) ,1,4- 二噁烷和THF底物初始濃度分別為100mg/L,分別放入溫度為30°C、轉(zhuǎn)數(shù)為160r/min的搖床中培養(yǎng)，不定時取樣，觀察底物的降解情況，結(jié)果見圖3。隨著時間的延長，底物濃度逐漸降低至完全降解。相同濃度的底物中THF降解只需 ^h，而1，4_ 二噁烷則需要48h，可見X. flavus DT8對不同底物的降解能力不同。
實施例7pH值對黃黃色桿菌DT8降解環(huán)醚類化合物的影響分別稱取實施案例5方法制備的含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑0. 5g (固態(tài)菌劑細(xì)胞個數(shù)為ι χ 1010CFU/g)，分別溶于不同初始PH的無機鹽培養(yǎng)基中作為降解環(huán)醚類化合物的酶源。用Imol/LNaOH水溶液或lmol/LHCl水溶液調(diào)節(jié)無機鹽培養(yǎng)基為不同pH值(4. 0、 5. 0、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、9. 0、10. 0)，實驗分兩個組(1,4- 二噁烷組和 THF 組)，每個 pH 值設(shè)3個平行，1個空白對照，分別加入1，4_ 二噁烷和THF作為唯一的碳源和能源，底物初始濃度分別為100mg/L的條件下，不接酶源作為空白對照，分別置于30°C、160r/min恒溫?fù)u床里振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)3 后取樣，分別測得反應(yīng)液中殘余1，4- 二噁烷和THF的濃度，結(jié)果見圖4。由圖4可見，在pH4. 0 10. 0，微生物均能降解THF和1，4_ 二噁烷；隨著pH從4. 0 增大到10. 0，底物的降解率均先增大后減小，固態(tài)菌劑降解1，4_ 二噁烷和THF的較適宜的 PH值均為7.0左右。說明固態(tài)菌劑在中性的較寬pH范圍內(nèi)能較好得降解底物，為其在不同 PH環(huán)境的應(yīng)用提供了保證。實施例8溫度對黃黃色桿菌DT8降解環(huán)醚類化合物的影響分別稱取實施案例5方法制備的含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)制劑0. 5g(固態(tài)菌劑細(xì)胞個數(shù)為lX101(lCFU/g)，分別溶于無機鹽培養(yǎng)基中作為降解環(huán)醚類化合物的酶源。將底物分成1，4- 二噁烷和THF兩組，每個溫度設(shè)3個平行，1個空白對照，空白對照不加固態(tài)菌劑， 底物初始濃度均為100mg/L無機鹽培養(yǎng)基。將各個樣品分別置于溫度為25°C、30°C、37°C、 40°C搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)數(shù)均為160r/min)，培養(yǎng)3 后測反應(yīng)液中殘余底物的濃度。由圖5可知，在25°C 40°C溫度范圍內(nèi)，固態(tài)菌劑均能降解1，4-二噁烷和1~冊，且以THF為唯一碳源和能源時其降解速率均大于1，4_ 二噁烷。但是固態(tài)菌劑降解1，4_ 二噁烷的適宜溫度為37°C，而降解THF的適宜溫度為30°C。因此推斷最適溫度在30 37°C之間。實施例9黃黃色桿菌DT8降解不同濃度環(huán)醚類化合物的性能分別稱取實施案例5方法制備的含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑0. 5g(固態(tài)菌劑細(xì)胞個數(shù)為lX101(lCFU/g)，以不同初始濃度的環(huán)醚類化合物為底物，在較適宜的培養(yǎng)條件 (PH7.0，溫度37°C )下，研究以黃黃色桿菌為優(yōu)勢菌株的菌劑對不同底物濃度環(huán)醚類物質(zhì)的降解性能，實驗分為兩個組(1，4_ 二噁烷組和四氫呋喃組)，每個底物濃度設(shè)3個平行， 1個空白對照，空白對照不加固態(tài)菌劑。向無機鹽培養(yǎng)基中加入不同濃度的底物，PH7.0，溫度37°C下反應(yīng)135h，間隔他或1 測反應(yīng)液中底物的濃度，其中1，4_ 二噁烷的底物初始濃度分別為50、100、200、300、400、500、650、850和1200mg/L ；THF的底物初始濃度分別為 50、100、200、500、800、1000和1500mg/L。結(jié)果如圖6所示，由圖A可知，固態(tài)菌劑降解1， 4-二噁烷的降解速率受底物初始濃度的影響較小，可見二噁烷對固態(tài)菌劑的毒性較小，且在高濃度下可將其完全降解礦化。與其略有不同的是固態(tài)菌劑對THF的降解速率顯著高于 1，4_二噁烷(圖B)，但是該菌株不可完全降解高濃度的THF，即降解至一定濃度后不能再將 THF降解。
權(quán)利要求
1.黃黃色桿菌DT8(Xanthobacter flavus DT8)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國 武漢 武漢大學(xué)，保藏日期2011年4月四日，保藏編號CCTCC NO =M 2011148。
2.如權(quán)利要求1所述的黃黃色桿菌DT8，其特征在于所述的黃黃色桿菌DT8為桿狀或弧狀，大小為0. 2 0. 5 μ mX 1 2. 5 μ m，有鞭毛，無芽孢，革蘭氏染色陰性；在固體平板培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)4 后，單菌落呈黃色，圓形，不透明，邊緣整齊，易挑起；氧化酶和接觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗和檸檬酸鹽試驗陽性；吲哚、甲基紅試驗陰性，淀粉水解酶陰性，明膠試驗陰性。
3.如權(quán)利要求1所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用，其特征在于所述的環(huán)醚類化合物為四氫呋喃或1，4_ 二噁烷。
5.如權(quán)利要求3所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以含黃黃色桿菌DT8的菌劑為酶源，以環(huán)醚類化合物為底物，于無機鹽培養(yǎng)基中，在25 35°C，120 160r/min搖床培養(yǎng)40 80h，使環(huán)醚類化合物降解；所述環(huán)醚類化合物為四氫呋喃或1，4_ 二噁烷；所述底物初始濃度為50 1500mg/L ；所述無機鹽培養(yǎng)基終濃度組成為=Na2HPO4 · 12H20 4. 5g/L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/ L、CaCl2 · 2H20 0. 023g/L，微量元素母液lmL/L，pH 7. 0，溶劑為水，所述微量元素母液終濃度組成=FeSO4 · 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/L、MnSO4 · 4H20 0. 10g/L、 ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。
6.如權(quán)利要求5所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用，其特征在于所述含黃黃色桿菌DT8的菌劑為黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液。
7.如權(quán)利要求5所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用，其特征在于所述含黃黃色桿菌DT8的菌劑為含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑，所述含黃黃色桿菌DT8菌的固態(tài)菌劑按如下方法制備將黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液于草炭載體和所述的無機鹽培養(yǎng)基中，攪拌混勻后，于25 35°C下固態(tài)發(fā)酵M 48h，30 37°C恒穩(wěn)干燥，干燥后研磨成粉末，獲得含DT8菌的細(xì)胞固態(tài)菌劑；所述草炭載體為草炭與水以質(zhì)量比1 2 的混合物；所述黃黃色桿菌DT8含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液中干菌體濃度為0. 77 1. 54g/L, 所述含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑中細(xì)胞個數(shù)為0. 1 X 101° 5X 101(lCFU/g。
8.如權(quán)利要求6或7所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用，其特征在于所述的黃黃色桿菌DT8的含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液按如下步驟制備1)斜面培養(yǎng)將黃黃色桿菌DT8接種至R2A固體培養(yǎng)基，30 32°C斜面培養(yǎng)40 48h，獲得斜面菌體；所述R2A固體培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、 MgSO4 ·7Η20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸鈉 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/ L，瓊脂15 18g/L，ρΗ7· 2，溶劑為水；2)種子培養(yǎng)將步驟1)獲得的斜面菌體接種至R2A 液體培養(yǎng)基，30 37°C培養(yǎng)M 48h，獲得種子液；所述R2A液體培養(yǎng)基終濃度組成為 酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸鈉 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/L，ρΗ7· 2，溶劑為水；3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟幻獲得的種子液以5 10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐內(nèi)30 37°C，pH 值6. 5 7. 3，DO值維持2. 0 3. 0，培養(yǎng)40 48h，獲得含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉 0. 5g/L，Na2HPO4 · 12H20 4. 5g/L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgS04 ·7Η20 0. 2g/L、CaCl20. 023g/L,微量元素母液lmL/L，溶劑為水，初始pH值為6. 7 7. 2，微量元素母液終濃度組成為=FeSO4 · 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/ L、MnS04 ·4Η20 0. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/ L0
9.如權(quán)利要求6或7所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用，其特征在于所述的黃黃色桿菌DT8的含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液按如下步驟制備a)斜面培養(yǎng)將黃黃色桿菌DT8接種至R2A固體培養(yǎng)基，30 32°C斜面培養(yǎng)40 48h，獲得斜面菌體；所述R2A固體培養(yǎng)基終濃度組成為酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、 MgSO4 ·7Η20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸鈉 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/ L，瓊脂15 18g/L，pH7.2，溶劑為水；b)種子培養(yǎng)將步驟a)獲得的斜面菌體接種至R2A 液體培養(yǎng)基，30 37°C培養(yǎng)M 48h，獲得種子液；所述R2A液體培養(yǎng)基終濃度組成為 酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸鈉 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/L，ρΗ7· 2，溶劑為水；c)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟b)獲得的種子液以5 10%接種量接種至R2A液體培養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基，發(fā)酵罐內(nèi)加入甘油消泡劑，30 37°C，pH值6. 5 7. 3，DO值維持2. 0 3. 0，培養(yǎng)40 48h， 獲得含DT8菌的細(xì)胞發(fā)酵液；所述R2A液體培養(yǎng)基終濃度組成同步驟b)，所述肉湯培養(yǎng)基的終濃度組成為酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L,NaCl 5g/L，溶劑為水，ρΗ7· 2 7. 4。
10.如權(quán)利要求1所述的黃黃色桿菌DT8在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以含黃黃色桿菌DT8的菌劑為酶源，所述的含黃黃色桿菌DT8的菌劑為含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑，以環(huán)醚類化合物為唯一碳源和能源，在無機鹽培養(yǎng)基中，30 370C，120 160r/min搖床培養(yǎng)40 48h，使環(huán)醚類化合物降解；所述含黃黃色桿菌DT8的固態(tài)菌劑中細(xì)胞個數(shù)為lX101(lCFU/g，所述環(huán)醚類化合物為THF或1，4_ 二噁烷；所述環(huán)醚類化合物初始濃度為50 1200mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃黃色桿菌DT8(Xanthobacter flavus DT8)及在降解環(huán)醚類化合物中的應(yīng)用，以含黃黃色桿菌DT8的菌劑為酶源，以環(huán)醚類化合物為底物，于無機鹽培養(yǎng)基中，在30～37℃，120～160r/min搖床培養(yǎng)40～48h，使底物環(huán)醚類化合物降解；所述環(huán)醚類化合物為四氫呋喃和1，4-二噁烷；本發(fā)明黃黃色桿菌DT8菌株易于擴大培養(yǎng)，具有高效降解環(huán)醚類化合物的性能，適用于含環(huán)醚類化合物的廢水或廢氣的生物降解，環(huán)境友好，具有極其重要的工程價值和經(jīng)濟價值。
文檔編號C02F3/34GK102433272SQ20111035528
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者金小君, 陳東之, 陳建孟 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)